Lex Guillermo Medina Magües. César Bedoya Pilozo, MSc.

Transcripción

1 «Genotipificación del Virus del Papiloma Humano mediante secuenciamiento y PCR cuantitativa en tiempo real y detección de variantes intratípicas por análisis filogenético» Lex Guillermo Medina Magües César Bedoya Pilozo, MSc.

2 La tesis de grado de ESPOL fue realizada en el Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública INSPI - Guayaquil. Dentro del proyecto del SENESCYT PIC-12-INH-001 «Epidemiología Molecular del Virus de Papiloma Humano para la Prevención del Cáncer Cérvico Uterino en mujeres de la Región Litoral del Ecuador». Siendo éste aprobado por el Comité de Bioética Institucional del Hospital del Niño Dr. Francisco de Ycaza Bustamante.

3 El VPH Es la ITS más común en el mundo. Afecta al menos, al 70% de los adultos sexualmente activos. Causa el 99% de los casos de cáncer cervicouterino, por lo que la detección, genotipificación y el grado de progresión de este virus es esencial para la prevención del cáncer citado. En Ecuador es una de las primeras causas de muerte oncológica (primera en mujeres de años).

4 Evolución del VPH El VPH ha convivido y coevolucionado junto a los humanos. Nuevos genotipos, variantes, linajes y sublinajes han aparecido. Género Especie Genotipo Variante Género Especie Genotipo Linaje Sublinaje Se clasifican en VPH de Alto y Bajo riesgo oncogénico. Los genotipos más frecuentes del VPH oncogénico en el mundo son el VPH 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 y 58. Las variantes intratípicas pueden diferir en la patogenicidad del virus.

5 Resultados de genotipificación (otros estudios en Ecuador) 1. VPH 16, 81, 31, 53, 56 y VPH 16, 52, 58, 59, 62, 71, 72 y VPH 18, 33, 16 y VPH 16, 66, 43 y VPH 16, 58, 52, 6, 11, etc. Debido a: Uso de cebadores distintos, incapacidad de detectar los genotipos, sensibilidad y especificidad del ensayo en particular. número de muestras Solamente el secuenciamiento del ADNv es capaz de genotipificar todos los genotipos y variantes del VPH.

6 Ensayo Ensayos para genotipificación Linear Array genotyping HPV (Roche) VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 Genotipos detectados AR y ARP (posible AR) BR *según el fabricante *según el fabricante VPH 6, 11, 26, 40, 42, 53, 54, 55, 61, 62, 64, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 y CP6108 Región blanco L1 (PGMY09/11) f-hpv typing kit (F-HPV) VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 VPH 6 y 11 E6 y E7 INNO-LiPA HPV Genotyping Extra (Innogenetics) VPH 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82 VPH 6, 11, 40, 43, 44, 54, 69, 70, 71 y 74 L1 (SPF10) Digene HPV genotyping LQ test (Qiagen) VPH 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68 (68a), 73 y 82 (IS39&MM4) - L1 (GP5+/6+) PANArray HPV genotyping chip (Panagene) VPH 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 70 y 73 VPH 6, 11, 32, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 62, 81 y 83 L1 (MY09/11, GP5+/6+) PapilloCheck (Greiner Bio One) VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73 y 82 VPH 6, 11, 40, 42, 43 y 44 E1 CLART human papillomavirus 2 (Genomica, S.A.U.) VPH 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 72, 73, 82, 84, 85 y 89 VPH 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 62, 70, 71, 81 y 83 L1 PCR Human Papillomavirus Typing Set (Takara) VPH 16, 18, 31, 33, 35, 52b y 58 VPH 6 y 11 E6 y E7 Kit Anyplex II HPV28 Detection (Seegene) VPH 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 73 y 82 VPH 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61 y 70 L1, E6 y E7 Secuenciamiento (in-house) Todos Todos Depende de los cebadores usados

7 Objetivo Evaluar el uso en la genotipificación al ensayo Anyplex II HPV 28 (H28), mediante la comparación de los resultados con el secuenciamiento; y disponer información de las variantes circulantes del VPH 16 y 58 en la población estudiada.

8 Muestras Criterio de inclusión: mujeres con citología NIC 1, 2 y 3; y ser mayor de 30 años. Provincias de Esmeraldas, Manabí, Los Ríos, Santa Elena, Guayas y El Oro. 192 muestras fueron codificadas por el INSPI y luego se diagnosticó el VPH.

9 Procedimiento Errores 4.43% 192 Primers MY 11/ (+) (DPO ) (TOCE ) (Cyclic-CMTA)

10 Porcentaje de frecuencias Porcentaje de frecuencia de genotipos encontrados con secuenciamiento y en la primera curva de H muestras TIPOS ENCONTRADOS CON SECUENCIACIÓN TIPOS ENCONTRADOS CON H28 (Primera Curva) 50% 45% 40% 45,3% Concordancia del 64% (89/139). 35% 30% 25% 20% 23,0% 20,1% 30,9% 15% 10% 5% 1,4% 7,2% 6,5% 2,9% 7,9% 0% Genotipos de VPH 85.6% (119/139) en todas curvas

11 Porcentaje de frecuencia Porcentaje de frecuencias encontradas por H28 en cada individuo 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% El kit H28 nos permite ampliar nuestro campo de apreciación de infecciones múltiples o coinfecciones. 26,6% 19,0% 14,6% 17,1% 8,9% 6,3% 5,7% 1,3% 0,6% Cantidad de coinfecciones por individuo

12 Porcentaje de frecuencias Porcentaje de frecuencia de genotipos totales encontrados con secuenciamiento y con H28 TIPOS TOTALES ENCONTRADOS CON SECUENCIACIÓN TIPOS TOTALES ENCONTRADOS CON H28 80% 75% 70% 65% 60% 55% 50% 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 77,8% 49,4% 41,7% 41,1% 30,4% 24,1% 18,5% 6,0% 2,6% 1,3% Genotipos de VPH

13 Discusión: porcentajes de frecuencias individuales En el secuenciamiento: El kit H28: Gardasil 9: 6/11/16/18/31/33/45/52/58 Mejía et al (2015) *Preferencia por parte de los cebadores MY en amplificar ciertos tipos de VPH; cebadores degenerados. *Tipo en alta prevalencia en H28, no es genotipificado por el secuenciamiento

14 Árbol filogenético del VPH muestras, 79.4%; linaje A Linaje A Linaje B Linaje C 7 muestra, 20.6%; linaje D Linaje D

15 Árbol filogenético del VPH 58 Linaje A Linaje B Linaje C 16 muestras, 94%; linaje A Linaje D 1 muestra, 6%, linaje C

16 Árbol del VPH 16 mostró: Discusión: Análisis filogenéticos Linaje A (Europea), presente en 80% de las secuencias analizadas; el resto de las secuencias (20%) se agruparon con el linaje D (Asiática-Americana), que se caracteriza posiblemente por tener un mayor potencial oncogénico. Total 34 secuencias. Mejía et al (93.75% la Europea y 6.25% la Asiática-Americana). Total 17 secuencias. Árbol filogenético del VPH 58: Sólo una secuencia se agrupó al linaje C. El resto (94%) se agruparon con el linaje A. Total 17 muestras. Los linajes A, en especial (A2-A3) presentan posiblemente mayor potencial oncogénico.

17 Conclusiones El kit H28 con su tecnología permite la genotipificación inclusive en coinfecciones numerosas donde el secuenciamiento es ineficaz. La frecuencia de genotipos encontrados debe tomarse en cuenta para la vacunación contra VPH en Ecuador. Se evidenció las variantes circulantes del VPH 16 y 58 en la población estudiada, proporcionando valiosa información para Ecuador. El 20% de las variantes del VPH 16 encontradas perteneció a una posible variante agresiva llamada Asiática Americana (AA).

18 INSPI Ac. César Bedoya Pilozo, MSc. Blga. Ma. Alejandra Ibarra Blga. María Quimis Ponce Blga. Karla Párraga Macias Inés Badano, PhD. Alberto Orlando N, MSc. Blga. Martha Sánchez Lcda. Johanna Parrales V. Blga. Denisse Molina Blga. Nancy Flores, MSc. Laboratorio de Biomedicina - ESPOL Blgo. Washington Cárdenas M. PhD. Blgo. Jaime Jockteng Blgo. Roberto Cucalón Blgo. Daniel Reyes, MSc.

19 IV Encuentro Internacional de Investigación en Enfermedades Infecciosas y Medicina Tropical.

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21 Kit Anyplex II HPV28 Detection (H28) Detecta y genotipifica individualmente hasta 28 genotipos del VPH en dos reacciones. Tiene el potencial de mejorar la genotipificación del VPH utilizando las tecnologías: Dual Priming Oligonucleotide (DPO ), Tagging Oligonucleotide Cleavage and Extension (TOCE ) y el análisis semicuantitativo (Cyclic-CMTA) que se detallan a continuación:

22 Análisis semicuantitativo (Cyclic-CMTA) Fuente: Seegene Inc. (Seoul)

23 Frecuencias Frecuencia de genotipos encontrados con secuenciamiento y en la primera curva de H28 TIPOS ENCONTRADOS CON SECUENCIACIÓN TIPOS ENCONTRADOS CON H28 (Primera Curva) Genotipos de VPH

24 Frecuencias Frecuencia de genotipos totales encontrados con secuenciamiento y H28 TIPOS TOTALES ENCONTRADOS CON SECUENCIACIÓN TIPOS TOTALES ENCONTRADOS CON H Genotipos de VPH

25 El kit H28:

26 Filogenia jmodeltest 2.1.7: HKY+I BEAST Base frequencies: Estimated Site heterogeneity model: Invariant sites Partition into codon position: 3 partitions Relaxed uncorrelated lognormal clock model Model: Bayesian Skyline Plot (BSP) El maximum clade credibility tree (MCCT) (TreeAnnotator descartando el 10% inicial) FigTree 1.4.2