5. IMPLICACIONES PARASITARIAS DE F. SOLANI, ASPERGILLUS Y PENICILLIUM AISLADOS DE LOS SUELOS DE LOS INVERNADEROS DE PIMIENTO

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1 5. IMPLICACIONES PARASITARIAS DE F. SOLANI, ASPERGILLUS Y PENICILLIUM AISLADOS DE LOS SUELOS DE LOS INVERNADEROS DE PIMIENTO 5.1. INTRODUCCIÓN Es conocido el papel de muchas de las micotoxinas de los hongos que han sido aislados en los análisis de suelo efectuados (IDRIS et al., 1998), por lo que se planteó la inoculación de los mismos (en principio no patógenos) mediante su extracto crudo. DIÁNEZ (2005) refiere cómo al inocular bacterias, levaduras, actinomicetos y hongos (entre ellos, Fusarium solani) para ensayar su poder antagonista frente a hongos fitopatógenos, encuentra que producen toxicidades que llegan a matar a las plántulas cuando las dosis de inóculo son muy elevadas. Al ser Fusarium solani, la especie mayoritariamente aislada en los análisis efectuados para determinar la población fusárica, parecía conveniente conocer el efecto de los extractos de diversas cepas. A este respecto, las preguntas que sugerían estos resultados eran de diversa índole: sería F. solani patógena en determinados momentos del desarrollo vegetativo de la planta?, sería la responsable del cansancio del suelo observado en el campo al final del cultivo? 5.2. OBJETIVOS El objetivo que se marcó para este apartado, fue contestar a las preguntas planteadas en el apartado anterior, y entre otros, era el de conocer el papel que juegan en la planta los hongos habitualmente aislados en los análisis de suelo, si inoculados en determinados momentos del estado fenológico de la planta eran capaces de interferir en su desarrollo o no MATERIAL Y MÉTODOS Se evaluó la incidencia de algunos hongos aislados mediante un inóculo constituido por propágulos del hongo y los metabolitos producidos por éste en el medio donde se multiplicó. El extracto se obtuvo tras el cultivo en medio líquido 315

2 Ecología de la microbiota fúngica de los suelos de los invernaderos de pimiento y su interés agronómico del hongo en cuestión, en este caso, se emplearon 500 ml de medio patata-dextrosa en un matraz Erlenmeyer que se mantuvo en agitación continua a 450 r.p.m. durante 12 días (Figura 35). Tal y como describen MONTOYA et al. (2001), la incubación se hizo en una habitación con luz natural y temperatura entorno a 25ºC. La filtración del extracto se hizo con papel Whatman nº1 (Figura 34), dejando paso del orden de propágulos ml -1. Figuras 34 y 35. Filtrados de los extractos de diferentes cepas (izquierda) y agitación de los mismos (derecha). El hongo había crecido previamente en PDA (Patata Dextrosa Agar) a 25º C durante 10 días en cámara de cultivo. De cada cepa escogida, se repicaron dos placas, de las cuales se extrajo un disco de cada una de 20 mm de diámetro que fue lo que se puso a agitar en los Erlenmeyer de 500 ml. Las inoculaciones se realizaron partiendo de semillas de pimiento de la variedad Sonar que previamente fueron desinfectadas con lejía comercial sin diluir (40 g de cloro activo por litro) y aclarados sucesivos con agua para eliminar restos de cloro. Se realizaron en una cámara de ambiente controlado, a 25º C, con un fotoperiodo de lux durante 14 horas/día y 60-80% de humedad relativa. La forma de trabajar fue similar a la realizada por Tello et al. (1985) y DE CARA (2007). Las macetas, consistieron en envases de 500 ml de plástico rectangulares, de tipo alimentario, de dimensiones 12x8x6 cm, con sustrato de vermiculita (previamente esterilizada a 121º C durante 1 hora). Se regaron cada 48 horas con unos 75 ml de agua cada terrina. Tal y como hicieran en su día FERNÁNDEZ-CO- RRAL et al. (2002), los contenedores que alojaban la vermiculita, fueron perforados a 1 cm de la base con el fin de evitar la contaminación por el drenaje del agua de riego. Las inoculaciones se efectuaron en tres momentos diferentes: 1) en estado de semilla, 2) cuando la plántula tenía 2 cotiledones y 3) cuando la planta tenía dos hojas verdaderas. Para los casos 2) y 3), las semillas fueron pregerminadas 316

3 Implicaciones parasitarias de F. solani, Aspergillus y Penicillium aislados de los suelos de los invernaderos de pimiento en placas de Petri con papel de filtro de 9 cm de diámetro esterilizado en autoclave a 121ºC, 25 minutos. Al cabo de 4 días, se trasplantaron a la vermiculita. En todos los casos, se sembraron seis semillas por maceta. Para cada aislado se ensayaron tres dosis de inóculo: un testigo, 5 ml y 10 ml, y a su vez, hubo dos macetas (repeticiones) por dosis ensayada, lo que hizo un total de seis macetas por cepa (de las que dos fueron control). Fusarium solani En un primer lugar, se escogieron quince cepas de F. solani procedentes de diversas muestras de suelo de los ensayos evaluados en el campo, a saber: FS- A, FS-7 y FS-9 tenían su origen en parcelas testigo, FS-B y FS-C en parcelas bromuradas, FS-1 y FS-2 de parcelas biosolarizadas por primera vez, FS-3 y FS- 4 de parcelas biosolarizadas por segundo año, FS-5 y FS-6 de parcelas biosolarizadas de tercer año, FS-8 y FS-10 de parcelas a las que se les había añadido un producto llamado Biomor (mezcla de estimulantes de origen biológico, principalmente, bacterias) y por último, FS-11 y FS-12 de parcelas que se desinfectaron con metam sodio después de solarizarlas. En el primero de los casos, cuando la inoculación se realizaba en estado de semilla, éstas fueron sembradas e inmediatamente después, inoculadas, para darse por acabado el ensayo unos cuarenta y cinco días después, cuando ya contaban con 6 hojas verdaderas en su mayoría. La segunda variante del ensayo, fue inocular el extracto cuando las plantitas contaban con dos cotiledones y la tercera fue inocularlas cuando tenían dos hojas verdaderas. En ambos casos, el ensayo se daba por finalizado cuando contaban con seis hojas verdaderas como ya se ha comentado, pues era cuando ya de por sí, el sustrato estaba agotado y físicamente no podían desarrollarse más. Entonces, se procedía al lavado bajo el agua de todas las plantitas que hubiesen sobrevivido y se colocaban sobre papel de filtro para que empapara el agua sobrante. A continuación, se medía la altura desde la base hasta el primer cruce de hojas, a lo que corresponde la altura expresada en los resultados. A su vez, se disponían las plantitas de forma individualizada dentro de unos papeles doblados a modo de sobre, y se introducían en estufa a 105º C durante 24 horas. De esta forma, se conocería el peso fresco y seco de cada planta, para poder averiguar así el peso medio seco. El ensayo, en sus tres momentos diferentes de inoculación, se repitió dos veces en el tiempo. 317

4 Ecología de la microbiota fúngica de los suelos de los invernaderos de pimiento y su interés agronómico Otros hongos Se trabajó también con otros géneros de hongos, en concreto, con la cepa P3 de Penicillium, procedente de suelos bromurados, las cepas A-7 de suelos testigo, A-11 de suelos biosolarizados por tercer año, A-18 (todas ellas de Aspergillus flavus), aislada de suelos biosolarizados por quinto año, An de Aspergillus niger, de suelos que habían sido bromurados y la cepa FS-193 de Fusarium solani, que provenía de suelos desinfectados con 1,3 dicloropropeno y cloropicrina. Cuando se comparó el efecto de los extractos de distintos géneros sobre la germinación de las semillas, se pusieron 20 semillas/placa sobre discos de papel de filtro en placas de Petri, y fueron regadas con 5 ml, de la dilución correspondiente. Cuando se comparó el efecto de diversas diluciones (1:1, 1:2, 1:4, 1:8 y 1:10) del extracto de Aspergillus, se pusieron 10 semillas/placa y se regó cada placa con 4 ml del inóculo líquido (hongo +metabolitos de su crecimiento). Al trabajar con las diluciones 1:1, 1:2, 1:3 y 1:9, se sembraron 5 semillas por placa y se regó con 2 ml de cada dilución Análisis estadísticos de los datos En cuanto a los análisis realizados para conocer la patogenicidad de las cepas, se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) factorial. Los análisis se plantearon de la siguiente forma: Cuando se realizaron los ensayos empleando quince cepas distintas de Fusarium solani, los dos factores estudiados para cada cepa fueron la dosis y la repetición y la variable dependiente, el parámetro a estudiar: la germinación, la altura, el número de hojas verdaderas o el número de plantas muertas. La germinación sólo se evaluó cuando la inoculación se realizó en estado de semillas. Cuando el ensayo se limitó a cinco cepas de F. solani y un testigo, los dos factores estudiados fueron la cepa y la repetición, y la variable dependiente, el parámetro a estudiar: la germinación, la altura, el número de hojas verdaderas o el número de plantas muertas. Al trabajar con otros hongos, sólo se tuvo en cuenta como variable dependiente, el número de semillas germinadas con los factores cepa y repetición como variables independientes. Para normalizar los datos de todos los análisis, se empleó la transformación (x+1), por ser la que mayor información proporcionaba para la interpretación de los resultados. 318

5 Implicaciones parasitarias de F. solani, Aspergillus y Penicillium aislados de los suelos de los invernaderos de pimiento El método empleado para la comparación de las medias fue el procedimiento de las menores diferencias significativas de Fisher (LSD) al 95% RESULTADOS Y DISCUSIÓN Evaluación de patogeneicidad de 15 aislados de F. solani Fusarium solani: inoculación en estado de semillas Los resultados obtenidos en relación a la inoculación con el extracto de distintas cepas de Fusarium solani de diversa procedencia, pusieron de manifiesto la arbitrariedad en la expresión de la patogeneicidad de las mismas cuando se inoculan en estado de semillas. La variación obtenida a la hora de reproducir los mismos ensayos al repetir las inoculaciones pone de manifiesto la dificultad para establecer una pauta generalizada en cuanto al comportamiento patogénico o no de los hongos aislados para los parámetros estudiados: porcentaje de germinación, peso seco de la planta, número de plantas muertas al finalizar el ensayo y altura de las mismas en dicho momento. En algunos casos, se demuestra cómo la dosis de 5 ml fue incluso más agresiva que la de 10 ml. Similares observaciones realizaron IDRIS et al. (1998), tras percatarse de que F. solani provocaba la muerte natural y esporádica de Striga hermonthica, la mala hierba que más estragos causa en el cultivo del sorgo en Sudán. Al regar sobre semillas de Striga el hongo en forma de suspensiones o de filtrados del mismo con una densidad de inóculo de esporas ml -1, al 100%, no obtuvo ninguna inhibición de la germinación; ni al diluirlo 10 o 100 veces. Sin embargo, cuando las semillas eran sumergidas en agua o en alcohol y posteriormente regadas con los filtrados del hongo, el efecto inhibidor fue total, independientemente del empleo de estimulantes de la germinación. La germinación era exitosa cuando se retrasaba la exposición a los filtrados del hongo, tras aplicarle estimulantes como OR24 o etefón. Cuanto más tiempo transcurría a la exposición del hongo, mayor porcentaje de germinación de las semillas se obtenía. El filtrado por tanto, inhibía o la acción del etileno o la biosíntesis del etileno. El Gráfico 5.1. es un ejemplo de lo comentado en el que sólo para el caso de las cepas FS-2, FS-4, FS-7, FS-8 o FS-11, se manifiesta un efecto del poder inhibidor del hongo en valores que oscilan del 10 al 30%, mientras que en otros casos como FS-A o FS-C, para las dos dosis ensayadas o para FS-B, FS-1, FS-5, FS-6, o FS-9 para una de las dos dosis el hongo aumenta incluso el porcentaje de germinación. 319