Aspectos prácticos de la validación e incertidumbre en medidas químicas

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2 Aspectos prácticos de la validación e incertidmbre en medidas qímicas

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4 Aspectos prácticos de la validación e incertidmbre en medidas qímicas Ricardo Crbellati - Cecilia D. Di Risio (Editores) COMITÉ EDITORIAL alidación de Métodos Analíticos: - María Lisa Castro de Esparza (Perú) - Cladia Campos (Colombia) - Saúl Peñaranda (Colombia) - Ssana Casas (Chile) - Yamileth Astorga (Costa Rica) - Aída Álvarez Alonso (Cba) - Francesc entra Amat (España) - Patricia Simone (Urgay) Cálclo de Incertidmbre: - Ricardo Crbellati (Argentina) - Cecilia Di Risio (Argentina) - Wilson Beita (Costa Rica) - Norma Ramírez (México) - Cladia Cordero (Gatemala) - Dalys Rovira (Panamá) - Rita Rodrígez Medina (Paragay) Area de Desarrollo Sostenible 009

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6 Aspectos prácticos de la validación e incertidmbre en médidas qímicas / Ricardo Crbellati... [et.al.]. - 1a ed. - Benos Aires : Ciencia y Tecnología para el Desarrollo - CYTED, p. ; 1x14 cm. ISBN Aga.. Sístemas de Redes. 3. Calidad del Aga. I. Crbellati, Ricardo CDD Diseño y compaginación: Editores: Ricardo Crbellati y Cecilia D. Di Risio Imprenta: CCC Edcando Av. Warnes 361/5 (1417) Capital Federal Con na tirada de 00 ejemplares Impreso en Argentina Qeda hecho el depósito qe previene la ley ISBN No se permite la reprodcción total o parcial, de este libro, ni s almacenamiento en n sistema informático, ni s transmisión en calqier forma o por calqier medio, electrónico, mecánico, fotocopia otros métodos, sin el permiso previo del editor.

7 Prefacio En el mes de enero de 005 inició ss actividades la Red Iberoamericana de Laboratorios de Calidad de Agas, dentro del Área de Desarrollo Sostenible del Programa CYTED. Esta pblicación cierra n ciclo, ya qe la Red está finalizando ss actividades, y representa n esferzo qe intenta conjgar na parte de las múltiples actividades realizadas, y na de las más provechosas de todas ellas. En la última actividad de la Red realizada en la cidad de Csco, Perú, se ha realizado n Taller qe ha logrado resmir las experiencias de toda esta frctífera etapa de trabajo, y en él se propso la realización de esta Gía, sobre la base del material presentado y el aportado posteriormente por los distintos integrantes del Comité Editorial. A lo largo de estos frctíferos catro años de trabajo, y a través de las reniones de coordinación, crsos, talleres, jornadas, la temática relacionada con la validación y el cálclo de incertidmbre en las mediciones ha sido objeto de discsiones y aportes diversos. Inclso en la actalidad, es n tema no del todo reselto, ya qe son mchas las acepciones y las formas de enfrentarlos en los laboratorios de la Región. Se ha qerido cerrar las actividades de la Red tratando de realizar n aporte sobre esta problemática a la qe nos vemos expestos como sarios. Es por ello qe esta pblicación no intenta ser na gran enciclopedia, sino na gía práctica de aplicación, para qe peda ser útil y aplicable en el trabajo cotidiano de los laboratorios de análisis de agas, tanto como en otros laboratorios de análisis. Es también intención del presente trabajo realizar n aporte en el campo de la docencia práctica en este tema, a nivel niversitario. No se pretende qe s contenido sea exclyente, y es de destacar qe representa el frto de catro años de discsiones y de experiencia volcados en estas páginas, qe los atores consideran

8 alidación e incertidmbre en medidas qímicas 7 n aporte valioso para todos los potenciales sarios, y qe se espera peda aplicarse con provecho. Como no de los editores de esta obra, y como Coordinador de la Red, qiero agradecer todas las contribciones para este libro, y espero qe el material presentado sea n aporte para mejorar este aspecto metodológico tan importante en el trabajo de los laboratorios qímicos de análisis. Ricardo Crbellati Coordinador Internacional - RILCA Red Iberoamericana de Laboratorios de Calidad de Agas Área Desarrollo Sostenible - Programa CYTED

9 Prólogo En este libro se abordan dos temas relacionados con no de los más importantes aspectos en lo relativo a la calidad de la información generada por n laboratorio de análisis qímico: la validación de los métodos tilizados, y la forma expresión de los resltados, esto es, el cálclo de incertidmbre en las medidas realizadas. En el Taller Iberoamericano sobre alidación y Cálclo de Incertidmbres, realizado del 14 al 17 de octbre de 008 en la Universidad San Antonio Abad en Csco, Perú, este tema fe disctido por representantes de laboratorios de diferentes países de Iberoamérica, y srgió la inqietd de prodcir na gía práctica para niformar los criterios en canto a los procedimientos de validación y en canto a la expresión de resltados y cálclo de incertidmbres. Si bien se dispone de profsa información bibliográfica, la realidad demestra (por ejemplo, en las participaciones en ensayos interlaboratorio), qe distintos laboratorios selen tilizar criterios no niformes para abordar estos temas. También hay otros, especialmente los no dedicados únicamente al análisis de mestras como actividad principal (por ejemplo, los qe desarrollan ss tareas en las Universidades), qe se enfrentan a la necesidad cada vez más creciente de demostrar qe s información es de la calidad adecada para el so previsto. Uno de los objetivos básicos del material presentado en este libro es ofrecer gías tendientes a la homogeneización de las metodologías de cálclo entre los laboratorios qe han participado en el Proyecto de la Red Iberoamericana de Laboratorios de Calidad de Agas (RILCA-CYTED), y tratar de promover s so en otros laboratorios de la región, a fin de lograr qe la información prodcida por diferentes laboratorios qímicos sea de calidad y comparable. Este libro está organizado en dos grandes secciones, na relacionada con la validación y la otra con el cálclo de incertidmbres. En ambas, se ha dado énfasis a los casos prácticos, considerando el día a día del qehacer en el laboratorio, en el cal

10 alidación e incertidmbre en medidas qímicas 9 debe estar claro para el analista o el responsable de calidad, qé parámetros debe estdiar de n método a fin de proceder a s validación, qé mediciones debe realizar para asegrar el cálclo de s incertidmbre, y qé docmentación básica debe generar y poseer registrada a fin de trabajar en condiciones qe garanticen la calidad de ss resltados. Todas las referencias bibliográficas básicas y de conslta han sido mencionadas en la sección correspondiente, ya qe, salvo algnos casos específicos, no se desarrollan exhastivamente los principios de las metodologías de cálclo, sino qe se hace énfasis en los procedimientos prácticos a aplicar. En ese sentido, se ha preferido explicar detenidamente qé se debe hacer ante n caso particlar (n cálclo de límites de detección para na determinación en particlar, el desarrollo de n procedimiento normalizado de operación, na expresión para la incertidmbre en n dado método de análisis qímico), y, más qe referirse a los docmentos generales, se ha optado por ejemplificar con sitaciones cotidianas en el trabajo del laboratorio. Como marco general, se ha desarrollado brevemente el concepto de validación de los métodos de análisis, y cáles se ha considerado qe son las características básicas a evalar cando se procede a la validación de n método. En el caso del cálclo de incertidmbres, se presentan los dos tipos de metodologías actalmente tilizadas, la del criterio Erachem, y la qe promeve el cálclo de incertidmbres basándose en los datos obtenidos en la validación previa del método; en ambos casos, se presentan también ejemplos prácticos de aplicación, con datos reales obtenidos en diferentes laboratorios. Esperamos qe este material sea útil para el trabajo en los laboratorios de análisis, y peda contribir, ofreciendo na metodología sencilla y explicada con ejemplos concretos, a qe más y más laboratorios en los cales se prodcen datos analíticos, pedan amentar s propia confianza en los resltados qe obtienen, y ofrecer así información cada vez de mayor calidad. Ricardo O. Crbellati Cecilia D. Di Risio

11 Índice 1 INTRODUCCIÓN 11 LA ALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS 15.1 Aspectos Generales 15. Características a Evalar 0.3 Ejemplo 1: Procedimiento Normalizado de Operación 33.4 Ejemplo : Cálclo del Límite de Detección para la determinación volmétrica de clorro 41.5 Ejemplo 3: alidación de n Método Cromatográfico 51.6 Ejemplo 4: Cálclo de Límites de Detección para la determinación de plomo y otros metales por técnicas de espectrometría atómica 58.7 Ejemplo 5: Estimación del Límite de Detección para Métodos Cantitativos Microbiológicos 63 3 INCERTIDUMBRE EN MEDICIONES QUÍMICAS Aspectos Generales Cálclo de Incertidmbre mediante el criterio Erachem Ejemplo 6: Cálclo de incertidmbre para métodos gravimétricos (Erachem) Ejemplo 7: Cálclo de incertidmbre para métodos volmétricos (Erachem) Cálclo de Incertidmbre en base a la información obtenida en la alidación Ejemplo 8: Cálclo de incertidmbre asociada a la determinación de cromo tilizando n material de referencia certificado Ejemplo 9: Cálclo de la incertidmbre asociada a la determinación de plomo por comparación con n método de referencia BIBLIOGRAFÍA Y FUENTES DE INFORMACIÓN 139 Pág.

12 1.- INTRODUCCIÓN Actalmente, en todo el mndo se realizan millones de determinaciones analíticas, donde se obtienen datos acerca de diferentes matrices y materiales: alimentos, textiles, materiales de constrcción, etc. Los valores obtenidos son my importantes para el comercio y también se relacionan con la vida y sald de la hmanidad (calidad del aga, del aire y del selo, procesos de contaminación, protección general del medio ambiente, investigaciones criminales en análisis forenses y otros mchos ejemplos). Básicamente, estamos hablando de determinaciones costosas, no sólo por ellas en sí, sino por las decisiones qe se toman a partir de ss resltados. Así, es bien sabido qe n peqeño error en el contenido de na sstancia en n dado prodcto pede traer cantiosas pérdidas si el error es por defecto, o grandes reclamos si el mismo es por exceso. Y en lo relacionado a la protección de la sald y el medio ambiente, los errores peden ser tan graves como para comprometer la vida de las personas. Es por eso qe, en todo el mndo, hay na creciente inqietd acerca de la forma de realizar las determinaciones analíticas, lo qe implica cada vez mayores esferzos a fin no sólo de llevarlas a cabo correctamente, sino de qe se peda demostrar qe los resltados obtenidos son confiables. Cando na mestra llega a n laboratorio, se spone qe ha sido enviada porqe el laboratorio posee la experiencia y experticia necesaria para entregar n resltado real, o sea, apropiado para el so previsto. Por esa razón, calqier laboratorio debe ser capaz de presentar ss resltados de forma tal qe la persona qe va a tilizarlos los peda comprender y obtener de ellos las conclsiones correctas para elcidar el problema qe ha llevado a qe la mestra sea analizada. Normalmente, los clientes no conocen las características de los métodos de análisis, y por qé son aplicables a la resolción del problema presentado. Los procedimientos de validación son los qe permiten a los

13 1 alidación e incertidmbre en medidas qímicas laboratorios demostrar qe ss métodos de análisis son los adecados para cada sitación concreta. Todo lo anterior está basado en el spesto de qe la mestra empleada es apropiada para evalar el problema qe se desea resolver. Una de las propiedades analíticas spremas es la representatividad de la mestra, y ésta tiene s soporte en el mestreo adecado. Es na tarea difícil qe reqiere mcha experiencia, y na clara compresión del problema y de s conexión con la qímica; por ejemplo, en el caso de los análisis de agas, mchos laboratorios ofrecen el servicio de toma de mestras, en el conocimiento de qe ese paso es fndamental para garantizar qe los datos analíticos entregados (qe peden ser my benos desde la óptica interna del laboratorio) pedan ser útiles y legalmente aceptables para evalar la sitación real qe da origen a la llegada de la mestra al laboratorio. Para qe n método se considere adecado para brindar información útil acerca de calqier problema analítico, deben determinarse las características de ese procedimiento, y debe además estimarse la incertidmbre del resltado brindado. Actalmente, es cada vez más importante qe los resltados de na medición analítica se expresen con s respectiva incertidmbre, como lo establece la norma ISO Según la Gía ISO la incertidmbre es na estimación nida al resltado de n ensayo qe caracteriza el intervalo de valores dentro de los cales se afirma qe está el valor verdadero. Esta definición presenta la dificltad filosófica de qe el valor verdadero no pede conocerse, ante lo cal reslta útil la definición planteada por el ocablario Internacional de Metrología (IM): la incertidmbre es n parámetro asociado al resltado de na medida, qe caracteriza la dispersión de valores qe peda ser razonablemente atribido al mensrando (el mensrando es la magnitd sjeta a medida, lo qe en análisis qímicos corresponde a la concentración del analito o a la propiedad qe se está determinando). La incertidmbre proporciona entonces na idea de la calidad del resltado, ya qe

14 alidación e incertidmbre en medidas qímicas 13 indica cánto pede alejarse n resltado del valor considerado como valor verdadero. En algnos sectores de la qímica analítica existe además n reqisito formal, generalmente legislativo, para qe los laboratorios introdzcan el asegramiento de calidad de las mediciones, de manera de asegrar qe ellos son capaces de proporcionar los datos con la calidad reqerida. El asegramiento de la calidad inclye el so de métodos de análisis validados, el so de procedimientos internos definidos de control de calidad, la participación en ensayos de aptitd, la acreditación según ISO , y el establecimiento de la trazabilidad de los resltados de las mediciones. Históricamente en el trabajo en Qímica Analítica, ha existido gran énfasis en la precisión de los resltados obtenidos sando n método especificado, más qe en s trazabilidad a patrones obtenidos. Esto ha llevado al so de métodos recomendados (oficiales, estandarizados, etc.), para cmplir con los reqisitos legislativos y comerciales. Sin embargo, como existe n reqisito formal para establecer la confianza de los resltados, es esencial qe el resltado de la medición sea trazable a n patrón definido, tal como na nidad SI, n material de referencia o, cando es aplicable, a n método definido o empírico. El concepto de trazabilidad complementa el concepto de exactitd (CITAC/EURACHEM 000). La trazabilidad se define formalmente como "la propiedad del resltado de na medición qe consiste en qe se peda establecer el resltado previsible de s comparación directa con los patrones apropiados, por lo general, nacionales o internacionales, por medio de na cadena ininterrmpida de comparaciones reales". Básicamente, esto significa qe es posible, dado n resltado obtenido, conectarlo con na referencia acreditada. Aqí srge la cestión de la distinta concepción de la trazabilidad, según se haga referencia a mediciones físicas o qímicas, ya qe se debe demostrar qe es posible hacer análisis qímicos trazables, debido a qe normalmente na medición qímica en calqier laboratorio implica la realización de más de na etapa independiente, y eso lo

15 14 alidación e incertidmbre en medidas qímicas diferencia de, por ejemplo, n proceso de medida donde sólo intervienen magnitdes físicas. La forma práctica de comprobar la trazabilidad es comparar los resltados entre laboratorios, y para ello, la comparación debe realizarse tilizando métodos normalizados. Aqí se recrre a lo qe en el caso de magnitdes físicas sería la comparación con n patrón, trabajando con materiales de referencia certificados. En esta breve síntesis inicial, se han abordado y definido los tres grandes conceptos qe hacen, hoy en día, a la calidad de la información generada por n laboratorio qímico: la validación de los métodos, la incertidmbre de las mediciones, y la trazabilidad de los resltados obtenidos. Estos serán explicados con más detalle en las sigientes secciones, haciendo énfasis en la aplicación práctica para diferentes casos particlares. Es importante remarcar, como conclsión final, qe para obtener trazabilidad es necesario proceder a la validación de los métodos de medida qe se desarrollan en los laboratorios. El proceso de validación de los métodos implica el conocimiento profndo de na determinada serie de características operativas de los mismos, qe debe ser estdiada en detalle en cada laboratorio, a fin de garantizar la calidad de los resltados. Los más prestigiosos atores remarcan qe, para garantizar condiciones adecadas de calidad, el primer cidado del analista qímico es cerciorarse de qe ss resltados se encentran bajo control estadístico. Esto implica conocer y manejar adecadamente los conceptos básicos de la estadística descriptiva. A lo largo de los diferentes ejemplos desarrollados en este libro, los mismos se irán definiendo y tilizando en forma práctica.

16 .- LA ALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS.1- ASPECTOS GENERALES Según la literatra especializada la validación pede definirse como: Un proceso para establecer las características y limitaciones de n método analítico y para identificar las inflencias qe peden modificar esas características y en qé medida. Un proceso para verificar qe n método es apropiado para n propósito, es decir para ser tilizado para resolver n problema analítico particlar. El proceso de validación debe poder contestar estas pregntas: Qé analitos peden ser determinados, en qé matrices y en presencia de qé interferentes? Dentro de estas condiciones, qé niveles de exactitd y precisión peden ser alcanzados? La alidación es la confirmación mediante examen y entrega de evidencia objetiva de qe se cmplen los reqisitos particlares para n so previsto específico. La alidación de n método de ensayo es la demostración de qe n método de ensayo es apto para n so previsto. En la práctica, qe n método analítico sea adecado para n determinado propósito se determina mediante estdios de validación, y éstos proporcionan información sobre el procedimiento completo y sobre la inflencia de factores individales, de tal forma qe peden ser aplicados además a la estimación de la incertidmbre asociada con los resltados de los métodos en so. Los métodos de validación de los procedimientos analíticos están my estrechamente vinclados a los métodos de desarrollo de dichos procedimientos y a veces no es posible

17 16 alidación e incertidmbre en medidas qímicas determinar exactamente dónde termina el desarrollo del método y dónde comienza la validación. La mayoría de las características de los métodos asociados a los procesos de validación han sido de hecho evaladas, al menos aproximadamente, en el desarrollo del método. Un procedimiento debe ser validado en mayor o menor extensión cando: se desarrolla n método nevo para resolver n problema particlar; n método establecido se modifica para incorporar mejoras o extenderlo a n nevo problema; el control de calidad indica qe n método establecido está cambiando con el tiempo; n método establecido se sa en n laboratorio diferente, o con diferentes analistas o instrmentación; se pretende demostrar la eqivalencia entre dos métodos, no nevo y no estándar. Es preciso aclarar qe aún cando el procedimiento analítico haya sido aceptado sin cambios de na fente reconocida (como scede típicamente, por ejemplo, con los procedimientos estandarizados para los laboratorios de calidad de aga), y posea na docmentación de validación apropiada, no reslta recomendable asmir qe la misma se ajsta a las condiciones del Laboratorio sin antes comprobar y garantizar, con todas las acciones necesarias, qe el laboratorio es capaz de alcanzar los niveles de aptitd declarados en el procedimiento. Diseño de la validación Para qe los resltados de la validación sean confiables ante calqier cliente, inclidos los Órganos Internacionales, Regionales y Nacionales de Acreditación, los diseños empleados deben ajstarse a algna de las gías y/o docmentos técnicos emitidos por Institciones, Comités y/o pblicaciones reconocidas internacionalmente. En este sentido se han redactado gías, metodologías y otros docmentos técnicos en el campo del análisis

18 alidación e incertidmbre en medidas qímicas 17 de los alimentos y de prodctos farmacéticos, qe abordan los aspectos vinclados al proceso de medición en s conjnto de manera amplia y rigrosa. En el campo del análisis de aga (indstrial, de consmo hmano y agas residales) las referencias docmentales más tilizadas tratan el tema de na manera más general, sin profndizar en el mismo. Es de señalar qe, sin estar vincladas a n campo de análisis en específico, las gías de EURACHEM y de IUPAC consideran las sitaciones qe en general peden presentarse en n laboratorio de ensayo. Lo cierto es qe independientemente de la rama con la qe están vincladas las entidades qe han emitido calqiera de los docmentos anteriormente mencionados, éstos son aplicables en calqier campo del análisis, haciendo las consideraciones y ajstes necesarios. Es importante tener en centa además, qe antes de emprender n proceso de validación es preciso asegrar qe el eqipamiento a emplear posee la calibración reqerida, los insmos (reactivos, materiales consmibles, etc.) se corresponden con las especificaciones establecidas, y qe el personal qe llevará a cabo tanto la parte experimental como la interpretación de los datos, posee la experiencia adecada. Alcance de la validación El alcance de la validación de n procedimiento introdcido en rtina dependerá de cán completo fe el proceso de desarrollo del procedimiento, de la natraleza de los cambios realizados na vez aplicado éste y de la confiabilidad de la fente de la qe fe tomado. Algnas recomendaciones generales al respecto se dan en la literatra especializada. El alcance de la validación debe ser establecido sobre la base de n adecado compromiso entre costo y rigor: o sea, tratando de minimizar la cantidad de trabajo experimental

19 18 alidación e incertidmbre en medidas qímicas reqerido para obtener la información necesaria con na confiabilidad aceptable. Existe profsa literatra sobre los métodos de validación mediante estdios interlaboratorios. Están además disponibles n gran número de protocolos y otras pblicaciones relacionados con este tipo de validación. Estos resltan los métodos de validación más completos y proporcionan la mayor cantidad de información sobre los procedimientos analíticos. Por eso, cando n método es desarrollado para n amplio so, como ocrre con los procedimientos estándar, es imprescindible este tipo de validación. No obstante, en la vida normal de n Laboratorio esto no siempre es posible. Los métodos qe aplica el Laboratorio peden no tener na amplia aplicación en otros Laboratorios: esto pasa frecentemente en los laboratorios indstriales, qe se enfrentan a la realidad de qe no existen otros laboratorios interesados en participar en este tipo de ensayos. En esos casos peden ser empleados los métodos de validación en n sólo Laboratorio, los comúnmente denominados métodos de validación in hose. Qe la validación en n único laboratorio peda ser aceptada para fines oficiales depende de las disposiciones de cada área con respecto a las mediciones específicas de qe se trate. Esto pede ser establecido por los organismos regladores mediante ss políticas. Un ejemplo de este hecho son las disposiciones de los regladores de las agas potables en Inglaterra donde tales validaciones están permitidas, bajo ciertas restricciones. Basándonos en esto, se pede recomendar, para los Laboratorios de Calidad del Aga, na validación en diferentes etapas: n diseño de validación dentro del laboratorio ( in hose ). n diseño gradal de validación en tres etapas: dentro del laboratorio; con no o dos laboratorios externos y finalmente n estdio interlaboratorio. En general, el reconocimiento oficial de n método reqiere na caracterización basada en estdios interlaboratorios apropiados.

20 alidación e incertidmbre en medidas qímicas 19 El alcance de la validación implica definir: Características de las mestras (matriz). En el ejemplo de la matriz aga, deberá especificarse por ejemplo: potable, so indstrial, eflentes de desecho, etc. Tipo de información: cantitativa y/o calitativa. Reqerimientos del cliente sobre la calidad de los resltados (en el ejemplo, estas son salmente las Normas de Calidad de Aga de aplicación local). Condiciones del laboratorio (hay qe definir si se van a emitir resltados aplicando el procedimiento en no o varios eqipos, en n mismo laboratorio o en laboratorios diferentes, y entonces es obvio qe el diseño deberá tener en centa tales circnstancias). Los parámetros a evalar y ss valores críticos de acerdo a los reqerimientos establecidos. Sele sceder qe el cliente establece reqerimientos en costo y tiempo y no en términos de confiabilidad de los resltados; esto qeda entonces a criterio del Laboratorio, en cyo caso éste deberá establecerlos sobre la base de las posibilidades de los procedimientos disponibles. Los métodos estándar qe están disponibles feron desarrollados y validados, sin embargo algnas veces no inclyen todas las características del método, por ejemplo la calibración. Por eso, estos métodos deben ser considerados como métodos recomendados de base, y partir de allí cada método debe adaptarse y validarse a las condiciones de cada laboratorio. Esta Gía se ha fndamentado en presentar los reqerimientos necesarios para evalar y validar en n Laboratorio aqellos procedimientos analíticos qe están basados en métodos recomendados, ya sean normalizados, estandarizados o pblicados por organismos de reconocido prestigio internacional (EPA, ASTM; TAPPI, AOAC, etc.).

21 0 alidación e incertidmbre en medidas qímicas.- CARACTERÍSTICAS A EALUAR En esta gía se ha acordado qe para validar n método, se deben evalar las sigientes características: Selectividad/Especificidad Aún cando los términos se han empleado indistintamente, la selectividad sele ser el término más apropiado para definir el grado en qe n procedimiento pede determinar con exactitd n analito en presencia de dos o tres componentes en na matriz dada. La selectividad se evalúa de forma práctica estdiando las interferencias de mayor potencialidad a partir del conocimiento de la composición promedio de la matriz de las mestras a analizar, las referencias al respecto y la propia experiencia del analista. La selectividad de n método se investiga salmente estdiando s habilidad de medir el analito de interés en na mestra a la qe se han añadido posibles interferentes deliberadamente. Cando no es posible definir claramente qé interferentes están presentes, la selectividad del método pede ser investigada comparando los resltados del método qe se evalúa con los obtenidos por otro método o técnica independiente. También debe considerarse otro tipo de selectividad cando n analito pede existir en la mestra en más de na forma: inorgánico organometálico, con diferentes grados de oxidación, etc., lo qe comúnmente se conoce como especiación del analito en cestión. Salvo na sitación imprevista, los estdios de selectividad para na matriz específica se realizan en la fase de desarrollo del procedimiento. Ejemplos de pérdida de selectividad peden darse en HPLC ó CI con la presencia de picos impros con señales de más de n compesto, sin qe pedan ser discriminados por el sistema de detección. Para mencionar otro ejemplo, también

22 alidación e incertidmbre en medidas qímicas 1 deben estdiarse las interferencias espectrales qe peden ocrrir en ICP para n ancho de banda dado siempre qe las relaciones de concentración interferente/analito sean lo sficientemente significativas, de otro modo no es posible garantizar la selectividad del método. Esta es na característica my importante, qe es necesario evalar aún cando se trabaje con n método recomendado y de amplia difsión, ya qe pede haber ligeras diferencias en las matrices a tilizar qe provoqen interferencias y lleven a resltados poco confiables. Robstez La robstez de n procedimiento analítico es na medida de s capacidad de permanecer inalterado ante peqeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método (cambios en na o más de las condiciones de trabajo); se dice qe n método es robsto cando se pede demostrar s invariabilidad drante el so normal. Cando se estdia esta característica de n método analítico, peden ser determinadas las variables con efectos más significantes sobre el método y además definir las formas de controlarlas drante s so. La robstez sele ser estdiada por los Laboratorios qe elaboran n método antes de entrar en estdios con otros Laboratorios, y es necesario evalarla cando no se ha considerado validar n método recomendado. Linealidad Se define como la relación lineal entre la señal y la concentración del analito. Para los métodos cantitativos es necesario conocer el rango de concentraciones del analito o valores de la propiedad en qe se basa el método sobre el cal el método pede ser aplicado. Generalmente se habla del rango en la solción de trabajo más qe en la mestra original, anqe mchas veces reslta cómodo también referirlo a la mestra de origen para

23 alidación e incertidmbre en medidas qímicas poder saber si en verdad se han cmplido los objetivos deseados. En el extremo inferior del rango de concentraciones, los factores limitantes son los límites de detección o cantificación, de los qe hablaremos más adelante. En el extremo sperior las limitaciones están dadas por las características de la respesta del instrmento. Dentro del ámbito de trabajo generalmente existe n rango de respesta lineal, dentro del cal habrá na relación lineal entre la señal y la concentración del analito o el valor de la propiedad qe se mida. Los cálclos de la regresión (como los coeficientes de correlación R ) selen ser insficientes para demostrar la linealidad del gráfico de calibración, y en general de calqier tipo de ajste. Para ello es preferible n análisis visal o el análisis de los residos. En general para comprobar la linealidad se reqiere de al menos 10 pntos. La evalación del rango de trabajo y el rango lineal son también importantes a la hora de planificar el grado de calibración reqerido para los métodos de rtina. Es aconsejable también investigar la varianza a través del rango de trabajo. Dentro del ámbito lineal, n pnto de calibración pede ser sficiente para establecer la pendiente del gráfico de calibración. Para establecer el rango de trabajo se reqiere en cambio de varios pntos, preferiblemente 6 ó más. La relación entre la respesta del instrmento y la concentración no tiene qe ser necesariamente lineal para qe el método sea efectivo, pero la crva debe ser repetible de n día a otro. El eqipamiento moderno permite tener na visalización rápida del proceso de calibración, lo qe facilita la determinación del rango de trabajo y el rango lineal. La figra mestra el gráfico de calibración obtenido en n ICP-OES.

24 alidación e incertidmbre en medidas qímicas 3 Límite de detección (LD) La posibilidad de detectar n cierto parámetro en na mestra depende del método recomendado, la calibración del método y del eqipo verificado. Cando las mediciones se realizan a niveles bajos del analito o propiedad qe se mida, en el análisis de trazas, es importante conocer cál es el límite inferior del analito o propiedad qe pede ser detectado con certeza por el método. Anqe se trata de n término my polémico y existen diversas denominaciones para el mismo: ISO mínima concentración neta detectable, IUPAC mínimo detectable valor verdadero, para los fines de la validación es sficiente na indicación del nivel a partir del cal la detección se velve problemática, para ello el valor del blanco + 3,3 s es na medida apropiada. Para calclarlo se toman no menos de 10 réplicas (a) del blanco o (b) del blanco fortificado con los elementos a determinar en s menor concentración aceptable y se evalúa la desviación estándar del blanco o del blanco fortificado expresándose el LD como el valor de la señal del blanco + 3,3 s B o como 0 + 3,3 s BF.

25 4 alidación e incertidmbre en medidas qímicas Entonces: Cando el método detecta la señal del blanco, el LD se calcla como el valor de la señal del blanco más s desviación estándar mltiplicada por el factor 3,3. LD= B + 3,3 s B Cando no hay señal, se tiliza n blanco fortificado (en baja concentración). El LD se calcla como tres veces la desviación estándar del blanco fortificado. LD = 0 + 3,3 s BF Límite de cantificación (LQ) El límite de cantificación es estrictamente la menor concentración de analito qe pede ser determinada con n aceptable nivel de repetibilidad y exactitd. Se obtiene al mltiplicar por tres el límite de detección, en casos especiales por cinco. Otras convenciones lo definen como la concentración de analito correspondiente a n valor del blanco + 5, 6 ó 10 desviaciones estándar de la media del blanco. Se denomina a veces también límite de determinación. El LQ no debe ser sado para la toma de decisión. Ni el LD ni el LQ representan niveles en los cales la cantificación es imposible. S significado práctico está asociado a qe, simplemente, en la región del LD la magnitd de la incertidmbre asociada es comparable al resltado real.

26 alidación e incertidmbre en medidas qímicas 5 Sensibilidad Es la propiedad del método qe demestra la variación de respesta en fnción de la concentración del analito. Pede ser expresada por la pendiente de la recta de regresión de calibración. Precisión La precisión es la medida de cán cerca o dispersos están los resltados nos de otros, y se expresa normalmente como la desviación estándar o desviación estándar relativa, ya qe se acepta la varianza como el mejor indicador de la dispersión: a menor varianza, mayor precisión. Las medidas más comnes de la precisión son repetibilidad y reprodcibilidad. Repetibilidad (de resltados de mediciones): grado de concordancia entre los resltados de mediciones scesivas del mismo mensrando bajo las mismas condiciones de medición; es la medida de la variabilidad de los resltados cando el método es aplicado por n solo analista, con n mismo eqipo, en n corto periodo de tiempo, etc. Reprodcibilidad: grado de concordancia entre los resltados de mediciones del mismo mensrando efectadas bajo condiciones de medición modificadas. Es el caso al realizar diversas réplicas en diversos días cambiando instrmento, analista e inclso el laboratorio. Cando se calcla la precisión en condiciones de repetibilidad, se obtienen valores distintos qe al calclar la precisión en condiciones de reprodcibilidad. Las condiciones de repetibilidad dan lgar a los mínimos valores de precisión y las condiciones de reprodcibilidad dan lgar a los máximos valores de precisión. Entre estas dos podemos encontrar condiciones intermedias (por ejemplo, diversas réplicas en diversos días cambiando instrmento y analista pero dentro de n mismo laboratorio); estas condiciones selen considerarse

27 6 alidación e incertidmbre en medidas qímicas tradicionalmente como reprodcibilidad, anqe lo más correcto en esos casos es hablar de la precisión intermedia. Para estimar la precisión se peden considerarse distintas opciones: Utilizar replicados de na misma mestra; se recomienda n número de alrededor de 0 para calclar la desviación estándar. Cando se sa en el tiempo na mestra de control, se recomienda obtener como mínimo 30 datos para determinar s promedio y la desviación estándar. A través de n diseño experimental realizado a tal efecto, como se desarrollará más adelante en n ejemplo específico para el cálclo de incertidmbre. Tanto la repetibilidad como la reprodcibilidad selen depender de la concentración del analito y cando esto ocrre, esta dependencia debe ser determinada si es significativa. La desviación estándar relativa es más útil en estos casos ya qe en s cálclo está inclida la concentración. eracidad (Sesgo) La veracidad del método es na expresión de cán cerca está la media de n conjnto de resltados (prodcidos por el método) del valor verdadero. La veracidad se expresa normalmente en términos del sesgo. El cálclo del sesgo pede hacerse de diferentes maneras: Utilizando materiales de referencia certificados alidando por comparación con otro método ya validado Participando en estdios colaborativos En el caso de no disponer de las alternativas anteriores, se recomienda sar para comparación las mestras tilizadas

28 alidación e incertidmbre en medidas qímicas 7 en prebas de desempeño, de las cales se disponga de los resltados del ejercicio interlaboratorio En la práctica para establecer la veracidad se efectúa la comparación de la media de los resltados del método con valores conocidos, o sea ésta se establece contra n valor de referencia. Hay dos formas para hacerlo: comparando con Materiales de Referencia Certificados (MRC) o con los resltados obtenidos por n método estándar. Los Materiales de Referencia Certificados y los valores de referencia obtenidos por métodos estándar deben ser absoltos (trazables al SI). Un Material de Referencia Certificado es na matriz natral certificada lo más similar posible a las mestras de interés. Como la disponibilidad de tales materiales es limitada se peden obtener Materiales de Referencia para la validación: Adicionando a n material típico materiales de referencia certificados pros otros materiales de preza y estabilidad adecadas. Reteniendo materiales caracterizados y cheqeados inhose para garantizar s estabilidad drante el Control de Calidad. Para fines reglatorios deben ser tilizados Materiales de Referencia Certificados reconocidos internacionalmente, mientras qe para trabajos de menor alcance o no críticos sele ser sficiente el so de estándares preparados en el Laboratorio o por adición. Para verificar contra n método alternativo, se comparan los resltados de ambos métodos en las mismas mestras. Las mestras deben ser preferentemente MRC, estándares inhose, o mestras típicas. Es mejor el empleo de los MRC por s probada estabilidad y homogeneidad y peden mostrar la presencia de sesgo respecto al SI, pero estos son caros y a veces no se encentran con las características exactas de las mestras.

29 8 alidación e incertidmbre en medidas qímicas La tabla qe se presenta a continación mestra n ejemplo de comparación de n método nevo desarrollado por ICP-OES, con otro ya establecido y tilizado por largo tiempo en n Laboratorio en el qe se emplea la técnica de Absorción Atómica para el análisis de agas residales. En este ejemplo se han empleando las herramientas estadísticas adecadas para la comparación. Elemento alor de alor de t Signif. EAA ICP calclado As (mg/l) No Cd (mg/l) No Cr (mg/l) No C (mg/l) No Fe (mg/l) No Mg (mg/l) No Mn (mg/l) No Ni (mg/l) No Pb (mg/l) No Sb (mg/l) No Zn (mg/l) No En la tabla sigiente se mestra otro ejemplo para la evalación del sesgo en na preba de recperación en na mestra fortificada, ya qe en este caso no fe posible comparar con otros métodos ni se disponía de MCR. Elemento Contenido en la mestra % de Recperación Ag (µg/ml) Ba (µg/ml) Hg (µg/l) Se (µg/l)

30 alidación e incertidmbre en medidas qímicas 9 La fortificación es la acción de añadir n analito, sstancia, matriz qímica o n material de referencia certificado (MRC) a na mestra en calqier etapa de n análisis qímico, para verificar la respesta del sistema de medición con n objetivo determinado. El porcentaje de recperación es solo n componente de la veracidad. Es útil para decidir la carta de control qe se emplea en el monitoreo de la calidad en mestras con matrices complejas qe presentan grandes interferencias, casos en los cales no sele ser fácil disponer de MRC. Las metas de recperación deben estar claras y dependen del método aplicado. Los límites en general son de %, pero habría qe establecer las metas por grpos de parámetros. Por ejemplo, para el análisis de compestos orgánicos se recomienda la tilización de compestos marcados con 13 C o H. Incertidmbre La Incertidmbre es n parámetro asociado con el resltado de na medición, qe caracteriza la dispersión de los valores qe razonablemente podrían ser atribidos al mensrando. Es necesario aclarar qe la incertidmbre es n sólo parámetro (salmente la desviación estándar o el intervalo de confianza) qe expresa el rango de valores posibles en base al resltado de las mediciones. La estimación de la incertidmbre toma en centa todos los efectos qe actúan sobre el resltado; las incertidmbres asociadas con cada efecto deben ser combinadas de acerdo a procedimientos bien establecidos, como se verá más adelante. La estimación de la incertidmbre debe tomar en centa: variaciones en el tiempo, el sesgo y s incertidmbre, la incertidmbre de la calibración, calqier otro efecto significativo.

31 30 alidación e incertidmbre en medidas qímicas Exactitd (eracidad + Precisión) La exactitd (de acerdo a la definición de ISO ) expresa la proximidad de n resltado al valor verdadero. La validación bsca cantificar la exactitd de los resltados teniendo en centa tanto los efectos sistemáticos como los aleatorios qe pedan afectarlos. La exactitd tiene en centa dos componentes: veracidad y precisión. Existe además otra expresión de la exactitd qe es la incertidmbre de las mediciones. Es más simple no tilizar el término exactitd, ya qe pede confndirse con otras definiciones, es mejor en s lgar hablar de ss componentes: veracidad y precisión, asociados al error total, el máximo sesgo qe pede tener n dato. Exactitd = Incertidmbre = eracidad + Precisión Conclsiones Los métodos de validación nos dan información sobre las características del método, ss posibilidades y limitaciones. Deben ser empleados en rtina bajo n control de calidad. Este control es necesario para verificar qe el método conserva ss propiedades, es decir qe trabaja en la forma esperada. Entre los elementos para el control de calidad, deben inclirse: Determinación de blancos, asociado al cálclo de la precisión. Mestras de control interno, asociado al segimiento de la calidad de los datos. Se pede sar n estándar primario o na mestra de concentración conocida estabilizada. El laboratorio debe establecer con qé frecencia se va a sar. Mestras de referencia certificadas, asociado con la trazabilidad. El laboratorio debe establecer la frecencia con qe deben ser tilizadas, dependiendo del método.

32 alidación e incertidmbre en medidas qímicas 31 Mestras de desempeño o ensayos de aptitd, asociado al control externo y en casos especiales a la trazabilidad. Se recomienda realizarlos al menos na vez al año. Drante la validación el método se aplica comúnmente a mestras de concentración conocida, mientras qe en la rtina se aplicará a mestras de diversa concentración. El Laboratorio pede decidir así si el método reqiere algna optimización o es adecado para el objetivo propesto. Es na práctica acertada dentro del control de calidad reanalizar mestras conocidas cada cierto tiempo, para mantener la confianza en los resltados. A continación, se presenta na Tabla Resmen con las características anteriormente mencionadas, donde se explicita, para diferentes parámetros qe selen determinarse en mestras de aga, cáles de ellas deben ser investigadas en el proceso de validación y cáles son los elementos básicos del control de calidad qe deben ser tenidos en centa para cada método.

33 3 alidación e incertidmbre en medidas qímicas Parámetros Linealidad Rango de trabajo Límite de detección Límite de cantificación eracidad Precisión Incertidmbre Porcentaje de Recperación Dplicados de blanco ph Condctividad Potencial redox Oxígeno diselto Iones selectivos Trbidez Slfato Calcio Magnesio Clorros Sólidos totales Sólidos sspendidos totales Nitratos Nitritos Amonio Indice de fenol DQO Detergentes Silicatos Fósforo metales Trihalometanos Benceno y ss derivados Plagicidas Bifenilos policlorados Aromáticos policíclicos Compestos orgánicos persistentes Dioxinas Carbono orgánico total Nitrógeno Kjendhal DBO no si no dado por el manal si si si no si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si si no si si, considerar los 3 niveles alto, medio y bajo. Cando se implementa el método medir por 7 días si si si para concentraciones bajas y no para concentraciones altas, rtinario Dplicados de mestras si Si, por cada lote (el lote lo decide el laboratorio Mestras de control interno Contol de calidad Mestra periódica de referencia certificada Si, mínimo 4 al año Si, con cada lote de mestras asociado a carta de control, definido por cada laboratorio. Si, mínimo 3 al año, dependiendo de qe no haya cambio del material de referencia Si, dependiendo de la variabilidad del método y de lo qe se reqier si, mínimo 1 al año Preba de desempeño Si, Mínimo 1/año erificación de eqipos si, dependiendo de la carta de control

34 alidación e incertidmbre en medidas qímicas EJEMPLO 1: PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE OPERACIÓN A continación, se detalla y comenta n procedimiento normalizado de operación (PNO). Un procedimiento normalizado de operación presenta los pasos scesivos a llevar a cabo cando se desea determinar algún parámetro en particlar en algna mestra. Detalla las distintas etapas qe sirven al analista para analizar na mestra, y generalmente está basado en algna normativa (ISO; ASTM, EPA, etc.); debe presentar además información sobre el alcance del método y sobre el control de calidad interno propesto. PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE OPERACIÓN PARA (la determinación del parámetro, por ej alcalinidad total ) POR EL MÉTODO DE (citar el método de análisis, por ej titlación potenciométrica ) Deben inclirse al pie de la primera página los datos relativos al personal qe preparó, revisó y aprobó el procedimiento: Preparado por: (Analista Instrmental) (Analista Qímico) Fecha: Firma: Revisado por: (Spervisor de Calidad) Aprobado por: Se inclyen además los datos del docmento: Fecha de emisión: Revisión: No. de páginas: Se prohíbe la reprodcción total o parcial de este docmento sin previa atorización del Spervisor del Laboratorio.

35 34 alidación e incertidmbre en medidas qímicas El PNO debe contener tanto del detalle del procedimiento como la forma de realizar el control de calidad del método analítico. SECCION DEL PROCEDIMIENTO 1. Aplicación 1.1 Este método es aplicable a la determinación de... en mestras de (especificar la matriz en la qe se pede aplicar el método, por ejemplo agas residales ) 1. El límite de detección de este método es... mg/l El alcance del método debe ser especificado claramente:: 1.3 Mediante este método se pede determinar..en n rango de a. mg/l, y por dilción, concentraciones máximas de.. Resmen del método Es necesario presentar na breve descripción de la metodología analítica, y los principios básicos del método. 3. Precaciones de segridad Deben figrar las condiciones relativas a la Higiene y Segridad en el trabajo, considerando los reactivos y el eqipamiento tilizado, y especificando el destino de los residos generados en el procedimiento analítico. 4. Precaciones Se refiere a los cidados especiales qe deben tenerse en cada no de los pasos del procedimiento.

36 alidación e incertidmbre en medidas qímicas Interferencias Deben detallarse todas las fentes posibles, en ítems separados. Por ejemplo, en n método espectrométrico, deberían figrar las interferencias físicas, las qímicas y las espectrales. 6. Instrmental/materiales Deben detallarse todos los instrmentos y material de laboratorio, en ítems separados; en el ejemplo citado anteriormente debería comenzarse por el tipo de eqipo espectrométrico; y sigiendo por las pipetas, matraces, vasos, filtros si son necesarios en el pretratamiento de las mestras, etc. 7. Reactivos Deben figrar tanto los reactivos pros como la forma de preparación detallada de las solciones necesarias. 8. Calibración del eqipo Indicar todos los pasos previos para garantizar qe el eqipo está fncionando correctamente (por ejemplo., para n método espectrométrico atómico, ajste de longitd de onda, ancho de ranra, fljo gaseoso, etc.) 9. Calibración del método Esto se refiere a la calibración qímica de la metodología. Se deben indicar los diferentes pasos, y cómo preparar las solciones qe se van a tilizar para constrir la crva de calibrado. También debe inclirse el tiempo de vencimiento de cada solción. 10. Mestreo y preservación Se definen las características necesarias para garantizar qe la mestra a analizar sea representativa del problema analítico en cestión. Asimismo, debe garantizarse qe la mestra na vez extraída llege al laboratorio sin qe se altere el parámetro a determinar. También debe

37 36 alidación e incertidmbre en medidas qímicas informarse la forma de preservación en el laboratorio y el tiempo máximo permisible antes del análisis. 11. Procedimiento de análisis Se debe detallar en pasos scesivos cada na de las etapas, desde el volmen de mestra tomado hasta la lectra final. Es la gía práctica para el trabajo del analista. 1. Análisis de datos Se debe detallar el procedimiento de cálclo, teniendo en centa cómo transformar el dato leído por el analista en el resltado final qe se debe entregar en el informe. El contenido de en la mestra se calcla de la sigiente manera: WAs C = m donde: C = concentración de en la mestra. W As = cantidad de obtenida de la crva de calibración en µg. m = volmen de la mestra en ml. El resltado se debe reportar en mg/l ± I, donde I es la incertidmbre calclada. 13. Registro Se detallan todos los registros qe deben realizarse y preservarse, para garantizar la trazabilidad del resltado. Se generan los sigientes registros, los cales se encentran en la sala de instrmental: Caderno de Toma de Mestras, es n registro de las mestras para análisis de, donde se consigna el nombre del analista,

38 alidación e incertidmbre en medidas qímicas 37 fecha de análisis, el método qe se aplica, la identificación de la mestra, acompañado de s control de calidad, alícota tomada sea en peso o volmen y volmen final a la qe se lleva. Formlario de preparación de reactivos, donde se registra la fecha de preparación, reactivo preparado, volmen de la solción preparada, marca y lote del reactivo, tiempo de dración máxima, nombre del analista qe preparó. Formlario de preparación de Estándares de Calibración y Control, donde se registra fecha de preparación, volmen preparado, nombre del analista qe preparó, marca y lote del estándar; igalmente el frasco de almacenamiento tiene na etiqeta donde se indica estándar preparado o estándar control, fecha de preparación, iniciales del analista, la concentración de cada analito, preservación, tiempo de dración máxima. Caderno de Mantenimiento de los Eqipos, donde se señalan los problemas en el eqipo, para el mantenimiento preventivo y correctivo del mismo. Caderno de Disposición de Mestras y extractos, donde se registra fecha de ingreso, lote, fecha de eliminación, nombre del responsable de las mestras y extractos en cstodia. Caderno de No Conformidades, donde se registran la fecha y nombre del responsable, la identificación del problema, casas del problema y las acciones correctivas o preventivas del mismo. Resltados Analíticos Resltados de los Análisis, donde se archivan los resltados finales. Cartas de control, donde se archivan las cartas de control mensales. SECCION DE CONTROL DE CALIDAD 1. Límite de detección El límite de detección del método (LDM) es mg /L y se calcla de acerdo al procedimiento descrito en el Manal de Control de Calidad.