TEMA 04 METABOLITOS PRIMARIOS Y SECUNDARIOS. Clasificación, fundamento químico de marchas fitoquímicas y reacciones de identificación.

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1 TEMA 04 Contenidos: METABOLITOS PRIMARIOS Y SECUNDARIOS Clasificación, fundamento químico de marchas fitoquímicas y reacciones de identificación. I. Clasificación Los principios activos son sustancias que se encuentran en las distintas partes u órganos de las plantas y que alteran o modifican el funcionamiento de órganos y sistemas del cuerpo humano y animal. La investigación científica ha permitido descubrir una variada gama de principios activos, de los cuales los más importantes desde el punto de vista de la salud, son los aceites esenciales, los alcaloides, los glucósidos o heterósidos, los mucílagos y gomas, y los taninos. Existen en las plantas otros principios activos relevantes denominados nutrientes esenciales, como las vitaminas, minerales, aminoácidos, carbohidratos y fibras, azúcares diversos, ácidos orgánicos, lípidos y los antibióticos. 1.1 Metabolitos primarios: Son comunes a todas las células y son necesarios para el funcionamiento adecuado de las células y organismos. Glúcidos: Drogas con oligósidos (caña de azúcar, remolacha azucarera). Drogas con polisacáridos elaborados por microorganismos (dextrano). Drogas con Polisacáridos aislados de algas (ácido algínico, carragenanos, otras). Polisacáridos de los vegetales superiores: Polisacáridos homogénos: Almidón, celulosa, fibras alimentarias, inulina, otras.

2 Polisacáridos heterogéneos: Gomas (goma karaya, otras) Mucílagos (goma de algarrobo, zaragatonas, otras). Pectinas. Metabolismo Primario El metabolismo primario comprende los procesos químicos que cada planta debe realizar cada día para sobrevivir y reproducirse: Fotosíntesis Glicólisis Ciclo del ácido cítrico Síntesis de aminoácidos Transaminación Síntesis de proteínas y enzimas Síntesis de coenzimas Síntesis de materiales estructurales Duplicación de material genético Reproducción celular (crecimiento) Absorción de nutrientes 1.2 Metabolitos secundarios: Son moléculas orgánicas que no cumplen ningún rol fisiológico en los vegetales en su crecimiento y el desarrollo. Generalmente se encuentran en cantidades relativamente pequeñas y su producción puede ser extendida o restringida a familias, géneros, o especies particulares. Compuestos fenólicos: flavonoides, leucoantocianos, cumarinas, antocianinas, taninos y antraquinonas. Terpenos y esteroides: triterpenos, esteroles, saponinas Alcaloides: alcaloides Metabolismo Secundario El metabolismo secundario comprende los procesos químicos que son únicos para una planta dada, y no son universales. El metabolismo secundario representa el conjunto de las reacciones químicas que da lugar a la formación de un producto natural. Partes de estas reacciones químicas son comunes a un cierto número

3 de diferentes plantas o familias de plantas, pero el resultado obtenido (producto natural) generalmente es diferente de una planta a otra. Precursores químicos comunes pueden producir resultados diferentes. Los metabolitos secundarios no parecen ser necesarios (en la mayor parte de los casos) para la supervivencia de la planta, pero pueden conferirle una ventaja competitiva. II. Fundamento químico de marchas fitoquímicas Tamizaje Fitoquímico: El tamizaje fitoquímico o screening fitoquímico es una de las etapas iniciales de la investigación fitoquímica, que permite determinar cualitativamente los principales grupos químicos presentes en una planta y a partir de allí, orientar la extracción y/o fraccionamiento de los extractos para el aislamiento de los grupos de mayor interés. El tamizaje fitoquímico consiste en la extracción de la planta con solventes apropiados y la aplicación de reacción de color y precipitación. Debe de permitir la evaluación rápida, con reacciones sensibles, reproducibles y de bajo costo. Los resultados del tamizaje fitoquímico constituyen únicamente en una orientación y debe de interpretarse en conjunto con los resultados del screening farmacológico. Así cuando una planta revela acción sobre el sistema nervioso central durante el tamizaje farmacológico y presencia de alcaloides en el tamizaje fitoquímico, es bastante probable que la acción farmacológica se deba a la fracción alcaloidal. De la misma manera, el hecho de evidenciarse acción antiinflamatoria en el tamizaje farmacológico y la presencia de flavonoides en el tamizaje fitoquímico, puede dar lugar a procesos de aislamiento y sometimiento a pruebas más especificas de estos compuestos. Efectos catárticos pueden ser asociados a las antraquinonas. La presencia de glicósidos cianogénicos durante la marcha fitoquímica puede dar lugar a la descartación de la planta por su alta toxicidad. La confirmación de la actividad farmacológica o antimicrobiana justifica la continuación de los estudios. El screening fitoquímico proporciona datos preeliminares sobre los constituyentes químicos de la planta que, junto con los resultados del tamizaje farmacológico, pueden orientar la continuación de los estudios. Diversos métodos de tamizaje fitoquímico están descritos en la literatura.

4 Algunos evalúan pocos grupos de sustancias, en compensación, otros evalúan la presencia de compuestos de poco interés, como ácidos grasos, azucares reductores, polisacáridos y mucílagos. La cantidad de material vegetal para realizar las pruebas varia de 5 g a 200 g. Ejemplos 01: La planta completa de Arenaria erinacea Boiss. (1), seca y pulverizada (100 g) fue extraída exhaustivamente con etanol 95% (v/v). Una vez obtenido el extracto etanólico se procedió a su purificación siguiendo la metodología de extracción líquido-líquido. El residuo se disolvió en (2x) 8 ml de DCM y se lavó con (x2) 8 ml de agua. Las fases acuosas se reunieron y se procedió a lavar con (4x) 10 ml de n-butanol. La fase orgánica se seca con sulfato de magnesio (MgSO4). El extracto n-butanólico fue concentrado a sequedad en el rotavapor (Büchi R-200). Posteriormente, este residuo (60 mg) se purificó mediante cromatografía preparativa en columna tipo flash con relleno de silica gel 60 (Merck) y eluido con la mezcla acetato de etilo-hexano (1:7). Todo el proceso de purificación se siguió por TLC (Silicagel 60 F254).Se obtuvieron 2 mg de producto puro. La fracción resultante de la elución de la columna, tras su desecado, se intentó caracterizar por sus propiedades espectroscópicas de Resonancia Magnética Nuclear de Protón (1H RMN). Para ello, la muestra se disolvió en metanol deuterado (CD3OD) pero debido a la escasa cantidad de muestra obtenida no se pudo caracterizar de forma fehaciente ningún compuesto o estructura conocida.

5 EJEMPLO 02: METODOS DE SCREENING FITOQUIMICO Material vegetal hexano Extracto hexánico Marco Diclorometano Grasas, Pigmentos Terpenoides Extracto DCM: Fenoles metoxilados Alcaloides Marco Extracto EtOAc Geninas de Flavonoides EtOAc Marco MeOH Heterosidos Alcaloides Extracto MeOH Marco H 2 O Fenoles,Heterosidos Extracto Acuoso Residuo Polisacaridos Polifenoles

6 EJEMPLO 03: MARCHA FITOQUÍMICA 5 mg de Extracto + V gotas de reactivo para: Rx. de la Gelatina Rx. de la Ninhidrina Taninos Aminoácidos Rx. del Tricloruro de Hierro Rx. de Nitrato de Cerio Amoniacal Compuestos fenólicos Alcoholes Rx. de Shinoda Rx. de Dragendorff Flavonoides típicos Alcaloides Rx. de Mayer Rx. de Borntranger Alcaloides Antraquinonas Rx. de Molish Rx. de Vainillina-H2SO4 M Heterósidos Rx. de Aurona Heterósidos Rx. de la Hidroxilamina Heterósidos Compuestos carbonílicos Rx. de las Hidrazinas Rx. de Lieberman Compuestos carbonílicos Esteroides y/o terpenoides Rx. de la Prueba de la espuma Saponinas III. Ensayos fisicoquímicos cualitativos: Los principios activos suelen encontrarse en la droga en muy bajas concentraciones, por lo que tendremos que realizar una perfecta extracción de los mismos, ya que si ésta es deficiente, podemos dar como negativo un resultado que es positivo. 3.1 Reacciones de identificación: Estos métodos comprenden coloración, de precipitación, fluorescencia, microsublimación, que permiten detectar sustancias químicas características de una planta.

7 3.1.1 Coloración o precipitación: Se pueden considerar como ensayos rápidos complementarios que forman parte del amplio esquema a realizar en el control de una planta. Se realizan sobre un extracto de la planta, siendo el extracto alcohólico el más utilizado para detectar los principios activos más importantes Fluorescencia: Se utilizan longitudes de onda corta (espectro ultravioleta), produciendo fluorescencia de color amarillo hasta celeste, Ejemplo cumarinas, polifenoles y flavonoides. Drogas que contienen alcaloides tropánicos: Atropa belladona (Belladona) tiene una cumarina que da fluorescencia azul, mientras que Hyoscyamus niger L. (Beleño) y la Datura stramonium L. (Estramonio) no la tienen Microsublimación: Este ensayo suele realizarse con drogas con principios fácilmente sublimables (antraquinonas, alcaloides). La determinación del punto de fusión o la producción de determinadas reacciones coloreadas características de los cristales formados sirven para la identificación de la droga. 3.2 Análisis cromatográfico: Permite separar los diferentes componentes de una especie determinada Cromatografía de adsorción: Depende de la diferente polaridad que presentan los distintos productos, así como de su configuración molecular. Entre los adsorbentes más empleados se encuentran diversas sustancias, siendo el Silicagel G, la alúmina, caolín las más empleadas. Es válido en el aislamiento y purificación de vitaminas, hormonas, diversos alcaloides, heterosidos, cardiotónicos, antraquinonas, etc. Cromatografía de partición: La separación de los componentes de una mezcla va a depender de los diferentes coeficientes de reparto, que ellos presentan entre dos fases: una fase acuosa y una fase orgánica no miscible; por tanto la separación se basa en la diferencia de solubilidad entre dos fases líquidas, pudiendo modificarse esta solubilidad por cambios de fuerza iónica o el ph de cada una de estas fases.

8 l UNIVERSIDAD CATOLICA LOS ÁNGELES DE CHIMBOTE Cromatografía en papel (CP) y capa fina (CCF) Son técnicas analíticas simples, donde la separación de las sustancias viene determinada por un conjunto complejo de propiedades físicas: velocidad de difusión, solubilidad del soluto y naturaleza del disolvente, capacidad de adsorción, intercambio iónico, etc. De las dos, la más utilizada es la CCF, porque se utiliza menores cantidades de muestra. La CCF, debido a su bajo costo y porque puede realizarse con poca muestra, es una técnica ampliamente usada en los controles de toda clase de productos naturales y se ha establecido como un método analítico muy importante en las modernas farmacopeas, permitiendo identificar de forma rápida el número de componentes presentes en un material vegetal. Se usa como ensayo semicuantitativo, comparando las intensidades de las manchas cromatográficos visualizados con patrones adecuados, lo que permite eliminar drogas de baja calidad o adulteradas. CCF Unidimensional CCF Bidimensional o Preparativa Reveladores: Universales: I 2, Br 2, H 2 SO 4, Luz UV Específicos: Dragendorff (alcaloides), Lieberman (terpenos y/o esteroides Placa 20x20 90º Recuperar y Filtrar con MeOH Cristalizar Elucidación Estructural: UV, IR, RMN, EM

9 3.2.2 Cromatografía gaseosa (CG) Esta técnica es utilizada principalmente en el estudio de las drogas con composiciones volátiles. La CG permite identificar aceites esenciales, alcanfor, ácidos vegetales, algunos alcaloides como del opio (Papaver somniferum L.) y tabaco (Nicotiana sp.), resinas del cannabis (Cannabis sativa L.) y compuestos esteroides como sapogeninas y heterosidos cardiotónicos. Otra aplicación es la detección y determinación de cocaína y sus metabolitos en el organismo humano, de gran importancia en el campo forense. 1 1 H. H. Perforatum Perforatum 2 2 muestra muestra comercial comercial T1 T1 hypericina hypericinat2rutina clorogenico clorogenicohyperosido hyperosidoisoclorogenico isoclorogenico Piperita Piperita y y japonesa japonesa mentofurano mentofurano nta piperita piperita y y crespa crespa ntol tol carvona carvona Menta Hiperico Cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) Es una técnica muy sencilla y muy sensible, que se puede realizar directamente sobre el extracto acuoso o alcohólico de una droga, sin necesidad de etapas previas de purificación. Permite la separación de moléculas muy parecidas, incluso isómeros. Se puede aplicar a una amplia gama de compuestos fijos no volátiles, tales como alcaloides, heterosidos, lípidos, esteroides, glúcidos, proteínas, vitaminas, etc Electroforesis Este ensayo se basa en el transporte de sustancias cargadas en un campo eléctrico. Se impregna un soporte (papel, gelatina, sephadex ) en un electrolito que lo hace conductor; en el centro del mismo se coloca la sustancia

10 problema y se somete a diferencia de potencial generada por dos electrodos. El paso de la corriente eléctrica determina la separación de la sustancia en función de la naturaleza, carga, masa del electrolito y concentración de iones del mismo diferencial de potencial aplicado. Se aplica para separar alcaloides.