AUTOMATIZACION TM PATRICIA TOLEDO RODRIGUEZ OBTENCION DE LAS MUESTRAS

Transcripción

1 AUTOMATIZACION TM PATRICIA TOLEDO RODRIGUEZ OBTENCION DE LAS MUESTRAS

2 FIJACION CONDICIONES IDEALES Actuar con rapidez Poder de penetración Insolubilizar componentes celulares Conservar detalles estructurales. Consistencia. Impedir la formación de estructuras artificiales Permitir y facilitar la aplicación de procedimientos posteriores. Ser económico, estable, fácil manejo y baja toxicidad. Concentración 4% Tamponada Penetración Fijación FORMALDEHIDO

3 DESHIDRATANTE eliminación completa del agua de la muestra para que se pueda embeber adecuadamente en los medios de inclusión no hidrosolubles posteriores DESHIDRATACION CONDICIONES IDEALES 1. No debe alterar las estructuras tisulares 2. Debe poder mezclarse con el reactivo intermediario o agente aclarante. 3. Rápido 4. Producir un endurecimiento aceptable 1. Lo mínimo de peligrosidad intrínsica (vapores) 2. Mínimo riesgo de incendio/explosión

4 DESALCOHOLIZAR Se trata de un proceso por el cual se consigue la sustitución del agente deshidratante por una sustancia miscible con el medio de inclusión que va a utilizarse. 1. Rapidez para eliminar el deshidratante 2. Acciones nocivas sobre los tejidos y células 3. Adecuación del aclarante sobre el deshidratante 4. Adecuación del aclarante sobre el medio de inclusión 5. Toxicidad /Peligrosidad 6. costo

5 IMPREGNACION Es el proceso de tiene por objeto rellenar o infiltrar completamente la muestra con el medio que se va a utilizar para la imbibición del tejido. El fundamento del proceso radica en la ocupación completa con el medio de los espacios intra y extraceculares inicialmente llenos con agua PARAFINAS mezcla de hidrocarburos saturados de cadena larga que se obtiene como un subproducto incoloro e inodoro de la industria petroquímica. A temperatura ambiente es sólida. Existen diferentes tipos de parafina, variando en punto de fisión (40 a 70 c). PUNTO DE PLASTICIDAD

6 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

7 INCLUSION INCLUIR

8 CORTAR Microtomo minot criostato

9 SECADO DE LAMINAS

10 LEICA AUTOSTAINER XL LEICA AUTOSTAINER XL

11 LEICA AUTOSTAINER XL MEDIOS ADHESIVOS TM PATRICIA TOLEDO RODRIGUEZ

12 MEDIOS ADHESIVOS Se utilizan entre el corte histológico y el portaobjetos, tiene como finalidad asegurar la permanencia e integridad del corte histológico obtenido, permitir realizar los procedimientos posteriores sin producir el desprendimiento de la muestra.

13 1. Albumina de Mayer 2. Albumina seca 3. Gelatina Cromoalumbre 4. Gelatina formalina 5. Film de celoidina 6. Colafría 7. Silanizados 8. Limpios PUENTE CALICANTO

14 ALBUMINA DE MAYER Clara de huevo (ml/grs) Glicerina Timol La mezcla filtrada se extiende sobre los portaobjetos limpios. La albúmina coagula con el calor al secar los cortes, de manera que logra adhesión al portaobjetos.

15 ALBUMINA DE MAYER V: barata, la mezcla es de larga duración. D: engorroso su filtrado, requiere timol, si la aplicación es excesiva se tiñe con eosina ALBUMINA SECA Albúmina en polvo 5g. Cloruro de sodio 0,5g Agua destilada 100 ml Filtrar a través de un embudo Buchener al vacío o a través de gasa doble. A 50 ml de filtrado agregar 50 ml de glicerina. Adicionar a la mezcla final un grano de timol.

16 Exceso de albúmina GELATINA CROMOALUMBRE SOLUCION A: Gelatina molida 4,5grs Agua destilada 1000ml Calentar progresivamente hasta 75 en agitación continua, una vez completa la disolución bajar temperatura a 50 SOLUCION B Alumbre de cromo al 4% 38,5 ml Ftalato de dibutilo 1 ml Merthiolate 0,1 g Mezclar ambas soluciones.

17 GELATINA CROMOALUMBRE Existe una variante a esta preparación: Gelatina en polvo 5g Cromoalumbre 0,5g Agua destilada 1000ml Agregar timol para preservar la solución. Guardar refrigerada. Filtrar antes de usar. GELATINA CROMOALUMBRE PROCEDIMIENTO: Sumergir los portaobjetos en la solución con el fin de que se forme una delgada película. Dejar escurrir. Colocar a secar en la estufa a 37 c.

18 GELATINA FORMALINA La formalina endurece la proteína contenida en la gelatina y en la albúmina del huevo asegurando una unión más forme entre el corte y el portaobjetos. Aplicar a los portaobjetos la gelatina o la albúmina de mayer. GELATINA FORMALINA Montar los cortes y secarlos durante 30 a 60 segundos Colocar los portaobjetos en un borrel que contenga aproximadamente 5 ml de formalina concentrada, de modo tal que la solución no estéen contacto con los cortes de tejido. Los bórreles herméticamente cerrados se colocan en la estufa a 60 por 1 hora. Secar los cortes del borrel y secar en la forma convencional.

19 COLAFRIA Solución al 1% de colafría en agua destilada. Sumergir los portaobjetos limpios, y dejar secar toda la noche. V: no se tiñe, barata, fácil de preparar, no se descompone. D:requiere preparar los portaobjetos

20 PORTAOBJETOS LIMPIOS V: la más barata de todas, fácil, no requiere preparación. D: no sirve para todas las tinciones posteriores, requiere secado a 60 x 25 minutos SILANIZADO 1.-Limpiar uno a uno los portaobjetos con Alcohol de 70, cuidar de no dejar pelusas en los portaobjetos. 2.-Sumergir el canasto en una solución de acetona PA con Silano al 1%. Dejar 5 minutos. 3.-Lavar en dos baños sucesivos de acetona nueva PA por 2 minutos cada uno. 4.-Dejar secar por 18 horas a 60

21 SILANIZADO V: soporta recuperaciones en temperatura y ph extremos. (100 ph alcalinos) D: tóxico, irritante e inflamable. No permite reubicar el corte. No usar material de vidrio

22 PORTAOBJETOS

23 IDENTIFICACION DE PORTAOBJETOS LAPIZ DIAMANTE LAPIZ GRAFITO LAPIZ PERMANENTE

24 IDENTIFICACION DE PORTAOBJETOS Lápiz permanente Lápiz diamante PORTAOBJETOS CON LAPIZ DIAMANTE

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26 OTROS PROCEDIMIENTOS Posterior a la obtención del corte, identificación, secar, desparafinación, hidratación y anterior al proceso de tinción, existen procedimientos derivados de fijador utilizado. ELIMINACION PIG. FORMOLADO Desparafinar y llevar los cortes hasta agua destilada Colocar los cortes en un borrel con una solución de acido pícrico al 6. -8% en alcohol absoluto durante 10 minutos a 2 horas Lavar en abundante agua corriente Continuar con la técnica.

27 Pigmento Formolado ELIMINACION PIG. BICLORURO MERCURIO Utiliza una Solución de Lugol o de Alcohol yodado Colocar las muestras en lugol o alcohol yodado durante 10 minutos Lavar en agua destilada Pasar por sulfito de sodio al 0,25% hasta que los cortes pierdan el color amarillo del yodo Lavar en abundante agua destilada

28 ELIMINACION DEL ACIDO PICRICO Se busca eliminar el color amarillo característico de este reactivo, se realiza colocando las láminas en una solución de carbonato de litio al 0,2% por 10 a 20 minutos. MEDIOS DE MONTAJE TM PATRICIA TOLEDO RODRIGUEZ

29 Es un medio que se coloca entre el portaobjetos con el tejido y el cubreobjetos

30 IMAGEN PORTA Y CUBRE OBJETIVOS Permitir hacer más duraderas las preparaciones. Facilitar su manipulación No interferir con la observación microscópica

31 INDICE DE REFRACCION Es una medida que determina la reducción de la velocidad de la luz al propagarse desde un medio homogéneo. Se busca medios de montaje con un IR cercano a 1, el que es el IR del aire. IR AIRE : IR AGUA : IR VIDRIO : 1.52 INDICE DE REFRACCION MEDIO ORIGEN IR SOLUCION IR SOLIDO BALSAMO DE CANADA NATURAL EUPARAL MIXTO PERMOUNT SINTETICO

32 HIDROFILOS: HIDRO= AGUA FILOS =AMIGO HIDROFOBOS HIDROFILOS 1.Gelatina de Kaiser 2.Gelatina 3.Jarabe de Von Apathy 4.Jarabe de Lillie y Ashburn

33 HIDROFOBOS 1. Resinas Naturales: Balsamo de canadá 2. Resinas Mixtas:Euparal 3. Resinas sintéticas: Flotex, Eukilt Agua Gelatina Glicerina GELATINA DE KAISER Fenol Hidratar la gelatina, agregar glicerina, calentar 10 min. A menos de 75 c. Mantener refrigerada. Calentar antes de usar.

34 GELATINA DE KAISER V: excelente medio hidrófilo. D: tiende a formar burbujas, cuidado con la temperatura (metagelatina), requiere calentar antes de usar. BALSAMO DE CANADA Se encuentra en el comercio. V: esta preparado, se usa directo. D: secado lento (días), en preparaciones antiguas el bálsamo se seca y resquebraja bajo el cubreobjetos. Fuera de uso

35 RESINAS SINTETICAS Se venden con diferentes nombre comerciales y fórmulas secretas. Flotex, Entellan, etc. V: se compra listo para usar, seca rápido, preparaciones de larga duración. D: Fórmula desconocida, contienen xilol. MEDIOS DE MONTAJE BALSAMO DE CANADA EUKITT

36 CUBREOBJETOS PINZA PATO

37 MONTAJE MANUAL MONTAJE MANUAL

38 MONTAJE MANUAL MONTAJE AUTOMATICO