Aplicaciones de la biología molecular al control de la Hidatidosis
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- Adrián Campos García
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1 Aplicaciones de la biología molecular al control de la Hidatidosis Rosenzvit M, Camicia F Cucher M, Kamenetzky L Prada L, Macchiaroli N, Jensen O, Gutierrez A, Muzulin P, Naidich A, Martínez M, Vizcaychipi K, Negro P. IMPAM-UBA-CONICET, Facultad de Medicina, UBA Departamento de Parasitología, ANLIS Instituto de Patobiología, INTA, Castelar Facultad de Cs.Veterinarias, UNR Secretaría Zoonosis, Chubut 1 de 35 mrosenzvit@fmed.uba.ar
2 Medidas de tratamiento: Proveer medicación para hospedero definitivo: Zonas de difícil acceso Conocimiento de situación: Ciclo del parásito, reservorio, factores de riesgo. Programa de CONTROL Educación Implementar medidas evaluación Diagnóstico hospedero intermediario, definitivo, hombre Nuevas herramientas de control: Vacunas Drogas: nuevas o mejoradas 2 de 35
3 Desarrollo de nuevas herramientas de control Ligado al conocimiento de la biología del parásito e interacción con hospedero Mediante estudios bioquímicos, farmacológicos, inmunológicos, biología celular y molecular Proyectos genoma, transcriptoma, proteoma: importante información 3 de 35
4 Por qué se estudian los genomas de parásitos? La obtención de los genomas completos ayuda a conocer los eventos que regulan superviviencia en hospedero y desarrollo de parásitos dado que permite conocer el conjunto de genes que contiene cada especie parásita y utilizar esta información para el diseño racional de vacunas, drogas antiparasitarias, así como la búsqueda de nuevos marcadores moleculares que permitan mejorar el diagnóstico e identificar cepas o variantes con diferente infectividad. 4 de 35
5 Genoma de E. granulosus Se ha secuenciado el genoma completo de E. granulosus basándose en el de E. multilocularis (mejor calidad) en el Instituto Sanger, Reino Unido ( nloads/helminths/) Tamaño: 114,9 Mb Nº genes: genes ( 5 de 35
6 Aplicaciones Búsqueda de nuevos blancos de drogas Identificación de nuevos Antígenos (diagnóstico o vacunas) Identificación y estudio de expresión de de isoformas de genes blancos de drogas, vacunas o diagnósticos: -resistencia -correcto diseño de reactivos diagnósticos Conocimiento de la biología del parásito: genómica funcional -Interferencia de ARN y transgénesis 6 de 35
7 Para aprovechar esta nueva información Grupos de Investigación: estrategias bioinformáticas y experimentales para confirmar predicciones Actividades de Capacitación: formación de recursos humanos Formación de Redes abocadas a un mismo objetivo: bancos de datos, evaluación de nuevas herramientas 7 de 35
8 Para aprovechar esta nueva información Asimismo es necesario mantener un continuo intercambio con profesionales y agentes sanitarios que trabajan en las zonas endémicas para conocer las necesidades de las mismas, probar los nuevos desarrollos en condiciones de campo y divulgar los avances obtenidos en los proyectos de investigación. 8 de 35
9 9 de 35
10 Curso de Posgrado 2011 Facultad de Medicina, UBA 10 de 35
11 Curso de Posgrado 2012: noviembre Facultad de Qúimica, UdelaR, Montevideo 11 de 35
12 Consorcio Internacional: Base de datos de platelmintos: FlatDB Grupos de Argentina, Brasil, Uruguay Obtener Genomas de las cepas de E. granulosus circulantes en nuestra región Integrar genomas de parásitos platelmintos en una misma base de datos Identificación de nuevos candidatos de blancos de drogas Validación experimental (estrategias experimentales disponibles) 12 de 35
13 13 de 35
14 Cepas de E. granulosus Presencia de 5 cepas de E. granulosus en ganado, perros y el hombre en América del Sur (Argentina, Uruguay, Chile, Brasil y Perú). Algunas reportadas por primera vez en el humanos. Difieren en organización genómica, perfil de proteínas secretedas/antigénicas, infectividad en modelos experimentales y desarrollo in vitro Rosenzvit et al., 1997; 1999; 2001; 2005; 2006 Kamenetzky et al., 2000; 2002; 2005 Muzulin et al., 2008 Cucher et al, enviado Ariana Gutierrez Gracias a la colaboración de profesionales de Programas de Control: E.Larrieu, A. Parra, O. Jensen, P. Cabrera, entre otros. 14 de 35
15 Genotipos de Echinococcus granulosus en América del Sur *: Casos humanos 15 de 35 Martínez y col., en preparación
16 Copro-PCR para diagnóstico en hospedador definitivo dco1 Elemento Repetido G1 G2 G4 G5 G6 G7 Detección de todos los genotipos circulantes en la región 16 de 35 Naidich y col, 2006
17 Ag nativos y recombinantes para diagnóstico en el hombre Red Sudamericana de Serología Hidatídica (RSSH): LH, AgB, AgB1r y AgB2r seroteca Perú Chile Uruguay Argentina Brasil antígenos protocolo de ELISA reactivos placas Muy buena reproducibilidad entre laboratorios Mayor potencial diagnóstico (RSSH): LH, AgB y AgB1r 17 de 35 Lorenzo y col., 2005
18 Expresión y Evaluación del potencial inmunodiagnóstico de AgB4r Antígeno Sensibilidad (%) Especificidad (%) AgB4r 74,0 93,0 Líquido Hidatídico ovino Líquido Hidatídico pocino 83,0 79,0 82,0 77,0 AgB1r (RSSH) 68,4 87,6 AgB2r (RSSH) 44,6 86,2 Alta especificidad: utilidad en confirmación del diagnóstico 18 de 35 Muzulin, 2009
19 19 de 35
20 Cultivos establecidos Sitio Argentino de Producción Animal Mateirial de partida: protoescólices E. granulosus G7 Laura Prada Marcela Cucher PEs + células de hepatoma de rata RH PEs + células COS-7 ó suero porcino Gusanos Pre-adultos 20 de 35 pre-microquistes 100 x
21 Comparación de genotipos 21 de 35
22 Cucher y col., enviado 22 de 35
23 Uno de los mecanismos clave que controlan el desarrollo: 23 de 35
24 Identificación de micrornas de E. granulosus micrornas: pequeños RNAs no codificantes que regulan la expresión genética por unión a RNAm blancos Marcela Cucher Genoteca de pequeños RNAs (19-30 nt) de E. granulosus cepa cerdo (G7) Algunos: expresión estadío específica: rol en el desarrollo Primer reporte de micrornas en cestodes Cucher et al, Int. J Parasitol de 35
25 Análisis de expresión utilizando modelos in vitro Confirmado en modelos in in vivo experimentales Pasantía en Alemania (Dr Klaus Brehm) para estudios funcionales 25 de 35
26 26 de 35
27 Modelos: permiten estudiar el desarrollo de sistemas como el sistema nervioso o Pre-adulto Protoescólex desarrollo In vitro Protoescolex Pre-microquiste Microquiste bandeado Protoescólex Pre-microquiste Microquiste RH COS7 Federico Camicia Componentes Serotoninérgicos del sistema nerviosos de E. granulosus Immunohistoquímica: anticuerpo anti-serotonina marcado con FITC 27 de 35
28 Vía de serotonina en genomas de Echinococcus spp. Los genes involucrados en síntesis, transporte y receptores de serotonina están presentes en el genoma. L.Kamenetzky Identidad con genes humanos: 36-54% Genes involucrados en degradación (MAO) y receptor de serotonina de tipo canal (LGIC) clásicos no pudieron ser identificados o son divergentes de los humanos. 28 de 35
29 Qué efecto produce la serotonina en los protoescólices de E. granulosus? VIDEO Sitio Argentino de Producción Animal 29 de 35
30 Cuantificación de la actividad motora Wormtracker Cuantificación de actividad motora Screening de drogas Aplicaciones en screening masivo de drogas!!! 30 de 35 Simonetta and Golombek, 2007
31 La serotonina induce actividad motora dependiente de la dosis en protoescólices de E. granulosus 31 de 35
32 Conclusiones o Serotonina: alta expresión en estadíos protoscolex y adulto o Serotonina: rol en neurotransmisión o Genes de la vía: diferencias con ortólogos humanos o Posibles blancos de drogas antihidatídicas 32 de 35 Camicia y col., en preparación
33 Conclusiones generales Aportes de la Biología Molecular al control de la Hidatidosis son importantes si y sólo si hay INTERACCIÓN con zonas endémicas Política de SALUD que apoye estas iniciativas 33 de 35
34 Agradecimientos Oscar Jensen, Perla Negro, E. Larrieu, A. Parra, Raúl López, Alicia Pérez, H. Bergagna; E. Fernández, H. Herrero, C. Brussoni, J.C.SalvittI, MT Costa, A García, M Vazquez, JC Casaza, C. Náquira, MM Leiba. Sylvia Dematteis, Gustavo Mourglia, Cecilia Fernández, Gualberto González (UdelaR) Gerardo Mirkin (UBA) Klaus Brehm, Markus Spiliotis (Univ. Wurzburg) Don McManus, QIMR, Australia Hugo García, S. Santibañez, Perú 34 de 35
35 Muchas gracias! Laura P Natalia Laura K Marcela Mara Federico 35 de 35
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