ÍNDICE INFORMACIÓN GENERAL... 2 INTERÉS CLÍNICO... 2 FUNDAMENTO DEL ENSAYO...

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1 ÍNDICE INFORMACIÓN GENERAL... 2 INTERÉS CLÍNICO... 2 FUNDAMENTO DEL ENSAYO EXTRACCIÓN DEL ARN DE LA MUESTRA: TRANSCRIPCIÓN INVERSA Y PRIMERA AMPLIFICACIÓN: SEGUNDA RONDA DE AMPLIFICACIÓN: HIBRIDACIÓN Y DETECCIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO:... 3 CONTENIDO DEL ESTUCHE... 3 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD... 4 MATERIALES Y REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS.. 4 PRECAUCIONES Y PROHIBICIONES... 5 OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS... 6 INSTRUCCIONES DE USO... 6 PROCEDIMIENTO TÉCNICO... 6 EXTRACCIÓN DE ARN... 6 TRANSCRIPCIÓN INVERSA Y AMPLIFICACIÓN... 7 DETECCIÓN... 8 CONTROL DE LA CALIDAD INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS LIMITACIONES DE LA PRUEBA GUÍA DE PROBLEMAS DESEMPEÑO ANALÍTICO DEL ESTUCHE ESPECIFICIDAD CLÍNICA SENSIBILIDAD ANALÍTICA EVALUACIÓN DEL IS, RC, PANEL PELICHECK Y CP REACTIVIDAD CRUZADA ROBUSTEZ CONCORDANCIA ENTRE EL UMELISA HCV Y UMELOSA HCV CUALITATIVO COMPARACIÓN CON ESTUCHE COMERCIAL AMPLICOR HCV BIBLIOGRAFÍA

2 Información general UMELOSA HCV CUALITATIVO La infección por el virus de la Hepatitis C (VHC) constituye hoy un problema de salud en el mundo. Se estima que aproximadamente 200 millones de personas están infectadas por el VHC, lo que representa el 3,3 % de la población mundial. Se destacan países con altísima incidencia como Egipto con más de un 20 % de la población infectada. En Cuba aproximadamente el 1 % de la población es seropositiva y se calcula, por la práctica internacional, que en un 80 % de los infectados la enfermedad se hace crónica y de estos un 20 % desarrolla cirrosis hepática. 1,2,3 El VHC, miembro de la familia Flaviviridae, posee un genoma constituido por ácido ribonucleico (ARN) de simple cadena positiva de unos nucleótidos. 4 El genoma lo compone una región no codificante (RNC) en el extremo 5' de 341 nucleótidos altamente conservada, una región que traduce a una poliproteína precursora de aminoácidos y una RNC en el extremo 3' de 200 nucleótidos. 5,6 El virus existe en el hospedero en forma de cuasiespecie. Según la clasificación actualmente aceptada, se han definido al menos seis genotipos que se nombran con las cifras 1, 2, 3, etc. 7 Dentro de los genotipos se definen diferentes subtipos denominados con letras: 1a, 1b, 2a, 2b, etc. El primer ELISA para diagnóstico serológico de la infección por VHC no estuvo disponible hasta el año 1990 y como resultado de su empleo se produjo una reducción en las hepatitis postransfusionales. El conocimiento de la secuencia completa del virus y la disponibilidad de nuevos antígenos permitió mejorar la sensibilidad de las técnicas de detección de anticuerpos. Como resultado de los esfuerzos realizados en ese sentido, se desarrollaron los ensayos RIBA (Recombinant Immunoblot Assay), que en su tercera generación usan epítopos diseñados para una mayor sensibilidad y especificidad Este ensayo se utilizó, durante algunos años como confirmatorio y complementario al ELISA de anticuerpos, debido a la gran cantidad de falsos positivos que estos producían. Hoy ninguna técnica basada en la detección de anticuerpos se considera confirmatoria, pues una muestra negativa por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) puede resultar positiva, negativa o indeterminada por RIBA. Los ensayos de detección de ácidos nucleicos han devenido sustitutos del RIBA para la confirmación y diagnóstico de la infección por VHC, al permitir la medición directa de la replicación viral. Interés clínico El UMELOSA HCV CUALITATIVO es un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos in vitro, con detección mediante hibridación en Sistema UltraMicroAnalítico (SUMA) para la determinación del ARN del VHC en suero y plasma humanos 8. La detección del ARN del virus por transcripción inversa y amplificación (RT-PCR) permite demostrar que la infección está presente y que el virus está en replicación, por lo que constituye la prueba más específica para el diagnóstico de la enfermedad y a diferencia de las pruebas serológicas: Detecta la infección en el período de ventana existente entre infección y seroconversión. Es útil para el diagnóstico en personas inmunodeprimidas. Permite definir los casos de infecciones resueltas: seropositivos que no tienen replicación activa del virus. El diagnosticador UMELOSA HCV CUALITATIVO no está diseñado para autoensayo, sólo podrá ser utilizado por personal entrenado en técnicas de Biología Molecular, en laboratorios de nivel secundario que tengan los requerimientos específicos para trabajar diagnóstico molecular y en servicios especializados del Sistema Nacional de Salud. Este ensayo es solo para diagnóstico in vitro y no podrá ser vendido en farmacias u otros establecimientos. Fundamento del ensayo La prueba UMELOSA HCV CUALITATIVO consta de cuatro etapas fundamentales: 1. Extracción del ARN de la muestra. 2. Transcripción inversa (RT) del ARN molde para generar ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) y su amplificación por PCR utilizando iniciadores específicos (RT-PCR). 3. Amplificación de un segmento del fragmento previamente amplificado empleando cebadores internos uno de los cuales está marcado con biotina (PCR-2, nested-pcr o PCR anidada). 4. Hibridación del producto amplificado con sonda específica y su detección por fluorescencia en una placa de tiras, empleando un conjugado Estreptavidina-Fosfatasa Alcalina (E/FA). 1. Extracción del ARN de la muestra: El ARN del VHC se aísla a partir de suero o plasma mediante lisis de los viriones con agentes caotrópicos y precipitación del ARN en isopropanol. Luego de un lavado con etanol al 75 %, los restos de solvente y agua son extraídos con acetona, y el ARN es resuspendido en agua libre de ribonucleasas (RNasas) para su posterior utilización. 2

3 2. Transcripción inversa y primera ronda de amplificación: El ARN es añadido a los viales de reacción que contienen la mezcla RT-PCR lista para la reacción. Posteriormente la mezcla se calienta a 45 ºC en el termociclador y la transcriptasa inversa del Virus de la Mieloblastosis Aviar (AMV) hace una copia de ADNc a partir de cada cadena simple de ARN, durante 30 minutos. Luego se desnaturalizan todos los híbridos ARN-ADNc por calentamiento a 95 ºC durante 5 minutos y se realizan varios ciclos de desnaturalización, hibridación de los iniciadores a las cadenas simples de ADNc y elongación por la enzima Taq polimerasa hasta obtener millones de copias de la secuencia blanco. 3. Segunda ronda de amplificación: Esta etapa se realiza con el objetivo de aumentar la sensibilidad y especificidad del ensayo. Una parte del ADN amplificado es añadida a los tubos de reacción que contienen la mezcla PCR-2 lista para el uso. Como resultado de la amplificación por PCR se obtienen amplicones, internos al fragmento obtenido en el paso anterior, cuya longitud está acotada por los iniciadores, uno de los cuales está biotinilado para hacer posible la detección en la hibridación. 4. Hibridación y detección del producto amplificado: El sistema de detección UMELOSA HCV CUALITATIVO es un ensayo de hibridación en fase sólida, cuyo principio no difiere de un ELISA tipo sándwich, excepto que los pocillos de la placa de tiras no están recubiertos con antígeno o anticuerpo, sino con una sonda consistente en un oligonucleótido correspondiente a la región 5 NC del VHC. Las muestras provenientes de la PCR anidada se desnaturalizan y se incuban con una solución de hibridación en los pocillos de la placa de tiras. En caso de reacción positiva, el ADN amplificado y marcado con biotina, hibridará por complementariedad de bases a la sonda de captura y el conjugado E/FA, unido a la biotina, producirá la hidrólisis del sustrato 4-Metilumbeliferil fosfato, permitiendo la detección del amplicón al producirse una señal fluorescente que será detectada en un lector de fluorescencia de placas. Contenido del estuche Los reactivos suficientes para 96 pruebas son suministrados en dos cajas. CAJA 1 y CAJA 2. A continuación se describe el contenido de ambas. Código UM 3001 (96 pruebas) CAJA 1 ESTUCHE DE EXTRACCIÓN Contenido E1-Tampón de Lisis Cantidad 2 x 25 ml ESTUCHE DE DETECCIÓN Contenido Cantidad Placa recubierta de 12 tiras x 8 pocillos 2 R1-Solución Desnaturalizante 1 x 5 ml R2-Solución Neutralizante 1 x 3,5 ml R3-Solución de Hibridación 6 x 25 ml R4- Conjugado 1 x 0,4 ml R5- Tampón Conjugado 1 x 8 ml R6- Sustrato 1 x 2 ml R7- Tampón Sustrato 1 x 18 ml CAJA 2 CONTROLES DEL ENSAYO Contenido Cantidad E3- Control Negativo 4 x 0,75 ml E4- Control Positivo 4 x 0,35 ml ESTUCHE DE AMPLIFICACIÓN Contenido Cantidad A1- Mezcla RT-PCR 4 x 0,40 ml A2- Enzimas RT-PCR 1 x 0,10 ml A3- Mezcla PCR-2 4 x 0,46 ml A4- Enzima PCR-2 1 x 0,04 ml E2- Agua libre de RNasas 2 x 3,5 ml 3

4 Conservación y estabilidad La CAJA 1 debe almacenarse a una temperatura entre 2 y 8 ºC. La CAJA 2 se almacenará a 20 ºC. Todos los reactivos serán estables en el envase original hasta la fecha de vencimiento. Una vez abiertos los estuches, los reactivos son estables durante tres meses, si se mantienen en las condiciones de almacenamiento descritas y se toman todas las precauciones necesarias para su manipulación. El componente E1 se conservará de 2 a 8 ºC, preferiblemente alejado de los reactivos de hibridación. Para una mejor conservación de E2 se recomienda, una vez abierto el frasco, hacer alícuotas de 350 µl en viales nuevos y estériles. Los controles del ensayo E3 y E4, contenidos en la CAJA 2 del estuche, se conservarán a 20 ºC como el resto de los componentes. No deberán descongelarse más de dos veces y de ser posible se almacenarán a 70 ºC. Para una mejor conservación y disminuir el riesgo de contaminación de E3 se recomienda, una vez abierto el vial, hacer alícuotas de 150 µl en viales nuevos y estériles, quedando listo para su uso. Conservar a 20 ºC. Los ARN extraídos y resuspendidos en E2 pueden ser almacenados a 20 ºC por no más de una semana y a 70 ºC por no más de dos semanas. Las tiras de reacción no utilizadas se mantienen estables durante tres meses conservadas de 2 a 8 ºC en la bolsa suministrada, con el desecante y herméticamente cerrada. La solución de lavado lista para el uso es estable durante un mes, conservada a una temperatura entre 2 y 25 ºC. El remanente de los reactivos de la detección preparados en el momento del uso (R2-R3, R4-R5, R6-R7), debe ser desechado. Materiales y reactivos necesarios no suministrados Reactivos. En el paso de extracción se emplean los siguientes solventes no suministrados en el estuche: Reactivo Fórmula Química Calidad 1. Cloroformo CHCl3 para análisis 2. Isopropanol C3H8O para análisis 3. Etanol C2H6O para análisis 4. Acetona (CH3)2CO para análisis 5. Hipoclorito de sodio NaOCl para análisis 6. Agua destilada H2O destilada 7. Agua estéril H2O estéril y libre libre de RNasas de RNasas El isopropanol, el etanol y la acetona se almacenarán a una temperatura inferior a 8 ºC. Materiales. Área de preamplificación para extracción de ARN de las muestras, preparación de mezclas para RT-PCR y PCR-2 y montaje de la RT-PCR: 1. Microcentrífuga refrigerada o no, con rotor de 24 posiciones. 2. Micropipetas de volumen variable ( µl, µl, µl, 1-10 µl) para la extracción. 3. Puntas estériles, libres de ribonucleasas (RNasas) y desoxirribonucleasas (DNasas), con filtros antiaerosoles. 4. Guantes de látex y batas de laboratorio específicos para esta área. 5. Agitador orbital (vortex). 6. Cubeta para desechos. 7. Gabinete con flujo laminar vertical o cabina de PCR. 8. Viales nuevos de 1,5 ml, preferiblemente con tapa roscada, previamente horneados durante dos horas de 75 ºC-80 ºC. 9. Papel absorbente. 10. Pinzas para manipulación de viales pequeños. 11. Micropipetas de volumen variable (0,5-10 µl, 2-20 µl, µl, µl) para la preparación y dispensado de las mezclas de reacción en los viales de PCR. 12. Viales nuevos para PCR, de pared fina y volumen de 0,5 ml ó 0,2 ml, previamente horneados durante dos horas de 75 ºC- 80 ºC. 13. Gradilla de 24 posiciones para viales de PCR de 0,5 ó 0,2 ml. 14. Probeta de cristal de 50 ml. 15. Envase con hipoclorito de sodio al 5 %. Área de amplificación: 1. Termociclador TEMPER 9 de 25 posiciones o similar. 2. Gradilla de 24 posiciones para viales de PCR de 0,5 ó 0,2 ml, dependiendo del termociclador que se tenga. 3. Pipeta de volumen variable de 2-20 µl. 4. Puntas estériles, con filtro antiaerosoles, libres de RNasas y DNasas. 5. Guantes de látex y batas de laboratorio específicos para esta área. 6. Lámpara de luz ultravioleta (UV). 4

5 7. Algodón o gasa. 8. Envase con hipoclorito de sodio al 5 %. Área de detección: 1. Papel absorbente. 2. Multipipeta de ocho canales y volumen variable (5-50 µl). 3. Micropipetas de volumen variable ( µl, µl, 2-20 µl). 4. Puntas nuevas desechables para 10, 200 y 1000 µl, previamente horneados durante dos horas de 75 ºC-80 ºC. 5. Cubetas para el trabajo con la multicanal. 6. Incubadora a 37 ± 2 C. 7. Plancha de calentamiento o agitador con calentamiento. 8. Guantes de látex y batas de laboratorio específicos para esta área. 9. Reservorios para la preparación de los reactivos para su uso. 10. Lavador de placas de la tecnología SUMA o similar. 11. Lector de fluorescencia de placas de la tecnología SUMA o similar. Con capacidad de lavado para un formato de 12 x 8 pocillos, con 30 µl de solución por pocillo y tiempos de lavado de 30 segundos. Características del lector de fluorescencia de placas: Longitud de onda de excitación λ= 365 nm, longitud de onda de emisión λ= nm. Precauciones y prohibiciones Para evitar la obtención de resultados no adecuados en el laboratorio, así como los perjuicios que pudieran ser ocasionados a los analistas que utilicen este diagnosticador, se deben adoptar las siguientes medidas: - Descontamine con luz UV e hipoclorito de sodio al 5 % las superficies de trabajo, antes de comenzar la extracción y una vez finalizado este proceso. Manipule con cuidado el hipoclorito pues es un inhibidor de la amplificación. - Durante la extracción trate las muestras y controles como potencialmente infecciosos. Use guantes desechables y bata de laboratorio para su manipulación. Lave cuidadosamente sus manos una vez terminado el trabajo. - En caso de derramamiento de la muestra sobre la superficie de trabajo u otros objetos, limpie la zona afectada con hipoclorito de sodio al 5 %. - No use plasma obtenido con heparina para esta prueba porque este anticoagulante inhibe la PCR 10. Las muestras a ensayar serán sueros o plasmas obtenidos con los anticoagulantes ácido etilendiaminotetracético (EDTA) o citratodextrosa (ACD). - Evite salpicaduras durante la preparación de las muestras para prevenir contaminaciones cruzadas. Se recomienda el uso de viales con tapa de rosca en lugar de cierre a presión. - Utilice puntas estériles, desechables, libres de ribonucleasas y con filtros antiaerosoles, en las etapas de extracción y amplificación. Use puntas desechables en la detección. - Las áreas de preamplificación, amplificación y detección deben quedar bien determinadas y físicamente separadas, así como los materiales, equipamiento y miscelánea a usar en las mismas, los cuales no deberán pasar de una a otra. Realice la extracción de ARN y la preparación de las mezclas para la RT-PCR y PCR-2 en el área de preamplificación. Use bata de laboratorio y guantes durante todo el proceso. Cámbielos si fuera a pasar de un área a otra. Las zonas de amplificación y detección son fuente de contaminación y por tanto no puede haber flujo de materiales de éstas hacia el área limpia o zona de preamplificación. - Nunca viole el flujo de circulación establecido: Preamplificación Amplificación Detección. - El Tampón de Lisis y las Soluciones de Desnaturalización, Neutralización e Hibridación son tóxicas o irritantes. Manipúlelas con cuidado. Evite su contacto con la piel y mucosas, en caso de producirse, lave inmediatamente la zona afectada con abundante agua. - No utilice reactivos después de la fecha de vencimiento. - No mezcle reactivos de distintos lotes del estuche. - Las muestras amplificadas se pueden almacenar a 4 ºC durante una semana, antes de realizar la detección. En caso de no poder realizar la detección en este periodo, conserve los amplicones a -20 ºC hasta el momento de la prueba. En estas condiciones evite congelaciones y descongelaciones reiteradas de los mismos. - Evite la exposición a la luz de los frascos de Sustrato y Tampón de Lisis. La ejecución del ensayo en sus cuatro etapas requiere de la aplicación de las buenas prácticas de laboratorio para obtener resultados confiables. La fiabilidad de los resultados dependerá en gran medida de los procedimientos de recolección, transportación y conservación de las muestras. Es preciso ser cuidadosos en el cumplimiento de las precauciones descritas para evitar contaminaciones y por tanto, falsos positivos en la prueba. Ninguna medida será extrema para preservar la pureza de los reactivos del estuche y especialmente de las enzimas (A2 y A4) y las mezclas de amplificación (A1 y A3). 5

6 Obtención y conservación de las muestras El ensayo UMELOSA HCV CUALITATIVO es aplicable a muestras de suero o plasma humano, obtenido éste último con los anticoagulantes ACD o EDTA. Las muestras tratadas con heparina no son útiles para esta prueba porque este anticoagulante inhibe la PCR. 10 La sangre con o sin anticoagulante, debe enviarse al laboratorio a una temperatura de 2 a 25 ºC y centrifugarse en las primeras seis horas luego de su colección, durante 20 minutos de 800 a 1600 g, para separar el suero o plasma de las células. El suero o plasma se transportará a una temperatura de 2 a 8 ºC o congelado, y podrá ser conservado: a temperatura ambiente (de 20 a 25 ºC) un día como máximo, de 2 a 8 ºC durante tres días, a -20 ºC un mes, o a 70 ºC por un tiempo más prolongado. Se recomienda no hacer congelaciones y descongelaciones repetidas de los sueros o plasmas porque pudieran producirse falsos negativos de la prueba, sobre todo para muestras con baja viremia. Esto es aplicable además a los controles del ensayo E3, E4 y a las muestras ya amplificadas. Es práctica recomendable preparar al menos dos alícuotas de 150 µl de aquellos sueros o plasmas que no vayan a procesarse en el día y congelarlas a 20 ºC, ó 70 ºC de ser posible, hasta el momento de su uso. Igualmente, se recomienda que una vez abierto por primera vez el vial del control negativo E3, el contenido se distribuya en alícuotas de 150 µl listas para el uso que se conservarán según se describió para las muestras. Instrucciones de uso Cada estuche contiene reactivos suficientes para cuatro series de 24 pruebas. Cada mezcla de amplificación contiene el volumen necesario para la realización de una de estas series. Si se desea, es posible hacer extracciones y amplificaciones de 12 muestras según se explica más adelante en la sección de Transcripción inversa y amplificación. Es factible la realización de dos series completas de 24 pruebas en la detección y esto equivale a una placa de 12 tiras, o de una sola serie equivalente a media placa. No se recomienda unir para su extracción y amplificación dos series de 24 muestras ni la eliminación de alguno de los controles del ensayo: E3 y E4, pero si se procesan dos series de 24 muestras por separado, sí es posible hacer una hibridación de 48 muestras. Procedimiento técnico Extracción de ARN Este paso se realiza en el área de preamplificación. Se recomienda para la extracción, agrupar las muestras en series de 12 ó 24 para aprovechar las facilidades que ofrece el estuche de amplificación. Realice en el orden indicado los siguientes pasos: 1. Atempere E1. 2. Descongele a temperatura ambiente las muestras y los controles E3 y E4, mezcle en agitador orbital (vortex) brevemente. Los controles del ensayo no se descongelarán más de dos veces y se conservarán de ser posible a 70 ºC. 3. Prepare en probeta de 50 ml el volumen necesario de etanol al 75 % o si desea una cantidad mayor para próximas extracciones. Para 50 ml tome 37,5 ml de etanol absoluto y complete hasta 50 ml con agua estéril libre de RNasas. Conserve en frío hasta el momento de su uso. 4. Una vez que abra el frasco de E2 prepare, en viales nuevos y estériles, alícuotas de 350 µl para su mejor conservación. 5. Añada a viales de 1,5 ml previamente rotulados, 500 µl de E1. 6. Adicione 150 µl de E3 y E4 en el primer y segundo vial respectivamente y de cada muestra a evaluar en los viales correspondientes. Mezcle en agitador orbital (vortex) brevemente. 7. Deje reposar 5 minutos a temperatura ambiente. 8. Adicione 100 µl de cloroformo. Mezcle en agitador orbital (vortex) durante 15 segundos. 9. Incube 10 minutos a temperatura ambiente. 10. Centrifugue 15 minutos a g y temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare un número de viales de 1,5 ml igual a la cantidad de muestras procesadas, rotule y añada 500 µl de isopropanol en cada uno. 11. Luego de la centrifugación aparecen tres fases. Con micropipeta de 1000 µl tome la fase superior acuosa que contiene el ARN y pásela a los viales con isopropanol. Evite tomar la fase fenólica. Mezcle por inversión varias veces la mezcla isopropanol - fase acuosa antes de poner a incubar. Cerciórese de cumplir estrictamente este último paso porque es imprescindible para la correcta precipitación del ARN. 12. Incube 10 minutos a temperatura ambiente (también se puede realizar la incubación a 20 C por una hora). 13. Coloque cada vez, a partir de este paso de centrifugación, los viales en la centrífuga con marcas hacia la periferia o el interior del rotor, de manera que queden orientados siempre de igual manera en el mismo, para facilitar la localización del ARN precipitado. Centrifugue 10 minutos a g y temperatura ambiente o a 4 ºC si dispone de centrífuga refrigerada. Elimine cuidadosamente el sobrenadante con micropipeta para no arrastrar el ARN precipitado, en ocasiones visible con bastante dificultad. 14. Añada a los viales 500 µl de etanol preparado al 75 % como se describe en el punto 3. y lave el ARN precipitado con movimiento muy suave de la gradilla. Si fuera necesario es posible detener en este paso la extracción y conservar los viales con el ARN en etanol al 75 %, a 20 ºC por varias horas o hasta el día siguiente. 6

7 15. Centrifugue 5 minutos a g y temperatura ambiente o a 4 ºC si dispone de centrífuga refrigerada. Elimine cuidadosamente el etanol para no arrastrar el precipitado. 16. Añada 100 µl de acetona a cada vial para lavar el precipitado con un movimiento muy suave de la gradilla. 17. Centrifugue 5 minutos a g y temperatura ambiente o a 4 ºC si dispone de centrífuga refrigerada. Elimine cuidadosamente la acetona con micropipeta de 100 ó 200 µl. Cerciórese que toda la acetona se retiró bien, de ser necesario aplique un golpe de centrífuga para ayudar a que el ARN precipitado se pegue bien a las paredes y toda la acetona se pueda retirar. Recuerde que este reactivo inhibe la actividad enzimática de las enzimas de la amplificación y por tanto debe evaporarse bien durante los 15 minutos de secado. 18. Destape los viales durante 15 minutos a temperatura ambiente para que seque el ARN precipitado (no superar los 15 minutos porque dificulta el proceso de disolución del mismo en E2). 19. Tome una o dos alícuotas de E2, según necesite de acuerdo al número de muestras que esté procesando (12 ó 24), y añada 20 µl a cada vial para disolver el ARN precipitado. 20. Agite con agitador orbital (vortex) unos 30 segundos y centrifugue por espacio de 5 segundos para hacer que todo el contenido baje en el vial. Termine de disolver el precipitado con ayuda de la micropipeta tomando y liberando varias veces todo el volumen, verifique que todo el precipitado se haya disuelto (use una punta nueva para cada vial). Si va a amplificar inmediatamente coloque en hielo los viales con el ARN disuelto, si no, guarde a 20 C por no más de una semana o a 70 C por no más de dos semanas. Transcripción inversa y amplificación Para una mejor comprensión hemos dividido este paso del ensayo en cuatro etapas: I. Preparación de la mezcla para RT-PCR II. RT-PCR III. Preparación de la mezcla para PCR-2 IV. PCR-2 I. Preparación de la mezcla para RT-PCR Este paso se realiza en el área de preamplificación una vez que hayan sido resuspendidos en E2 los ARN precipitados. Es importante que las mezclas listas para el uso estén el menor tiempo posible a temperatura ambiente antes de la realización de las amplificaciones. Puede colocarla en hielo pero nunca la congele. A continuación se describe el proceso para la realización de 24 ó 12 pruebas según se desee. Ensayo de 24 pruebas: 1. Coloque en gradilla apropiada 24 viales de 0,2 ó 0,5 ml para PCR y rotule cuidadosamente del 1 al 24, así como el número de ensayo o la fecha, según acostumbre. Siempre utilice un marcador del mismo color para todas las RT-PCR. Coloque la gradilla sobre hielo. 2. Añada a un vial de 1,5 ml previamente rotulado como mezcla A1-A2 para 24 reacciones, 355 µl de mezcla A1, 300 µl de E2 y 19,6 µl de A2. Homogeneice la mezcla por inversión, suavemente y centrifugue por espacio de 5 segundos, para hacer que todo el contenido baje de la tapa al fondo del vial. 3. Distribuya, empleando micropipeta con puntas antiaerosoles, 25 µl de mezcla por vial y deseche el resto. Ensayo de 12 pruebas: 1. Coloque en gradilla apropiada 12 viales para PCR de 0,2 ó 0,5 ml y rotule cuidadosamente del 1 al 12, así como el número de ensayo o la fecha, según acostumbre. Siempre utilice un marcador del mismo color para todas las RT-PCR Coloque la gradilla sobre hielo. 2. Añada a un vial de 1,5 ml previamente rotulado como mezcla A1-A2 para 12 reacciones, 178 µl de mezcla A1, 150 µl de E2 y 9,8 µl de A2. Homogeneice la mezcla por inversión, suavemente y centrifugue, por espacio de 5 segundos, para hacer que todo el contenido baje de la tapa al fondo del vial. 3. Distribuya, empleando micropipeta con puntas antiaerosoles, 25 µl de mezcla por vial y deseche el resto. II. RT-PCR La preparación de las reacciones se realiza en el área de preamplificación. 1. Añada 5 µl de cada ARN extraído a los viales de reacción preparados en el paso anterior y homogeneice mediante pipeteo repetitivo unas cinco veces. 2. Traslade los viales al área de amplificación y colóquelos en el termociclador. Programe, si es la primera vez, o seleccione si está disponible, el programa de RT-PCR de 40 ciclos con los siguientes pasos: Pasos Temperatura Tiempo de duración 1 45 ºC 30 minutos 2 95 ºC 5 minutos 3 95 ºC 30 segundos 4 50 ºC 30 segundos 5 72 ºC 30 segundos 6 Ir a 3, 39 veces 7 72 ºC 7 minutos 8 4 ºC definido por el usuario 7

8 3. Una vez terminada la amplificación recupere los viales de reacción y colóquelos en el refrigerador de 2 a 8 ºC si va a realizar el PCR-2 en breve plazo, o a 20 ºC si fuera a demorar varios días. No conserve por más de una semana los amplicones para su segunda ronda de amplificación. Evite congelaciones y descongelaciones reiteradas de los mismos. III.Preparación de la mezcla para PCR-2 Este paso se realiza en el área de preamplificación. A continuación se describe el proceso para la realización de 24 ó 12 pruebas según se desee. Ensayo de 24 pruebas: 1. Coloque en gradilla apropiada 24 viales de PCR de 0,2 ó 0,5 ml y rotule cuidadosamente del 1 al 24, así como el número de ensayo o fecha según acostumbre. Siempre utilice un marcador de color diferente al empleado para rotular los viales de reacción de RT-PCR. Coloque la gradilla sobre hielo. 2. Añada a un vial de 1,5 ml previamente rotulado como mezcla A3-A4 para 24 reacciones, 425 µl de una mezcla A3, 300 µl de E2 y 5,4 µl de A4. Homogeneice la mezcla por inversión, suavemente y centrifugue, por espacio de 5 segundos, para hacer que todo el contenido baje de la tapa al fondo del vial. 3. Distribuya, empleando micropipeta con puntas antiaerosoles, 27 µl de mezcla por vial y deseche el resto. Ensayo de 12 pruebas: 1. Coloque en gradilla apropiada 12 viales de PCR de 0,2 ó 0,5 ml y rotule cuidadosamente del 1 al 12, así como el número de ensayo o fecha según acostumbre. Siempre utilice un marcador de color diferente al empleado para rotular los viales de reacción de RT-PCR. Coloque la gradilla sobre hielo. 2. Añada a un vial de 1,5 ml previamente rotulado como mezcla A3-A4 para 12 reacciones, 212 µl de mezcla A3, 150 µl de E2 y 2,7 µl de A4. Homogeneice la mezcla por inversión, suavemente y centrifugue, por espacio de 5 segundos, para hacer que todo el contenido baje de la tapa al fondo del vial. 3. Distribuya, empleando micropipeta con puntas antiaerosoles, 27 µl de mezcla por vial y deseche el resto. IV. PCR-2 La preparación de la reacción de PCR-2 se realiza en el área de amplificación. Es importante descontaminar con hipoclorito de sodio al 5 % y luz ultravioleta (UV) las superficies de trabajo al comienzo y final de su uso. 1. Añada 3 µl de cada vial de reacción de RT-PCR a los viales de reacción con mezcla para PCR-2 y homogeneice mediante pipeteo repetitivo unas 5 veces. Es recomendable limpiar el guante con gasa humedecida en hipoclorito de sodio al 5 %, después de abrir cada vial de RT-PCR (antes de abrir un nuevo vial con mezcla para PCR-2). Esto es importante para evitar posibles contaminaciones. 2. Coloque los viales en el termociclador. Programe, si es la primera vez, o seleccione si está disponible, el programa de PCR-2 de 40 ciclos con los siguientes pasos: Pasos Temperatura Tiempo de duración 1 95 ºC 3 minutos 2 95 ºC 30 segundos 3 50 ºC 30 segundos 4 72 ºC 30 segundos 5 Ir a 2, 39 veces 6 72 ºC 7 minutos 7 4 ºC definido por el usuario 3. Una vez terminada la amplificación recupere los viales de reacción y colóquelos en el refrigerador de 2 a 8 ºC si va a realizar la detección en breve plazo, o a 20 ºC si fuera a demorar varios días. No conserve por más de una semana los amplicones para su hibridación. Evite congelaciones y descongelaciones reiteradas de los mismos. Detección Este paso se realiza en el área de detección. Antes de comenzar la hibridación siga los pasos descritos a continuación: Deje atemperar sobre la mesa de trabajo la placa de tiras y todos los reactivos necesarios para el ensayo. Evite la incidencia de luz sobre el frasco que contiene el Sustrato. Equilibre la cámara húmeda a una temperatura de 37 ± 2 ºC. Durante ese tiempo, homogeneice manualmente las muestras amplificadas y centrifugue brevemente para hacer que todo el contenido baje en el vial. Asegúrese de tener suficiente reactivo R3 para la preparación de la solución Neutralización-Hibridación (R2-R3) y de la Solución de Lavado. Caliente 3 ó 4 frascos de la solución R3 a una temperatura entre 37 y 60 ºC en plancha de calentamiento, durante 15 minutos aproximadamente, agítelos de 2 a 3 veces manualmente hasta lograr su completa homogeneización y un aspecto transparente. Mantenga el frasco de R3 a una temperatura entre 37 y 60 ºC hasta el momento de la preparación de ambas soluciones. 8

9 Preparación de la Solución de Lavado: Prepare la cantidad de solución de lavado necesaria de acuerdo al número de tiras a utilizar. Para una placa son suficientes alrededor de 200 ml. Realice dilución ¼ de R3: tome un volumen de R3 y tres de agua destilada (por ejemplo 50 ml de R3 y 150 ml de agua). Homogeneice bien la solución y manténgala entre 37 y 60 ºC hasta un poco antes del primer lavado, (Lavado 1 descrito en el punto 6), viértala en el frasco del lavador y cebe el equipo para dejarlo listo para el uso. La Solución de Lavado es estable durante un mes, conservada a una temperatura entre 2 y 25 ºC. Una vez atemperada la placa, elimine la cubierta protectora. Retire del marco las tiras que no vaya a utilizar, guárdelas en la bolsa con desecante suministrada en el estuche y consérvelas para su posterior uso a una temperatura entre 2 y 8 ºC, por no más de tres meses. Verifique que todas las tiras de reacción estén bien niveladas en el soporte. Enumérelas en orden consecutivo según acostumbre. Realice en el orden indicado los siguientes pasos: 1. Adición de la Solución Desnaturalizante (R1): Añada 10 µl de R1 por pocillo. Extraiga del frasco de R1, el volumen necesario para el número de tiras a utilizar y deposítelo en un reservorio apropiado. Cargue y dispense con multipipeta 10 µl de la solución en cada pocillo. 2. Adición de las muestras y controles: Añada 5 µl de muestras y controles por duplicado, homogeneizando de 5 a 8 veces. APLIQUE LAS MUESTRAS Y CONTROLES POR DUPLICADO siguiendo el esquema de distribución que se representa en la Fig 1. Las muestras M1, M2, etc, se añadirán luego de los controles E3 y E4, consecutivamente en línea vertical, a partir de la posición 1E. Adicione 5 µl de muestras y controles a los diferentes pocillos de la placa. Homogeneice después de cada aplicación, mezclando adecuadamente con la solución R1 mediante pipeteo repetitivo de 5 a 8 veces A B C D E F G E3 M3 M7 M11 M15 M19 M23 M27 M31 M35 M39 M43 E3 M3 M7 M11 M15 M19 M23 M27 M31 M35 M39 M43 E4 M4 M8 M12 M16 M20 M24 M28 M32 M36 M40 M44 E4 M4 M8 M12 M16 M20 M24 M28 M32 M36 M40 M44 M1 M5 M9 M13 M17 M21 M25 M29 M33 M37 M41 M45 M1 M5 M9 M13 M17 M21 M25 M29 M33 M37 M41 M45 M2 M6 M10 M14 M18 M22 M26 M30 M34 M38 M42 M46 H M2 M6 M10 M14 M18 M22 M26 M30 4 M34 M38 M42 M46 Fig. 1. Esquema de distribución de muestras y controles en la placa. Donde: M1, M2, etc, son muestras provenientes de la PCR Incubación 1: 10 minutos a 37 ± 2 ºC en cámara húmeda Incube la placa de tiras durante 10 minutos a 37 ± 2 ºC en cámara húmeda previamente equilibrada a esa temperatura. 4. Preparación y adición de R2-R3: Prepare R2-R3 y añada 10 µl en cada pocillo. Homogeneice de 10 a 15 veces. Prepare inmediatamente la solución de Neutralización-Hibridación (R2-R3). Para ello calcule el volumen necesario para el número de tiras a usar teniendo en cuenta que la solución R2-R3 se añade a razón de 10 µl por pocillo. Mezcle partes iguales de R2 y R3 (este último previamente calentado de ºC) hasta obtener el volumen calculado. Por ejemplo, tome para una placa, 1 ml de R2 y 1 ml de R3. Homogeneice y deje reposar entre 37 y 60 ºC hasta el momento de su uso. Aplique 10 µl de R2-R3 en cada pocillo. Mezcle bien con la multipipeta (de 10 a 15 veces), hasta lograr un color amarillo homogéneo en todos los pocillos. No debe conservar la mezcla de R2-R3 sobrante, deséchela al terminar! 5. Incubación 2: 2 horas a 37 ± 2 ºC en cámara húmeda Incube la placa durante 2 horas a 37 ± 2 ºC en cámara húmeda previamente equilibrada a esa temperatura. En este tiempo pueden prepararse el conjugado y el sustrato diluidos a sus concentraciones de trabajo. 9

10 Dilución de conjugado y sustrato: Dilución del conjugado (R4-R5): El conjugado se añade en cantidad de 30 µl por pocillo. Calcule el volumen necesario de acuerdo al número de tiras en uso y prepárelo mediante dilución 1/100 de R4 con R5. Para una placa completa tome 35 µl de R4 y µl de R5. Para seis tiras tome 18 µl de R4 y µl de R5. Dilución del sustrato (R6-R7): El sustrato se añade a la placa en cantidad de 30 µl por pocillo. Calcule el volumen necesario de acuerdo al número de tiras en uso y prepárelo mediante dilución 1/10 de R6 con R7, para ello mezcle un volumen de R6 con nueve de R7. Para una placa completa tome 400 µl de R6 y µl de R7. Para seis tiras tome 200 µl de R6 y µl de R7. Conserve R6-R7 a temperatura ambiente y en frasco ámbar protegido de la luz, hasta el momento de su uso. 6. Lavado 1 (después de las 2 horas de incubación): lave 4 veces con un volumen de 30 µl por pozo de solución de lavado. Si fuera a utilizar solución de lavado no preparada en el día, verifique que esté homogénea. En caso necesario caliéntela a una temperatura entre 37 y 60 ºC y agite manualmente hasta lograr una solución totalmente transparente. Utilice un lavador de la tecnología SUMA o similar apropiado, cébelo adecuadamente. Lave la placa 4 veces con un volumen de 30 µl de solución por pocillo y un tiempo mínimo de lavado de 30 segundos. Después de la última aspiración sacuda la placa sobre un papel absorbente no fluorescente para eliminar cualquier resto de solución que haya podido quedar en los pocillos. 7. Adición del conjugado: 30 µl de R4-R5 por pocillo. Dispense en cada pocillo, 30 µl de R4-R5 preparado como fue descrito anteriormente. Deseche el sobrante R4-R5 no utilizado. 8. Incubación 3: 30 minutos a 37 ± 2 ºC en cámara húmeda. Incube la placa durante 30 minutos a 37 ± 2 ºC en cámara húmeda previamente equilibrada a esa temperatura. 9. Lavado 2: 4 veces con 30 µl por pozo de solución de lavado. Lave la placa según se describe en el paso Adición del sustrato: 30 µl de R6-R7 por pocillo. Aplique 30 µl por pocillo de R6-R7 preparado como fue descrito anteriormente. Deseche el sobrante. 11. Incubación 4: 30 minutos entre 20 y 25 ºC en cámara húmeda. Incube la placa durante 30 minutos entre 20 y 25 ºC en cámara húmeda previamente equilibrada. 12. Lectura de fluorescencia: Realice la lectura de la intensidad de la fluorescencia emitida en cada pocillo utilizando un lector de la serie SUMA o similar. La validación, interpretación de resultados y su impresión, son efectuadas automáticamente por el lector SUMA con el programa UMELOSA HCV CUALITATIVO. Si no se dispone de este programa, el operador puede interpretar los resultados siguiendo las instrucciones que se describen más adelante. Control de la calidad Las características de los parámetros requeridas para asegurar la calidad del ensayo son las siguientes: a) Al menos uno de los valores de fluorescencia de los duplicados del Control Negativo (E3) debe ser menor o igual que 40 unidades de fluorescencia, de lo contrario, se invalidará la serie completa y deberá repetirse todo el procedimiento analítico (extracción, amplificación y detección). b) Al menos uno de los valores de fluorescencia de los duplicados del Control Positivo (E4) debe ser mayor o igual que 140 unidades de fluorescencia, de lo contrario, se invalidará la serie completa y deberá repetirse todo el procedimiento analítico (extracción, amplificación y detección). Interpretación de los resultados Los resultados de la prueba, deben ser analizados conjuntamente con la información de carácter clínico y otros datos analíticos disponibles, para un diagnóstico correcto de la infección. Ver siguiente punto Limitaciones de la prueba. La muestra se considera positiva (ARN de VHC detectado) cuando la media de los duplicados es igual o mayor que 140 unidades de fluorescencia. Nivel de corte: F 1+ F Donde: F1: Fluorescencia de la réplica 1 de la muestra a evaluar. F2: Fluorescencia de la réplica 2 de la muestra a evaluar. 10

11 La muestra se considera negativa (ARN de VHC no detectado) cuando la media de los duplicados es igual o menor de 40 unidades de fluorescencia. Un resultado negativo no excluye la presencia de infección por el VHC. Los resultados dependen de la recolección adecuada de la muestra, ausencia de agentes inhibidores y de que la cantidad de ARN en la misma sea igual o mayor que el límite de detección de la técnica. El resultado se considera indefinido cuando la media de los duplicados de la muestra es mayor que 40 y menor que 140 unidades de fluorescencia. Para aclarar un resultado indefinido se repetirá el procedimiento de detección por duplicado. De obtenerse el mismo resultado, se hará todo el procedimiento (extracción, amplificación y detección) usando una nueva alícuota de la muestra del paciente. Para las muestras con media de fluorescencia de los duplicados por ambas pruebas (inicial y repetida con nueva alícuota) mayor que 40 y menor que 140 se orientará la realización de una nueva extracción de sangre al paciente para repetir la prueba (el paciente debe ser encuestado para saber si se le ha puesto heparina o algún otro medicamento que pueda inhibir la prueba). En caso de obtener los mismos resultados se considerará la muestra indefinida por esta técnica. Limitaciones de la prueba 1. Pueden obtenerse resultados falsos negativos por inhibición de la enzima Taq polimerasa por agentes intrínsecos de la muestra, aunque el porcentaje reportado de muestras con inhibición en la práctica es inferior al 0,5 % Es real el riesgo de obtención de falsos positivos por contaminación con amplicones inherente a la técnica de PCR. Sólo el cumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio y de los cuidados y precauciones descritos en este instructivo, podrá disminuir dicho riesgo. 11

12 Guía de problemas Problema Causa(s) Solución(es) Control Negativo (CN) con señal mayor de 40 UF y/o Falsos Positivos en las muestras. Alta frecuencia de Repetir. Ejecución incorrecta de la técnica. Paso crítico en la transferencia de RT-PCR a PCR-2. Violación del sentido del flujo de trabajo de ARN a ADN. Presencia de amplicones ambientales. Calidad muestras y controles: a. Descongelaciones repetidas del CP y/o las muestras por mala conservación b. Presencia de un agente inhibidor en la muestra, ej. Heparina: previo a hemodiálisis al pacientes se le inyecta heparina, si se hace la extracción de sangre después de esto, se inhibe la amplificación. Descontamine el área de pre-amplificación con luz UV e hipoclorito de sodio (NaOCl) al 5%. Cuando haga la transferencia RT-PCR a PCR-2, se debe limpiar bien los guantes con hipoclorito entre muestra y muestra. Procese nuevamente las muestras cumpliendo rigurosamente las buenas prácticas de laboratorio y los cuidados y precauciones descritos en el instructivo utilizando nuevas alícuotas de controles, muestras y reactivos. a. Verifique periódicamente la temperatura del freezer donde se conservan los Controles del ensayo y las muestras. b. Cerciórese que trabaje con muestras libres de inhibidores. c. Cuando haga la transferencia RT-PCR a PCR- 2, si se limpia los guantes con hipoclorito, séquelos bien porque éste inhibe la PCR. Control Positivo (CP) con señal baja (alrededor o menor de 140 UF) y resultados de muestras bajos, discordantes con otros medios diagnósticos o clínicos: Falsos Negativos. Alta frecuencia de Repetir. Ejecución incorrecta en: Extracción del ARN: a. Ausencia del precipitado de ARN por poca fase acuosa. b. Ausencia del precipitado de ARN por no mezclar por inversión la fase acuosa con el isopropanol antes de incubar. c. Pérdida del precipitado de ARN en los lavados. Amplificación: Empleo de mezclas de RT-PCR y/o PCR-2 congeladas después de la preparación. Hibridación: a. Temperatura del laboratorio menor de 23 ºC. b. Dilución del conjugado a menos de una hora de su empleo. c. Mal lavado por problemas técnicos del lavador de placas. a. Si durante la separación de fases Ud. obtuvo poca fase acuosa e incluso una interfase gruesa y difusa, es probable que no haya añadido la cantidad correcta de cloroformo. Procese nuevamente la muestra. b. Si tras centrifugar Ud. se percatara de que no mezcló antes de incubar, mezcle por inversión, reincube igual y continúe la extracción. c. Realice nuevamente la extracción del ARN de la muestra. Repita la RT-PCR y/o PCR-2 con mezclas no congeladas. a. Leer a los 35, 40 minutos o más, de reacción del sustrato. b. Preparar el conjugado una hora antes de emplearlo. c. Solicite Asistencia Técnica Instrumental para que revisen y/o arreglen el equipo. Desempeño analítico del estuche 12 Especificidad clínica Se evaluaron 118 muestras seronegativas por el UMELISA HCV para la detección de anticuerpos al VHC: 50 sueros y 68 plasmas. De ellos 28 parejas de suero y plasma procedentes de igual número de donantes, que fueron evaluados en paralelo. Todos los sueros fueron negativos. Tres plasmas resultaron inicialmente positivos en el ensayo, por lo que fueron sometidos a prueba nuevamente para resolver si se trataba de falsos positivos. Se aclaró que uno de los plasmas era realmente negativo lo cual se correspondió con el resultado obtenido para su suero respectivo en la prueba inicial. Los otros dos plasmas, que no tenían parejas de suero, fueron ensayados nuevamente con el estuche UMELOSA HCV CUALITATIVO y el kit comercial de la Roche AMPLICOR Hepatitis C Virus (HCV) Test, versión 2.0 y se demostró que eran verdaderos positivos, correspondientes a muestras en seroconversión procedentes de donantes de plasmaféresis. 12

13 El falso positivo obtenido inicialmente no estuvo relacionado con problemas de especificidad de la técnica, sino con la posibilidad real de contaminación conocida y descrita para este tipo de ensayos si no se tienen todos los cuidados en la realización del mismo. Si consideramos la posibilidad de su ocurrencia y lo incluimos en el cálculo de especificidad, se obtiene un valor de 99,14 %. Sensibilidad analítica Para estudiar la sensibilidad del ensayo, se prepararon varias diluciones del Estándar Internacional (IS) 13 de la OMS para ARN de VHC 96/790, así como del Control de Corrida del NIBSC, genotipo 3: RC 96/586 (RC) 14, 15 Se ensayó además el panel Pelicheck HCV- RNA sensitivity panel (Cat.No.S2004) 16, destinado al control de la sensibilidad de los ensayos de amplificación de ARN de VHC y consta con ocho muestras en diluciones seriadas del genotipo 1 y ocho del genotipo 3. Para determinar el límite de detección del 95 % (LD 95%), se prepararon varias diluciones de un plasma de trabajo (CP) calibrado contra el IS. EL LD 95% fue calculado por el método PROBIT 17 Evaluación del IS, RC, panel Pelicheck y CP: De las diluciones del IS y RC, se ensayaron varias réplicas por distintos operarios y en días diferentes. Los resultados obtenidos aparecen reflejados en la Tabla 1 y la Tabla 2 respectivamente. La Tabla 3 muestra los resultados obtenidos de la prueba del panel de referencia Pelicheck. En la Tabla 4 aparecen los resultados obtenidos en la evaluación del CP. Tabla 1. Evaluación del IS Dilución Nº de Nº de % de UI/mL IS réplicas positivos positivos 1/ / / / / , Tabla 2. Evaluación del RC Dilución Nº de Nº de % de UI/mL RC réplicas positivos positivos / /100 7, Nº Genotipo 1 (geq/ml) Tabla 3. Evaluación del panel Pelicheck Genotipo 3 Resultado Nº Resultado (geq/ml) n % + n % , , , , geq/ml: genomas equivalentes/ml (1UI/mL 3,8 geq/ml) 15 Tabla 4. Evaluación del CP Dilución Nº de Nº de % de UI/mL CP réplicas positivos positivos 1/ / ,5 1/ , / ,

14 Análisis de los resultados: Hasta este momento los requerimientos de sensibilidad para los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (Nucleic Acid Amplification Technology- NAT) empleados en las pruebas para la liberación de bolsas de plasma o sangre, no están armonizados. Igualmente ocurre con las unidades utilizadas para expresar la carga viral de los estándares y materiales de referencia disponibles para el control de estas técnicas. A pesar de la existencia del IS de la OMS, cuantificado en UI/mL, son indistintamente usadas las cop/ml y los geq/ml. En Estados Unidos la FDA exige, para la pesquisa de bolsas de sangre, un LD 95% para 5000 UI/mL, mientras que en Europa se requiere la detección el 95% de las veces de 5000 cop/ml, equivalentes a 1250 UI/mL 18. Por otra parte, para los ensayos tipo NAT para probar las mezclas de plasma a utilizar en productos derivados de la sangre en Europa, se exige una sensibilidad igual o menor a 100 UI/mL 11,15, equivalentes a 400 geq/ml o dilución 1/10 del RC 14. Quedó establecido desde Febrero de 1998 el valor de 100 UI/mL como el límite de detección del 95 %, exigido para estas pruebas 11. El LD 95%, calculado para el ensayo a partir de los resultados obtenidos para el CP, resultó igual a 101,7 UI/mL con un intervalo de confianza de 81,0 a 162,8 UI/ ml. Esta sensibilidad cumple con lo exigido por la FDA y Europa, para la pesquisa de bolsas de sangre y está muy cerca de las 100 UI/mL requeridas en Europa para este mismo fin cuando se trata de mezclas de plasma a utilizar en productos hemoderivados. El ensayo fue capaz de detectar 100 UI/mL del IS de la OMS el 88 % de las veces. Ver Tabla 1. Para el RC el análisis se dificulta por el pequeño número de replicaciones analizadas para cada dilución. No obstante, en su dilución 1/10 con concentración inferior a las 100 UI/mL, fue detectado el 75 % de las veces. Ver Tabla 2. Como resultado de la prueba con las muestras del panel Pelicheck, se demostró que el estuche UMELOSA HCV CUALITATIVO es capaz de detectar ambos genotipos estudiados con porcentajes de positividad comparables con los obtenidos en el Segundo Estudio de Colaboración Internacional para la caracterización del panel 16. Ver Tabla 3. En el manual del panel, destinado al control de la sensibilidad de los ensayos de amplificación de ARN de VHC, se plantea que una adecuada sensibilidad para estos sistemas se corresponde con la detección de 3600 geq/ml y preferiblemente, de 900 geq/ml del genotipo 1 el 100 % de las veces. Los resultados mostrados en la Tabla 3 se corresponden con estos requerimientos de sensibilidad. Reactividad cruzada Se realizó la prueba a diez muestras positivas al VIH, nueve del tipo 1 y una del tipo 2. Se probaron además nueve muestras VHB positivas y cinco positivas al virus del HTLV-1. Todas las muestras ensayadas resultaron negativas a la prueba de Anti-VHC y al UMELOSA HCV CUALITATIVO. Robustez 19 La robustez de un procedimiento analítico, como medida de su capacidad de no ver afectados sus resultados por pequeñas variaciones deliberadas en sus condiciones de ejecución, ofrece una medida de su confiabilidad para el uso rutinario. Para evaluar este parámetro, se ensayaron 8 muestras positivas bajas (con concentración 3 veces mayor al LD 95% obtenido para el ensayo) en tres días diferentes, por varios operadores y con diferentes lotes del estuche, para un total de 24 determinaciones. La no-ocurrencia de contaminación cruzada se demostró mediante el ensayo de un panel de 22 muestras consistente en 11 plasmas negativos alternando con estos mismos plasmas contaminados con UI/mL del CP. Todas las muestras positivas bajas ensayadas resultaron positivas a la prueba. No hubo afectaciones por pequeñas variaciones en las condiciones de ejecución. No se produjo contaminación cruzada entre las muestras positivas altas y aquellas negativas analizadas. Todas las muestras negativas y el control negativo del ensayo fueron negativos a la prueba, mientras que las muestras positivas y el control positivo resultaron positivos. Evaluación de concordancia de resultados por UMELISA HCV y UMELOSA HCV CUALITATIVO 20 Como consecuencia de un estudio clínico que incluyó muestras positivas por UMELISA HCV: 45 sueros de pacientes de una consulta especializada de gastroenterología y 40 muestras procedentes de bancos de sangre (26 plasmas y 14 sueros), se obtuvieron los resultados que se muestran en la Tabla 5. Tabla 5. Resultados por UMELISA HCV y UMELOSA HCV CUALITATIVO Muestras (procedencia) Consulta Gastroenterología Total Suero/Plasmas + Ac + PCR % Concordancia / % Banco de sangre 40 14/ / 14 52,5 % 14