Espectroscopía de Fluorescencia 2. Ana Denicola

Transcripción

1 Espectroscopía de Fluorescencia 2 Ana Denicola

2 Quenching de fluorescencia quenching = desactivación= apagamiento = menor emisión I F (Q) < I F (-Q) Reacciones en el estado excitado (Quenching colisional) Entrecuzamiento intersistema a estado Triplete Rearreglos moleculares Transferencia de energía Transferencia de carga Formación de complejo en el estado basal (Quenching estático)

3 Mecanismos de desactivación bimolecular * F + Q F+ Q * * F + Q F+ Q * + - F + Q F + Q * F + Q P Quenching colisional Transferencia de energía Transferencia de carga Reacción d[f*] dt =Σk [F*] + Σk [F*] + Σk [F*][Q] r nr d

4 Quenching colisional o dinámico hν X X * τ 0 Q hν k Q X XQ* τ < τ 0 τ / τ 0 = F/F 0 X + Q

5 Quenching colisional o dinámico A una concentración fija del fluoróforo, medimos cómo varía la fluorescencia con concentraciones crecientes de quencher y se calcula: F 0 /F (F 0 : fluorescencia en ausencia de quencher) Gráfico de Stern-Volmer F 0 /F = 1 + Ksv [Q] F 0 /F 1 Ksv [Q] Ksv = constante de Stern- Volmer, depende de: tipo de fluoróforo y quencher accesibilidad del fluoróforo (viscosidad,temperatura)

6 Quenching colisional o dinámico Stern-Volmer F 0 /F

7 Quenching de triptofano por O 2 K SV = 32 M -1

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9 Quenching colisional o dinámico K SV = k q τ 0 k q = cte. vel. quenching k 0 = cte. vel. colisional (controlada por difusión) f Q = fracción de encuentros efectivos que terminan en quenching k Q se determina experimentalmente a partir de K SV. Se estima la eficiencia de quenching f Q calculando k 0 según Smoluchowski: O se conoce la eficiencia de quenching f Q entonces se calcula k 0 para estimar el coeficiente de difusión D usando la ecuación de Stokes-Einstein:

10 = 1

11 Quenching dinámico y estático Se requiere contacto entre Q y F, interacción molecular Quenching dinámico o colisional: Q + F* Quenching estático: Q + F Q debe difundir hacia F distancias moderadas (a diferencia de relajación por solvente) Indica localización del F, exposición de F de manera de ser accesible a Q

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13 Colicin E1 = proteina de membrana 12 W

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15 Quenchers of W emission: Iodide, acrylamide, disulfide, e-defficient groups like NH3+, -COOH, histidine protonated

16 Carga del quencher afecta el quenching (Ksv)

17 Impedimento estérico disminuye quenching (Ksv) DHE = dihidroequinelin = esteroide fluorescente SBP = steroid binding protein

18 Quenching intermolecular Q y F están unidos covalentemente Enzima flavina reductasa con FMN unido La F de FMN en solución > F de FMN unido La Y35 responsible de quenching interno de FMN por transferencia electrónica

19 Autoquenching elevada concentración del fluoróforo Fluoróforos con poco corrimiento Stokes - reabsorción de las λ menores de emisión - formación de excímeros Rodamina 6G 5 µm 0.16 mm 5.7 mm

20 Transferencia de energía hν 1 hν 2 hν Donante FRET Aceptor Cuando una molécula del donante absorbe un fotón y hay una molécula de aceptor cerca, puede ocurrir la transferencia de energía del estado excitado del donante al aceptor por una via no radiativa. Como resultado de la transferencia de energía se observa una disminución en la intensidad de fluorescencia emitida por el donante y, si el aceptor es fluorescente, la aparición de una nueva señal fluorescente.

21 RESONANCE ENERGY TRANSFER (RET o FRET): F λ EX D λ EM D λex A λ EM A D λ EX D D * D A A * A λ EM A

22 Solapamiento espectral Absorbancia Fluorescencia Donante Fluorescencia Aceptor Absorbancia Solapamiento

23 La eficiencia de la transferencia depende de: la distancia entre D y A el grado de solapamiento entre el espectro de emisión de D y el de absorción de A la orientación relativa entre D y A el tiempo de vida de D* La constante de velocidad del proceso es: k T (r) = (1 / τ D )(R 0 / r) 6 R 0 : distancia de Föster (depende del par D-A) r: distancia D-A

24 El factor de orientación κ 2 = (cosθ T 3cosθ D cosθ A ) 2 D θ T θ A φ donde θ T es el ángulo entre los momentos de D y A, dado por θ D R A cos θ = sinθ sinθ cosφ + T D A cosθ D cosθ A θ D, θ A son los ángulos entre el vector de separación R, y los momentos D y A, respectivamente, y φ es el ángulo entre los planos (D,R) y (A,R) Los límites para κ 2 son 0 to 4, si las moléculas presentan movimientos isotrópicos rápidos κ 2 = 2/3

25 Diagrama de energía simplificado D* A* D A Transiciones acopladas D* A* Interacción dipolo-dipolo depende de la distancia entre moléculas y de la orientación relativa entre los dipolos k TE = ln 10 κ Q 5 6 d,a 128 π Na r τ η d d J 4

26 Eficiencia de la transferencia de energía E= k k TE TE + i k Experimentalmente, E puede calcularse a partir de los tiempos de vida o intensidades de fluorescencia del donante en ausencia y presencia del aceptor. E= - τ - I d,a d,a 1 = 1 τ d I d

27 Eficiencia de la transferencia de energía k TE = ln 10 κ Q 5 6 d,a 128 π Na r τ η d d J 4 E = kte 1/τ d + k TE k ΤΕ ( Ro ) = 1 τ d R 6 o = ln 10 κ Q d π Na η J E = r 6 Rο Rο d,a

28 Dependencia con la distancia 1 Efficiency of transfer E = r 6 Rο Rο d,a Distance in Angstrom Se pueden medir distancias por FRET entre ~0.5 R 0 and ~1.5R 0 Donante Aceptor R o (Å) Fluoresceina Tetrametilrodamine 55 IAEDANS Fluoresceina 46 Fluoresceina Fluoresceina 44 BODIPY FL BODIPY FL 57

29 Para que sirve? para medir distancia inter o intramoleculares. Con esa informacion se puede: -estudiar cambios conformacionales -medir asociaciones -colocalizarin vivo etc,etc se puede ver la disminución de la fluorescencia de D o el aumento de la emisión de A. En general se usa la primera forma. F λ EX D λ EM A

30 Hidrólisis de un sustrato

31 Unión de un sustrato

32 Fusión de vesículas

33 Cambios conformacionales

34 Medir distancias intramoleculares

35 Formación de agregados moleculares