RESUMEN INTRODUCCIÓN. G. Beltrán 1 ; MªP. Aguilera 1 ; C. del Rio 2 ; S. Sánchez 3 ; L. Martínez 4.

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1 TEC-15 INFLUENCIA DEL PROCESO DE MADURACION DEL FRUTO SOBRE EL CONTENIDO EN ANTIOXIDANTES NATURALES DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN DE LA VARIEDAD HOJIBLANCA G. Beltrán 1 ; MªP. Aguilera 1 ; C. del Rio 2 ; S. Sánchez 3 ; L. Martínez 4 1 Estación de Olivicultura y Elaiotecnia. CIFA Venta del Llano. DGIFAP., Mengíbar, Jaén. 2 CIFA Alameda del Obispo DGIFAP, Córdoba. 3 Dpto. de Ingeniería Química, Ambiental y de los Materiales. Universidad de Jaén. 4 Dpto. de Ingeniería Química, Facultad de Ciencias. Universidad de Granada gbelt@eresmas.com. Foro de la Tecnología Oleícola y la Calidad RESUMEN En este trabajo se ha estudiado el efecto del proceso de maduración del fruto sobre el contenido de antioxidantes del aceite de la variedad Hojiblanca. Para ello se ha realizado un seguimiento con carácter quincenal a lo largo del proceso de maduración en tres campañas consecutivas: 96/97, 97/98 y 98/99. En el aceite se han analizado: contenido en polifenoles totales, contenido en tocoferoles, amargor K 225, pigmentos carotenoides y clorofílicos y estabilidad oxidativa. Durante el proceso de maduración se aprecia un descenso en el contenido en compuestos fenólicos, si bien el efecto de las condiciones de cada campaña no ha sido significativo, no encontrándose diferencias entre lo valores medios de cada año. El amargor de los aceites K225 presenta una variación similar a la descrita para los polifenoles totales, con los que se encuentra estrechamente relacionado. El contenido en tocoferoles totales y de a-tocoferol, al igual que sucede en el caso de los polifenoles, presenta un descenso durante la maduración del fruto, observándose como las campañas con los niveles mas bajos de pluviometría presentaron un contenido mas elevado de estos compuestos obteniéndose diferencias significativas entre las diferentes campañas. La estabilidad oxidativa, medida como tiempo de inducción, en Rancimat durante el proceso de maduración desciende para cada una de las campañas analizadas. Se obtienen diferencias significativas entre las diferentes campañas analizadas presentando los valores más elevados en las campañas con precipitaciones más bajos. Estos resultados permiten un avance en el conocimiento sobre los cambios en el contenido en antioxidantes naturales del aceite durante el proceso de maduración del fruto, lo que permitiría establecer el momento adecuado de su recolección en función de las características del aceite deseadas. INTRODUCCIÓN En Andalucía la segunda variedad en importancia, en cuanto a producción y superficie cultivada, es la variedad Hojiblanca, esta variedad ocupa una superficie cercana a las ha y su área de cultivo se centra en el norte de la provincia de Málaga, Comarca de Antequera y el sur de la provincia de Córdoba. Se trata de una variedad vigorosa de entrada en producción tardía, presenta vecería muy acusada y es de elevada productividad. Presenta una buena aptitud para la recolección mecanizada por el tamaño del fruto, si bien la fuerza de desprendimiento del mismo es elevada. Se trata de una variedad de maduración tardía y de bajo contenido graso. Esta variedad es apreciada por su resistencia a la sequía y a los suelos calizos. Presenta doble aptitud, para aceituna de mesa y elaboración de aceite. Su aceite presenta una equilibrada composición, con una estabilidad oxidativa media y unas características sensoriales apreciadas por el consumidor. El aceite de oliva virgen presenta de forma natural una serie de componentes minoritarios con elevado poder antioxidante, de entre ellos destacan por su interés nutricional y sensorial los compuestos fenólicos que presentan actividad antioxidante a nivel celular (Visioli y Galli, 1994, Martínez de Victoria y Mañas, 2001) y frente a procesos autoxidativos del aceite (Gutiérrez et al., 1999; Beltrán, 2000). Además estos compuestos son responsables de la sensación de amargo del aceite parámetro con el que están correlacionados (Beltrán et al., 2000). Otros antioxidantes son los tocoferoles cuyos efectos beneficiosos sobre la salud han sido ampliamente descritos (Martínez de Victoria y Mañas, 2001). Por ultimo, un grupo de compuestos que también presentan poder antioxidante son los pigmentos, de los que los carotenoides han mostrado una importante actividad a nivel celular, si bien ambos actúan como antioxidantes en el aceite protegiéndolo frente a procesos oxidativos.

2 Por tanto, el contenido y composición de estos compuestos minoritarios y sus efectos beneficiosos sobre la salud son responsables en parte del creciente interés del consumidor por el aceite de oliva virgen. Sin embargo, a pesar de tratarse de una de las variedades más importantes en España, existen pocos trabajos en los que se describa su composición química y su contenido en antioxidantes naturales de sus aceites, en los mismos se ha descrito los cambios durante el proceso de maduración sin tener en cuenta la interacción de la misma con las condiciones de cada campaña. Por tanto, y debido a la importancia de esta variedad en cuanto a nivel de producción, y a la necesidad de un conocimiento mas profundo del contenido en antioxidantes de sus aceites, el objetivo de este trabajo ha sido determinar la evolución del contenido en antioxidantes naturales del aceite de oliva virgen de la variedad 'Hojiblanca' durante el proceso de maduración del fruto y como se ve afectada a su vez, por las condiciones de cada campaña. MATERIALES Y METODOS Material vegetal. Para el estudio se han seleccionado 12 árboles de la variedad Hojiblanca de 16 anos de edad, dispuestos en un marco de plantación de 7x7 m, cultivados en la Finca Experimental de la Estación de Olivicultura y Elaiotecnia. CIFA Venta del Llano en Mengibar, Jaén. Se han utilizado técnicas estándar para su cultivo aplicándose riego de apoyo en verano. Toma de muestras. La toma de muestras del fruto se ha realizado del conjunto de los 12 árboles por duplicado con una periodicidad aproximada de 15 días. Las muestras fueron inmediatamente llevadas al laboratorio para su análisis. A una alícuota de 100 frutos se le ha determinado el índice de madurez, según metodología descrita por Uceda y Frías (1975). Extracción de aceite. La extracción del aceite se ha llevado a cabo utilizando un equipo Abencor (Abengoa, Sevilla) para extracción de aceite a nivel de laboratorio, equipado con molino de martillos, una termobatidora, y una centrifuga para la pasta. Las condiciones de batido han sido 28 C durante 30 minutos. Las muestras de aceite una vez filtradas fueron conservadas a 24 C hasta el momento del análisis. Determinaciones en aceite. En el aceite se ha determinado el contenido en polifenoles totales según método descrito por Vázquez et al. (1973), utilizando reactivo de Folin Ciocalteau y medida colorimetrica a 726 nm. Los resultaros se expresaron en mg/kg de ácido cafeico. El amargor, medido como K225 se ha realizado utilizando extracción en fase sólida y medida de la absorción a 225 nm (Gutiérrez et al, 1992). El contenido en pigmentos cloroficliocos y carotenoides se ha determinando según metodología descrita por Minguez et al. 1991), midiendo la absorbancia a 430 y 670 nm para los carotenoides y los clorofílicos respectivamente. Los resultados fueron expresados como mg/kg. Los tocoferoles fueron determinados siguiendo el método de la IUPAC 2432, utilizando un cromatógrafo de líquidos PerkinElmer, equipado con una bomba Lc200 y detector UV-Vis Lc 295. La columna utilizada para la determinación ha sido Lichrosphere Si 60 (Merck) de 250 mm de longitud, 4.6 mm de diámetro interno y un tamaño de partícula de 5 µm. Como fase móvil se utilizo 0.5% de isopropanol en n-hexano y medida a 296 nm. Los resultados se expresaron como mg/kg. La estabilidad oxidativa se ha medido utilizando un equipo Rancimat, las condiciones de trabajo fueron: 98 C y flujo de aire de 10-12L/h. Los resultados se han expresado en horas. Análisis estadístico. Se ha llevado el análisis de la varianza con el objetivo de determinar el efecto de la campana y el estado de maduración sobre cada uno de los parámetros medidos en el aceite. Se ha aplicado el Test de Tukey para establecer diferencias entre medias. RESULTADOS Y DISCUSION El estudio se ha realizado desde mediados de septiembre por lo que se ha partido de un índice de madurez cercano a 0 aunque el cambio en pigmentación hacia el verde amarillento ya había comenzado. Los valores de índice de madurez para cada una de las campañas se muestran en la TABLA 1. Los compuestos fenólicos presentes en el aceite de oliva virgen, son uno de los pilares esenciales de la importancia nutricional de este aceite vegetal. En los aceites de la variedad Hojiblanca su contenido total ha oscilado, para el conjunto de las tres campanas analizadas, en un intervalo comprendido entre 148 y 819 ppm. Cuando se comparan el contenido medio de polifenoles de cada una de las campañas por separado se puede

3 observar como en la campaña 1996/97, presentaron el contenido medio más elevado, si bien en las fases iniciales de la maduración de la campaña 97/98 se parte de valores más altos. Durante la maduración del fruto se aprecia una tendencia general a sufrir un descenso en la concentración de estos antioxidantes naturales (Figura 1). Sin embargo, este descenso no se produce de forma similar en todas las campañas, así mientras en la campaña 97/98 se produce un descenso lineal desde 819 ppm hasta 282 ppm, las otras dos presentan un descenso con una pendiente mucho más suave. La variedad Hojiblanca ha sido incluida en un intervalo medio de entre ppm (Uceda y Hermoso, 2001) con un valor medio de 250 ppm. Este valor medio se encuentra por debajo de del valor medio encontrado en este trabajo (491 ppm), si bien podría deberse a la inclusión de varias épocas durante el proceso de maduración y a la variabilidad originada por las diferentes condiciones de cada campaña. A la hora de determinar la influencia de los factores estudiados en este trabajo, maduración y campaña, sobre el contenido en polifenoles se obtiene como la campaña no tiene una gran incidencia con sólo el 16.97% de la variabilidad observada, sin embargo el estado de madurez es el factor que incide de forma más importante en el contenido de estos compuestos en esta variedad. Estos resultados no están de acuerdo con el comportamiento de otras variedades de olivo ya que ante unas condiciones de estrés hídrico, el contenido en polifenoles de los aceites aumenta (Beltrán, 2000: Ortega et al., 2001). Estos resultados confirman la resistencia de esta variedad a las condiciones de sequía. Un parámetro relacionado con los compuestos fenólicos es la medida del amargor K 225, se trata de un parámetro correlacionado con la determinación mediante panel test de este atributo sensorial (Gutiérrez et al.,1992). Según los resultados obtenidos, el aceite de la variedad Hojiblanca presentaría un valor medio de amargor de 0.42; sin embargo, el amplio rango en el que se ha encontrado para esta variedad permite encontrar aceites con muy diferentes intensidades de amargor, desde los poco amargos hasta los muy amargos. Durante el proceso de maduración del fruto se produce un descenso en el amargor de los aceites, tendencia que se repite para cada una de las campanas analizadas (Figura1). El valor medio del amargor en cada una de las campanas no presenta diferencias significativas entre sí. Otros antioxidantes de especial interés, principalmente desde el punto de vista nutricional, son los tocoferoles (vitamina E). Al igual que otras variedades, de las tres formas en que se encuentran los tocoferoles (α, β y γ) es el α - tocoferol el que se encuentra en una mayor proporción (> 95%). De los factores agronómicos estudiados, es la campaña el que ejerce mayor influencia sobre la variabilidad encontrada para estos compuestos con un valor del 53%. Los porcentajes de variación obtenidos para cada uno de los tocoferoles se muestran en la TABLA 2. Se obtienen diferencias significativas entre los valores medios de las diferentes campañas para el contenido de tocoferoles totales y α-tocoferol, obteniéndose los valores mas altos durante la campaña 98/99, caracterizada por su escasez de precipitaciones, mientras que en la 96/97 se obtuvieron los valores más bajos, coincidiendo con niveles muy elevados de precipitaciones (TABLA 3). En general, el contenido de tocoferoles desciende a lo largo del proceso de maduración, si bien se aprecian claras diferencias en la velocidad de este descenso. El contenido medio encontrado en los aceites de esta variedad presenta un valor muy similar a los resultados descritos por Uceda y hermoso, Sin embargo, la composición media obtenida en este trabajo y su evolución durante la maduración no ha sido descrita previamente, el contenido en α- tocoferol es de ppm, para el β-tocoferol de 3.3 ppm y 5.2 ppm de γ-tocoferol. Los pigmentos presentes en el aceite de oliva virgen además de presentar actividad antioxidante, como es el caso de lo carotenoides y las clorofilas en oscuridad, son responsables del color de los aceites que constituye uno de los parámetros que influyen en la selección del aceite por parte del consumidor. En los aceites de la variedad 'Hojiblanca' los pigmentos clorofílicos se han encontrado en una concentración que puede oscilar entre 0.5 y mg/kg. Los aceites con un mayor contenido en estos pigmentos se han obtenido durante la campaña 98/99, mientras que los más bajos en la 96/97. Durante el proceso de maduración se ha observado un descenso en el contenido de estos pigmentos para cada una de las variedades (Figura 1). Del análisis de la varianza, se obtiene como la principal fuente de variabilidad es el estado de maduración del fruto con un 83.23% de la variación encontrada. Los carotenoides están presentes en el aceite de esta variedad en una concentración comprendida dentro del intervalo mg/kg. Al igual que sucede con los pigmentos clorofílicos, los valores mas elevados de carotenoides se encuentran en los aceites obtenidos en la campaña 98/99, presentando diferencias significativas respecto a las otras dos. Estas diferencias son de difícil explicación ya que no se han observado diferencias en el índice de madurez, aunque podría deberse al efecto del estrés hídrico sobre la concentración de ácido abcísico, cuya formación sigue una ruta metabólica común a los carotenoides (Rmiki et al. 1999; Hartung et al., 1999). El descenso en el contenido en pigmentos durante el proceso de maduración es similar al descrito por Garrido et al. (1990).

4 La estabilidad media del aceite de la variedad Hojiblanca es de 73.4 h, con un intervalo comprendido entre 42.1 y 106.h. Se han obtenido diferencias significativas en los valores de estabilidad de los aceites obtenidos en las diferentes campañas. El valor medio obtenido para esta variedad es mayor que el descrito por Uceda y Hermoso (2001). La campaña es la principal fuente de variabilidad de este parámetro 91.43% para el modelo analizado mientras la época solo representa el 1.38%. Los aceites más estables son los correspondientes a la 96/97 mientras que los de estabilidad mas baja se obtuvieron en la 97/98. En general, estas diferencias podrían ser explicadas por los cambios en el contenido en compuestos fenólicos del aceite, parámetro con el que se encuentra relacionado siempre que la composición de ácidos grasos de los aceites sea similar (Beltrán, 2000: Beltrán et al., 2000). Durante el proceso de maduración del fruto (Figura 1) se observa un descenso en la estabilidad de los aceites de acuerdo con lo descrito previamente (Gutiérrez et al., 1999) Por tanto, en este trabajo se ha descrito la composición media en antioxidantes naturales del aceite de oliva virgen de la variedad 'Hojiblanca', estableciéndose como influye en su composición los principales factores agronómicos: campaña y maduración. En general, se aprecia un descenso general de todos lo antioxidantes naturales presentes en el aceite, viéndose afectados principalmente por el nivel de precipitaciones de cada campaña, apreciándose como respuesta al estrés hídrico un aumento del nivel de antioxidantes naturales, a excepción de los polifenoles que no presentan el mismo comportamiento observado en otras variedades. Estos resultados permiten un conocimiento más profundo de los cambios durante el proceso de maduración del aceite de oliva lo que permitiría establecer el momento óptimo de recolección del fruto en función de las características nutricionales, organolépticas y comerciales deseadas. AGRADECIMIENTOS Este trabajo se ha llevado a cabo gracias a una Beca de Investigación Tipo B.2 del Programa de Formación del Personal Investigador y de Desarrollo Agrario de la Dirección general de Investigación y Formación Agraria y Pesquera de la Consejerías de Agricultura y Pesca de la Junta de Andalucía. BIBLIOGRAFIA 1. Beltrán, G. (2000). Influencia del proceso de maduración del fruto de Olea europaea L. sobre las características físico-químicas de los aceites. Tesis doctoral. Facultad de CC. Experimentales, Universidad de Jaén. 2. Beltrán, G., Jiménez., A., Aguilera, M.P., Uceda, M. (2000). Análisis mediante HPLC de la fracción fenólica del aceite de oliva virgen de la variedad Arbequina. Relación con la medida del amargor K225 y la estabilidad oxidativa. Grasas y Aceites, Garrido, J., Gandul, B., Gallardo, L., Minguez, M.I. (1990). Pigmentos clorofílicos y carotenoides responsables del color del aceite de oliva virgen. Grasa y Aceites, 41, Gutiérrez Rosales, F., Perdiguero, S., Gutiérrez, R. y Olías, J.M. (1992). Evaluation of the bitter taste in virgin olive oil. J. Am. Oil Chem. Soc., 69, Gutiérrez, F. (1989). Determinación de la estabilidad oxidativa de aceites de oliva vírgenes: comparación entre el método del Oxigeno Activo (A.O.M.) y el método Rancimat. Grasas y Aceites, 40, Gutiérrez, F., Jiménez, B., Ruiz, A. y Albi, M.A. (1999). Effect of olive ripeness on the oxidative stability of virgin olive oil extracted from the varieties Picual and Hojiblanca and on the different components involved. J. Agric, Food Chem., 47, Hartung, W., Peuke, A.D., Davies, W.J. (1999). Abcisic acid A hormonal long distance stress signal in plants under drought and salt stresses. En: Handbook of plant and crop stresses. Pessarakli, M. Marcel dekker, New York. 8. IUPAC (1992). Determination of tocopherols and tocotrienols in vegetable fats by HPLC. Method n En: Standard methodsof analyses of oils, fats and derivatives. Blackwell, Oxford. 9. Martínez de Victoria, E., Mañas, M.(2001). El aceite de oliva en la dieta y la salud humana. En: El cultivo del olivo, (Barranco, D., Fernández-escobar, R., Rallo, L.). MundiPrensa, Madrid. pp Mínguez, M.I., Rejano, J.L., Gandul, B., Higinio, A., Garrido, J. (1991) Colour pigment correlation in virgin olive oil. J. Am. Oil Chem. Soc. 68: Rmiki, N., Schoefs, B., Lemoine, Y. (1999). Carotenoids and stress in higher plants. En: Handbook of plant and crop stresses. Pessarakli, M. Marcel dekker, New York.

5 12. Uceda, M., Frías, L. (1975). Harvest dates. Evolution of the fruit oil content, oil composition and oil quality. En: Proceedings del Segundo Seminario Oleicola Internacional. COI, Córdoba. Pp: Uceda, M., Hermoso, M. (2001). La calidad del aceite de oliva. En: El cultvo del olivo, (Barranco, D., Fernández-escobar, R., Rallo, L.). MundiPrensa, Madrid. pp Vázquez-Roncero, A., Janer del Valle, C., Janer del Valle, M.L. (1973). Determinación de polifenoles totales del aceite de oliva. Grasas y Aceites. 22, Visioli, F. y Galli, C. (1994). Oleuropein protects low density lipoproteins from oxidation. Life Sci., 55,

6 Polifenoles (mg/kg) Amargor K Estabilidad oxidativa (h) Pigmentos (mg/kg) Figura 1. Variación del contenido en polifenoles totales, pigmentos clorofílicos (símbolos rellenos) y carotenoides (símbolos blancos) y estabilidad oxidativa de los aceites de la variedad Hojiblanca durante el proceso de maduración del fruto en las tres campañas analizadas: ( ) 96/97, (? ) 97/98 y (?) 98/99. Época Campaña 96/97 Campaña 97/98 Campaña 98/ TABLA 1. Indice de madurez de los frutos de la variedad Hojiblanca correspondientes alas tres campañas analizadas

7 Compuesto Campaña (%) Época (%) Campaña* Error (%) (%) a-tocoferol ß-tocoferol ?-tocoferol Tocoferoles Tot TABLA 2. Porcentaje de variabilidad para cada una de las fuentes de variacion de los tocoferoles presentes en el aceite de la variedad Hojiblanca Campaña 96/97 Época a- tocoferol ß- tocoferol?-tocoferol Tocoferoles Tot ± 3.65 * 3.94 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 5.28 Campaña 97/98 Época a- tocoferol ß- tocoferol?-tocoferol Tocoferoles Tot ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.22 Campaña 98/99 Época a- tocoferol ß- tocoferol?-tocoferol Tocoferoles Tot ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.85 * Media ± SE (Error estándar) TABLA 3. Evolución del contenido en tocoferoles (mg/kg) de los aceites de la variedad Hojiblanca durante el proceso de maduración del fruto correspondiente a las campañas 96/97, 97/98 y 98/99.