Quimiotaxonomía de Triatoma longipennis por Análisis de Hidrocarburos Cuticulares

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1 INVURNUS En busca del conocimiento Volumen 3 No. 2 ( Julio-Diciembre 2008): 3-10 División de Ciencias e Ingeniería INVESTIGACIÓN Quimiotaxonomía de Triatoma longipennis por Análisis de Hidrocarburos Cuticulares Paredes González Edgar Alfonso 1, Márquez Rivera Gabriel Iván 2, Juárez M. Patricia 3, Nogueda Torres Benjamín 4, Lugo Sepúlveda Ramón Efraín 1, De la Rosa López Rafael 1 y Noriega Rodríguez Juan Antonio 1,* 1 Maestros de Tiempo Completo del Departamento de Ciencias Químico Biológicas y Agropecuarias 2 Egresado del Programa de Químico Biólogo Clínico 3 Instituto de Investigaciones Bioquímicas de la Plata. Facultad de Medicina. La Plata Argentina. 4 Laboratorio de Parasitología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN. Resumen La quimiotaxonomía estudia las sustancias químicas de los grupos taxonómicos. El perfil característico de hidrocarburos cuticulares (HC) para la especie Triatoma longipennis, puede ayudar a la comparación entre especies y a identificar vectores de infecciones parasitarias. En este trabajo, se identificaron y cuantificaron los HC de las alas primarias y secundarias de T. longipennis. Las alas de los insectos fueron desprendidas para la extracción de hidrocarburos y compuestos grasos utilizando hexano. Los HC fueron purificados en una columna cromatográfica de vidrio empacada con sílica gel, eluidos con hexano. Las fracción eluida fue inyectada a un equipo de cromatografía de gases (VARIAN CP-3800), provisto con una columna Factor Four (30 m x 0.32 mm x 0.25 µm) y un detector de ionización de flama. La identificación y cuantificación de los HC se realizó con el Índice de Kovats (IK) y estándares certificados C19- C40 (ALDRICH), respectivamente. Se obtuvieron los cromatogramas característicos de T. longipennis, con excelente resolución de picos. Se encontraron un total de 40 HC (14 lineales y 26 ramificados) en machos, y 38 HC (14 lineales y 24 ramificados) en hembras. Los HC característicos, que representan los marcadores taxonómicos de la especie T. longipennis fueron los lineales, C23 (1.78%), C25 (5.31%), C27 (8.86%), C29 (16.30%), C31 (13.70%), C33 (5.03%). El C27 puede ser utilizado para identificar el género ya que este hidrocarburo mostró diferencia significativa entre ambos sexos (5.74 % en machos y % en hembras). Palabras Claves: Cromatografía de gases, hidrocarburos cuticulares, quimiotaxonomía y Triatoma longipennis. Abstract Chemotaxonomy of Triatoma longipennis by Analysis of Cuticular Hydrocarbons Chemotaxonomy studies the chemical substances of taxonomic groups. The characteristic profile of cuticular hydrocarbons (CH) for T. longipennis specie, can serve to compare between species and to identify vectors with parasite infections. In this work, CH from primary and secondary wings of Triatoma longipennis were identified and quantified. Wings of the insects were removed for lipid extraction with hexane. HC were purified in a glass chromatographic column packed with silica-gel ( mesh), eluted with hexane. Eluted fraction was injected to a gas chromatograph (VARIAN CP-3800), provided with a Factor Four column (30 m x 0.32 mm x 0.25 µm), and a flame ionization detector. Identification and quantification of HC were conducted with the Kovats Index (KI) and certified standards C19 C40, (ALDRICH), respectively. The typical chromatograms of T. longipennis were obtained with excellent peak resolution. A total of 40 HC (14 lineal, 26 ramified) in male, and 38 HC (14 lineal, 24 ramified) in female were found. The characteristic CH, that represents taxonomy markers of T. longipennis species, were lineals C23 (1.78%), C25 (5.31%), C27 (8.86%), C29 (16.30%), C31 (13.70%), C33 (5.03%). C27 could be used to identify genre because this hydrocarbon shows significant difference between sexes (5.74% male, 11.97% female). Keywords: Cuticular hydrocarbons, gas chromatography, chemotaxonomy, and Triatoma longipennis. *A quien enviar la correspondencia a: Universidad de Sonora-Unidad Regional Norte. Ave. Universidad e Irigoyen s/n col. Centro. H. Caborca, Sonora. México. CP Tel/Fax: (637) janoriega@guayacan.uson.mx 2008 Editorial UNISON-URN Derechos reservados

2 4 INVURNUS, Vol. 3 No. 2 (2008): 3-10 Introducción Las chinches del género Triatoma se encuentran ampliamente distribuidas en América central y Sudamérica, son los vectores portadores de Tripanosomas causantes de la Enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana (Chagas, 1993; Imbert-Palafox y col., 2004). Este insecto pertenece a la subfamilia Triatominae, tribu Triatomini, género Triatoma, especie longipennis. El insecto es de los de mayor tamaño en el género Triatoma. Sin embargo, para la identificación y clasificación taxonómica de este tipo de organismos se requiere de personas expertas. La quimiotaxonomía estudia las sustancias químicas que componen las membranas celulares de los diferentes grupos taxonómicos. La realización de estudios con el fin de analizar e identificar compuestos químicos presentes en la cutícula de los insectos se realiza para lograr una comparación de la composición en diferentes especies de triatomineos, logrando así definir poblaciones dentro de una misma especie, con el fin de poder controlar este importante vector de la enfermedad de Chagas (Howard, 1993). Una diversidad de grupos de insectos ha sido estudiada en los últimos años en lo que respecta a sus hidrocarburos cuticulares como posible semioquímicos (Dhabi y col., 1996). Los semioquímicos se definen como sustancias químicas usadas en la comunicación entre individuos de la misma especie o diferente especie (Nordlund y Lewis, 1976). En investigaciones recientes sobre la composición en ácidos grasos de larvas D de Almeja Fina (Ruditapes decussatus) se realizó la separación de dos familias de lípidos neutros y lípidos polares mediante una cromatografía de adsorción empleando como fase estacionaria gel de sílice hidratada al 6% y como fases móviles cloroformo/metanol (98:2) y metanol. Obtenidas las dos fracciones se procede a la transesterificación empleando trifluoruro de boro. Para la identificación y cuantificación de los ácidos grasos se emplea en la cromatografía de gases (Novoa y col., 2002). La superficie cuticular de los insectos, está cubierta por una gran variedad de compuestos grasos, dentro de los cuales se encuentran mezclados los hidrocarburos. Los lípidos cuticulares juegan un papel importante dentro de la protección del insecto, ya que previenen la desecación del mismo reduciendo la transpiración, dándole impermeabilidad a la cutícula sobre los vapores de agua. Además, los lípidos cuticulares constituyen una barrera contra la penetración de insecticidas (Juárez y Blomquist, 1993). Los hidrocarburos también pueden tener varias funciones en el comportamiento (ej. feromonas) y en la fisiología de los insectos (Nation, 2002). Los hidrocarburos que generalmente se encuentran en la cutícula del insecto, son alcanos lineales de 25 a 33 átomos de carbono, y cadenas de alcanos ramificados de uno o tres grupos metilos insertados a lo largo de un esqueleto carbonado de 29 a 41 átomos de carbono (Juárez, y col., 2001; Juárez y Fernández, 2007). Se han realizado estudios con diversas especies de Triatomas con el fin de analizar e identificar compuestos químicos presentes en cutícula como con Rhodnius prolixus (Juárez y col., 2001), T. mazzottii (Juárez y Blomquist, 1993). También se han realizado comparaciones por medio de la composición de los hidrocarburos cuticulares como con diversos Triatomas (Juárez, 2007). Sin embargo, no existen reportes de determinación de los HC de la especie T. longipennis. El objetivo de este trabajo fue identificar y determinar la composición de HC en las alas de la T. longipennis para criterios taxonómicos. Izq. Fotografía de Triatoma longipennis adulto; der. detalle de las alas Paredes-González y col., Quimiotaxonomía por medio del análisis de hidrocarburos.

3 INVURNUS, Vol. 3 No. 2 (2008): Materiales y Métodos Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Análisis Instrumental Avanzado del Departamento de Ciencias Químico Biológicas y Agrícolas, ubicado en la Universidad de Sonora, Unidad Regional Norte campus Caborca, Sonora. Para la extracción, y purificación de HC se utilizó hexano grado HPLC (Sigma-Aldrich). Para la identificación y cuantificación de los HC se utilizaron 18 estándares certificados (C19-C40) los cuales se listan en la Tabla 1 (ALDRICH). Para eliminar el polvo y grasa, todo el material de vidrio fue lavado cuidadosamente utilizando extran 2% y agua tridestilada. Material Biológico Los especimenes adultos (10 machos y 10 hembras) de T. Longipennis fueron colectados del hábitat peri-doméstico en San Gaspar Atotonilo el Alto, Jalisco y transportados al laboratorio de Parasitología de la Universidad de Sonora Unidad Regional Norte, donde se mantuvieron a condiciones de laboratorio a 28 C, y 60% humedad, alimentados con sangre de gallina hasta su sacrificio. Después de sacrificar los insectos por congelación (-4 C, 15 min), las alas primarias y secundarias fueron desprendidas cuidadosamente utilizando pinzas entomológicas, para evitar el desgarre de las mismas. Las muestras fueron transportadas y conservadas cubriéndolas con papel aluminio (previamente rotulado) a temperatura ambiente hasta su posterior tratamiento. Extracción y Purificación de HC Primeramente, las alas fueron lavadas con agua tridestilada para eliminar contaminantes hidrosolubles y se secaron a temperatura ambiente. Para la extracción de los compuestos grasos y los hidrocarburos, cada juego de alas se colocaron dentro de viales de 4 ml previamente rotulados donde se agregaron 1.5 ml de hexano grado HPLC, dejándolo reposar por un día. Después de retirar las alas utilizando las pinzas entomológicas la mezcla de hidrocarburos y lípidos fueron concentradas evaporando el solvente con una corriente de nitrógeno. La mezcla concentrada de hidrocarburos y lípidos fue reconstituida en 0.5 ml de hexano e inyectada a una columna cromatográfica de vidrio previamente empacada con 1.5 g de sílica gel mesh (Sigma-Aldrich) y activada con 2.5 ml de hexano. La elusión de los HC no adsorbidos se realizó con 2.0 ml de hexano como eluyente por gravedad y fueron recolectados en un nuevo vial a la salida de la columna. El solvente fue nuevamente evaporado utilizando una corriente de nitrógeno con el fin de lograr la concentración HC. Análisis por Cromatografía de Gases Los HC purificados fueron reconstituidos en 5 L de hexano y se inyectaron en un cromatógrafo de gases (VARIAN CP-3800) provisto de una columna capilar Factor Four (30m x 0.32mm x 0.25µm), utilizando Helio como gas acarreador (2.5 ml/min), con un make-up de 27 ml/min. La temperatura del inyector fue de 300 C. Para la elusión se utilizó una rampa de temperatura de 50 C por 1 min, incrementando 15 C/min hasta alcanzar 300 C, y manteniéndose a esa temperatura por 10 min. La temperatura del detector de ionización de flama (FID) fue de 300 C. Análisis Cualitativo Para el análisis cualitativo se utilizó el Indice de Kovats (IK) que relaciona el tiempo de retención de un compuesto desconocido (t R(x) ) con otro que contiene n- carbonos, el cual eluye antes (A) y después que él (B).

4 6 INVURNUS, Vol. 3 No. 2 (2008): 3-10 Los IK, se definen de tal modo de asignar un valor de 100 veces el número de carbonos de cada uno de los hidrocarburos lineales. El cromatograma que se obtiene muestra una relación logarítmica entre el número de carbonos y los tiempos de retención, reflejando la tendencia en los puntos de ebullición entre los miembros de una serie homóloga (Skoog, 2005; Marques y col., 2000). t IK = 100 A 100 ( B A) t R( x) R( B) t t R( A) R( A) Análisis Cuantitativo Artículos publicados recientemente sobre cuantificación de hidrocarburos cuticulares en insectos, han reportado el porcentaje en área de cada hidrocarburo, logrando así una mejor comparación química entre las especies (Juárez y col., 2002). En este trabajo se utilizó el porcentaje de área normalizada para la cuantificación de HC utilizando 18 estándares certificados (Tabla 1). Resultados y Discusión La extracción de hidrocarburos de las alas del insecto resultó un proceso sencillo pero, debido a la facilidad con la que se pueden contaminar las muestras, se requiere tener la debida precaución. Se debe evitar extraer la linfa del cuerpo ya que ocasionaría errores en la determinación de la composición de los HC. Algunas investigaciones han reportado el uso del cuerpo del insecto, sin embargo, se ha observado que al morir el insecto, el cuerpo se endurece y puede llegar a quebrarse fácilmente lo que ocasiona que se corra el riesgo de extraer hidrocarburos de la linfa, provocando errores en el cálculo de la concentración en el análisis (Chester y col., 1990). La cantidad de hidrocarburos en los especimenes es muy pequeña por lo que requiere de mayor nuestra. Por tal motivo, para la purificación de los HC de la muestra por cromatografía en columna, se realizó una prueba utilizando una mezcla de estándares de hidrocarburos (C14, C15, C16), con el fin de determinar si el volumen de solvente fue suficiente para elusión de los HC. Por la parte inferior de la columna fue tomada la elusión de la muestra en viales, obteniendo 5 fracciones de 0.5 ml, posteriormente se inyectó 2 µl de cada fracción en el CG. Se determinó que un volumen de 2.0 ml es suficiente para eluir todos los hidrocarburos y que la mayor concentración se obtiene en la segunda fracción (1.0 ml) eluida (Márquez, 2008). Tabla 1. Estándares de hidrocarburos C19-C40 y sus respectivos tiempos de retención del análisis por cromatografía de gases. Estándar Nombre Tiempo de retención (min) C19 Nonadecano 6.31 C20 Eicosano 7.18 C21 Heneicosano 8.23 C22 Docosano 9.51 C23 Tricosano C24 Tetracosano C25 Pentacosano C26 Hexacosano C27 Heptacosano C28 Octacosano C29 Nonacosano C30 Triacontano C31 Heneitriacontano C32 Dotriacontano C33 Tritriacontano C36 Hexatriacontano C38 Octatriacontano C40 Tetracontano Paredes-González y col., Quimiotaxonomía por medio del análisis de hidrocarburos.

5 INVURNUS, Vol. 3 No. 2 (2008): Análisis Cualitativo de Hidrocarburos Cuticulares En la Fig. 1 se muestra el cromatograma característico de T. longipennis macho (a) y hembra (b), respectivamente. En estos cromatogramas se puede observar que, bajo las condiciones de análisis utilizadas, se logró una separación correcta de los picos. Los picos fueron identificados por los tiempos de retención correspondientes a los estándares certificados comerciales (Tabla 1). Los picos mayoritarios correspondieron a hidrocarburos lineales, siendo predominantes los C23, C25, C27, C29, C31 y C33. También se encontraron los HC lineales C24, C26, C28, C30, C32, C37, C38, C39 pero en menor cantidad. Se ha reportado que los picos de menor área corresponden a HC ramificados y que es posible identificarlos por medio del IK (Juárez y col., 2002). En la Tabla 2 se enlistan los HC de Triatoma longipennis característicos, tanto lineales como ramificados, que se identificaron mediante el IK. En Triatoma longipennis machos se identificaron 40 HC de los cuales 14 correspondieron a HC lineales (57.93%) y 26 pertenecieron a HC ramificados (42.07%). En hembras se encontraron 38 HC de los cuales 14 HC fueron lineales (61.93%) y 24 HC ramificados (38.07%). Tanto en hembras como en machos se encontraron el mismo tipo de HC lineales. Estos van desde el tricosano (C23) hasta el nonatriacontano (C39), contando con la inexistencia de algunos (C34, C35, C36). Estos resultados concuerdan con los HC identificados por IK de otras especies de Triatomas donde se analizaron los componentes de la cutícula de los insectos (Juárez y col., 2002). Análisis Cuantitativo de Hidrocarburos Cuticulares La Tabla 3 muestra la composición de HC en Triatoma longipennis. Los HC con mayor concentración correspondieron a HC lineales, predominando el C23 (1.78%), C25 (5.31%), C27 (8.86%), C29 (16.30%), C31 (13.70%) y C33 (5.03%). El C29, fue el más predominante de esta especie. Dentro de los HC ramificados, el C37r (IK: 3778) fue el que presentó mayor concentración (5.33%). Solamente dos HC ramificados (IK: 2467, 2472) no fueron detectados en las hembras. Los HC lineales predominantes fueron los mismos para ambos géneros (C23, C25, C27, C29, C31, C33), lo cual constituye una huella quimiotaxonómica característica para la especie de T. longipennis. Al graficar la composición de HC característicos que se forman respecto al número de carbonos de HC lineales se obtiene una distribución normal (Fig. 1). En investigaciones recientes, se han reportado en otras especies de Triatomas, hidrocarburos lineales mayoritarios diferentes o iguales a Triatoma longipennis, como son: a) Triatoma longipennis macho b) Triatoma longipennis hembra Figura 1. Cromatograma característico de los hidrocarburos cuticulares de Triatoma longipennis. Los nombres de los respectivos hidrocarburos se encuentran en la Tabla 1. Triatoma pallidipennis C31, Triatoma mazzottii C27 (Gálvez, 2002), Triatoma dimidiata C31, Triatoma barberi C29 (Juárez y col., 2002), Triatoma rubida C27 (Paredes, 2008), siendo comúnmente los hidrocarburos cuticulares impares los de mayor concentración. Al comparar la concentración de HC entre géneros, solamente se encontró una diferencia significativa (p>0.05) en el C27, correspondiendo al 5.74% y 11.97% a machos y hembras respectivamente. La composición de los principales HC lineales en hembras produce una perfecta campana de Gauss al graficarlos en contra del número de carbonos.

6 8 INVURNUS, Vol. 3 No. 2 (2008): 3-10 Tabla 2. Identificación de hidrocarburos cuticulares de T. Longipennis utilizando el Índice de Kobats. Indice de Kobats Pico Hidrocarburo Nombre Hembra Macho 1 n-c23 Tricosano n-c24 Tetracosano C24r Desconocido ND C24r Desconocido ND n-c25 Pentacosano r-c25 Monomero C n-c26 Hexacosano n-c27 Heptacosano r-c27 5-metil heptacosano r-c27 x,x-dimetil heptacosano n-c28 Octacosano n-c29 Nonacosano r-c29 Monomero de nonacosano n-c30 Triacontano n-c31 Heneitriacontano n-c32 Dotriacontano n-c33 Tritriacontano r-c33 5-metil tritriacontano r-c34 x,x-dimetil tetratriacontano r-c34 4,4-dimetil + x,x,x-trimetil tetratriacontano r-c35 5-metil pentatriacontano r-c35 3-metil + x,x-dimetil pentatriacontano r-c36 x-metil hexatriacontano r-c36 x,x,x-trimetil hexatriacontano r-c36 Desconocido nc37 Heptatriacontano r-c37 Desconocido r-c37 Monomero de heptatriacontano r-c37 5-metil heptatriacontano r-c37 x,x-dimetil heptatriacontano n-c38 Octatriacontano r-c38 Monomero del octatriacontano r-c38 5-metil octatriacontano r-c38 3-metil + x,x-dimetil octatriacontano r-c38 x,x,x-trimetil octatriacontano nc39 Nonatriacontano r-c39 Desconocido r-c39 Monomero del nonatriacontano r-c39 5-metil nonatriacontano r-c39 x,x-dimetil + x,x,x-trimetil nonatriacontano r = ramificado. ND. No detectado Paredes-González y col., Quimiotaxonomía por medio del análisis de hidrocarburos.

7 INVURNUS, Vol. 3 No. 2 (2008): Tabla 3. Composición de hidrocaburos cuticulares de las alas de Triatoma longipennis. Macho Hembra Hidrocarburo IK % D.E. % D.E. Tricosano Tetracosano Desconocido Desconocido Pentacosano Monomero C Hexacosano Heptacosano metil heptacosano x,x-dimetil heptacosano Octacosano Nonacosano Monomero de nonacosano Triacontano Heneitriacontano Dotriacontano Tritriacontano metil tritriacontano x,x-dimetil tetratriacontano ,4-dimetil + x,x,x-trimetil tetratriacontano metil pentatriacontano metil + x,x-dimetil pentatriacontano x-metil hexatriacontano x,x,x-trimetil hexatriacontano Desconocido Heptatriacontano Desconocido Monomero de heptatriacontano metil heptatriacontano x,x-dimetil heptatriacontano Octatriacontano Monomero del octatriacontano metil octatriacontano metil + x,x-dimetil octatriacontano x,x,x-trimetil octatriacontano Nonatriacontano Desconocido Monomero del nonatriacontano metil nonatriacontano x,x-dimetil + x,x,x-trimetil nonatriacontano Los datos representan la media (%) y desviación estándar (D.E.) correspondiente a 10 especimenes de cada género.

8 10 INVURNUS, Vol. 3 No. 2 (2008): 3-10 Conclusiones En este trabajo fue posible identificar y cuantificar la composición de hidrocarburos cuticulares en las alas de T. longipennis, por medio de técnicas cromatográficas. El tamaño de los insectos facilitó el manejo y extracción de muestra, y la cantidad de HC fue suficiente para el análisis. El índice de Kobats se considera una herramienta valiosa para la identificación cualitativa de compuestos (hidrocarburos ramificados) de los cuales no se cuenta con estándares. Este trabajo permitió identificar hasta 35 HC con el mismo valor de IK a los reportados en otros trabajos similares. Los compuestos identificados permitieron establecer un perfil característico para la identificación de la especie de T. longipennis que resultó comparable con especies del mismo patrón taxonómico. La diferencia entre las concentraciones de machos y hembras permite identificar los diferentes géneros de la misma especie. Los resultados de trabajos similares permitirá contar con bibliotecas de perfiles quimiotaxonómicos característicos que permitirán identificar especies sin requerir experiencia en la clasificación taxonómica. Bibliografia Chagas, C.F Carlos Chagas. Rio de Janeiro. Casa de Oswaldo Cruz, Fundación Oswaldo Cruz. 1 (2): Chester, B. P., Clifton, R, y Eddie C Enfermedad de Chagas. Parasitologia Clínica. 2a edición Salvat Editors. México. pp Dhabi A., Cerda X., Hefetz A Social Closure, Agressive Behaviour and Cutucular Hydrrocarbon Profiles in the Polydomus ant Cataglyphis iberica. Chem. Ecol. vol 22. pp Gálvez-Cruz J.A Identificación Química de Hidrocarburos Cuticulares en Triatomineos Para Fines Quimiotaxonomicos. Chiapas. Tesis de Licenciatura. Instituto Tecnológico de Tapachula. Howard, R.W Cuticular Hydrocarbons and Chemical Communication. En Insect Lipids: Chemistry, Biochemistry and Biology. University of Nebraska Press. pp Imbert-Palafox J.L., Figueroa-Gutierrez A.H., Gómez-Gómez J.V Tripanosomiasis Americana o Mal de Chagas Otra Enfermedad de la Pobreza. Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, México. Elementos: Ciencia y Cultura 10, (49): Juárez M.P., Fernandez G Cuticular Hydrocarbons of Triatomines. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A 147: Juárez P., Blomquist G. J Cuticular Hydrocarbons of Triatoma mazzoti. Comparative Biochemistry and Physiology, 106: Juárez P., Carlson D.A., Salazar Schettino P.M., Mijailovsky S., and Rojas G Cuticular Hydrocarbons of Chagas Disease Vector in México. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata, Argentina. 97 (6): Juarez P., Blomquist G. J., Shofield Hydrocarbons of Rhodnius prolixus. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, 129: Marques F. de A., McElfresh, J. S. & Millar, J. G Kovats Retention Indexes of Monounsaturated C12, C14 and C16 Alcohols, Acetates and Aldehydes Commonly Found in Lepidopteran Pheromone Blends. J. Braz. Chem. Soc. 11: Márquez Rivera G. I Extracción y Cuantificación de Hidrocarburos Cuticulares de Triatoma longipennis por Cromatografía en Columna y de Gases. Tesis de Licenciatura. Universidad de Sonora-Unidad Regional Norte, H. Caborca. Sonora. Nation, J. L Insect Physiology and Biochemistry. CRP press, Boca Raton. pp Nordlund D. A., Lewis W. J., Terminology of Chemical releasing Stimuli in Transpecific and Interspecific Interactions. Chem. Ecol. 14: Novoa, S., Martínez D., Ojea J., Rodríguez J. L Composición en Ácidos Grasos de Larvas D de Almeja Fina (ruditapes decussatus), Obtenidas a partir de Progenitores Acondicionados en Distintos Regímenes de Temperatura y Progenitores del Medio Natural. Centro de Cultivos Marinos de Ribadeo de Bioquímica y Biología Molecular. España. 26 (35): Paredes González E. A., Comparación del Perfil de Hidrocarburos Cuticulares de Tres Poblaciones de Triatoma rubida: Domestica, Peridomestica y Silvestre. Insecto Transmisor de la Enfermedad de Chagas en Sonora. Tesis de Maestría. Universidad de Sonora. Hermosillo, Sonora. Schofield C. J Control of Chagas Disease Vector. British Med. Bull. 41. pp Skoog Douglas A Aplicaciones de la cromatografía gas-liquido. Fundamentos de química analítica. ed Thomson Learning Ibero. pp Paredes-González y col., Quimiotaxonomía por medio del análisis de hidrocarburos.