Comportamiento de los virus de crustáceos de declaración obligatoria de la OIE en Litopeneaeus vannamei de cultivo en Cuba en el período

Transcripción

1 Revista Cubana de Investigaciones Pesqueras Enero-junio, 2011, vol. 28, No. 1, ISSN , pp Comportamiento de los virus de crustáceos de declaración obligatoria de la OIE en Litopeneaeus vannamei de cultivo en Cuba en el período Crustacean virus of obligatory declaration by OIE performance in cultured Litopeneaeus vannamei in Cuba from 2003 to 2009 Adriana Artiles, 1 Manuel Rubio, 1 Ernesto Gonzalez, 2 Raico Laria 1 y Raquel Silveira 1 1 Centro de Investigaciones Pesqueras, 5ta. Ave. y 246, Santa Fe, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba, CP: 19100, Teléfono: (537) , Fax: (537) , aartiles@cip.telemar.cu 2 Instituto Medicina Veterinaria, calle 12 entre 15 y 17, Vedado, Plaza, Ciudad de La Habana, Cuba. RESUMEN Uno de los principales problemas del cultivo del camarón blanco del Pacífico, Litopeneaeus vannamei, es la susceptibilidad de esta especie a diversas enfermedades virales, que pueden conducir a grandes mortalidades y/o pérdidas económicas. En este trabajo se reportan los resultados obtenidos en la ejecución de los muestreos periódicos y chequeos de cuarentenas correspondientes al programa de vigilancia, desde la primera introducción de esta especie en Cuba en 2003 hasta el Para ello se emplearon técnicas de análisis en fresco, histológicas y de biología molecular. En este período, no se detectó ninguno de los virus de crustáceos que son de declaración obligatoria por la Organización Mundial de la Salud Animal (OIE, de sus siglas en francés): el virus de la Necrosis Infecciosa Hematopoyética (IHHNV, de sus siglas en inglés), el virus de la Mancha Blanca (WSSV, de sus siglas en inglés), el virus del Taura (TSV, de sus siglas en inglés), el virus de la Cabeza Amarilla (YHV, de sus siglas en inglés), el virus de la Mionecrosis Infecciosa (IMNV, de sus siglas en inglés) y el Baculovirus penaei, PsSOV Bonami (antes BP). Como conclusión se establece que las medidas de bioseguridad adoptadas, así como el establecimiento de muestreos periódicos y chequeo de cuarentenas ha permitido que nuestras camaroneras se mantengan libres de estos virus. Palabras clave: Litopenaeus vannamei, virus, histopatología, PCR, cultivo, bioseguridad. ABSTRACT One main problem for cultured white Pacific Shrimp, Litopeneaeus vannamei is viral disease susceptibility, which can cause important mortalities and/or economic losses. This work is a report of the results obtained in periodic tests and quarantine checking belonging to the Surveillance program since the first introduction of these specie in 2003 until last year, Fresh analysis, histologic and molecular biology techniques were used for this aim. In this period, none of Crustacean viruses of obligatory declaration by OIE (World Animal Health Organization by French abbreviations) was detected: Infectious Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV), White Spot Syndrome Virus (WSSV), Taura Syndrome Virus (TSV), Yellow Head Virus (YHV), Infectious Mionecrosis Virus (IMNV) and Baculovirus penaei, PsSOV Bonami (before BP). As a conclusion it is stated that biosecurity measures and the establishment of periodic tests and quarantine checking have made the farms be free from those viruses. Keywords: Litopenaeus vannamei, virus, histopatoogy, PCR, culture, biosecurity. INTRODUCCIÓN El camarón blanco del Pacífico, Litopenaeus vannamei, se introduce por primera vez en Cuba en el año 2003 (Tizol et al., 2004), proveniente del Centro de Mejora del Camarón (SIS, de sus siglas en inglés), en EE. UU. Esta especie es susceptible a varios virus que ocasionan severas mortalidades y pérdidas económicas. Una estrategia ampliamente utilizada por muchos cultivadores en el mundo para prevenir la presencia de estos virus, es el empleo de líneas libres de patógenos o Shrimp 12

2 Pathogen Free (SPF de sus siglas en inglés) (Lightner, 2005). Los camarones L. vannamei que se cultivan en Cuba provienen de estas líneas, lo que garantiza salud, mejor rendimiento productivo y mayor rentabilidad. Dos de los virus de ADN a los que es susceptible Litopeneaus vannamei y que son de declaración obligatoria por la OIE, son el virus de la Necrosis Hemorrágica y Hematopoyética Infecciosa (IHHNV, de sus siglas en inglés) y el virus de la Mancha Blanca (WSSV, de sus siglas en inglés). Para estas enfermedades la histopatología clásica y las técnicas moleculares han demostrado ser eficientes para los diagnósticos presuntivos y confirmatorios cuando hay un brote de la enfermedad (OIE, 2009). Sin embargo, para la vigilancia de los portadores asintomáticos en el período de incubación de ambos virus, solamente las segundas han demostrado su certeza, rapidez y sensibilidad. Para los virus de ARN: el virus del Taura (TSV, de sus siglas en inglés), el virus de la Cabeza Amarilla (YHV, de sus siglas en inglés) y el virus de la Mionecrosis Infecciosa (IMNV, de sus siglas en inglés), la hibridación in situ y/o la reverso trascripción acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR, de sus siglas en inglés) son los métodos recomendados por la OIE para su detección. Baculovirus penaei, también es un virus ADN de declaración obligatoria, pero no se necesitan las técnicas de Biología Molecular ni la histología para detectarlo, en virtud de los evidentes cuerpos de oclusión tetraédricos que forma y que son fácilmente detectables por microscopía convencional de preparaciones frescas de las heces (Couch, 1974). De estos virus, solo ha habido reportes previos en Cuba de IHHNV, infectando a Litopennaeus shmitti de cultivo (Laria et al., 2004); no así en el medio natural. Baculovirus penaei, que también se ha encontrado en Cuba en Litopenaeus schmitti en ambientes naturales (Fajer et al., 1998), no ha sido reportado en nuestro país para el camarón introducido, y el presente estudio confirma también este resultado. También se ha reportado la infección por reovirus (Cruz & Laria, 2006) y el parvovirus del hepatopáncreas (HPV) (Cruz et al., 2004). Con respecto a estos que no son de declaración obligatoria se mantiene igualmente una vigilancia epidemiológica, ya que pueden ocasionar pérdidas en los cultivos, principalmente, retardo en el crecimiento y afectación en los animales preadultos. Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo de este trabajo es analizar los resultados de la vigilancia de los virus de declaración obligatoria de la OIE en L. vanamei, que se lleva a cabo en Cuba desde la introducción en 2003 hasta el MATERIALES Y MÉTODOS Se creó una base de datos con la información tomando como fecha de inicio el año 2003, de las fechas de las introducciones, cantidad de animales que entraron al país, sexo y estadio de los camarones. Del mismo modo, se compiló la información con los resultados obtenidos en los análisis en fresco, histopatológicos y por PCR de los virus, en los muestreos periódicos realizados a las cuatro camaroneras del país: Cultizaza, Cultisur, San Ros, Calisur y en el Centro de Producción y Cría de Larvas Yaguacam, como parte del programa de vigilancia de enfermedades donde cada instalación se chequea cuatro veces al año. Toma de muestra Se realizaron dos muestreos: uno al arribo de los camarones al centro de cuarentena y otro a los 21 días del período de cuarentena en cada una de las cinco introducciones realizadas durante el período En cada uno de ellos se emplearon en el diagnóstico técnicas de biología molecular e histopatológicas, así como montajes en fresco para la observación directa al microscopio de frotis de piel y heces. En el caso de los muestreos periódicos se hizo una toma de muestra en el período de cada camaronera cada cuatro meses. Para los análisis se tomaron 150 larvas (95 % de límite de confianza y una prevalencia del 5 %). Para PCR se colocaron de PL5 a PL15 en un tubo con tapa de rosca y se fijó con etanol absoluto hasta su utilización. Para histopatología las larvas fueron fijadas en solución Davidson por 24 h, luego transferidos a etanol 95 % manteniendo una relación 10:1 fijador larvas hasta su procesamiento. Para el análisis de los reproductores se utilizaron 60 camarones (95 % de límite de confianza y una prevalencia del 5 %) en cada muestreo realizado, de los que se tomaron fragmentos del cuarto par de pleópodos entre el exo y endopodito y branquias que se colocaron en viales con etanol absoluto para su posterior utilización. Para el estudio histopatológico, muestras de todos los órganos fueron fijadas en solución Davidson durante 48 h y luego trasladadas a alcohol 50 %, manteniendo una relación 10:1 fijador fragmento. Las larvas y los fragmentos de los reproductores fueron procesados mediante la técnica propuesta por Lightner y Redman (1998), utilizando la tinción con hematoxilina eosina de Meyer-Bennett. Las preparaciones fueron observadas en microscopio óptico. 13

3 Extracción de ADN y ARN La extracción de ADN y ARN se realizó siguiendo las instrucciones de los fabricantes del kit (Farming IntelliGene Tech. Corp. teniendo en cuenta el principal órgano diana que afecta cada virus y el tipo de material genético que porta este. De este modo, de las branquias solamente se purificó ARN y cada pleópodo se dividió en dos luego de eliminar la cutícula para extraer tanto ADN como ARN. Una vez realizado el protocolo de extracción, las muestras se disolvieron en agua libre de nucleasas el ADN y en agua con DEPC el ARN. En el caso de la quinta introducción la extracción de ADN se hizo por el método fenol cloroformo modificado (Sambrook et al., 2001). Condiciones de PCR y RT-PCR Las reacciones de PCR o RT-PCR se llevaron a cabo por triplicado en un termociclador MJResearch, con la mezcla de reacción especificada en el kit y su programa correspondiente (Farming IntelliGene Tech. Corp. Los productos amplificados de las muestras y los respectivos controles se corrieron en electroforesis de agarosa al 1,5 % teñida con bromuro de etidio y se visualizaron en un transiluminador FBTI 88 (Fisher Biotech). En todos los ensayos se utilizó un control positivo del kit, un control negativo con agua o ARNt de levadura y se aplicó en la corrida electroforética un patrón de peso molecular del kit con tres bandas: 848 pb, 630 pb y 333 pb. Criterios de positividad A continuación se muestran en la TABLA 1 los tamaños de los amplicones correspondientes a los controles internos de cada kit (regiones del genoma conservadas en L. vannamei) y de genes de patogenicidad para cada virus pesquisado. TABLA 1. Virus muestreados, ensayo que se realiza para su detección y tamaños de los amplicones y controles internos para cada ensayo Virus Tipo de Pares de base Pares de base ensayo del control interno de los amplicones del virus IHHNV PCR 243 pb 438 pb, 644 pb WSSV PCR 848 pb 296 pb, 550 pb YHV/GAV RT-PCR 680 pb 277 pb, 777 pb: para YHV 406 pb, 777 pb: para GAV TSV RT-PCR 680 pb 284 pb, 476 pb IMNV RT-PCR 680 pb 255 pb, 510 pb La composición en cuanto a sexo, estadio, cantidad de animales y otros datos de interés de cada una de las introducciones de L. vannamei desde 2003, han sido previamente descritas por Jaime Ceballos et al. (2009). RESULTADOS La observación al microscopio de las células epiteliales y el tejido conectivo de tegumento, branquias, esófago, estómago e intestino posterior, glándula antenal, órgano linfoide y músculo esquelético no mostró alteraciones histopatológicas que indicaran la presencia de alguna de las enfermedades investigadas. Las observaciones del tegumento (Fig. 1) muestran la cutícula, el epitelio cilíndrico y el tejido conectivo de epidermis subyacente sanos, sin la presencia de cuerpos de inclusión intranucleares o citoplasmáticos característicos de los procesos virales. Los cortes de branquias (Fig. 2a) no muestran lesiones en sus filamentos, entre las paredes cuticulares se desarrollaron procesos celulares típicos del epitelio columnar, no se observó necrosis ni otro tipo de alteraciones celulares. El tejido muscular esquelético (Fig. 2b) y el resto de los órganos evaluados no mostraron alteraciones celulares agudas o crónicas, cuerpos de inclusión o procesos de inflamación, fibrosis o necrosis que indiquen desarrollo de algún proceso patológico causado por enfermedades virales. 14

4 Fig. 1 Cutícula del exoesqueleto cefalotoráxico dividida en cuatro capas y el epitelio cilíndrico del tejido subcuticular en condiciones normales. Aumento 20X. Fig. 2 Panel A (izquierda): Filamentos branquiales secundarios no ramificados, con vasos aferentes y eferentes separados por el septum. Entre las paredes cuniculares desarrollan procesos celulares típicos del epitelio columnar. Aumento: 20X. Panel B (derecha). Sección transversal músculo esquelético de camarón compuesto por células alargadas formando miofilamentos. Aumento: 20X. En la figura 3, se muestra un gel de agarosa al 1,5 % teñido con bromuro de etidio, en el que se verifican las reacciones de PCR para la detección de los virus cuyo material genético es el ADN: IHHNV y WSSV. En los casos de todas las muestras se ven las bandas de control interno, de 243 pb en el primer caso y de 848 pb en el segundo. Obsérvese que en los pocillos donde se aplicó el producto amplificado correspondiente a la reacción de PCR para los controles positivos, se observan claramente las bandas especificadas anteriormente: 438 pb para IHHNV y 296 pb y 550 pb para la mancha blanca. Fig. 3 Electroforesis del gel de agarosa al 1,5 % teñido con bromuro de etidio de los productos de PCR con cebadores específicos para IHHNV (Panel A, izquierda) y para WSSV (Panel B, derecha) A: 1; 2; 3; 5 y 6: Muestras negativas. 7: Control positivo del kit IQ 2000 para IHHNV. 4: Control negativo del kit (trna de levadura). 8: Marcador de peso molecular del kit, con bandas de 848 pb, 630 pb y 333 pb. B: 1 y 10: Marcador de peso molecular del kit. 2; 3; 4; 7; 8 y 9: Muestras negativas con control interno de 848 pb. 6: Control negativo del kit (trna de levadura). 5: Control positivo del kit IQ 2000 para WSSV. 15

5 En la figura 4, se muestra un gel de agarosa al 1,5 % teñido con bromuro de etidio, en el que se verifican las reacciones de RT-PCR para la detección de los virus cuyo material genético es el ARN: YHV/GAV, TSV e IMNV. Observe en las líneas 6; 7; 14 y 21 los controles positivos para YHV, GAV, TSV e IMNV respectivamente. Fig. 4 Electroforesis en agarosa 1,5 % teñida con bromuro de etidio de los productos de la RT-PCR, a partir de RNA de branquias o pleópodos de Litopeneaus vannamei para detección de los siguientes virus RNA: YHV/GAV, TSV e IMNV. 1-5: Productos amplificados a partir de ARN aislado de branquias. 6: Control positivo de YHV. 7: Control positivo de GAV. 8; 15 y 22: Patrón de peso molecular del kit con bandas de: 848, 630 y 333 pb. 9-13: Productos amplificados a partir de ARN de pleópodos. 14: Control positivo para TSV : Productos amplificados a partir de ARN de pleópodos. 21: Control positivo para IMNV. En todos los casos los productos de PCR a partir del ARN de camarones fueron una región conservada utilizada como control interno de la reacción y no hubo amplificación de las bandas de los virus RNA analizados. En resumen, el criterio de negatividad para la presencia de los cinco virus en todas las muestras y réplicas analizadas y la positividad de los controles de los kits, así como la ausencia de signos patognomónicos en los análisis histológicos y en fresco, permite concluir que no han sido introducidos al país camarones infectados con virus desde el año 2003, y del mismo modo, todos los análisis de monitoreo han sido negativos para la presencia de BP, IHHNV, WSSV, YHV/GAV, TSV e IMNV. Este último, comenzó a pesquizarse en el 2007 en los muestreos periódicos, pues es el virus que afecta camarones peneidos más recientemente descubierto (Nunes et al., 2004; Lightner et al., 2004) y posteriormente comenzó a comercializarse el kit ( y en ese propio año fue listada la enfermedad como de declaración obligatoria por la OIE ( DISCUSIÓN Como ya se ha presentado a lo largo de este trabajo, en 2003 se realiza la primera introducción de L. vannamei procedente de un centro de cría y mejoramiento genético del camarón de la Florida, EE. UU. (Shrimp Improvement System, SIS, de sus siglas en inglés). Este centro comercializa larvas y reproductores libres de patógenos específicos (Shrimps Pathogen Free, SPF, de sus siglas en inglés), certificadas por el Laboratorio de Salud Animal de Organismos Acuáticos de la Universidad de Arizona. Desde entonces, se creó un sistema de vigilancia para mantener niveles adecuados de salud en estos cultivos, que incluye, además de la puesta a punto de los sistemas de diagnósticos necesarios, una capacitación constante del personal de trabajo de las camaroneras, así como de los investigadores que ejecutan proyectos relacionados con estas temáticas. Del mismo modo este programa vela por el cumplimiento de las medidas de bioseguridad en todas las instalaciones en las que se lleva a cabo (Silveira, 2006) y parte de la premisa de que los animales que entran están certificados como libre de los principales patógenos virales de declaración obligatoria por la OIE. Por su ubicación geográfica y los brotes de enfermedades que han conducido a pérdidas económicas importantes en América Latina, Cuba es susceptible a posibles entradas de los virus. Con excepción del virus del complejo de la Cabeza Amarilla (YHV/GAV), que hasta el momento no está reportado en nuestro hemisferio occidental, los otros cuatro de los que se habla en el presente trabajo, han provocado brotes de enfermedades o han sido encontrados en portadores crónicos sanos. Por ejemplo, el IHHNV está extendido por casi todo el mundo, tanto en camarón en cultivo como en poblaciones salvajes. En el Pacífico este se ha reportado desde Perú hasta México (Lightner & Redman, 1998a y b; Lightner, 1999), solamente en granjas de cría, al igual que en las islas del Pacífico como Hawai, Polinesia Francesa y Nueva Caledonia (Brock & Main, 1994). Particularmente en Cuba, Laria et al. (2004) detectaron este virus en el camarón de cultivo L. schmitti, con una metodología similar a la 16

6 utilizada en este trabajo, aunque con un kit comercial de la firma DiagXotics Inc. Ellos plantean, sin embargo, que en la población de origen de los animales analizados no se presentaba ninguna deformidad o cualquier signo característico que pudiera indicar la presencia del agente. En la fase crónica de la enfermedad, las altas mortalidades son inusuales, pero hay una disminución significativa del crecimiento y son comunes las deformidades cuticulares, especialmente del rostrum (Ligthner, 1999). No obstante, en Litopenaeus vannamei, para los niveles de prevalencia ya descritos, no se ha detectado el IHHNV. Con respecto a Baculovirus penaei, reportado previamente en Cuba en L. schmitti, no se ha encontrado en L. vannamei ni en los muestreos periódicos ni en las cuarentenas, a pesar de que esta especie foránea también es susceptible a este patógeno. Indiscutiblemente las medidas de bioseguridad aplicadas en las granjas camaroneras, especialmente el cuidado en la larvicultura ha posibilitado la no infección. La enfermedad de las Manchas Blancas, producida por el virus homónimo, ha arrasado en todo nuestro continente, produciendo grandes mortalidades en muchas regiones de América del Norte, Central y del Sur (Global Aquaculture Alliance, 1999; OIE, 2009). Este virus, además, tiene múltiples hospederos que pueden portarlo de manera asintomática, tales como rotíferos, bivalvos, gusanos poliquetos, copépodos y crustáceos no decápodos como Artemia salina (Chang et al., 2002). De manera que su temprana detección en los camarones de cultivo es una medida importante para la biocontención de la enfermedad en caso de que existiera, y del mismo modo el análisis de los alimentos que consumen estos animales en cultivo. El virus del Taura se reconoció por primera vez en Ecuador (Jiménez, 1992) en P. vannamei cultivado y a partir de ahí se diseminó mayormente en los cultivos en EE. UU., Hawaii y al igual que el IHHNV, por la costa del Pacífico, desde Perú hasta México. También se ha reportado en algunas poblaciones salvajes en la costa del Pacífico que no incluyen el Caribe y Golfo de México (Tang & Lightner, 2005). Por último, la mionecrosis infecciosa también tuvo su primer brote en América, en este caso en el noreste de Brasil (Nunes et al., 2004; Lightner et al., 2004) aunque el resto de sus localizaciones corresponden al continente asiático (Saengchan et al., 2007). Por otra parte, son imprescindibles los pesquisajes de las cuarentenas y el análisis de los proveedores exigiéndose siempre pruebas de laboratorio y documentos que demuestren que los animales están verdaderamente libres de patógenos. El virus del Taura fue introducido en China Taipei en 1999, mediante animales infectados provenientes de América Central y del Sur, y a partir de ahí se diseminó a la República Popular de China, Tailandia, Malasia e Indonesia (Yu & Song, 2000; Nielsen et al., 2005). De esta manera, como se han reportado brotes de enfermedades causadas por estos virus de crustáceos en países cercanos e incluso, en el país de origen de los animales importados por nuestro país, se hace imprescindible continuar realizando este trabajo para garantizar la salud de los cultivos en Cuba de L. vannamei y, por consiguiente, no convertirnos en posibles exportadores de alguna de estas enfermedades para el área del Caribe. REFERENCIAS Brock, J. A. & Main, K. (1994). A guide to the common problems and diseases of cultured Peneaus vannamei. Oceanic Institute, Makapuu Point, P.O. box 25280, Honolulu, Hawai, EE. UU., 241 pp. Chang, Y. S., Lo, C. F., Peng, S. E., Liu, K. F., Wang, C. H. & Kou, G. H. (2002). White spot syndrome virus (WSSV) PCR-positive Artemia cysts yield PCRnegative nauplii that fail to transmit WSSV when fed to shrimp postlarvae. Dis. Aquat. Org., 49, Couch, J. A. (1974). An enzootic nuclear polyhedrosis virus of pink shrimp: ultraestructure, prevalence and enhancement. J. Invert. Pathol., 24, Tomado de E. Fajer, Y. Noriega, D. Menéndez & M. T. Frías (1998). Prevalencia de Baculovirus penaei PsSOV Bonami (antes BP) en camarones peneidos cubanos silvestres. Veterinaria México, 29 (2). Cruz, Y. & Laria, L. R. (2006). Presencia de partículas semejantes a Reovirus en nauplios de Litopenaeus vannamei. CIVA ( Cruz, Y., Silveira, R. & González, N. (2004). Hepatopancreatitis por parvovirus (HPV) en Litopenaeus schmitti de cultivo en Cuba. Comunica-ción Científica. CIVA ( Civa2004.org), pp Fajer, E., Noriega, Y., Menéndez, D. & Frías, M. T. (1998). Prevalencia de Baculovirus penaei PsSOV Bonami (antes BP) en camarones peneidos cubanos silvestres. Veterinaria México, 29 (2). Global Aquaculture Alliance (1999). Shrimp white spot virus confirmed in Central America. GAA Newsletter, 2 (2). Global Aquaculture Alliance (1999). Shrimp white spot virus confirmed in Latin America an update. GAA Newsletter, 2 (3). (Farming Intelligene Tech. Corp.) Jaime, B., Cabrera, J. E., Guerra, M., Isla, M., Artiles, A., Aguila, J. C. et al. (2009). Introducción del Camarón Blanco del Pacífico Litopenaeus vannamei en Cuba: Puntos críticos identificados durante la etapa de cuarentena. ColacMarCuba, XIII Congreso 17

7 Latinoamericano de Ciencias del Mar, VIII Congreso de Ciencias del Mar, La Habana, Cuba. Jimenez, R. (1992). Síndrome de Taura (Resumen). En Acuacultura del Ecuador. Cámara nacional de Acuacultura. Guayaquil. Ecuador, Laria, L. R., Cruz, Y., Silveira, R. & González, N. (2004). Detección del Virus de la Necrosis Hipodérmica y Hematopoyética Infecciosa (IHHNV) en el Camarón de cultivo Litopenaeus schmitti en Cuba. Comunicación Científica. CIVA ( org), pp Lightner, D. V. (1999). The peneaid shrimp viruses: TSV, IHHNV, WSSV and YHV: current status in the Americas available diagnostic methods and management strategies. J. Appl. Aquaculture, 9, Lightner, D. V. (2005). Biosecurity in shrimp farming: pathogen exclusion trough use of SPF stock and routine sourveillance. J. World. Aquaculture Soc., 36, Lightner, D. V. & Redman, R. M. (1998a). Shrimp diseases and current diagnostic methods. Aquaculture, 164, Lightner, D. V. & Redman, R. M. (1998b). Strategies for the control of viral diseases of shrimp in the Americas. Fish Pathol, 33, Lightner, D. V., Pantoja, C. R., Poulos, B. T., Tang, K. F. J., Redman, R. M., Pasos de Andrade, T. et al. (2004). Infectious myonecrosis: new disease in Pacific white shrimp. Global Aquaculture Advocate, 7, 85. Nielsen, L., Sang Oum, W., Cheevadnarak, S. & Flegel, T. W. (2005). Taura syndrome virus (TSV) in Thailand and its relationship to TSV in china and the Americas. Dis. Aquat. Org, 63, Nunes, A. J. P., Cunha, P. & Vasconselos, T. C. (2004). Carcinicultura ameac ada. Rev. Panoram. Aquic., 83, [En portugués] OIE sitio web: (Consultado en 2009). Sambrook, J. & Russell, D.W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, the third edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Silveira, R. (2006). Informe de país: Sanidad acuícola en Cuba. Primera Reunión del Comité Interamericano de la OIE de Sanidad de los Animales Acuáticos. Ciudad de Panamá, República de Panamá. es_acuaticos_reunion_panama_ presentaciones. htm Saengchan, S., Phewsaiya, K., Briggs, M. & Flegel, T. W. (2007). Outbreaks of infectious myonecrosis virus (IMNV) in Indonesia confirmed by genome sequencing and use of an alternative RT-PCR detection method. Aquaculture, 266, Tang, K. F. J. & Ligthner, D. V. (2005). Phylogenetic analysis of Taura Syndrome virus isolates collected between 1993 and 2004 and virulence comparison between two isolates representing different genetic variants. Virus Research, 112, Tizol, R., Jaime, B., Laria, R., Pérez, L., Machado, R. & Silveira, R. (2004). Introducción en Cuba del camarón blanco del Pacífico L. vannamei. Etapa I Cuarentena. Ocean Docs. Yu, C. I. & Song, Y. L. (2000). Outbreaks of Taura syndrome in Pacific White shrimp Penaeus vannamei cultured in Taiwan. Fish. Pathol., 32,