Centro de Nanociencias y Nanotecnología Licenciatura en Nanotecnología

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1 PROGRAMA DE ASIGNATURA CLAVE DENOMINACIÓN DE LA ASIGNATURA SEMESTRE 0003 BIOCATÁLISIS SEXTO MODALIDAD CARÁCTER HORAS HORAS/SEMANA CRÉDITOS SEMESTRE TEÓRICAS PRÁCTICAS CURSO, LABORATORIO OPTATIVA ETÁPA ESPECIALIZACIÓN EJE TEMÁTICO BIOTECNOLOGÍA TIPO TEÓRICO - PRÁCTICA ÁREA DE CONOCIMIENTO TÓPICOS DE INGENIERÍA OBJETIVO GENERAL Mostrar al alumno las bases de la biocatálisis y aplicarlas a la solución de problemas. Introducir al alumno a los métodos sistemáticos de solución de problemas en el ámbito de la biotecnología. Enfatizar la importancia de los principios generales de las reacciones enzimáticas, y mostrar su utilidad para la síntesis y modificación de nanomateriales. SERIACIÓN OBLIGATORIA O INDICATIVA DE LAS ASIGNATURAS ASIGNATURA ANTECEDENTE ASIGNATURA SUBSECUENTE BIOQUÍMICA II BIOLOGÍA MOLECULAR Elaborado por: Dr. Rafael Vázquez

2 TEMAS # HORAS I Introducción a la enzimología II Propiedades y clasificación de las enzimas 3 III Conceptos básicos de termodinámica, catálisis y cinética 5 IV Cinética e las reacciones monosustrato V Significado de los parámetros cinéticos VI Métodos de medida de la velocidad de la reacción global y de las constantes de velocidad VII Efecto del ph y de la temperatura sobre la velocidad de reacción VIII Inhibición enzimática 3 IX Aspectos prácticos X Otros tipos de inhibición XI Reacciones multisustrato 3 XII Determinación de mecanismos y parámetros cinéticos 4 XIII Inhibición por producto e intercambio isotópico XIV Aislamiento y purificación de enzimas 4 XV Técnicas de aislamiento y purificación XVI Cromatografías de exclusión molecular, de intercambio iónico y de interacción XVII Cromatografía de afinidad y técnicas complementarias XVIII Tabla de purificación y criterios de pureza XIX Mecanismos de catálisis enzimática 4 XX Otros mecanismos catalíticos XXI Pruebas experimentales de la fijación preferencial del estado de transición 3 XXII Mecanismos de acción de enzimas seleccionadas () XXIII Mecanismos de acción de enzimas seleccionadas () XXIV Estrategias de regulación enzimática XXV Unión de ligandos a proteínas XXVI Cooperatividad y alosterismo XXVII Modelos matemáticos para explicar la cooperatividad XXVIII Modelos moleculares que explican la cooperatividad XXIX Aplicaciones del uso de enzimas en biotecnología XXX Enzimas inmovilizadas Total horas 64

3 CONTENIDO TEMÁTICO I II III IV V. Introducción a la Enzimología.. Perspectiva histórica... Estudios sobre la fermentación..3. Naturaleza química de las enzimas..4. Tipos de enzimas..5. Ribozomas, abzimas y sinzimas.. Propiedades y clasificación de las enzimas.. Propiedades y características generales de las enzimas... Conceptos de cofactor, gurpo prostético, coenzima, eisoenzima..3. Nomenclatura y clasificiación de las enzimas. 3. Conceptos básicos de termodinámica, catálisis y cinética 3.. Conceptos termodinámicos. 3.. Equilibrio químico Cinética química Estado de transición y energía de activación Molecularidad y orden de una reacción Concepto de velocidad inicial Determinación experimental del orden de una reacción Reacciones irreversibles y reversibles Ecuaciones integradas de velocidad. 4. Cinética de las reacciones monosustrato. 4.. Factores que afectan a la velocidad de una reacción catalizada por una enzima. 4.. Derivación de ecuaciones de velocidad Aproximación del equilibrio rapido: ecuación de Michaelis y Menten Aproximación del estado estacionario: de Briggs y Haldane Ecuación de velocidad para una reacción que incluye dos ejemplares centrales Zonas funcionales en la cinética de Michaelis-Menten. 5. Significado de los parámetros cinéticos 5.. Significado de los parámetros cinéticos: Km, Vmax y Kcat. 5.. Poder catalítico de una enzima Medida de la eficiencia y la especificidad de una enzima: Kcat/Km Reacciones reversibles: efecto del producto sobre la reacción directa Relación de Haldane Transformaciones lineales de la ecuación de Michaelis- Menten Cálculo de parámetros cinéticos mediante regresión no lineal: características y ventajas Ecuación integrada de Michaelis-Menten

4 VI 6. Métodos de medida de la velocidad de la reacción global de las constantes de velocidad 6.. Técnicas de medida de la actividad enzimática: espectofotometría, fluorescencia, titulación automática, métodos radiactivos. 6.. Ensayos continuos y discontinuos Reacciones acopladas Estado preestacionario Técnicas para esl estudio de reacciones rápidas Técnicas de flujo rápido: flujo continuo, flujo detenido (stopped flow), flujo extinguido (quenched flow) Técnicas fotolíticas Cinéticas de relajación del equilibrio: salto de temperatura, salto de presión y métodos ultrasónicos Valoración de centros activos de una enzima. VII 7. Efecto del ph de la temperatura sobre la velocidad de racción 7.. Efecto del ph sobre la velocidad de reacción. 7.. Dependencia de la Vmax y Km respecto al ph Determinación de pka de aminoácidos del centro activo Efecto de los cambios de temperatura en las reacciones 7.5. enzimáticas Diagramas de Arrhenius Estabilidad térmica de las enzimas Inactivación por calor. VIII 8. Inhibición enzimática Tipos de inhibición. 8.. Inhibidores reversibles, irreversibles y pseudoirreversibles Inhibidores lineales e hiperbólicos Inhibición reversible lineal: inhibición competitiva, nocompetitiva, mixta e incompetitiva Derivación de las ecuaciones de velocidad Inhibición por sustrato. IX 9. Aspectos prácticos 9.. Representaciones gráficas. 9.. Diagramas secudarios Representaciones directas: diagramas de Dixon y de Cornish-Bowden Significado de las constantes de inhibición Diseño de un experimento de inhibición Expresiones de la inhibición, a C50 y las constantes cinéticas. 4

5 X 0. Otros tipos de inhibición 0.. Inhibición parcial y activación enzimática. 0.. Ecuaciones de velocidad Tipos de inhibidores parciales Cálculo de parámetros cinéticos Activadores enzimáticos Activación esencial y no esencial Inhibidores irreversibles Inhibidores basados en el mecanismo Inhibidores de alta afinidad (pseudoirreversibles). XI. Reacciones multisustrato 3.. Introducción... Notación de Cleland..3. Reacciones bisustrato..4. Mecanismos secuenciales ordenado y al azar y mecanismo ping-pong..5. Ecuaciones de velocidad..6. Significado de los parámetros cinéticos. XII. Determinación de mecanismos y parámetros cinéticos 4.. Representaciones primarias y secundarias... Cálculo de parámetros cinéticos..3. Determinación del mecanismo mediante cinética en estado estacionario..4. Estudios variando la concentración de los sustratos..5. Uso de sustratos alternativos..6. Inhibición por análogos de sustrato. XIII 3. Inhibición por producto e intercambio isotópico 3.. Inhibición por producto. 3.. Reglas de Cleland Efecto de saturar con el sustrato fijo Patrones de inhibición Representaciones gráficas Estudios de intercambio isotópico en mecanismos de Ping-Pong Intercambio isotópico en mecanismos secuenciales. XIV 4. Aislamiento y purificación de enzimas 4.. Aspectos previos. 4.. Selección de la fuente Detección de la proteína de interés: técnicas. inmunológicas y medida de la actividad enzimática 4.4. Solubilización de la proteína Estabilización de la proteína en cada paso: ph, grado de oxidación y presencia de metales pesados. 4 5

6 XV 5. Técnicas de aislamiento y purificación 5.. Otros factores que afectan a la estabilidad de las proteínas: temperatura, presencia de proteasas, polaridad y fuerza iónica. 5.. Técnicas de precipitación de proteínas: fraccionamiento salino, precipitación por calor, isoeléctrica, con disolventes orgánicos y con polímeros Cromatografía Fundamentos de la cromatografía Fase estacionaria y fase móvil Tipos de interacciones entre la proteína y la fase estacionaria Cromatografía de adsorción. XVI 6. Cromatografías de exclusión molecular, de intercambio iónico y de interacción 6.. Cromatografía de filtración en gel. 6.. Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de interacción hidrofobica Cromatografía en fase reversa. XVII 7. Cromatografía de afinidad y técnicas complementarias 7.. Cromatografía de afinidad. 7.. Tipos y fundamento Adición a colas mediante ingeniería genética Técnicas complementarias Concentración y diálisis Membranas de filtración, dialíticas y de ultrafiltración Fundamento de la diálisis Diálisis inversa Membranas de ultrafiltración Métodos de concentración. 7.. Determinación de la concentración de proteínas. 7.. Conservación de la muestra purificada. XVIII 8. Tabla de purificación y criterios de pureza 8.. Tabla de purificación. 8.. Actividad total y actividad específica Ejemplos de purificación Estrategias de purificación Criterios de pureza Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) Electroforesis bidimensional Criterios cromatográficos Espectometría de masas. 6

7 XIX 9. Mecanismos de catálisis enzimática Incrementos de velocidad producidas por las enzimas. 9.. Estado de transición e intermedios de reacción Naturaleza química de la catálisis enzimática Mecanismos de catálisis Catálisis ácido-base Catálisis covalente. XX 0. Otros mecánismos catalíticos 0.. Catálisis por iones metálicos y electrostática. 0.. Efectos de proximidad y orientación Utilización de la energía de unión en la catálisis: fijación preferencial del estado de transición. XXI. Pruebas experimentales de la fijación preferencial del estado de transición.. Pruebas estructurales... Estudios con análogos del sustrato..3. Análogos de estado de transición..4. Anticuerpos catalíticos..5. Mutagénesis dirigida..6. Evolución de las enzimas para conseguir la máxima. velocidad: máxima Km manteniendo kcat/km..7. Pruebas experimentales. 3 XXII. Mecanismos de acción de enzimas seleccionadas ().. Quimotripsina... Activación del zimógeno..3. Cinética de hidrólisis de amidas y ésteres..4. Identificación de residuos esenciales en la catálisis: modificación química..5. Estructuras de rayos X..6. Mecanismo catalítico. XXIII 3. Mecanismos de acción de enzimas seleccionadas () 3.. Otras serín proteasas: tripsina, elastana y subtilisina. 3.. Evolución convergente y divergente Generalización al mecanismo de acción a otras proteasas Lactato deshidrogenasa Factores que intervienen en la catálisis Catálisis ácido-base Estereospecifidad de la reducción del NAD Otras deshidrogenasas: alcohol deshidrogenasa Ribonucleasa A Catálisis por piridoxal fosfato. 3.. Formación de bases de Shiff. 3.. Transaminasas, descarboxilasas y racemasas. 7

8 XXIV 4. Estrategias de regulación enzimática 4.. Control de cantidad de enzima: enzimas constitutivas e inducibles. 4.. Recambio enzimático Proteínas multienzimáticas Complejos multienzimáticos Modificación cavolente de enzimas Modificación covalente irreversible: zimógenos Modificación covalente reversible: cascadas de enzimas interconvertibles Fosforilación y defosforilación Otras modificaciones covalentes Regulación por unión reversible de ligandos: cooperatividad y alosterismo. XXV 5. Unión de ligandos a proteínas 5.. Métodos para determinar la cantidad de ligando unido. 5.. Métodos homogéneos y heterogéneos Tratamiento cuantitativo Representación de los datos experimentales Ecuación de Scatchard Aplicaciones prácticas. XXVI 6. Cooperatividad y alosterismo 6.. Tipos de cooperatividad. 6.. Alosterismo: efectos homotrópicos y heterotrópicos Significado biológico de la cooperatividad positiva y negativa Ejemplos de cooperatividad y alosterismo: hemoglobina y aspartato transcarbamilasa. XXVII 7. Modelos matemáticos para explicar la cooperatividad 7.. Detección y medida de la cooperatividad. 7.. Ecuaciones de Hill y de Adair Representaciones gráficas Índice de cooperatividad (Hill y otros). XXVIII 8. Modelos moleculares que explican la cooperatividad 8.. Modelo de simétrico o concertado (WMC). 8.. Modelo secuencial (KNF) Elección de modelo de cooperatividad adecuado Cooperatividad negativa Cooperatividad cinética Cinéticas sigmoidales en ausencia de cooperatividad Polimeración reversible Enzimas histeréticas 8

9 XXIX 9. Aplicaciones del uso de enzimas en biotecnología 9.. Análisis enzimático. 9.. Biocatálisis industrial Biocatálisis energética Biocatálisis farmacéutica Tipos de análisis enzimáticos Ensayos directos e indirectos Ensayos cinéticos y de punto final Métodos inmunológicos: RIA y ELISA Enzimas como instrumentos analíticos Diagnóstico enzimático. 9.. Enzimas conmo fármacos: enzimas con actividad fibrinolítica, antineplásica y proteolítica. 9.. Terapia enzimática. XXX 30. Enzimas inmovilizadas 30.. Métodos de inmovilización y propiedades de las enzimas inmovilizadas Efectos sobre la estabilidad y parámetros cinéticos Uso de enzimas inmovilizadas en medicina e industria Aplicaciones industriales de las enzimas Industria alimentaria y química Biosensores. Bibliografía básica Cornish-Bowden A. 995, Fundamentals of Enzyme Kinetics: Portland Press Limited. Cambrigde, Reino Unido. Leskovak V, 003, Comprehensive enzyme Kinetics, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. Bibliografía complementaria Segel, I. H. 993, Enzyme Kinetics. Wiley & Sons, New York. Prince N. C. Stevens L., 999, Fundamentals of Enzymology: The Cell and Molecular Biology of Catalytic Proteins. Oxford University Press. Reino Unido. Fersht A. 000, Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding. W. H. Freeman, New York. Boyer P. D. Lardy H. and Myrback K. (editores). 965, The Enzymes. Academic Press, New York. Boyer P. D. (ed). 970, The Enzymes. Student Edition Academic Press, New York. 9

10 SUGERENCIAS DIDÁCTICAS TÉCNICAS DE EVALUACIÓN SUGERIDAS Exposición oral x Exámenes parciales x Exposición audiovisual x Examen final x Ejercicios dentro de clase x Trabajos y tareas fuera del aula x Ejercicios fuera del aula x Prácticas de laboratorio x Lecturas obligatorias x Participación en clase x Prácticas de taller o laboratorio x PERFIL DE LOS PROFESORES QUE PUEDEN IMPARTIR LA ASIGNATURA: Profesor con estudios de posgrado (maestría o doctorado) en ciencias químicas, biológicas o de la salud, o áreas afines con una fuerte preparación en la especialidad de la materia y experiencia o capacitación docente. 0