MANUAL DEL KIT DE ENSAYO PARA DETERMINACIÓN DE LA PROTEÍNA PRIÓNICA ESPECÍFICA DE LA ENFERMEDAD, EN GANADO BOVINO Y OVINO

Transcripción

1 Prionics -Check MANUAL DEL KIT DE ENSAYO PARA DETERMINACIÓN DE LA PROTEÍNA PRIÓNICA ESPECÍFICA DE LA ENFERMEDAD, EN GANADO BOVINO Y OVINO Introducción Distintos tejidos de los animales infectados con priónidos contienen una forma de la proteína priónica PrP, específica de la enfermedad, que está alterada patológicamente. A la proteína priónica alterada se la denomina PrP Sc (la isoforma de la PrP, específica del Scrapie) o PrP BSE, respectivamente. A la forma normal de la PrP se la denomina PrP C (la forma celular de PrP). Tanto la PrP Sc como la PrP BSE se diferencian de la PrP normal por su resistencia a la proteasa: bajo tratamiento con proteasa, la forma normal de la PrP se destruye, mientras que la PrP Sc y la PrP BSE se reducen desde su tamaño original de 32-35kD a un tamaño menor de 27-30kD. Al fragmento PrP Sc /PrP BSE proteasa-resistente remanente se le denomina PrP la PrP C. En una segunda fase, la PrP27-30 se identifica por su actividad inmunológica frente a los anticuerpos anti-prp y por su tamaño, mediante una técnica Western Blot optimizada. Las peculiares propiedades de las soluciones tampón utilizadas en Prionics-Check y la elevada afinidad del anticuerpo, permiten que el test pueda ser llevado a cabo directamente con homogeneizados celulares, combinando la fiabilidad de la técnica Western Blot con la velocidad necesaria para el mass-screening (separación por masa). El anticuerpo monoclonal utilizado en el procedimiento de determinación distingue entre la proteína priónica bovina, ovina y humana, permitiendo que el Prionics-Check pueda utilizarse en cada una de estas especies. El test Prionics alcanza su mayor precisión y fiabilidad al monitorizar tanto la resistencia a la proteasa como el tamaño de la PrP En una primera fase, el tratamiento con proteasa genera el fragmento PrP27-30, a la vez que destruye

2 Materiales integrantes del kit 1. Tampón de homogeneización concentrado. (Concentrado 5, diluir antes de usar). Un frasco con 200mL de tampón de homogeneización concentrado (5 ). Diluir el tampón de homogeneización con H 2 O, hasta alcanzar un volumen final de 1L. 2. Tampón bloqueante PVDF concentrado. (Concentrado 5, diluir antes de usar). Un frasco con 200mL de tampón bloqueante concentrado para bloquear los sitios de unión inespecíficos. Diluir con H 2 O el tampón bloqueante, hasta alcanzar un volumen final de 1L. 3. Tampón de digestión. Un vial con 2,2mL de tampón de digestión. El tampón de digestión de proteinasa K es estable durante 12 meses, almacenado a +4 C. 4. Proteinasa K. Un vial con 2,2mL de proteinasa K. 5. Digestion-Stop. (Pefabloc SC). Un vial con 2,2mL de inhibidor de la proteinasa K, que detiene su actividad proteolítica. 6. PAGE tampón de muestra. Un vial con 25mL de tampón de muestra, para electroforesis en los geles de poliacrilamida SDS (PAGE). 7 Muestra de control. Un vial con 200ìL de PrP normal y marcador de peso molecular en tampón de muestra PAGE. 8. Anticuerpo primario. Un vial con 50ìL de una solución de 2mg/ml y de anticuerpo monoclonal para PrP (IgG 1 ratón anti-prp). Dilución de trabajo: 1: Anticuerpo secundario-ap. Un vial con 50ìL de 0,3mg/ml IgG-AP cabra anti-ratón (anticuerpo contra la IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina). Dilución de trabajo: 1: Tampón de luminiscencia concentrado. (Concentrado 10, diluir antes de usar). Un frasco con 27mL de tampón de luminiscencia concentrado. Antes de usar, diluir con H 2 O hasta conseguir 270mL de solución. Materiales no incluidos en el kit (para mayor detalle y especificaciones del producto, véase el apéndice 2, página 8) MATERIALES Tubos de ensayo cónicos de 50mL. Placa profunda de 96 pocillos de 1,2mL (para ser utilizado como placa matriz de muestra). Placa de digestión de proteinasa K, de 96 pocillos de 0,2mL de pared fina, con láminas de precintado. Puntas de pipeta. Membrana de PVDF (0,45ìm). Papel Whatman 3MM Geles NuPAGE al 12% (17 pocillos, para su utilización con la pipeta de 8 canales) para el análisis de Western Blot. Tampón de elución NuPAGE MOPS/SDS (10 ). Antioxidante NuPAGE. Hyperfilm ECL. SOLUCIONES Metanol al 100%. Tampón de transferencia (10 ). Buffer TBS (ph 7.4). Buffer TBST. Ponceau S (40 ). CDP-Star (Tropix): substrato de fosfatasa alcalina (APS).

3 Instrumental adicional necesario (para mayor detalle y especificaciones del producto, véase el apéndice 3, página 9) Autoclave que alcance 136 C (con válvula de seguridad de hasta 3 bar). Cabina de alta seguridad biológica. Aparato de homogeneización con adaptador para las paletas desechables. Paletas desechables. Balanza. Bloque térmico con el correspondiente bloque de incubación metálico de 96 pocillos. Fuente de alimentación. Cubeta de electroforesis de SDS-PAGE. Cubeta de transferencia. Cajas de plástico para incubar las membranas. Plataforma oscilante. Revelador de película de rayos X. Artículos indicados con una flecha: Las especificaciones exactas del producto (véase el apéndice 2) se recomiendan muy específicamente para obtener resultados óptimos. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO Homogeneización y digestión de las muestras 1. Homogeneización En un tubo de 50mL se introduce una muestra de tejido (aproximadamente 0,5gr) y se pesa con exactitud en una balanza. A esta muestra de tejido se le añade 10 veces su volumen de tampón de homogeneización (p/v). A continuación se homogeneiza el tejido, mediante un Polytron (OMNI GLH220 ó OMNI TH, rpm) durante 1 minuto, con paletas desechables (OMNI International). Para cada homogeneizado, guardar 2 alicuotas de 1mL en una placa matriz para muestras de 96 pocillos de 1,2mL (a partir de aquí, cada fase se realiza con dos muestras para el homogeneizado original). 2. Digestión Para preparar la placa de digestión de 96 pocillos, añadir 10µl de tampón de digestión a cada pocillo de 0,2mL utilizado para la digestión. Transferir 100ìl a cada pocillo del homogeneizado mediante una pipeta multicanal desde la placa maestra a la placa de digestión. Finalmente, añadir 10ìl de Proteinasa K mezclando bien pipeteando en sentido ascendente y descendente. La digestión se realiza durante 40min a 50 C sobre el bloque térmico (que homogeneiza la temperatura de la solución a 47 C). Para detener la reacción, añadir 10ìl de la solución Digestion-Stop. Electroforesis en gel Pasos preparatorios: Preparar los geles NuPAGE (anteriormente NOVEX; actualmente Invitrogen). Calentar la muestra control hasta 65 C durante 2min. 3. Desnaturalización Para analizar las muestras digeridas, añadir 100ìl de tampón de muestra PAGE, mezclar bien, pipeteando en sentido ascendente y descendente y hervir durante 5min a 96 C (calentar las muestras más antiguas, ya hervidas anteriormente, a 65 C, durante 2min). 4. Cargado Cargar 10ìl de la Muestra Control en el primer pocillo. Cargar 10ìl de las muestras anteriormente calentadas en el resto de los pocillos. Llenar la cámara interna y externa de la cubeta de electroforesis con tampón SDS-MOPS para electroforesis (NOVEX) y añadir 500ìl de antioxidante (NOVEX), solamente a la cámara INTERNA.

4 5. Electroforesis Correr el gel a 200V durante 30-40min hasta que el frente de color se encuentre aproximadamente a 1-2cm del fondo del gel. Trasferencia de las bandas Pasos preparatorios: Humedecer la membrana de PVDF (Millipore, Immobilon-P, 0,45µm, 15 cm 18 cm) en metanol (100%) durante unos segundos. Equilibrar la membrana durante 15min como mínimo en el tampón de transferencia. Llenar la unidad de transferencia con 2L de tampón de transferencia previamente enfriado a +4 C. 6. Transferencia Colocar la membrana humedecida encima del papel Whatman y de la esponja. Abrir el cassette del gel NuPAGE mediante la espátula destinada a tal efecto. Eliminar

5 la parte superior del gel con los pocillos y la parte inferior, por debajo del frente de color. Colocar el gel restante sobre la membrana. Una membrana del tamaño descrito admite hasta 6 geles. Cubrir los geles con papel Whatman y colocar encima la esponja. Cerrar el cassette de transferencia y colocarlo en la unidad de transferencia. Las proteínas están cargadas negativamente, por lo que migrarán hacia el polo positivo (rojo) de la unidad de transferencia. Asegurarse de que el cassette se ha insertado con la membrana PVDF situada hacia el polo positivo y los geles hacia el polo negativo (véase página siguiente). Transferir a 150V durante 1h, a +4 C. 7. Tinción Retirar la membrana del cassette de transferencia y teñirla con Ponceau S (1 ) durante 2min. Marcar la posición de los marcadores de peso molecular. El desteñido se realiza con TBST hasta que el color rojo haya desaparecido.

6 Membrana M, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 4, 4, 5, 5, 6, 6, 7, 7, 8, 8 M, 9,9, 10,10, 11,11, 12,12, 13,13, 14,14, 15,15, 16,16 Gel 1 Gel 2 M, 17,17, 18,18, 19,19, 20,20, 21,21, 22,22, 23,23, 24,24 M, 25,25, 26,26, 27,27, 28,28, 29,29, 30,30, 31,31, 32,32 Gel 3 Gel 4 M, 33,33, 34,34, 35,35, 36,36, 37,37, 38,38, 39,39, 40,40 M, 41,14, 42,42, 43,43, 44,44, 45,45, 46,46, 47,47, 48,48 Gel 5 Gel 6 Placa de 96 pocillos cargada con 48 muestras en duplicado, transferidas a 6 geles de 17 pocillos. Los números indican las muestras 1-48 (M=Marcador). Determinación inmunológica 8. Bloqueo Incubar la membrana en aproximadamente 50mL de Tampón Bloqueante PVDF durante 0,5-1h, a temperatura ambiente, sobre una plataforma oscilante. 9. Anticuerpo primario Diluir 10µl del Anticuerpo primario en 50mL de Tampón Bloqueante PVDF (dilución 1:5000), añadir a la membrana (15 18cm) e incubar durante 1-2h a temperatura ambiente (o alternativamente durante 12-18h a +4 C) agitando suavemente sobre una plataforma oscilante. Lavar las membranas con TBST 4 veces durante 5-10min. 10. Ac. secundario-ap Diluir 10µl del Anticuerpo secundario-ap en 50mL de TBST (dilución 1:5000). Incubar a temperatura ambiente durante 0,5-1h, agitando suavemente sobre una plataforma oscilante. Lavar las membranas con TBST 4 veces durante 5-10min. 11. Detección Equilibrar la membrana durante 5min en 50mL de Tampón de luminiscencia. Diluir 100µl de CDP-Star (50 ) en 5mL de Tampón de luminiscencia. Eliminar el exceso de Tampón de luminiscencia. Colocar la membrana sobre una placa de cristal. Distribuir uniformemente sobre la membrana el CDP-Star diluido e incubar durante 5min a temperatura ambiente. Eliminar el exceso de líquido del cristal y el líquido que queda en la membrana con un paño suave. Cubrir inmediatamente la membrana con una lámina Sarán (de vinilo). Transcurridos 5-10min exponer la membrana a un HyperFilm ECL durante aproximadamente 1-2min y revelar la película. Para ver las señales de forma óptima, podrían necesitarse otras exposiciones (desde 10 segundos hasta varios minutos).

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8 APÉNDICE 1 Procedimiento de ensayo (descripción resumida) HOMOGENEIZACIÓN Y DIGESTIÓN DE LAS MUESTRAS 1. Homogeneización Cortar una muestra de médula y pesarla en la balanza (0,50-0,75gr) Añadir 10 volúmenes de Tampón de homogeneización (por ejemplo, 5mL para 0,5gr de tejido cerebral) y homogeneizar durante 1min con un homogeneizador tisular OMNI. Guardar 2 muestras de 1mL por homogeneizado, en la placa matriz de muestras de 96 pocillos. 2. Digestión En la placa de digestión de 96 pocillos, añadir 10ìl de Tampón de digestión a cada uno de los pocillos que se utilizarán para las digestiones. Transferir 100ìl de homogeneizado, desde la placa matriz a la placa de digestión de 96 pocillos. Añadir 10ìl de Proteinasa K, mezclando bien. Digerir durante 40min a 47 C (temperatura del bloque: 50 C, en el desarrollo). Detener la digestión con 10ìl de Digestion-Stop. ELECTROFORESIS EN GEL Pasos preparatorios Preparar los geles NuPAGE. Calentar el control positivo y el marcador a 65 C durante 2 min. 3. Desnaturalización Añadir 100ìl de Tampón de Muestra PAGE a las muestras digeridas, mezclar bien y calentar durante 5min a 96 C. Las muestras calentadas pueden almacenarse a -20 C. 4. Cargado Cargar 10ìl de la Muestra Control en el primer pocillo. Cargar el resto de los pocillos del gel con 10ìl de cada muestra calentada. Llenar totalmente las dos cámaras de la cubeta con Tampón de electroforesis. Añadir 500ìl de antioxidante solamente a la cámara INTERNA. 5. Electroforesis Correr los geles a 200V, durante unos 30-40min. TRANSFERENCIA DE LAS BANDAS Pasos preparatorios Humedecer la membrana de PVDF (sumergiéndola unos segundos en metanol). Equilibrar la membrana durante 15min en Tampón de transferencia. Llenar la unidad de transferencia con Tampón de transferencia enfriado a +4 C. 6. Transferencia Colocar la membrana sobre el papel Whatman y la esponja. Abrir el cassette del gel, extraer el gel y colocarlo sobre la membrana. Cubrir el gel con el papel Whatman y colocar encima la esponja. Cerrar el cassette de transferencia y colocarlo en la unidad de transferencia. Transferir a 150V durante 1 hora a +4 C.

9 7. Tinción Retirar la membrana y teñir con Ponceau S durante 2min las proteínas unidas a la membrana de PVDF. Marcar las posiciones de los carriles y de los marcadores de peso molecular. Desteñir la membrana con TBST hasta que el color rojo haya desaparecido. DETERMINACIÓN INMUNOLÓGICA 8. Bloqueo Incubar la membrana en aproximadamente 50mL de PVDF Tampón de Bloqueo durante 0,5-1horas a temperatura ambiente. 9. Anticuerpo primario 10. Anticuerpo secundario-ap Diluir 10ìl del Anticuerpo primario en 50mL de Tampón de Bloqueo PVDF (1:5000), añadirlo a la membrana e incubar durante 1-2horas, a temperatura ambiente (o alternativamente durante 12-18h a +4 C). Lavar las membranas con TBST 4 veces durante 5-10min. Diluir 10ìl del Anticuerpo secundario-ap (IgG cabra anti-ratón, conjugado con fosfatasa alcalina) en 50mL TBST (1:5000), añadirlo a la membrana e incubar durante 0,5-1horas a temperatura ambiente. 11. Detección Equilibrar la membrana durante 5min con Tampón de luminiscencia. Diluir 100ìl de CDP-Star (50 ) en 5mL de Tampón de luminiscencia. Eliminar el exceso de líquido de la membrana. Distribuir el CDP-Star diluido sobre la membrana e incubar durante 5min a temperatura ambiente. Eliminar el exceso de líquido; secar la membrana con un paño suave y cubrirla con una lámina Sarán (de vinilo). Exponer a un ECL HyperFilm durante 1min y revelar la película. Para optimizar las señales exponer a diferentes tiempos (desde 10seg. hasta varios minutos).

10 Normas de seguridad 1. Cumplimiento de las Normas de Seguridad Nacionales. 2. Directrices del ACDP. El Comité de Seguridad sobre Patógenos Peligrosos del Departamento de Salud de Inglaterra (Advisory Committee on Dangerous Pathogens - ACDP; Department of Health; London, UK), publicó una directriz sobre el trabajo con priones titulado "Precauciones a tomar en el trabajo con Encéfalopatías Espongiformes Transmisibles humanas y animales" ("Precautions for work with human and animal Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSE)". Dicha directriz puede solicitarse a la Stationery Office, ISBN , teléfono +44 (0) Directrices de Prionics AG. La bioseguridad puede definirse como la utilización de técnicas y equipos para el trabajo en contacto con patógenos potencialmente nocivos para los humanos. La consideración primera y más importante al respecto, es utilizar el sentido común. La clave para la seguridad en el laboratorio es aplicar las normas correctas de trabajo en el laboratorio. La totalidad del proceso de homogeneización en particular y todos aquellos procesos que produzcan aerosoles deben realizarse en una cabina de bioseguridad (p.e., Skan VSE ). Cualquier recipiente que contenga materiales infecciosos deberá abrirse únicamente dentro de la misma. Todos los trabajadores deberán llevar ropa de laboratorio desechable y guantes y zapatos especiales de laboratorio. Para trabajar en la cabina de bioseguridad, se utilizarán mangas de protección adicionales y otro par de guantes para colocar sobre los anteriores. Este segundo par de guantes deberá cambiarse con frecuencia. Cada cierto período de tiempo razonable, los trajes se depositarán en los recipientes para desechos. Sólo se utilizarán pipetas mecánicas; las pipetas bucales están prohibidas. Para la protección ocular, utilizar gafas de seguridad, ante al riesgo de salpicaduras. Cualquier proceso que potencialmente produzca aerosoles (sonicación, homogeneización) deberá realizarse dentro de la cabina. Siempre que sea posible, utilizar material desechable. Etiquetar todas las muestras, los equipos contaminados y las zonas de trabajo con cintas indicadoras de peligro de contaminación biológica. Siempre que sea posible, evitar o reducir los objetos cortantes. Eliminar de forma segura los desechos contaminados, mediante autoclavado durante 2horas a 136 C o por incineración. Tanto los líquidos como el equipo se incubarán durante un mínimo de 2h en hipoclorito sódico al 4% para su descontaminación. Cualquier objeto que haya estado en contacto con priones se considerará infeccioso, a menos que haya sido específicamente descontaminado; como el SDS al 10% reduce el título de priones pero no esteriliza, los filtros de nitrocelulosa y de PVDF del Western Blot deben ser considerados potencialmente infecciosos. Descontaminar las superficies y el equipo cada cierto período de tiempo, utilizando para ello NaOH 1M o hipoclorito sódico al 4%. Se prohibe terminantemente comer, beber y fumar en el laboratorio.

11 APÉNDICE 2: MATERIALES NO INCLUIDOS EN EL KIT HOMOGENEIZACIÓN Y DIGESTIÓN DE LAS MUESTRAS Tubos cónicos de 50mL Cultek [Corning # , # ó # ] Placa de 96 pocillos de 1,2mL Cultek [Corning # ó #154410] (para ser utilizada como placa matriz de muestra) Tapa selladora para la placa matriz Cultek [Corning # ó #154418] Placa de digestión de 96 pocillos de Cultek [Corning # ó #156551] 0,2mL Lámina de sellado para la placa de Cultek [Corning # ó #156570] digestión de 96 pocillos ELECTROFORESIS EN GEL Geles NuPAGE al 12% (17 pocillos) para el análisis Western Blot Tampón de elución NuPAGE MOPS/SDS Antioxidante NuPAGE Cultek [Invitrogen #75NP0349] Cultek [Invitrogen #75NP0001] Cultek [Invitrogen #75NP0005] TRANSFERENCIA DE LAS BANDAS Membrana de PVDF Cultek [Millipore #92IPVH 00010] (Immobilone-P 0,45ìm) Tampón de transferencia (10 ) Cultek [Invitrogen #75NP0006] Composición para hacerlo en el propio laboratorio: Tris base (tribásico) 30,28gr Glycine (glicina) 144,13 g Añadir agua desionizada hasta 1L Para su utilización, diluir 200mL de Tampón de Transferencia (10 ) en 1800mL de agua desionizada y añadir 200mL de metanol (10% v/v). Enfriar hasta +4 C. Película de rayos-x Cultek [Pierce CL-XPosure Film # ] ECL HyperFilms Amersham SOLUCIONES Metanol al 100% Tris-Buffered-Saline (TBS, ph 7,4) NaCl 8,0gr KCl 0,2gr Tris base 3,0gr Añadir 1L con agua desionizada, ajustar el ph a 7,4 con HCl. Tris-Buffered-Saline con Tween (TBST) Ponceau S (40 ) Substrato de fosfatasa alcalina (AP) TBS con Tween-20 al 0,05% (v/v) Cultek [#93P7170] Ponceau S al 0,5% (p/v) Ácido acético al 5% (v/v) Diluir con TBST a 1 para su uso Cultek [Pierce Lumi-Phos WB# ] CDP-Star [Tropix]

12 APÉNDICE 3: INSTRUMENTAL ADICIONAL NECESARIO Autoclave que alcance hasta 136 C Cabina de alta bioseguridad Aparato de homogeneización Cultek [Integra-Fedegari #39FVA/2-HP] Cultek [Faster BHA 2004-D #23F ] Cultek [OMNI International #68TH220P] Paletas de 7mm OMNI desechables Cultek [OMNI International # ] Adaptador para el homogeneizador Balanza de precisión Cultek [OMNI International #68A1000P] Cultek [#53EK6000G] Bloque térmico Cultek [Biometra TB1 # ] Cultek [UniTek #71UHBS-130E] Bloque de incubación metálico de 96 pocillos Cultek [Biometra # ] Cultek [UniTek #UB-96V] Fuente de alimentación Cultek [Biometra PowerPack 25# ] Cubeta de electroforesis SDS-PAGE Cultek [Invitrogen XCell SureLock Mini Cell #75EI0001] Cubeta de transferencia Cultek [Biometra TankBlot # ] Baño de recirculación de 6L Cajas para incubar membranas Cultek [#53PS911] Plataforma oscilante Cultek [Biometra WT15 # ] Equipo de análisis de imágenes Cultek [Biometra BioDocAnalyze # ] ó Revelador de películas para rayos X En los artículos señalados con una flecha, se recomienda seguir exactamente las especificaciones del producto para obtener resultados óptimos.