PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Transcripción

1 PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Determinación de parámetros de cultivo para la evaluación del perfil de susceptibilidad in vitro en Malassezia spp. ANA VICTORIA TORRES DUQUE TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar el título de Microbióloga Industrial DIRECTORA MELVA YOMARY LINARES LINARES M.Sc. COODIRECTORA MARÍA XIMENA RODRÍGUEZ BOCANEGRA Ph.D. BOGOTÁ D.C., Noviembre 2012

2 Determinación de parámetros de cultivo para evaluación del perfil de susceptibilidad in vitro en Malassezia spp. ANA VICTORIA TORRES DUQUE APROBADO INGRID SHULER Ph.D DECANA ACADEMICA JANET ARIAS M.Sc DIRECTORA DE CARRERA

3 Determinación de parámetros de cultivo para evaluación del perfil de susceptibilidad in vitro en Malassezia spp. ANA VICTORIA TORRES DUQUE APROBADO MELVA LINARES M.SC DIRECTORA IVONNE GUTIERREZ JURADO

4 NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N 13 de Julio de 1946 "La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia".

5 AGRADECIMIENTOS Nadie llega solo a la meta, son muchas las personas que están ahí, apoyándonos y dándonos todo su cariño, compresión y amistad para no desfallecer en este largo camino. En primer lugar agradezco a Dios por todas las bendiciones que me da día tras día. A mis padres y familiares por el apoyo tan grande que me dieron, porque aunque el camino fue largo, siempre estuvieron a mi lado, esperando siempre el mejor resultado, este triunfo es de ustedes y mío. A mis directoras de tesis, Melva Yomary Linares y María Ximena Rodríguez, por su apoyo, compresión y entrega en la realización del presente trabajo. A Lorena Paloma y Andrea Ramírez, mis hermanitas adoptivas, que sin su ayuda estaría aun haciendo la parte practica. A Ange (la fotografa de Malassezia spp) yangelita por todos el apoyo moral y el ánimo que me dieron durante la realización de la parte practica. Y en general a todas las personas que de una u otra forma estuvieron siempre ahí brindándome su amistad, cariño y apoyo incondicional.

6 RESUMEN Malassezia spp. es una levadura que se caracteriza por ser lipodependiente, lo que hace necesario la inclusión de sustancias lipídicas en los medios de cultivo, dificultando la realización de pruebas de susceptibilidad in vitro, ya que por su fisiología se hace imposible la utilización de protocolos estandarizados como el M27-A propuesto por el CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Teniendo en cuenta esta característica fisiológica y por el interés de realizar pruebas de susceptibilidad in vitro para aislamientos clínicos obtenidos de humanos y animales, se propuso evaluar el inóculo inicial de trabajo y el medio de cultivo idóneo para el desarrollo del microorganismo. Para el inóculo inicial de trabajo se determinó el emulsionante que permitiera obtener la menor formación de conglomerados celulares bajo los tratamientos de Tween 80 al 0,1, 0,5 y 1%, Tween 40 al 0,5 y 1%, Glicerol al 1% y Tritón al 0,05%. Para el medio de cultivo se evaluaron tres bases de medio: caldo base urea de Christensen, caldo base urea de Christensen suplementado con solución estéril de urea y caldo Sabouraud, con diferentes suplementos lipídicos mediante un factorial recortado (Tween 40, Tween 60, Tween 80 y glicerol). La cuantificación de biomasa se realizó mediante lectura espectrofotométrica a una longitud de onda de 530 nm. El emulsionante del inóculo inicial óptimo para obtener suspensiones celulares homogéneas fue agua destilada con Tween 80 al 1%. Como medio de cultivo se estableció el caldo Sabouraud suplementado con Tween 40 al 0,5% y Tween 60 al 0,5% con un tiempo de incubación de 96 horas.

7 INTRODUCCIÓN, JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El género Malassezia actualmente se encuentra conformado por catorce especies (M. furfur, M globosa, M. restricta, M sympodialis, M. sloffiae, M. obtusa, M. pachydermatis, M. dermatis, M. japonica, M. yamatoensis, M. nana, M. equina, M caprae y M. cuniculi) (1), caracterizadas por ser levaduras lipodependientes/lipofílicas, es decir que no tienen la capacidad de sintetizar ácidos grasos saturados de cadena larga, indicando que requieren de la adición de una fuente externa de lípidos para su desarrollo, ya que son indispensables para la formación de sus estructuras (2). Estas levaduras forman parte de la microbiota normal de la piel de humanos y algunos animales homeotermos; sin embargo, bajo algunas condiciones y factores predisponentes pueden llegar a ser patógenas, causando afecciones como pitiriasis versicolor, dermatitis seborreica y foliculitis (3), además de otitis media y externa en animales, principalmente en caninos (4). También se encuentran reportes en pacientes inmunocomprometidos, especialmente en neonatos, personas con cáncer o VIH, causando infecciones sistémicas con altas tasas de mortalidad (5,6). Actualmente, el aumento de casos en humanos e infecciones en la piel de animales ha incentivado a la investigación de agentes antifúngicos eficaces para su tratamiento (7). Los tratamientos aplicados hoy en día frente a las afecciones causadas por este género de levaduras no son eficaces para erradicarlas completamente, por lo que en muchos casos se presentan como micosis recurrentes (8). Estos tratamientos incluyen el uso de agentes antifúngicos como el ketoconazol y el itraconazol durante periodos prolongados (7), sin embargo son pocos los datos que se tienen de la terapia antifúngica óptima para combatir este tipo de levaduras, desconociéndose si presenta resistencia a algún antifúngico (9). Algunos estudios realizados en la última década han demostrado que no todas las especies de Malassezia presentan el mismo comportamiento hacia los antifúngicos empleados, por ejemplo Rincón y colaboradores (2006) demostraron la baja actividad de los azoles frente a Malassezia restricta y Malassezia globosa, teniendo esta última una tasa de recurrencia del 60-80% en pitiriasis versicolor (10).Estas patologías carecen de un tratamiento único y efectivo contra estos microorganismos se debe a la ausencia de un protocolo estandarizado de pruebas de susceptibilidad in vitro para este tipo de levaduras, que permitan vigilar la aparición de resistencia frente a los antifúngicos utilizados en la terapia clínica. Esto debido a que existe dificultad para su aislamiento y crecimiento en medios convencionales, ya que necesitan la adición de sustancias lipídicas en el medio de cultivo, lo que ha obstaculizado realizar estudios in vitro del perfil de susceptibilidad, impidiendo la utilización de los protocolos estandarizados para levaduras no lipodependientes como el M27-A, propuesto por el CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (11).

8 Dado el interés que se ha generado por conocer el perfil de susceptibilidad in vitro de Malassezia spp. los estudios realizados para efectuar estas pruebas se han hecho modificado el protocolo M27-A del CLSI. En este estudio se tuvo como objetivo determinar los parámetros necesarios para realizar pruebas de susceptibilidad in vitro para Malassezia spp. enfocado a las condiciones necesarias para la realización del inóculo inicial de trabajo y el medio de cultivo idóneo para el crecimiento del microorganismo basándose en su fisiología y en los parámetros propuestos por el CLSI. MARCO TEÓRICO Generalidades de Malassezia spp. Malassezia spp. es una levadura que forma parte de la microbiota comensal habitual de la piel de los humanos, siendo aislada en 92 a 100% de personas sanas, en el conducto auditivo externo de perros, en la piel de osos, monos, cerdos, elefantes, gatos y aves (12), especialmente en zonas ricas en glándulas sebáceas (11). Taxonómicamente el género Malassezia se clasifica en el orden Malasseziales, subclase Ustilagomycetes y filo Basidiomycota (13). Todas las especies que pertenecen al género Malassezia, excepto M. pachydermatis, son lipodependientes, ya que utilizan ácidos grasos de cadena larga (ácido oleico, ácido linoleico) como fuente de carbono, lo que hace necesario suplementar los medios de cultivo, como el agar Dixon y Lemings. La temperatura de crecimiento oscila entre 31 a 35 C, con una temperatura óptima de 32 C (14). Macroscópicamente se evidencian colonias rugosas a lisas con bordes irregulares, secas, de color beige y microscópicamente sus células pueden ser globosas, subglobosas, ovales o cilíndricas, dependiendo de la especie; se reproducen por gemación unipolar dejando una cicatriz prominente y característica en la célula madre (9). Clínicamente Malassezia se asocia a pitiriasis versicolor, que es una micosis de distribución mundial, representando el 5% de las micosis en general y el 20% de las micosis superficiales. También es responsable de patologías como dermatitis seborreica, pustulosis neonatal y dermatitis atópica entre otras (5). El tratamiento de las diferentes patologías de Malassezia spp. se lleva a cabo con agentes queratolíticos, como el sulfuro de selenio, el azufre o el propilenglicol, la ciclopiroxolamina, la terbinafina y los derivados azólicos, como el ketoconazol en

9 soluciones, geles y champús. En casos sistémicos o con lesiones recurrentes se procede a la administración de antifúngicos por vía oral como ketoconazol e itraconazol (5). Pruebas de susceptibilidad Los métodos de susceptibilidad para antifúngicos se basan en la determinación del perfil de susceptibilidad de los hongos filamentosos o levaduriformes a un agente antifúngico, bajo condiciones de laboratorio específicas y estandarizadas. En 1992 el CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) determinó el método M27-A para realizar el perfil de susceptibilidad in vitro de levaduras a partir de microdilución en caldo, actualmente la versión M27-A3 (15). Sin embargo, el protocolo estandarizado para levaduras, no es aplicable a las especies de Malassezia, ya que no son capaces de desarrollarse sin fuentes lipídicas en el medio de cultivo, a excepción de M. pachydermatis, que es la única especie no lipodependiente (16). Estudios recientes se basan en la condición bioquímica de estos microorganismos, al ser ureasa positiva, tomando como primicia que en este medio el microorganismo puede desarrollarse, por lo que modificando el caldo base de urea de Christensen se ha logrado establecer condiciones para realizar pruebas de susceptibilidad in vitro (16,10). Estos ensayos preliminares se han realizado variando el protocolo establecido por el CLSI (M27- A) modificando el medio de cultivo en el cual se realiza la prueba, las condiciones de incubación y del inóculo (10,7). Optimización de medios de cultivo Para la realización de las pruebas de susceptibilidad in vitro es necesario la optimización del medio de cultivo para el metabolismo de las levaduras lipodependientes, lo que consiste en encontrar los componentes idóneos para el desarrollo del microorganismo sin que los costos aumenten significativamente (17). La optimización de medios de cultivo hace referencia al mejoramiento, reemplazo o búsqueda de los componentes del medio, la temperatura o ph (17), para el aumento de biomasa, por medio de diseños estadísticos, que evalúan niveles y variables a analizar. Actualmente hay diversidad de métodos útiles para evaluar las respuestas que se obtienen de las variables y niveles, ya sea utilizando toda la información o no. Cuando se está evaluando una única variable en un determinado tiempo el diseño se denomina One-factor-at-a-time design, pero si por el contrario se quiere estudiar el efecto de más de un factor de dos o más niveles el diseño se denomina Factorial design y para ello

10 existen varios métodos como lo son el factorial completo, factorial fraccionado y Plackett Burman, entre otros (18). OBJETIVOS Objetivo general Determinar las condiciones de inóculo y cultivo para el desarrollo de pruebas de susceptibilidad in vitro en Malassezia spp. Objetivos específicos Identificar las condiciones óptimas para la preparación del inóculo de trabajo. Determinar el suplemento de lípidos y el medio de cultivo para la realización de la prueba de susceptibilidad in vitro para Malassezia spp. METODOLOGÍA Cepas de trabajo Se utilizaron las cepas de referencia: Malassezia furfur CBS 7019, M. pachydermatis CBS 1879, M. sympodialis CBS 7222, M. slooffiae CBS 7956, M. globosa CBS 7986, de la colección de microorganismos de la Universidad de los Andes y un aislamientos obtenido de paciente canino (con otitis externa). Las cepas se conservaron en caldo leche descremada a -20 C y se reactivaron dada la necesidad de su uso, realizando siembra en agar Dixon modificado (medio que contiene 3.6% extracto de malta, 0.6% peptona, 1% Tween 40, 2% sales biliares, 0.2% glicerol, 0.2% ácido oleico) (10) e incubando a 32 C durante 48h, excepto para M. globosa que se incubó por 7 dias. Identificación de las condiciones de preparación del inóculo de trabajo (objetivo específico uno) A partir de las seis cepas de trabajo reactivadas, se tomaron de tres a cinco colonias para suspender en 5 ml de agua destilada estéril con los diferentes suplementos lipídicos,

11 Tween 80 al 0.1, 0.5 y 1%, Tween 40 al 0.5 y 1% y glicerol al 1%. Las suspensiones de células se llevaron a agitación en vortex por 60 segundos (en tres ciclos de agitación) y cuando fue necesario se calentó en baño termostatado a 37 C. Debido a que no se obtuvieron suspensiones celulares homogéneas, se procedió a utilizar perlas de vidrio, agitando en vortex en el tiempo ya descrito. La evaluación de las condiciones de preparación del inóculo se basó en la observación de la menor formación de conglomerados celulares a través del montaje en cámara de Neubauer. Luego de identificar el emulsionante adecuado para las levaduras, se preparó el inóculo de trabajo con una concentración de 1 x 10 6 cel/ml, que se ajustó por conteo de células en cámara de Neubauer y lectura por espectrofotometría a diferentes longitudes de onda (530, 620 y 660 nm) (10,15). Cinética de crecimiento Para conocer el comportamiento del microorganismo y establecer el tiempo de incubación y la longitud de onda a la cual se debían leer las pruebas posteriores de obtención del medio de cultivo, se realizó una curva de crecimiento de las seis cepas estudiadas en caldo base de Christensen con Tween 40 y glicerol. Se realizó el inóculo según como se determino anteriormente y se ajustó a una concentración 1x10 6 cel/ml mediante recuento en cámara de Neubauer. A partir de la suspensión se tomaron 150 ul y se adicionaron en 15 ml de caldo base urea de Christensen con Tween 40 y glicerol, realizando agitación en vortex. Se incubó durante 120 horas a 32 C, realizando muestreo cada 24 horas, desde la hora cero. Cada muestreo incluyó recuento en cámara de Neubauer y lectura de biomasa por medio de absorbancia a tres longitudes de onda (530, 620 y 660nm) (10, 15) Determinación de la influencia del color en la lectura por espectofotometría Para poder determinar que el color generado por la actividad enzimática del microorganismo (producido en el caldo urea de Chirstensens suplementado con solución estéril de urea) no interfiere con la lectura de la biomasa por medio de la absorbancia. Se tomó un medio inoculado con microorganismo, con una actividad enzimática fuerte, otro con una actividad enzimática leve, y uno sin inocular, pero cambiándole el color con hidróxido de sodio. A cada tonalidad se le realizó un barrido en el espectro de luz visible ( nm). De la misma forma se realizó con el medio de cultivo inoculado evidenciando o no cambio en la tonalidad. Determinación de las condiciones óptimas para el medio de cultivo (objetivo específico dos)

12 Determinación de medio de cultivo base y compuestos lipídicos: Para la optimización del medio de cultivo se evaluaron tres bases de medio, caldo base urea de Christensen, caldo base urea de Christensen suplementado con solución estéril de urea y caldo Sabouraud, cada una de las bases se enfrentó con cuatro variables Tween 80 al 0,1%, Tween 40 al 0,5%, Tween 60 al 0,5% y glicerol 1%, a través de un diseño factorial recortado, con tres réplicas, para cada uno, realizandolos siguientes ensayos y combinaciones indicados en la tabla 1. Tabla 1: Combinaciones de lípidos aplicados para cada una de las bases de medio. Bases de medio: Caldo base urea de Christesen suplementado con solución estéril de, caldo base de urea de Christensen y caldo Sabouraud Corrida Factor 1 A:Tween % Factor 2 B: Tween % Factor 3 C: Tween % Factor 4 D: Glicerol 1% 1 0, ,1 0, ,5 0, ,5 0,1 0, , ,5 0 0, ,05 5 0,5 9 0,5 0 0, ,05 5 0, ,1 0, , ,5 0, , ,1 0, , ,5 0,1 0, ,5 0,1 0, ,5 0 0, , , , ,5 0, , ,05 5 0,5 La prueba se llevó a cabo con las seis cepas de trabajo, incubando a a 32 C, con cuantificación de biomasa a través de la absorbancia. Tratamiento estadístico

13 Todos los datos obtenidos se analizaron mediante análisis multifactorial y análisis de varianza a un factor con pruebas posthoc (Duncan). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Determinación de las condiciones para la preparación del inóculo Para realizar las pruebas de susceptibilidad in vitro para Malassezia spp. se establecieron condiciones específicas apropiadas de acuerdo a la fisiología del microorganismo, basándose en la realización del inóculo y el medio de cultivo idóneo para su desarrollo. En primer lugar se realizó la optimización de las condiciones del inóculo buscando suspensiones homogéneas. Para esto las seis cepas de Malassezia spp., fueron evaluadas bajo diferentes tratamientos, buscando el emulsionante óptimo para realizar las suspensiones celulares, tal como se muestra en el diagrama 1. Se estableció que el emulsionante óptimo para la preparación inicial del inóculo de trabajo es agua destilada estéril suplementada con Tween 80 al 1%. Aunque no se logró un inóculo completamente homogéneo, fue el tratamiento que mostró menos conglomerados celulares (Figura 1). La dificultad para encontrar un emulsionante óptimo para Malassezia spp. radica en que estas levaduras son hidrofóbicas (19,20), por lo cual tienden a formar conglomerados celulares y a no dispersarse, lo que dificulta la obtención de inóculos y recuentos celulares totalmente homogéneos (20) (Anexo 1)

14 Diagrama 1: Tratamientos realizados en busca del emulsionante óptimo para la preparación del inóculo

15 Figura 1: Suspensiones celulares de Malassezia furfur, al lado izquierdo suspensión celular en Tween 80 al 0,5%y al lado derecho suspensión celular en Tween 80 al 1% El género Malassezia contiene en su pared celular una bicapa muy rica en lípidos, la cual se asemeja a una capsula, la cual le da su alto carácter hidrofobico(19,21). Adicionalmente, la hidrofobicidad de las células de estas levaduras depende de la especie, las condiciones de incubación y el medio de cultivo utilizado (20), los cuales están suplementados con diferentes lípidos que pueden aumentar su carácter hidrofóbico; sin embargo, el rendimiento en biomasa es escaso sin suplemento lipídico, incluso para M. pachydermatis (22). Cinética de crecimiento Para establecer el comportamiento del microorganismo a nivel del tiempo de crecimiento, así como el tiempo de incubación y la longitud de onda apropiada para la lectura de las pruebas posteriores en la obtención del medio de cultivo óptimo, se realizó a todas las cepas de trabajo una curva de crecimiento en caldo urea de Christensen suplementado con Tween 40 y glicerol (en las mismas concentraciones que se utilizan en el agar Dixon modificado). La cinética de crecimiento se llevó a cabo durante 120 horas a tres longitudes de onda diferentes (530,620 y 660 nm) para cuantificación de la biomasa, evidenciando una fase de adaptación de aproximadamente 24 horas, a la hora 48 se evidenció la fase exponencial que se extendió hasta las 120 horas, por lo cual no se observó ni la fase estacionaria ni de muerte. Sin embargo, al medir la biomasa por recuento de células, no se evidenció fase de adaptación para ninguna de las especies estudiadas, iniciando directamente con la fase exponencial, la cual a las 120 horas de evaluación no había terminado, excepto para M. furfur y M. pachydermatis donde a partir de la hora 72 se observó disminución en biomasa. Las diferencias observadas en las

16 curvas de crecimiento se deben a la dificultad para realizar de forma apropiada el recuento de células, ya que estas levaduras tienden a aglutinarse y formar cúmulos que en muchos casos son incontables, lo que imposibilita determinar un número exacto de células, gracias a su carácter hidrofóbico (19,20), lo cual genera un margen de error más alto (Anexo 2 y 3). Teniendo en cuenta los resultados obtenidos y los parámetros establecidos en el protocolo para realizar pruebas de susceptibilidad en levaduras mediante el documento M27-A2, se estableció las 72 y 96 horas como los tiempos de muestreos para realizar las pruebas posteriores. Frente a las tres absorbancias evaluadas para medir la producción de biomasa, las cuales fueron 530, 620 y 660 nm (10,15), se descartaron las lecturas realizadas en las longitudes de onda de 620 y 660 nm, debido a que no presentaron diferencias significativas frente a la absorbancia de 530nm, siendo esta última la que evidenciaba una mayor lectura en cuanto a la producción de biomasa (Anexo 3). Determinación de la influencia del color producido por la actividad ureasa Para determinar la influencia del color producido por la actividad ureasa en el medio caldo base urea de Christensen suplementado con solución estéril de urea en la cuantificación de biomasa por lectura espectrofotométrica, se realizó un barrido del espectro de luz visible (400nm a 800nm). Los espectros de absorción mostraron que el color producido en este medio no interfiere con la lectura, ya que el pico de absorbancia fue de 560nm en todas las mediciones, lo cual no interfiere con la lectura a 530, 620 o 660nm para ensayos con y sin color y turbidez (figura 2). Figura 2: Espectro de absorbancia en rango de luz visible para el caldo base urea de Christensen suplementado con solución estéril de urea,

17 Determinación del medio de cultivo óptimo para el crecimiento de Malassezia spp. Finalmente, se estableció el medio de cultivo para realizar las pruebas de susceptibilidad in vitro para Malassezia spp. Las tres bases de medio evaluadas, caldo Sabouraud, caldo base urea de Christensen y caldo base Urea de Christensen con solución estéril de urea se suplementaron con las diferentes combinaciones de lípidos, y se incubó durante 96h, realizando muestreo a las 72 y 96 horas, con lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 530 nm. En todas las combinaciones de medio evaluadas se observó aumento de biomasa entre las 72 y 96 horas (Anexo 4). Se presentaron diferencias significativas en la producción de biomasa según la combinación lipídica, independientemente de la base de medio utilizada; sin embargo, las combinaciones lipídicas mostraron mejor rendimiento en el caldo Sabouraud en comparación con las otras dos bases de medio evaluadas (Anexo 4). De igual forma, se pudo evidenciar que no todas las especies de Malassezia presentan la misma respuesta frente a los compuestos lipídicos, determinando que no existe homogeneidad a nivel de género respecto al suplemento lipídico. Para analizar los datos se asumió normalidad y se realizó un análisis de varianza multifactorial, el cual tiene en cuenta las interacciones del diseño propuesto. Se determinó el coeficiente de correlación (R 2 ), el cual indica la dependencia que existe entre la variable dependiente e independiente, idealmente se espera que este valor sea cercano a 1, así que para el análisis se tuvieron en cuenta valores mayores a 0.8. La mayoría de los modelos presentaron valores de R 2 mayores a 0.8 a excepción de los modelos señalados en rojo en la tabla 2. También se analizó la significancia de cada uno de los modelos, es decir si se presentaban diferencias significativas entre las combinaciones lipídicas propuestas según la base de medio. Se determinó que en la mayoría de los casos el modelo fue significativo, a excepción del modelo de M. furfur en base Sabouraud a la hora 96 y M. globosa en base urea de Christensen suplementado con solución estéril de urea a la hora 96 (Tabla 2). Tabla 2: Resultados correspondientes al R 2 y a la significancia que tiene el modelo para cada una de las bases evaluadas, teniendo en cuenta todas las combinaciones de lípidos evaluados. Medio de cultivo Micoorganismo R 2-72h R 2-96h Modelo-72h Modelo-96h M.fufur 0,9364 0,0001 significativo No significativo Sabouraud M.globosa 0,9243 0,8191 significativo significativo M. pachydermatis 0,6436 0,7551 significativo significativo M. sloffiae 0,8835 0,9272 significativo significativo M. sympodialis 0,8492 0,951 significativo significativo Muestra clínica 0,8457 0,9391 significativo significativo

18 Medio de cultivo Caldo Urea Christensen Caldo Urea Christensen suplementado con solución estéril de urea Micoorganismo R 2-72h R 2-96h Modelo-72h Modelo-96h M.fufur 0,994 0,9534 significativo significativo M.globosa 0,9485 0,8263 significativo significativo M. pachydermatis 0,9574 0,9011 significativo significativo M. sloffiae 0,8825 0,6536 significativo significativo M. sympodialis 0,9041 0,8764 significativo significativo Muestra clínica 0,8429 0,9229 significativo significativo M.fufur 0,8493 0,8664 significativo significativo M.globosa 0,3298 0,8108 significativo No significativo M. pachydermatis 0,8248 0,8553 significativo significativo M. sloffiae 0,9118 0,7234 significativo significativo M. sympodialis 0,9045 0,8288 significativo significativo Muestra clinica 0,8037 0,9282 significativo significativo Según el análisis del varianza multifactorial para el factorial recortado realizado, no se evidenciaron diferencias entre los tratamientos aplicados, independientemente de la base de medio, que sugieran cual es el suplemento lipídico o combinación de estos que influya significativamente en el crecimiento de las seis cepas en estudio. En general todos los tratamientos son aptos para el desarrollo de Malassezia spp. (Tabla 3), por lo tanto este método de análisis no permitió establecer un único modelo de medio de cultivo para las especies de Malassezia. Tabla 3: Resultado del análisis de varianza multifactorial. A: Tween 40 al 0,5%, B: Tween 80 al 0,1%, C: Tween 60 al 0,5%, D: Glicerol al 1% Medio de cultivo Microorganismo A- 72 A- 96 B- 72 B- 96 C- 72 C- 96 D- 72 D- 96 AB- 72 AB- 96 AC- 72 AC- 96 AD- 72 AD- 96 Sabouraud Caldo base urea de Christensen M. fufur X X X X X X X M. globosa X X X X X X X X X X M. pachydermatis X X X X X X M. sloffiae X X X X X X X X X M. sympodialis X X X X X X X X X Muestra clínica X X X X X X X X X X M. fufur X X X X X X X X M. globosa X X X X X X X X X X X X M. pachydermatis X X X X X X X X X X M. sloffiae X X X X X X X X M. sympodialis X X X X X X X X X Muestra clínica X X X X X X X X X X X

19 Medio de cultivo Microorganismo A- 72 A- 96 B- 72 B- 96 C- 72 C- 96 D- 72 D- 96 AB- 72 AB- 96 AC- 72 AC- 96 AD- 72 AD- 96 Caldo base urea de Christensen suplementado con solución estéril de urea M. fufur X X X X X X X X X X X M. globosa X X X X M. pacydermatis X X X X X M. sloffiae X X X X X X M. sympodialis X X X X X X X X X Muestra clínica X X X X X X X X X Teniendo en cuenta que no se pudo establecer el lípido o combinación de lípidos ideal para las especies de Malassezia en estudio por medio del análisis multifactorial, se llevó a cabo un análisis de varianza de un factor. Este análisis mostró diferencias significativas entre las combinaciones de medio empleadas, incluyendo la base de medio y los suplementos lipídicos (cada análisis se realizó a los aislamientos estudiados, tomando todas las bases de medio y sus posibles combinaciones lipídicas) (Anexo 5). En cuanto a la base de medio de cultivo empleada, independientemente de la combinación lipídica utilizada, todas las cepas de Malassezia mostraron mayor producción de biomasa en caldo Sabouraud (Anexo 5), en comparación con el caldo base urea de Christensen y el caldo base de urea de Christensen suplementado con solución estéril de urea. Este resultado puede estar relacionado con la composición del caldo Sabouraud, que es similar a la del medio Dixon modificado, medio específico para el aislamiento y desarrollo del género Malassezia (9,13). Los medios de cultivo coinciden en presentar alta proporción de fuentes de carbono y nitrógeno orgánico, sin tener en cuenta los suplementos lipídicos, mientras que el caldo base urea de Christensen presenta menor proporción de fuentes carbono y nitrógeno (Anexo 6). Lo mismo sucedió con el caldo base urea de Christensen suplementado con solución estéril de urea, que adicionalmente induce actividad ureasa de Malassezia spp., donde se evidenció cambio de color del medio de amarillo a fucsia, pero no se observó turbidez, por lo cual este medio favorece la actividad enzimática mas no la producción de biomasa. En 1996 un estudio realizado por Bond y colaboradores demostró que no existen diferencias significativas en cuanto al desarrollo de Malassezia spp. en los medios Dixon modificado y Sabouraud(24). De igual forma, Carfachia y colaboradores en el 2012 concluyen que el medio de cultivo óptimo para el desarrollo de Malassezia spp. y la realización de pruebas de susceptibilidad in vitro es el medio Sabouraud suplementado con lípidos, en comparación con el caldo urea de Christensen (7); resultados que se evidenciaron en el presente estudio. Para la determinación del suplemento lipídico óptimo para el desarrollo de Malassezia spp., no se observó un comportamiento homogéneo, ya que no todas las especies de este género tienen el mismo patrón de crecimiento frente a una fuente lipídica (25,26).

20 Igualmente, se demostró que es necesaria la inclusión de lípidos en los medios de cultivo, ya que en las bases de medio que no contenían suplementos lipídicos se presentó una baja producción de biomasa en comparación con los medios que si contenían el suplemento; incluso para M. pachydermatis única especie no lipodependiente, (23). Esta dependencia lipídica se debe a un defecto en la síntesis de ácido mirístico, que sirve como precursor de ácidos grasos de cadena larga (19). Las combinaciones lipídicas que mostraron mejores respuestas por parte de las especies de Malassezia estudiadas, se muestran en la tabla 4, donde se puede evidenciar que existen tres combinaciones óptimas, demostrando que todas las especies de Malassezia spp. tienen un comportamiento diferente en respuesta a la combinación lípidica (25,26). La combinación de Tween 40 al 0,5% y Tween 60 al 0,5% mayoritariamente mostró que es la combinación donde se observómejor el desarrollo de este microorganismo. Tabla 4. Medio con suplemento lipídico para cada una de las especies de Malassezia en estudio, según el análisis estadístico de varianza a un factor. Microorganismo Medio Combinación lipídica cultivo Hora 72 Hora 96 M. globosa Sabouraud Tween 40 + Tween 60 Tween 40 + Tween 60 M. pachydermatis Sabouraud Tween 40 + Tween 60 Tween 40 + Tween 60 M. sloffiae Sabouraud Tween 40 + Glicerol Tween 40 + Tween 60 M. furfur Sabouraud Tween 40 + Glicerol Tween 40 + Tween 60 M. sympodialis Sabouraud Tween 80 + Glicerol Tween 40 + Tween 60 Muestra clínica Sabouraud Tween 40 + Glicerol Tween 40 + Glicerol Respecto al tiempo de incubación para Malessezia spp., se observó que a las 96 horas hubo la mayor producción de biomasa para todas las especies estudiadas, por lo que son microorganismos de lento crecimiento, especialmente M. globosa (25, 26). Aunque el CLSI recomiendo un tiempo de incubación de 48 horas para Candida spp. y de 72 horas para Criptococcues neoformans, no existe un apartado para Malassezia spp, sobre su tiempo de incubación, siendo levaduras de metabolismo lento. Carfachia y colaboradores (2012) determinan un tiempo de incubación de 72 horas, pero solo tienen en cuenta a Malassezia pachydermatis (7), especies de metabolismo rápido. Adicionalmente Rincón y colaboradores (2006) establecen un tiempo de incubación de 96 horas (10) para estas levaduras de lento desarrollo. Conclusión que coincide con lo establecido por este estudio

21 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Conclusiones Se determinó que la solución de agua destilada estéril suplementada con Tween 80 al 1% es óptima para la realización del inóculo. Se estableció que el caldo Sabouraud es el medio apropiado para el desarrollo de las especies de Malassezia, presentando mayor rendimiento en cuanto a la producción de biomasa, respecto a los otros dos medios evaluados. Respecto al suplemento lipídico se definió Tween 40 al 0,5% y Tween 60 al 0,5%, es la combinación apropiada para el desarrollo la mayoría de especies de Malassezia en estudio. Se estableció que el tiempo de incubación para la cuantificación de biomasa es 96 horas. Recomendaciones Realizar un ensayo de susceptibilidad teniendo en cuenta las condiciones establecidas de preparación de inóculo, medio de cultivo y tiempo de lectura frente a antifúngicos de diferentes naturaleza química. BIBLIOGRAFIA. 1. Zinkeviciene A, Norkunas V, Citavicius D, Atypical non-lipid-dependent strains of Malassezia furfur. Central European Journal of Biology 2012; 7(2) Mesa C, Díaz M, Ocampo P, Rodríguez S, León G, Comparación del crecimiento de Malassezia furfur y Malassezia slooffiae en los medios del exudado gomoso de spondias dulcis y Dixon. Kasmera 2008; 36(1): 45-52, 3. Sugita T, Tajima M, Ito T, Saito I, Tsuboi R, Nishikawa A. Antifungal activities of tacrolimus and azole agents against the eleven currently accepted Malassezia species. Clinical Microbiology 2005; 43 (6), Martin J, Tejedor M, Lupiola P, Morales M, Gonzales Z. Relación entre la presencia de Malassezia pachydermatis y los signos clínicos encontrados en cuadros de otitis crónicas caninas en una población de perros de raza Podenco canario. Clin Vel Pequeños Anim 2001; 21 (2), Ramos L, Mellado S, Ramadán S, Bulacio L, López C. Empleo de blanco de calcoflúor para el estudio de las especies de Malassezia por microscopía directa. Rev. Argentina de Micología 2006; 38: 4-8.

22 6. Torres E, Arenas R, Dieguez A. Infecciones causadas por el genero Malassezia. Medd Cutan Iber Lat Am 2008; 36 (6), Cafarchia C, Figueredo L, Favuzzi V, Surico M, Colao V, Iatta R, Montagna M, Otranto D. Assessment of the antifungal susceptibility of Malassezia pachydermatis in various media using a CLSI protocol. Veterinary Microbiology Padilla, M. Pitiriasis versicolor. Dermatologia 2005; 49 (4), Giusiano, E. Malassezia Estado del conocimiento y perspectivas en su estudio. Rev. Argentina de Micología 2006; 38: Rincon S, Cepero M, Espinel A. A modified christensen s urea and CLSI broth microdilution method for testing susceptibilities of six Malassezia species to voriconazole, itraconazole, and ketoconazole. Journal of Clinical Microbiology 2006; 44 (9): Garau M, Pereiro M, Palacio A. In Vitro susceptibilities of Malassezia species to a new triazole, albaconazole (UR-9825), and other antifungal compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2003; 47(7), Torres E, Arenas R, Dieguez A. Infecciones causadas por el genero Malassezia. 13. Crespo V, Crespo M, Gómez E. Diagnóstico de laboratorio de las levaduras del género Malassezia. Piel 2008; 23(10), Pulido A, Castañeda R, Linares M, Mercado M. Clinical microbiological diagnostic of external otitis in canines in Bogotá Colombia. Rev. Unicordoba 2010; 15(3). 15. Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast. Approved standard. Second Edition. CLSI document M27-A2. CLSI, Wayne, PA Nakamura Y, Kano R, Mural S, Hasegawa A. Susceptibility testing of Malassezia species using the urea broth microdilution method. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2000, 44(8), Weuster, D. Experimental Design for Fermentation Media Development: Statistical Design or Global Random Search?. Bioscience and Bioengineering 2000; 90(5), Wang J, Wan W. Experimental design methods for fermentativehydrogen production: A review. Hydrogen Energy 2009; 34, Brunke S, Hube B. MfLIP1, a gene encoding an extracellular lipase of the lipiddependent fungus Malassezia furfur. Microbiology 2006; 152, Akaza N, Akamatsu H, Takeoka S, Mizutani H, Nakata S, Matsunaga K. hydrophobicity in Malassezia species correlates with increased proinfl ammatory cytokine expression in human keratinocytes. Medical Mycology November 2012; 50, Kruppa M, Lowman D, Chen Y, Selander C, Scheynius A, Monteiro M, Williams D. Identification of (1-6)-b-D-glucan as the major carbohydrate component of the Malassezia sympodialis cell wall. Carbohydrate Research 2009; 344, Peano A, Beccati M, Chiavassa E, Pasquetti M. Evaluation of the antifungal susceptibility of Malassezia pachydermatis to clotrimazole, miconazole and thianbendazoles using a modified CLSI M27-A3 microdilution method. Veterinary Dermatology 2011; Guého-Kellermann E, Boekhout T, Begerow D. Biodiversity, Malassezia and the Skin. Springer Verlag Berlin Heidelberg Bond R, Lloyd D. Comparison of media and conditions of incubation for the quantitative culture of Malassezia pachydermatis from canine skin. Research in Veterinary Science 1996; 61,

23 25. Kim B, Chang Lee E, Young Lim Y, Kim D, Chum Y. Optimal Culture Condition for Antifungal Susceptibility Tests of Malassezia globosa. Kor J Med Mycol 2009; 14(4). 26. Koyama T, Kanbe T, Kikuchi A, Tomita Y. Effects of topical vehicles on growth of the lipophilic Malassezia species. Journal of Dermatological Science 2002; 22,

24 ANEXO 1 Tratamientos realizados para la obtención del inóculo inicial de trabajo en Malassezia spp.

25 ANEXO 2 Montajes en cámara de Neubauer de la curva de crecimiento a las 72h para Malassezia spp

26 ANEXO 3 Cinética de crecimiento, tiempo vs. Unidades de absorbancia y Log 10 células por mililitro de Malassezia spp. M. furfur 1,2 7,2 1,0 7,0 6,8 UA 0,8 0,6 6,6 6,4 6,2 6,0 Log 10 (Cel/ml) 0,0 5, Tiempo (horas) Tiempo (horas) vs 530 nm Tiempo (horas) vs 620 nm Tiempo (horas) vs 660 nm Tiempo (horas) vs Recuento celulas (Log 10 cel/ml) 5,8 5,6 M. sympodialis 1,2 7,2 1,0 7,0 6,8 UA 0,8 0,6 6,6 6,4 6,2 6,0 Log 10 (Cel/ml) 0,0 5, Tiempo (horas) Tiempo (horas) vs 530 nm Tiempo (horas) vs 620 nm Tiempo (horas) vs 660 nm Tiempo (horas) vs Recuento celulas (Log 10 cel/ml) 5,8 5,6

27 M. sloffiea 1,6 1,4 1,2 7,2 7,0 6,8 UA 1,0 0,8 0,6 6,6 6,4 6,2 6,0 Log 10 (Cel/ml) 0,0 5, Tiempo (horas) Tiempo (horas) vs 530 nm Tiempo (horas) vs 620 nm Tiempo (horas) vs 660 nm Tiempo (horas) vs Recuento celulas (Log 10 cel/ml) 5,8 5,6 M. pachydermatis 1,4 7,0 1,2 1,0 6,5 UA 0,8 0,6 6,0 5,5 Log 10 (Cel/ml) 5,0 0,0 4, Tiempo (horas) Tiempo (horas) vs 530 nm Tiempo (horas) vs 620 nm Tiempo (horas) vs 660 nm Tiempo (horas) vs Recuento celulas (Log cel/ml)

28 M. globosa 0,5 6,8 6,6 UA 0,3 6,4 6,2 Log 10 (Cel/ml) 0,1 6,0 0,0 5, Tiempo (horas) Tiempo (horas) vs 530 nm Tiempo (horas) vs 620 nm Tiempo (horas) vs 660 nm Tiempo (horas) vs Recuento celulas (Log cel/ml) Muestra clinica 1,6 9,0 1,4 8,5 1,2 8,0 UA 1,0 0,8 0,6 7,5 7,0 6,5 Log 10 (cel/ml) 6,0 5,5 0,0 5, Tiempo (horas) Tiempo (horas) vs 530 nm Tiempo (horas) vs 620 nm Tiempo (horas) vs 660 nm Tiempo (horas) vs Recuento celulas (Log cel/ml)

29 UA UA ANEXO 4 Cuantificación de biomasa de Malassezia spp. por medición espectrofotométrica del ensayo factorial recortado. Los datos de unidades de absorbancia corresponden al promedio de tres réplicas. 1 M. globosa- Caldo Sabouraud 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h 1 M. globosa- Caldo base urea de Christensen 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h

30 UA UA 1 M. globosa- Caldo base urea de Christensen suplementado con solución de urea estéril 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h 1 M. pachydermadis- Caldo Sabouraud 0,8 0,6 530nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h 0

31 UA UA 1 M. pachydermatis- Caldo base urea de Christensen 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h 1 M. pachyermatis-caldo base urea de Christensen suplementado con solución de urea estéril 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h

32 UA UA 1 M. sloffiae-caldo Sabouraud 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h 1 M. sloffiae-caldo base urea de Christensen 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h

33 UA UA 1 M. sloffiae-caldo base Urea de Christensen suplementado con solución de urea estéril 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h 1 M. furfur-caldo Saboraud 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h

34 UA UA 1 M. furfur- Caldo base urea de Christensen 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h 1 M. furfur- Caldo base urea de Christensen suplementado con solución de urea estéril 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h

35 UA UA 1 M. sympodialis- caldo Sabouraud 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h 1 M. sympodialis- Caldo base urea de Christensen 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h

36 UA UA 1 M.sympodialis- Caldo base Urea de Christensen suplementado con solución de urea estéril 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h 1 Muestra clínica- Caldo Sabouraud 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h

37 UA UA 1,000 Muestra clínica-caldo base urea de Christensen 0,800 0, , nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h 1 Muestra clínica-caldo base urea de Christensen suplementado con solución de urea estéril 0,8 0, nm 72h 530nm 96h 620nm 72h 620nm 96h

38 ANEXO 5 Resultados del análisis de varianza a un factor. Codificación utilizada en cada uno de los análisis efectuados, los tres primeros corresponde a la base de medio empleada y los siguientes números corresponden a la combinación lipídica. Código Significado 111 Caldo Sabouraud 222 Caldo base urea de Christensen Caldo base urea de Christensen suplementado 333 con solución de urea estéril 0 Sin lípidos 50 Todos los lípidos a media concentración 100 Todos los lípidos a concentración completa 409 Tween 40 con Glicerol 609 Tween 60 con Glicerol 809 Tween 80 y Glicerol 4060 Tween 40 con Tween Tween 40 con Tween Tween 60 con Tween 80

39 TMTO Promedio Abs 530nm M. fufur-72h M. fufur-96h Subconjunto para alfa = 0.05 TMTO Promedio Abs 530nm Subconjunto para alfa = ,01533 a 3330,02500 a 2220,01600 a 2220,02567 a ,03500 a b ,06800 a 1110,03667 a b 22250,08700 a 22250,06600 a b c ,11167 a ,07767 b c d ,12500 a ,08400 b c d ,12733 a 11150,09333 b c d e 1110,13233 a ,09933 c d e ,15400 a ,10967 c d e f ,15650 a ,11433 c d e f ,16700 a ,11767 c d e f ,17633 a ,13867 d e f ,17633 a 33350,15267 e f g 33350,18567 a ,15400 e f g ,19133 a ,16167 f g h ,23567 a ,16467 f g h ,24733 a ,16500 f g h ,24933 a ,17167 f g h i ,25467 a ,20333 g h i ,25633 a ,21033 g h i ,26667 a ,21667 h i j ,27867 a ,21700 h i j ,35067 a ,21833 h i j ,42300 a ,23133 i j ,50167 a ,27067 j ,56867 a ,48867 k ,07567 b

40 TMTO Promedio Abs 530nm M. sympodialis-72h M.sympodialis-96h Subconjunto para alfa = 0.05 TMTO Promedio Abs 530nm ,01400 a ,04300 a 2220,01433 a 3330,04933 a b 3330,02967 a b ,05300 a b ,03800 a b c ,06400 a b c ,04033 a b c d ,06433 a b c 33350,04067 a b c d 2220,07033 a b c d Subconjunto para alfa = ,04367 a b c d ,08000 a b c d e ,04867 b c d e 1110,08033 a b c d e ,04933 b c d e ,08567 a b c d e ,05700 b c d e f 22250,08733 a b c d e ,05900 b c d e f g 11150,08867 a b c d e 22250,06300 c d e f g h ,11033 a b c d e f ,06533 c d e f g h ,11433 a b c d e f ,07100 d e f g h i 33350,11900 a b c d e f ,07200 d e f g h i ,12533 b c d e f ,07633 e f g h i ,12733 b c d e f ,08367 f g h i ,14133 c d e f ,08450 f g h i ,14200 c d e f ,08833 f g h i ,14933 d e f g ,09067 g h i ,15500 e f g ,09267 h i ,15800 e f g 11150,09467 h i ,18333 f g h ,09933 i ,22350 g h ,13200 j ,23333 h ,13633 j ,24500 h ,15300 j k ,58000 i ,16900 k ,76867 j

41 M.sloffiae-72h M. sloffiae.96h TMTO Promedio Abs 530nm Subconjunto para alfa = 0.05 TMTO Promedio Abs 530nm 2220,01467 a 22250,03500 a ,01550 a ,04300 a b 3330,02333 a b 3330,04767 a b c ,02900 a b c ,04867 a b c ,03167 a b c ,05933 a b c d Subconjunto para alfa = ,03200 a b c 11150,06600 a b c d e ,03833 a b c d ,07000 a b c d e 1110,03900 a b c d 2220,07133 a b c d e ,04200 a b c d ,07867 a b c d e ,04667 a b c d ,08367 a b c d e ,04667 a b c d ,08500 a b c d e ,05233 a b c d f 1110,09033 a b c d e ,05300 a b c d f ,09067 a b c d e ,05700 a b c d f ,09167 a b c d e ,05733 a b c d f ,09567 a b c d e f ,05900 a b c d f g ,09667 a b c d e f 11150,05967 a b c d f g ,10700 b c d e f g ,07033 a b c d f g 33350,10900 b c d e f g ,07500 b c d f g h ,11433 c d e f g ,08133 c d f g h i ,11500 c d e f g ,08867 d f g h i ,12800 d e f g 33350,10433 f g h i ,13100 e f g ,11133 g h i ,16133 f g ,12567 h i ,17167 g ,13100 i ,25233 h ,21667 j ,44600 i ,36433 k ,46467 i

42 TMTO M. pachydermatis - 72h M. pachydermatis - 96h Promedio Abs 530nm Subconjunto para alfa = 0.05 TMTO Promedio Abs 530nm 2220,01533 a 3330,03433 a 3330,01600 a 2220,04067 a ,04533 a b ,06133 a ,05400 a b c 1110,07000 a 1110,05933 a b c ,12933 a b ,05933 a b c ,13100 a b ,06900 a b c d ,13633 a b c Subconjunto para alfa = ,07100 a b c d e ,15420 a b c d ,08767 a b c d e f ,16833 a b c d ,10433 b c d e f ,17500 a b c d ,11500 b c d e f g ,21667 b c d e 22250,11533 b c d e f g ,22300 b c d e ,11667 b c d e f g 22250,22767 b c d e ,11833 b c d e f g ,22833 b c d e ,11867 b c d e f g ,24933 b c d e ,12750 b c d e f g h 33350,24967 b c d e ,13333 c d e f g h ,25600 b c d e ,13533 c d e f g h i ,26000 b c d e ,14167 c d e f g h i ,26000 b c d e ,14200 c d e f g h i ,27667 b c d e ,14833 d e f g h i ,28467 c d e ,15800 e f g h i ,30133 d e ,17200 f g h i 11150,32433 e 33350,20167 g h i ,34000 e ,20800 h i ,34700 e ,22033 i ,53700 f ,31600 j ,56133 f

43 TMTO M.globosa-72h Promedio Abs 530nm Subconjunto para alfa = 0.05 TMTO M. globosa-96h Promedio Abs 530nm ,00967 a ,00700 a 3330,01100 a 3330,01400 a 2220,01300 a ,02100 a ,01400 a ,02367 a ,01867 a ,02567 a ,01967 a ,02633 a ,02067 a ,02667 a ,02167 a 33350,02767 a ,02300 a 2220,03233 a ,02333 a ,04033 a ,02500 a ,04200 a ,02700 a 22250,04433 a 33350,02767 a ,04600 a ,02867 a ,04900 a ,03600 a ,05967 a 22250,03833 a b ,06133 a 1110,04167 a b ,06833 a ,04600 a b ,07533 a 11150,05533 a b c ,08267 a ,05633 a b c 11150,08333 a ,09333 b c d ,08767 a ,10200 c d ,11433 a b ,10533 c d ,12800 a b ,11400 d e 1110,13467 a b ,16200 e ,21600 b Subconjunto para alfa = ,23000 f ,47833 c ,54233 g ,64900 d

44 TMTO Muestra clínica-72h Promedio Abs 530nm Subconjunto para alfa = 0.05 TMTO Promedio Abs 530nm Muestra clínica-96h ,00233 a ,03567 a 1110,03533 a b 3330,05467 a b 22250,04767 a b c 2220,05800 a b 2220,04767 a b c 1110,09033 a b c ,05633 a b c ,10633 a b c d 11150,11167 b c d ,12467 b c d e ,12033 b c d e 11150,12733 b c d e ,12067 b c d e 22250,13200 b c d e Subconjunto para alfa = ,12150 b c d e ,15067 c d e f ,13667 c d e f ,15250 c d e f ,14133 c d e f g ,16800 c d e f g ,14533 c d e f g ,17500 d e f g 3330,15833 d e f g ,20400 e f g h ,16000 d e f g ,21900 f g h i ,17167 d e f g ,23800 g h i j ,17533 d e f g 33350,26133 h i j k ,20367 d e f g ,26200 h i j k ,21100 d e f g h ,26533 h i j k ,21733 e f g h ,27400 h i j k 33350,22167 e f g h ,28433 h i j k ,22267 e f g h ,29867 i j k ,22667 f g h ,31433 j k l ,22667 f g h ,32267 k l m ,24067 g h ,37967 l m ,30733 h ,39133 m ,44933 i ,51400 n ,48167 i ,58000 n }

45 ANEXO 6 Composición de los medios: Dixon modificado, caldo Sabouraud y caldo base urea de Christensen Medio de cultivo Componentes Cantidad para 1L Extracto de malta 36g Peptona bacteriológica 10g Dixon modificado Bilis de buey 2g Glicerol 2ml Ácido oleico 2ml Caldo Sabouraud Caldo base urea de Christensen Tween 40 Glucosa 10ml 40g Peptona 10g Peptona de carne 1g Glucosa 1g Cloruro sódico 5g Dihidronofosfato potásico 2g Rojo de fenol 0,012g