PALABRAS CLAVE: Phytophthora capsici, extractos fermentado, polifenoles, Larrea tridentata, Fluorensia.

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1 EXTRACTOS NORMALES Y FERMENTADOS DE Larrea Y Fluorensia cernua SOBRE Phytophthora capsici IN VITRO RESUMEN Francisco Daniel Hernández Castillo 1 Alberto Díaz Díaz 1 Diana Jasso Cantú 1 Noé Cristóbal Aguilar 2 Raúl Rodríguez Herrera 2 Ruth Elizabeth Belmares Cerda 2 En el cultivo de chile, la incidencia de la enfermedad marchitez del chile causada por Stramenopila Phytophthora capsici, constituye a nivel nacional, uno de los principales problemas que afectan la productividad del cultivo. El presente trabajo tuvo como objetivo: Determinar el efecto de extractos normales y fermentados de Larrea, Fluorensia cernua sobre Phytophthora capsici. Se extrajeron los compuestos polifenolicos de ambas plantas con acetona y metanol mediante el método de Sóxhlet y sonicación, para evaluar su efecto en el crecimiento micelial de P. capsici in vitro. El solvente del extracto se separó usando un rotavapor. Los extractos se disolvieron en medio de cultivo papa-dextrosa-agar, preparándose 8 tratamientos a 1, 10, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500 y 3000 ppm. Para cada patógeno con su testigo se coloco una porción de micelio de fitopatógenos con PDA de 0.5 mm de diámetro en las cajas petrí con PDA más el extracto y se incubaron durante seis días a 26 C en ausencia de luz; la lectura se realizó a los 144 horas usando un vernier. El extracto que mostró el 100% de inhibición en el crecimiento micelial de P. capsici desde la dosis de 100 ppm fue Soxgme, muestra que con el Hojasen se obtuvo el 100% de inhibición con Soxhace 750 ppm. Las dosis que presentó resultados similares fueron los siguiente: Fsoxgace a 4000 ppm, Fsoxgme a 4000 ppm, Fsgace a 4000 ppm, Fsgme a 4000 ppm y Fsoxhace a 4000 ppm respectivamente. Estos resultados indican que los extractos fermentados son más eficientes para el control P. capsici en comparación con extractos normales. Lo cual indica un buen efecto de los extractos a concentraciones más bajas a lo reportado en la literatura. La abundancia de polifenoles en los extractos señala en estos compuestos la actividad fungicida. PALABRAS CLAVE: Phytophthora capsici, extractos fermentado, polifenoles, Larrea, Fluorensia. INTRODUCCIÓN En el cultivo de chile, la incidencia de la enfermedad marchitez del chile causada por Phytophthora capsici, constituye a nivel nacional, uno de los principales problemas que afectan la productividad del cultivo; se estima que el efecto de esta enfermedad sobre la disminución de la densidad de plantación es del 10 a 60 % (Romero 1988) y en zonas como el Bajío y Puebla, hasta un 100% de mortalidad (Chávez et al., 1994). El agente causal se aisló por primera vez en Nuevo México, EUA, en pimiento (Leonian, 1922); después en otros hospedantes como berenjena, calabacita, melón, jitomate, cacao, macadamia, fresa, pepino y sandía (Romero 1988). El patógeno habita en el suelo y afecta principalmente las raíces y la base del tallo de la planta, aunque también puede atacar las partes aéreas. Los síntomas iniciales son necrosamiento y pudrición de raíces secundarias y terciarias que son las que se encargan de la absorción de agua, luego se presenta la marchitez de plantas y posteriormente pudrición de 1 Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. fdanielhc@hotmail.com 2 Universidad Autónoma de Coahuila.

2 frutos, la muerte de la planta es ocasionada por avance del hongo a través del pedúnculo del fruto, ramas y tallo. Bajo condiciones favorables de temperatura (25 a 28ºC) y alta humedad del suelo, P. capsici es sumamente agresivo, capaz de destruir campos enteros de los hospedantes mencionados en corto tiempo (Chávez et al., 1994). Este hongo sobrevive de un ciclo a otro en el suelo en forma de oosporas, las cuales se producen cuando en un mismo campo se encuentran los tipos de compatibilidad A1 y A2. El control de esta enfermedad ha sido tradicionalmente difícil, no habiendo hasta la fecha un manejo integral de la misma; pues por una parte no se tienen materiales comerciales resistentes, el control cultural no es totalmente efectivo, finalmente, el control químico es deficiente, debido que el hongo tiene una respuesta variable a los fungicidas empleados y a desarrollar resistencia a los mismos. Dada la relevancia de este problema, se intenta buscar alternativas de control como la utilización de biopesticidas que son más amigables para el medio ambiente buscando siempre una agricultura sustentable (Pérez et al., 1990). Los objetivos fueron evaluar el efecto de extractos normales y fermentados de L. y F. cernua sobre P. capsici bajo condiciones in vitro. MATERIALES Y MÉTODOS Obtención de extractos Plantas de gobernadora L. y F. cernua se colectaron en el km 4 de la carretera Saltillo Zacatecas, el 11 de abril del 2008, y se trasladaron al laboratorio donde se dejaron secar a temperatura ambiente. Para la extracción se emplearon hojas, tallos secos y molidas en polvo, conservándose éste en bolsas de plástico de poliuretano etiquetadas y conservadas bajo condiciones de laboratorio. Los extractantes empleados fueron Acetona y Metanol tanto extracción normal y fermentado a una proporción 1:4 (tejido vegetal: extractante) (Gamboa et al., 2003). La extracción de los fitoquímicos de las plantas se realizó por infusión en los extractantes por 7h a 60 C, después se dejó enfriar a temperatura ambiente y se vaciaron a frascos ámbar para conservarse en refrigeración a -20 º C, Biotransformación fúngica de la materia vegetal Propagación y obtención de esporas de Aspergillus niger GH1 Se prepararon 14 matraces Erlenmeyer con una capacidad de 125 ml con 30 ml del medio papa dextrosa agar (PDA) en cada uno de ellos (Cuadro 1), se taparon con gasa y algodón y se sometieron a esterilización en autoclave a 121º C durante 15 minutos, se dejaron enfriar y una vez solidificados se inocularon con 50 µl de hongo Aspergillus Níger GH1 (cepario DIAUAde C) y se incubaron a una temperatura de 30º C durante 3-4 días aproximadamente esperando observar abundante producción de esporas sobre el agar. Cuadro 1. Preparación de agar PDA. Composición Cantidad Infusión de papa 4.0 g. Dextrosa 20.0g. Agar 15.0g. PH final Agar-Dextrosa y Papa 3.076G./L Conteo de esporas Sobre el matraz conteniendo el esporulando se vaciaron 30 ml de una solución del detergente Tween 80 al 0.1% v/v, previamente esterilizada. Se realizó una cosecha de esporas con ayuda de un agitador magnético estéril y una parrilla de agitación. De este barrido se hizo una dilución 1:20, de la cual se tomó una pequeña alícuota para el llenado de la cámara de Newbauer,

3 donde se contaron 13 cuadros de los 25 cuadros centrales, utilizando para el conteo el microscopio con el objetivo de 40X. La cantidad de esporas se determinó con la siguiente ecuación. Numero de esporas/ml= (promedio de esporas/cuadro) (10 4 ) (25) (factor de dilución). Preparación de inóculo Para el inóculo se utilizó el medio Czapek-Dox inoculado con una cantidad ajustada de la solución de esporas de 2 E 7 esporas/gramo de la planta. Las condiciones de fermentación fueron: 70% de humedad por cada 30g de planta a fermentar, por tanto se ajustó la cantidad de agregar del medio Czapek-Dox para fermentar 800 gramos de L. y 800 gramos de F. cernua en total de cada muestra. Así, se agregaron 19.7 ml de la solución esporas con una concentración de 1.6 E 10 esporas en una cantidad de 1866 ml de Czapek-Dox, todo en condiciones de estériles. Fermentación de planta Las condiciones de fermentación fueron: fuente de carbono (Gobernadora y Hojasén), en cada planta a fermentar, se utilizó el medio de cultivo Czapek- Dox para darle a la fermentación una condición de humedad del 70%, el inóculo de 2 E 7 esporas/g de planta, a una temperatura de 30º C durante un tiempo de 24 horas. El procedimiento de la fermentación fue: Cada muestra se fermentó en charolas de aluminio con capacidad de 3 L se agregaron 800 g de de planta pulverizada, posteriormente se agregaron 1866 ml de Czapek-Dox ya inoculado, se taparon con papel aluminio se incubaron a 30º C durante 24 horas con agitación manual cada 4 horas, y se observaron en el estereoscopio para ver el avance del crecimiento de las esporas o micelio. Una vez transcurrido éste tiempo, la planta fermentada se tapó y sobre aluminio, se llevo a secar en estufa a una temperatura de 60º C durante 36 horas. Finalmente se realizó la extracción de ambas plantas fermentadas. Determinación de concentración de taninos Se determinó la concentración de taninos hidrolizables y taninos condensados por espectrofotometría. De cada extracto se hizo una dilución de 1:100 (extracto: agua destilada). Para taninos condensados se colocaron 500 µl de muestra diluida en un tubo de ensaye, posteriormente se agregaron 3 ml de HCL/Butanol (1:9) y 100 µl de reactivo Férrico y por otro lado se colocó sólo catequina (estándar) en agua destilada a diferentes concentraciones (0, 200, 400, 600, 800 y 1,000 ppm) para determinar la curva de referencia. Los tubos se taparon fuertemente y fueron calentados por 1 h en baño María a 100 C, después de este tiempo se dejó enfriar y se leyó la absorbancia con UV/visible a 550 nm. Para taninos hidrolizables, se colocaron 800 µl de muestra diluida en un tubo de ensaye, enseguida se adicionaron 800 µl del reactivo comercial Folin-Ciocalteu, se agitó y dejó reposar por 5 min. Después se agregó 800 µl de NaCO 3 (0.01 M), y 4 ml de agua destilada. Por otro lado se preparó ácido gálico en agua destilada a diferentes concentraciones (0, 200, 400, 600, 800, 1,000 ppm). Por último se leyó a 750 nm de UV/visible. Efecto de extractos normales y fermentados de Larrea t. y F. cernua sobre el crecimiento micelial de P. capsici Las concentraciones empleadas de los extractos se encuentran en el Cuadro 2. Se utilizó la técnica del medio envenenado; para ello se utilizó PDA en cajas petri de 0.84 cm de diámetro. Previamente se determinó y cuantificó el volumen de cada extracto y se agregó a un matraz con el volumen de agua y PDA exacto a la concentración final y se esterilizó a 120 C por 15 min.

4 Cuadro 2. Concentraciones de extractos y extractantes contra Phytophthora capsici. Tratamient Método Especie Solvent Concentración (ppm) os e NFSOXG ME Sóxhlet L. Metano l NFSOXH ACE Sóxhlet F. cernua Aceton a FSOXGA CE Sóxhlet L. Aceton a FSOXGM E Sóxhlet L. Metano l FSGACE Sonica do L. Aceton a FSGME Sonica do L. Metano l FSOXHA CE Sóxhlet F. cernua Aceton a Para la siembra se utilizaron explantes de 0.5 cm de diámetro, con crecimiento micelial de 7 días de P. capsici y se incubaron a 25 C hasta que el testigo sin tratamiento cubrió el 100% de la caja petri; la variable medida fue el crecimiento radial; éste crecimiento se transformó a porcentaje de inhibición del crecimiento micelial. Diseño experimental y análisis de los datos Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con 5 repeticiones por tratamiento. La unidad experimental estuvo constituida por cinco cajas petrí por repetición, los resultados se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) y a una comparación de medias de Tukey (p<0.05) utilizando el paquete estadístico SAS (Statistical Analsis System) para Windows v RESULTADOS Y DISCUSIÓN Efecto de extractos normales y fermentados de Larrea t. y F. cernua sobre inhibición micelial de P. capsici El porcentaje de inhibición del crecimiento micelial fue variable; de un 4.3% (extracto NFSOXHACE a 1 ppm) hasta un 100% (extracto NFSOXGACE a 750 ppm). El análisis de varianza detectó diferencias estadísticas; la prueba de medias (Tukey, p 0.05), indica que los no fermentados que inhibió el 100% del crecimiento micelial de p. capsici fueron: SOXGACE a ppm, SOXGME a ppm, SOXHACE a ppm; y los tratamientos con extractos fermentados que inhibió el 100% del fitopatógenos fueron: SOXGACE a ppm, SOXGME a ppm, SGACE a ppm, SOXGME a ppm y SOXHACE a ppm; (Cuadro 3). Además los resultados indican que con el método de extracción por Sóxhlet fermentado se obtiene mayor cantidad de producción de compuestos polifenolicos en comparación con el método de extracción por sonicación. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por (López et al., 2009), quienes reportan que obtuvieron inhibiciones al 100% de P. capsici usando concentraciones de extractos de L. al 9% en 96 horas de incubación. Otros estudios realizados con Hojasen en diferentes extractantes contra los hongos fitopatógenos Alternaria alternata, Colletrichum gloeosporioides y Penicillium digitatum requirieron concentraciones de 4,000 ppm con una inhibición del 92% (Jasso et al., 2007).

5 Cuadro 3. Inhibición del crecimiento micelial in vitro de Phytophthora capsici por extractos normales y fermentados de L., F. cernua en extractantes a base de acetona y metanol Ppm Tratamientos 1 % inhibición 750 SOXGACE A SOXGACE A SOXGACE A SOXGACE A SOXGACE A SOXGACE A SOXGME A SOXGME A SOXGME A SOXGME A SOXGME A SOXGME A SOXGME A SOXGME A SOXGME A SOXHACE A SOXHACE A SOXHACE A SOXHACE A SOXHACE A SOXHACE A FSOXGACE A FSOXGACE A FSOXGACE A FSOXGACE A FSOXGACE A Ppm Tratamiento 1 % inhibición 3000 FSOXGACE A FSOXGACE A FSOXGME A FSOXGME A FSOXGME A FSOXGME A FSOXGME A FSOXGME A FSGACE A FSGACE A FSGACE A

6 2500 FSGACE A FSGACE A FSGACE A FSGME A FSGME A FSGME A FSGME A FSGME A FSGME A FSOXHACE A FSOXHACE A FSOXHACE A FSOXHACE A FSOXHACE A , Valores con la misma letra son estadísticamente similares (Tukey, p 0.05). Cuadro 4. Inhibición del crecimiento micelial in vitro de Phytophthora capsici por extractos normales y fermentados de L., F. cernua en extractantes a base de acetona y metanol. Ppm Tratamientos 1 % Inhibición Ppm Tratamientos 1 % Inhibición 1000 FSOXHACE B SOXGACE B FSOXGACE B FSGACE CB FSGME CB FSOXGACE CB FSOXGME CD FSOXHACE CD FSGACE CD FSGME FD FSOXGACE FG FSGACE FG FSOXHACE G FSOXGME G FSOXHACE G SOXGACE IG FSGACE IG SOXHACE IG FSOXGME IG FSGME I FSOXGME J

7 100 FSGME J FSGME K FSGACE L FSGME L SOXHACE M SOXGACE M SOXGME N SOXGME O FSOXHACE PO SOXHACE PQ SOXGACE RQ SOXGACE RQ FSOXHACE RS FSOXHACE TS SOXHACE TU SOXHACE U SOXHACE V FSGME V SOXGME V TESTIGO FSOXGACE V TESTIGO FSGACE V TESTIGO FSGACE V TESTIGO SOXGACE V TESTIGO FSOXGME V TESTIGO FSOXGME V TESTIGO FSOXGME V TESTIGO FSOXGACE V , Valores con la misma letra son estadísticamente similares (Tukey, p 0.05). CONCLUSIONES El extracto que mostró el 100% de inhibición en el crecimiento micelial de P. capsici desde la dosis de 100 ppm fue Soxgme, muestra que con el Hojasen se obtuvo el 100% de inhibición con Soxhace 750 ppm. Las dosis que presentó resultados similares fueron los siguiente: Fsoxgace a 4000 ppm, Fsoxgme a 4000 ppm, Fsgace a 4000 ppm, Fsgme a 4000 ppm y Fsoxhace a 4000 ppm respectivamente. Estos resultados indica que los extractos fermentados son más eficientes para el control P. capsici en comparación con extractos normales. AGRADECIMIENTOS CONACYT-GOBIERNO DEL ESTADO DE COAHUILA (FOMIX) COAH-2008-C Y GBS GLOBAL, S.A DE C.V. POR EL FINANCIAMIENTO DEL PRESENTE PROYECTO

8 LITERATURA CITADA Chávez, A.J.J., Zavaleta, M.E., Téliz, O.D. y Juárez, P.C Control integrado de la marchitez del chile (Capsicum annuum) ocasionada por Phytophthora capsici en la región de Valsequillo, Puebla. En: Memorias del XXI Congreso Nacional de la Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C. Cuernavaca, Morelos. p. 26. Jasso de Rodríguez, D., Hernández-Castillo, D., Angulo-Sánchez, J.L., Rodríguez-García, R., Villarreal-Quintanilla, J.A., and Lira-Saldívar, R.H Antifungal activity in vitro os F. cernuap extracts on Alternaria sp., Rhizoctonia solani, and Fusarium oxysporum. Industrial Crops and Products 25: Gamboa Alvarado, R., Hernández-Castillo, F.D., Guerrero-Rodríguez, E. y Sánchez-Arizpe, A Inhibición del crecimiento micelial de Rhizoctonia solani Kühn y Phytophthora infestans Mont (De Bary) con extractos vegetales metanolicos de hojasén (Flourensia cernua D.C.), mejorana (Origanum majorana L.) y trompetilla (Bouvardia ternifolia (Ca.) Schlecht.). Revista Mexicana de Fitopatología 21: Leonian, L.H Stem and fruit blight of pepper caused by Phytophthora capsici sp. nov. Phytopathology 12: López Benítez et al., Efecto de Extractos Vegetales Acuosos sobre el crecimiento in vitro de Phytophthora capsici. Memorias del XXXVI Congreso Nacional de la Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C. Acapulco, Guerrero. L 3. Pérez, M.L., Medina, L.O. y Salinas, G.J.G Control genético y químico de la marchitez del chile Capsicum annuum L. causada por el hongo Phytophthora capsici en la región de Irapuato, Gto., México. Revista Mexicana de Fitopatología 8: Romero, C.S Hongos Fitopatógenos. Universidad Autónoma Chapingo. México, D.F., México. 347 p.