CytoCount Code No. S 2366 Edición

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1 CytoCount Code No. S 2366 Edición Indicaciones de uso Introducción Principio del ensayo Reactivos suministrados Asignación del valor Almacenamiento Para uso diagnóstico in vitro. CytoCount TM está indicado para su uso en citometría de flujo. CytoCount TM es una suspensión de microesferas fluorescentes que se pueden utilizar como población de referencia para el recuento de una población de interés de leucocitos. CytoCount TM puede utilizarse con muestras de sangre periférica, productos de leucoféresis, hemoderivados leucorreducidos y muestras de sangre medular. El recuento de niveles absolutos de subgrupos celulares en las muestras clínicas es de una importancia primordial, p. ej., para la monitorización del estado inmunológico de los individuos inmunocomprometidos (enumeración de linfocitos T CD4+), para la elección del momento oportuno para la leucoféresis en pacientes que son candidatos para autotrasplante (recuento de células progenitoras hematopoyéticas CD34+) y para evaluar los hemoderivados leucorreducidos (recuento de glóbulos blancos residuales) (1). El recuento de células se puede lograr mediante el uso de técnicas de plataforma única o doble que utilizan métodos citométricos. En la técnica de plataforma única, se realizan recuentos celulares absolutos de las células de interés identificadas en un volumen de muestra definido con precisión. Se puede utilizar el agregado de perlas fluorescentes de referencia con una concentración conocida, como CytoCount TM para definir el volumen de la muestra que se analiza. La técnica de plataforma única tiene menos fuentes de variabilidad si lo comparamos con la técnica de plataforma doble que se utilizaba habitualmente con anterioridad y los estudios multicéntricos demostraron que brinda un mejor coeficiente de variación (CV), y que los riesgos de generar resultados erróneos son menores (1). Se tiñe un volumen cuidadosamente medido de la muestra de interés con los anticuerpos conjugados con fluorocromo correspondientes. Para el recuento de CD4 se pueden elegir anticuerpos contra el CD45, CD4, CD8 y el CD3. Para el recuento de CD34, habitualmente se utiliza una combinación de anticuerpos contra el CD45/FIT C y contra el CD34/RPE. Después de la incubación con anticuerpo conjugado, se lisan los glóbulos rojos. Después de la lisis, se agrega un volumen cuidadosamente medido de perlas CytoCount TM a la muestra utilizando la técnica de pipeteo inverso (por favor, busque la descripción en Procedimientos generales ). El volumen de perlas debe ser el mismo que el volumen de la muestra. Se analiza la muestra en un citómetro de flujo y se cuentan las células en cuestión con la técnica de sincronización recomendada (2, 3). Se obtiene el número de perlas CytoCount TM estableciendo una región alrededor de las perlas en un diagrama de puntos donde las perlas están claramente separadas de las células teñidas. Los eventos sincronizados de las perlas se muestran en un histograma de tiempo frente a FSC y se dibuja una región alrededor de los eventos mono-dispersos. Se calcula el número absoluto de células en cuestión (células/ L) mediante la siguiente ecuación: Número de células contadas (p. ej., CD4+ o CD34+) x concentración de CytoCount TM x factor de dilución Número de perlas CytoCount TM contadas Definiciones: Número de células contadas: p. ej., número de CD4+ o CD34+ obtenido mediante la técnica de sincronización recomendada (2, 3). Número de perlas CytoCount TM contadas: Número de eventos de perlas de la misma muestra que la de las células en cuestión. Concentración de CytoCount TM : Número de perlas/µl que se indica en el vial. Factor de dilución: Es el factor por el que se diluyó la muestra original (el protocolo está optimizado para el análisis de 10 6 leucocitos y, por lo tanto, la muestra original con frecuencia necesita diluirse antes de realizar el análisis). Se recomienda utilizar una técnica en la que la muestra no esté lavada, dado que se puede perder la relación inicial entre el número de células sanguíneas y el volumen de células, por lo que el número absoluto de células no se puede calcular de forma precisa (1). La agregación de perlas control es un fenómeno bien conocido (1). Las perlas CytoCount TM muestran un número especialmente bajo de múltiplos (inferior al 3%), lo que hace que la sincronización de las perlas sea más sencilla. Si se observa un número superior de múltiplos CytoCount TM y se sospecha un problema con el producto, por favor contacte nuestro servicio técnico. CytoCount TM es una suspensión de fluoroesferas de poliestireno (perlas) de 5,2 m en una solución acuosa que contiene surfactante. Las perlas CytoCount contienen una mezcla de tintes registrados con una emisión de luz de amplio rango. Los tintes son compuestos fluorescentes hidrosolubles que se cargan uniformemente en las perlas durante el proceso de fabricación. Los tintes se excitan a 488 nm y emiten luz entre 530 y 700 nm. CytoCount se suministra en un vial que contiene 17 ml de una suspensión de perlas con una concentración de aproximadamente 1100 perlas/µl. El número exacto de perlas por µl se indica en el vial. Un vial es suficiente para al menos 150 pruebas (100 µl por prueba). La concentración de perlas (C) y la desviación estándar correspondiente (S) se indican en el vial en forma de número/µl. El número se obtiene contando el producto en un contador de partículas Coulter Z1. La desviación estándar de la concentración de perlas es un contribuyente menor a la incertidumbre combinada del resultado analítico. Almacene el producto en la oscuridad a una temperatura de 2 a 8 C. No lo utilice después de la fecha de caducidad impresa en el vial. Si el producto se almacena bajo condiciones distintas a las especificadas, éstas ( ) S 2366/ES/TIA/ p. 1/5

2 deben ser verificadas por el usuario. No mantenga al vial en un mezclador rotativo a temperatura ambiente durante más de 2 horas por vez. Precauciones 1. Para uso por profesionales. 2. Este producto contiene azida sódica (NaN 3), un compuesto altamente tóxico en su forma pura. A las concentraciones en que está presente en el producto, aunque no se clasifican como peligrosas, la azida sódica puede reaccionar con las cañerías de plomo y cobre, formando acumulaciones de azidas metálicas altamente explosivas. Tras desechar el producto, aclare con agua abundante a fin de evitar acumulaciones de azida metálica en las cañerías. 3. Asegúrese de que el vial de CytoCount TM se guarda herméticamente cerrado en posición vertical para evitar que se derrame el líquido. Antes de su uso, debe resuspender concienzudamente las perlas CytoCount TM. Si las perlas CytoCount TM se mezclan violentamente en un vórtex, se pueden introducir burbujas de aire en el líquido, y esto puede reducir el volumen esperado de perlas CytoCount TM pipeteadas. Se recomienda una rotación suave (p. ej., en un mezclador rotativo o en un rodillo para tubos con sangre). 4. Se debe tener cuidado para no perder parte de la suspensión CytoCount TM antes de la resuspensión; de lo contrario, el recuento de perlas es inválido. 5. Es sumamente importante utilizar la misma pipeta calibrada y la técnica de pipeteo inverso con punta húmeda, tanto con la muestra como con las perlas CytoCount TM. Es importante que el volumen de las perlas CytoCount TM y el de la muestra sean exactos. Los volúmenes de los reactivos de anticuerpo y del reactivo de lisis no son importantes en relación a la determinación del número absoluto de cuentas, ya que es la relación entre el volumen de la muestra y el volumen de las perlas lo que realmente importa. Procedimiento general 1. Diluya la muestra original hasta aproximadamente 10 6 leucocitos por 100 L. Tenga en cuenta el factor de dilución exacto. En algunos casos no se requerirá ninguna dilución. 2. Pipetee 100 µl de la muestra que contiene 10 6 leucocitos en un tubo de ensayo. Utilice la técnica de pipeteo inverso (véanse las pautas más adelante). 3. Tiña y lise la muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el recuento de CD4+, recomendamos el uso de Dako UtiLyse, n de catálogo S 3325 o S Para el recuento de CD34+, recomendamos el uso de Dako EasyLyse, nº. de catálogo S Para ambos procedimientos se recomienda lisis sin lavado. 4. Retire las perlas CytoCount TM del lugar donde las almacena entre 2 y 8 C. Asegúrese de que el tapón esté ajustado para evitar derramar líquido y mezcle bien para asegurarse una completa resuspensión de las perlas. Evite el mezclado mecánico en esta fase, p. ej., con un vórtex, ya que la introducción potencial de burbujas de aire puede reducir el volumen real de las perlas pipeteadas. Se aconseja colocar las perlas en un mezclador rotativo durante 5 a 60 minutos para asegurarse de que las perlas permanezcan en suspensión hasta que se necesiten. 5. Permita que las perlas alcancen la temperatura ambiente antes de su uso. 6. Añada 100 µl de CytoCount a la mezcla teñida y lisada. Se debería pipetear la muestra y las perlas CytoCount con la misma pipeta calibrada y utilizando la técnica de pipeteo inverso con punta húmeda (1) (véanse las pautas más adelante). 7. Mezcle las perlas y la muestra suavemente mediante un vórtex durante 3 segundos antes de la adquisición para asegurar una distribución homogénea de las perlas CytoCount TM en toda la muestra. 8. La adquisición de la muestra debe realizarse en las 4 horas posteriores a añadir las perlas CytoCount TM para asegurar una concentración precisa de las perlas en la muestra. Consulte también la documentación incluida en la caja del producto para los anticuerpos y reactivos de lisis correspondientes utilizados y para el tiempo máximo de incubación. 9. Adquiera un mínimo de 1000 perlas CytoCount y un número mínimo de 100 células de interés (1). 10. No se aconseja el uso de dispersión frontal (FSC) como parámetro umbral para la recogida de datos, ya que esto podría eliminar algunas perlas CytoCount TM debido a su pequeño tamaño de 5,2 µm. Se recomienda utilizar el canal usado para el isocianato de fluoresceína (FITC) (generalmente llamado FL1) como parámetro umbral. Un método alternativo es ajustar el valor umbral de la dispersión frontal a cero y adquirir mediante un not gate ( sin sincronización ) ubicado en la esquina inferior izquierda de un diagrama de puntos de FSC (dispersión frontal) frente a SSC (dispersión lateral) (R8 en la Figura 1). Esto eliminará la mayoría de los residuos sin excluir ninguna de las perlas CytoCount TM (4). ( ) S 2366/ES/TIA/ p. 2/5

3 Dispersión lateral Dispersión frontal Figura 1. Dispersión frontal frente a dispersión lateral, donde se observa una muestra de sangre normal. El umbral se configura en el parámetro de dispersión frontal. Para asegurarse de que no se excluyen las perlas CytoCount TM, se debe ajustar a cero el umbral de dispersión frontal. Para eliminar los residuos, se configura un not gate ( sin sincronización ) (R8) en la esquina inferior izquierda. 11. Recuerde guardar el parámetro tiempo durante la adquisición. 12. La tasa de flujo debe ser estable antes de iniciar la adquisición. Pautas, técnica de pipeteo inverso con punta húmeda" Se debe utilizar la misma pipeta para dispensar la muestra y las perlas. Utilice una punta de pipeta limpia para cada reactivo. La adopción de la misma técnica para dispensar la muestra y las perlas asegurará resultados más consistentes. Muestra: 1. Presione el émbolo hasta el segundo tope, coloque la punta en el líquido y aspire la muestra. Luego presione el émbolo hasta el primer tope para dispensar la muestra. La punta de la pipeta no debería contener ahora exceso de líquido. 2. Repita este paso al menos dos veces manteniendo la punta de la pipeta dentro de la muestra. 3. La punta de la pipeta está ahora lista para su uso. Presione el émbolo hasta el segundo tope, coloque la punta en el líquido y aspire la muestra. Retire cuidadosamente la punta de la pipeta de la muestra y séquela suavemente con un papel para quitar el exceso de líquido; al hacerlo, tenga cuidado de no tocar el orificio de la punta ni retirar parte de la muestra inadvertidamente desde el interior de la punta de la pipeta. 4. Trate de mantener la pipeta tan vertical como sea posible. Controle la presencia de burbujas de aire en la punta. Si observara la presencia de burbujas de aire, dispense el líquido nuevamente en la muestra y repita el procedimiento de muestreo. 5. Dispense la muestra hasta el primer tope del émbolo, no debe observarse restos de líquido en la punta de la pipeta una vez que se haya dispensado el líquido. No toque las paredes del tubo de ensayo cuando retire la punta. Perlas: 6. Prepare la pipeta de la forma que se describió anteriormente para la muestra (pasos 1 a 3). 7. Para dispensar la solución de perlas, coloque la punta de la pipeta en la pared del tubo cerca del límite de la muestra, una ligera inclinación del tubo y de la pipeta ayudará en este paso. Dispense hasta el primer tope del émbolo, no debe observarse líquido residual en la punta de la pipeta una vez que se haya dispensado el líquido. 8. Para pipetear más perlas, coloque la punta en el vial CytoCount TM y aspire más suspensión de perlas sin dispensar el líquido residual que quede en la punta después del primer pipeteo. 9. Si la punta no estuvo en contacto con la muestra, se debe dispensar el líquido residual de la punta en el vial CytoCount TM. Si elige descartar el líquido residual, no va a disponer de reactivo para 150 muestras. Recuento de CD34 y CD4 Procedimiento para el recuento de células madre CD34+ o de linfocitos T CD4+ utilizando CytoCount TM Se debe teñir la muestra con anticuerpos conjugados con fluorocromo y lisar los glóbulos rojos; por favor, consulte el paso 3 en la sección Procedimiento general. Recomendamos usar la técnica de sincronización ISHAGE para identificar las células madre CD34+ (1, 2), y la técnica de sincronización CD45/SSC para el recuento de las células CD4+ (3). CytoCount TM está optimizado para su uso con una muestra de 100 L que contenga hasta 10 6 leucocitos. Determinación de los eventos CytoCount TM : 1. Construya un diagrama de puntos del canal de fluorescencia utilizado para la R-ficoeritrina (generalmente llamada FL2) frente a la SSC; las perlas CytoCount TM son visibles en el cuadrante superior derecho del diagrama. ( ) S 2366/ES/TIA/ p. 3/5

4 Dispersión lateral Dispersión frontal Diagrama 2A 2. Dibuje una región que incluya la población de perlas CytoCount TM asegurándose de que la región esté fuera de escala en el eje de la SSC para permitir capturar todas las perlas CytoCount TM (R6 en el diagrama 2A). Se debe tener cuidado de no incluir ningún evento que no corresponda a las perlas CytoCount TM en la región. Nota: la combinación del diagrama de puntos utilizando el canal de la R- ficoeritrina frente a la SSC no se puede utilizar si el CD45 se marca con R-ficoeritrina, dado que las perlas se superpondrán con los neutrófilos teñidos. En este caso, se debería utilizar el canal de la FITC o la RPE-Cy5 para determinar el número de perlas. 3. Construya un diagrama de puntos del tiempo frente a la FSC (Diagrama 2B) y sincronice este diagrama de puntos en la región 6 del diagrama 2A. 4. Dibuje una segunda región (R7 en el diagrama 2B), que incluya la población de perlas CytoCount TM mono-dispersa evitando todos los eventos que puedan encontrarse por debajo o por encima en la FSC en comparación con la población principal. 5. Construya una combinación de sincronización lógica de R6 y R7 (G7) para definir de forma más precisa la población de perlas CytoCount TM (G7 = R6 y R7). Diagrama 2B R7 Tiempo (512,00 seg) Figura 2, Diagrama 2A: CD34/RPE frente a dispersión lateral, donde se observa una muestra de sangre periférica de un paciente estimulado con factor de crecimiento. Se dibujó una región alrededor de la población de perlas (R6). Para incluir todas las perlas CytoCount TM, la región R6 debe alcanzar el límite superior de dispersión lateral o debe ubicarse "fuera de escala". Diagrama 2B: Tiempo frente a dispersión frontal sincronizada en los eventos R6. Para determinar el número de perlas CytoCount TM, se dibuja una región alrededor de las perlas mono-dispersas en el diagrama 2B (R7). Este número debe utilizarse como el Número de perlas CytoCount TM contadas cuando se calcula el número absoluto de la población de linfocitos en cuestión. Tiempo como control de calidad Solución de problemas El uso del tiempo como un control de calidad interno para determinaciones de plataformas únicas Los estudios recientes demostraron que el número de perlas adquiridas en un período fijo de tiempo es remarcablemente constante en la mayoría de los citómetros de flujo. Por lo tanto, para cada lote nuevo de perlas, el usuario puede calcular un rango promedio de cuenta de perlas ± 2 desviaciones estándar. Cualquier muestra con un recuento de perlas fuera de este rango indica la presencia de un posible error en el pipeteo y se debe volver a teñir toda la muestra (5). Recuento absoluto de células superior al anticipado Un recuento absoluto de células que es superior al anticipado podría ser el resultado correcto de la muestra. Sin embargo, también se puede deber a un aumento erróneo en el número de eventos celulares contados. Esto podría estar causado por un problema en el pipeteo, por ejemplo, que el volumen de la muestra sea superior al volumen de perlas añadidas debido a que la punta de la pipeta se secó de forma inadecuada antes de dispensar la muestra o debido a que se utilizaron diferentes pipetas para dispensar la muestra y las perlas, respectivamente. También puede estar provocado por una ubicación incorrecta de la sincronización celular, lo que permite que se cuenten demasiados eventos no celulares. Un recuento de células superior al anticipado también se puede deber a una disminución del número de perlas CytoCount TM contadas. Esto podría estar causado por un problema en el pipeteo, tal como la adición de insuficientes perlas debido a una resuspensión inadecuada de las perlas antes de su uso, a la presencia de burbujas de aire en la punta mientras se dispensaba o al uso de diferentes pipetas para dispensar la muestra y las perlas. Una disminución de los eventos CytoCount TM también puede estar causada porque se configuró el umbral de dispersión frontal demasiado alto o por una posición incorrecta de la sincronización de las perlas, que conduce a la exclusión de algunas perlas. Recuento absoluto de células inferior al anticipado Un recuento absoluto de células que es inferior al anticipado podría ser el resultado correcto de la muestra. También se puede deber a una disminución errónea en el número de eventos celulares contados. Esto ( ) S 2366/ES/TIA/ p. 4/5

5 podría estar causado por un problema en el pipeteo, por ejemplo, que el volumen de la muestra sea inferior al volumen de perlas añadidas debido a la presencia de burbujas de aire mientras se dispensó la muestra (es difícil detectar la presencia de burbujas de aire en la muestra de sangre) o debido a que se utilizaron diferentes pipetas para dispensar la muestra y las perlas, respectivamente. También puede estar causado por una ubicación incorrecta de la sincronización celular, lo que conduce a la exclusión de eventos celulares o a la pérdida de células debido a la incubación prolongada con el reactivo de lisis. Un recuento de células inferior al anticipado también se puede deber a un aumento del número de perlas CytoCount TM contadas. Esto podría estar causado por un problema durante el pipeteo, tal como la adición de un volumen superior de perlas que el de la muestra, a que se secó de forma inadecuada la punta de la pipeta antes de dispensarla, o al uso de diferentes pipetas para dispensar la muestra y las perlas. Un aumento de los eventos CytoCount TM también puede estar causado por una posición incorrecta de la sincronización de las perlas, lo que permite que se cuenten demasiados eventos "no" relativos a las perlas. La pérdida de la suspensión de CytoCount TM antes de la resuspensión adecuada puede tener como resultado un aumento de la concentración de perlas. La pérdida de la suspensión puede estar causada por un tapón flojo en el vial, lo que permite la pérdida de líquido o que se derramen los componentes del vial de CytoCount TM antes de la resuspensión. Referencias 1. Brando B, Barnett D, Janossy G, Mandy F, Autran B, Rothe G, et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood (review). Cytometry 2000;42: Gratama JW, Keeney M, Sutherland DR. Enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. In: Robinson JP, Darzynkiewicz S, Dean PN, Dressler LG, Rabinovitch PS, Stewart CC, Tanke HJ, Wheeless LL. editors. Current protocols in cytometry. New York: John Wiley & Sons; p Schnizlein-Bick CT, Mandy FF, O Gorman MRG, Paxton H, Nicholson JKA, Hultin LE et al. Use of CD45 gating in three and four-color flow cytometric immunophenotyping: guideline from The National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry 2002;50: Brocklebank AM, Sparrow RL. Enumeration of CD34+ cells in cord blood: a variation on a single-platform flow cytometric method based on the ISHAGE gating strategy. Cytometry 2001;46: Bergeron M, Lustyik G, Phaneuf S, Ding T, Nicholson JKA, Janossy G, et al. Stability of currently used cytometers facilitates the identification of pipetting errors and their volumetric operation: time can tell all. Cytometry 2003;52B: Explicación de los símbolos Número de catálogo Límite de temperatura Fecha de caducidad Producto sanitario para diagnóstico in vitro Consulte las instrucciones de uso Mantener alejado de la luz solar (consulte la sección Almacenamiento) Código de lote Fabricante ( ) S 2366/ES/TIA/ p. 5/5