15/07/2015. Experiencias de estudios de campo en cisticercosis del LRNZP INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN INTRODUCCION

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1 Experiencias de estudios de campo en cisticercosis del LRNZP Blgo. EduardoRenatoAyalaSulca HOMOLOGADO pormin.educ.-españa Dr(c) Mg(c) BIOTECNOLOGÍA Laboratorio Ref. Nac. de Zoonosis Parasitaria DEET-CNSP/INS INTRODUCCIÓN La teniosis/cisticercosis: zoonosis producida por T. solium, es una parasitosis que afecta principalmente a personas pobres del mundo, pertenece al grupo de enfermedades desatendidas u olvidadas, pero son erradicables, considerado un problema de gran impacto en la salud pública con pérdidas económicas. La neurocisticercosis (NCC) es la enfermedad neurológica más importante causada por parásitos en humanos (OMS). En Perú esta zoonosis es endémica, cuya prevalencia oscila entre %(hospitales de Lima) y 8%(Selva-Tarapoto). INTRODUCCIÓN En la Red de Labs. del INS, el diagnóstico de cisticercosis por IB no se realiza por el costo elevado y no estar implementado el programa de vigilancia y control por el MINSA. En nuestro país a la fecha no se ha reportado el rango de los valores de la [Prot] antigénica LVC.T.solium, los cuales sirvan como referencia a los investigadores. MINSA no cuentan con Kit de Dx. cisticercosis humana. El Lab. R.N.Zoon.Paras.-INS produce kit in house con Ag.nativo Total LVC.T.solium INTRODUCCION Ciclo biológico Hombre-Porcino Porcino-Hombre Puerta de entrada: Vía oral x huevo T.sol. Diseminación: Vía sanguínea x cist. Localización: 1.- SNC 2.- Ojo 3.- Tejido subcutáneo (pocos casos Sud A.) 4.- Músculo 5.- Otros 1.- Coordinaciones con autoridades 2.- Recolección de material biológico (LVC) de zonas endémicas 3.- Procesamiento de LVC en LRN.ZP-INS, mediante Lowry para [prot], y preparación de Ag. nativo T. 4.- Determinar la curva estándar de seroalbúminabobina (BSA) y LVC 5.- Realizar corrida electroforética Ag. nativo T. para perfil protéico 6.- Preparar Tiras reactivas IB - kit Ag.nativo Total LVC.T.sol. 7.- La [prot] Ag.nativo Total (LVC.T.sol.) es 1µg/µL. para inmunodiagnóstico (prueba de ELISA o de Inmunoblot). 1

2 1.- Coordinaciones con autoridades : LRR, DIRESA, Municipio, Camal municipal o particular, la Universidad, autoridades locales y comunales. 2.- Recolección de material biológico (LVC) de zonas endémicas: Obtención de Ag.nativo-Total y producir el kit in house. Junín; Huánuco; Cajamarca; Ayacucho; Ucayali; Abancay; Cusco Cortesía CDC San Juan de Occollo, cerca a Andahuaylas, Peru 1998 FLUJOGRAMA CISTICERCOSIS: PREPARACIÓN DE ANTÍGENO Musculatura naturalmente infectado de porcino Extracción de cisticercos Obtención del LVC (Aspirar con jeringa tuberculina Centrif.refrig. a g x 60 mins. Cortesía CDC CERDO: Coprofagia Cisticercos en tejidos de cerdo infectado naturalmente En lengua En costillar En corazón En músculo En cerebro 2

3 OBTENCIÓN DEL LVC Obtención del LVC Disección de musculatura de cerdos provenientes de zonas endémicas: Huancayo, Huánuco, Ayacucho, Ucayali. Participaron Lab.Ref.Reg. y Lab.Ref.Nac.Zoon.Paras.-INS (LRNZP-INS) LVC.T.sol. (traslúcido), principal fuente antigénica para preparar kits in house de inmunodiagnóstico, en zonas de alta endemicidad. Los kits son utilizados en el diagnóstico de la cisticercosis humana. larva o cisticerco de T.solium. C: canal espiral, Ex: escólex, P: pared vestibular, Pv: pared vesicular y V: espacio vestibular. 3.- Procesamiento de LVC en LRN.ZP-INS, mediante Lowry para determinar [prot.] antigénica del LVC.T.solium, procedente de cerdos naturalmente parasitados de zonas endémicas del Perú y preparar Ag. nativo T. 4.- Determinar la curva estándar de seroalbúminabobina(bsa) y LVC. PROCEDIMIENTO * Recolectar el fluido vesicular de cisticerco (LVC) T.sol. * LVC centrifugar a 40,000 rpm. a 4 C x 60 * Sobrenadante conservar a - 20 C. * Determinar [proteica] antigénica x Lowry (1) Corrida electroforética Perfil proteico, SDS-PAGE 15% (160 V x aprox.70 ) (2) Corrida electroforetica Transferencia a membrana nitrocelulosa (55 V x 1 hr.) * Rx. Inmunoenzimática Pool de sueros (+) y (-) PROCESAMIENTO DEL LVC MÉTODO LOWRY Procedimiento determinación de 1. Obtención de la curva estándar y la concentración de proteína de la muestra problema. 2. Rotular 6 tubos para las diluciones de acuerdo a los cuadros siguientes: A. Para la curva estándar (todos los volúmenes se dan en µl.) Blanco Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 React. BSA(1mg/ ml H20 bid B.alcalino R.de Cu Reposar x 10 Minut. Folin (1:4) Dejar Reposar 10 Minutos, agitar en el vórtex y leer a 700nm. B. Para las muestras (todos los volúmenes se dan en µl) Muestra 1 Muestra 2 Reactivo Muestra H20 bid B.alcalino R.de Cu Reposar 10 minuto Folin (1:4) Dejar reposar por 10 minutos, vortexeary leer a 700nm. 3

4 Tabla N 1: DATOS PARA LA CURVA ESTANDAR DE ALBUMINA MÉTODO: LOWRY Gráfico N 1: Curva Estándar BSA Absorvancia (DO) BSA µg µg experimental r1 r1-b r2 r2-b Promedio 10 0,392 0,089 0,412 0,109 0,099 3, ,504 0,201 0,484 0,181 0,191 17, ,761 0,458 0,75 0,447 0,452 56, ,125 0,822 1,115 0,812 0, , ,65 1,347 1,7 1,397 1, ,711 b (blanco)= Curva estandar ploteada: Absorvancia ó DO vs. Masa de proteínas ó[prot] enµg. Elfactor decalibraciónres0,9899yestáenelrangode aceptable PRUEBA DE ELISA Tabla N 4: CUANTIFICACIÓN PROTEICA DEL ANTÍGENO DE CISTICERCO DE Taenia solium (LVC. T.solium) Método : Lowry Concentración protéica del Antígeno de Cisticerco por el método Lowry Antígenos Procedencia Vol. utilizado en Concentración la reacción en µl protéica en µg/µl HCO Huanuco 20 0,937 UCAY Ucayali 20 0,806 HCYO.L Huancayo (lengua) 20 0,520 AYAC Ayacucho-Huanta 20 0,782 HCYO.M Huancayo (músculo) 20 3,596 PERFIL PROTEICO Ag.T.LVC.T.solium 5.- Realizar corrida electroforética Ag. nativo T. para perfil protéico 6.- Preparar Tiras reactivas IB - kit Ag.nativo Total LVC.T.sol. 7.- La [prot] Ag.nativo Total (LVC.T.sol.) es 1µg/µL. para inmunodiagnóstico (prueba de ELISA o de Inmunoblot). Electroforesis del Ag.T.LVC.T.sol. en Gel de Poliacrilamida con bandas diagnósticas (13 a 97 Kda) 4

5 PRUEBA DE INMUNOBLOT Electroforesis del Ag. en Gel de Poliacrilamida con bandas diagnósticas (13 a 35 Kda) para Transferencia LECTURA DE Dx. Cist. humana IB (+) con LVC-T.solium, condicionadas al reconocimiento de 1 ó más bandas (50-13 kda), 42, 35, 31, 24, 23, 18, 17, 14 y 13 kda. Fig.1. La mejor resolución para el Ag.LV.T.solium Huancayo (HCYO.M) total es 1.15 µg/mm, para el antígeno total Ayacucho (AYAC) es 0.82 µg/mm y para el antígeno HCYO.L es 0.62µg/mm. LECTURA DE IB Encuesta de pacientes neurológicos para la cisticercosis (EITB) Ubicación del Hospital Beijing, Rep.Pop.China(convulsiones) Beijing, Rep.Pop.China(todo Adm.neurol. 8 Bombay, India (convulsión +?) Ruanda (epilepsia) Peru Mexico (epilepsia) (epileptic) % positivos Encuesta total PROGRAMA PARA CISTICERCOSIS OBSERVASIÓN: campo-laboratorio integrado y sistemático - producir tests eficaces - Desarrollar una gestión eficaz del paciente - determinar la prevalencia - desarrollar fármacos eficaces - desarrollo eficaz y sostenible - prevención / estrategia de control - desarrollar vacuna para cerdos - desarrollar una asociación local para los programas de Mexico control (epileptic) - objetivo final = eliminación / erradicación La concentración proteica del material antigénico o Ag.T. va depender de muchos factores: el LVC no debe contener líquido intersticial ni restos de tejido, el LV debe ser incoloro, se debe tener en cuenta la cadena de frío, se debe observar la asepsia. Realizar estudios de tipo genético de la cisticercosis de cerdos parasitados naturalmente. 5

6 GRACIAS 6