DIAGNÓSTICO GENÉTICO DE LA DMD

Transcripción

1 DIAGNÓSTICO GENÉTICO DE LA DMD Colágeno IV Laminina -2 Fukutina/FKRP Complejo sarcoglicano -distroglicano -distroglicano Caveolina-3 Pia Gallano Servicio de Genética Hospital de Sant Pau Barcelona Distrofina nno Distrobrevina Sintrofinas Disferlina Citoesqueleto de actina Calpaína

2 DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE (DMD) DISTROFIA MUSCULAR DE BECKER (DMB) Ausencia de distrofina Reducción de distrofina Afectación clínica grave Afectación clínica más benigna varones que nacen varones que nacen Herencia: recesiva ligado al cromosoma X Gen responsable: GEN DMD - localizado en Xp21-79 exones - DNA genómico: 2300 Kb - mrna: 11 Kb - distrofina: 427 KDa, 3655aa

3 DIAGNÓSTICO GENÉTICO POR QUÉ? 1. Confirmar el diagnóstico clínico y anatomopatológico de distrofinopatía Distinguir las distrofinopatías de otras distrofias musculares Permitir el consejo genético Detección de portadoras Diagnóstico prenatal / preimplantacional 2. Comprender el defecto molecular Pronóstico (correlaciones genotipo/ fenotipo) Herramienta imprescindible para terapias mutación-específicas (PTC124, exon-skipping)

4 PATOLOGÍA MOLECULAR DEL GEN DMD Grandes reordenamientos intragénicos (pérdida o ganancia de uno o más exones) (70%): Deleciones (65%) Duplicaciones (5%) Tecnología: MLPA: Mulitplex Ligation-dependent Probe Amplification Mutaciones puntuales (alteración de una o pocas bases) (30%): Mutaciones nonsense (codón de stop prematuro) Mutaciones de splicing (procesamiento anómalo del mensajero) Inserciones / duplicaciones (1-5bp) Mutaciones missense (cambio de aminoácido) Creación exones crípticos Tecnología: Secuenciación masiva (NGS): multiplicom DMD, MiSeq Illumina

5 PATOLOGÍA MOLECULAR DEL GEN DMD La mayoría de mutaciones: deleciones o duplicaciones de 1 o más exones (70%) Deleciones 60% exones crípticos 1% deleciones 1-5bp 23% missense 5% nonsense 33% Mutaciones puntuales 30% Ins/dup 1-5bp 7% splicing 31% Duplicaciones 10%

6 DIAGNÓSTICO GENÉTICO CÓMO? La longitud del gen y su complejidad (2,4 Mb y 79 exones) implica un estrategia diagnóstica 1. Grandes reordenamientos intragénicos (pérdida o ganancia de uno o más exones): Deleciones Duplicaciones Cuantificación número de exones Tecnología: MLPA, Mulitplex Ligation-dependent Probe Amplification 2. Mutaciones puntuales (alteración de una o pocas bases): Mutaciones nonsense (codón de stop prematuro) Mutaciones de splicing (procesamiento anómalo del mensajero) Inserciones / duplicaciones (1-5bp) Mutaciones missense (cambio de aminoácido) Creación exones crípticos Secuenciación DNA Secuenciación mrna Tecnología: Secuenciación masiva (NGS): multiplicom DMD, MiSeq Illumina

7 ANÁLISIS MLPA: PACIENTE DMD DELECIÓN EXONES 45>52 (Frameshift)

8 Xq28.2 e70 e30 e50 e10 e69 e29 e49 e9 Xq13 e68 e28 e48 e8 e67 e27 e47 e7 e66 e26 e46 e6 e65 e25 e45 e5 Xq28 e64 e24 e44 e4 e63 e23 e43 e3 Xp22 e62 e22 e42 e2 e61 e21 e41 e1 Xq11.2 ANÁLISIS MLPA: PACIENTE DMD (Frameshift) Duplicación exones 3>7

9 ANÁLISIS MLPA: MUJER PORTADORA DELECIÓN EXONES 48>55 (In Frame)

10 ANÁLISIS MLPA: MUJER PORTADORA DUPLICACIÓN EXONES 56>67 (In Frame)

11 Ley de Chamberlain PATOLOGÍA MOLECULAR DEL GEN DMD ABD ABD ABD ABD H1 1 H H H4 23 CRD CTD mrna DMB severo Calambres / Mialgia DMB DMB >36 exones DMD / <36 mayoritariamente DMB DMD DMD DMD Relación de la mutación in-frame y la severidad fenotípica

12 EFECTO DE LAS MUTACIONES EN LA PROTEÍNA Deleción in-frame de parte del dominio espectrina proteína más corta pero funcional Deleción out-of-frame proteína truncada, rápidamente degradada en el músculo

13 Organización exónica del gen DMD

14 FENOTIPO SEVERO FENOTIPO LEVE PATOLOGÍA MOLECULAR DEL GEN DMD Ley de Monaco, Reading frame rule Mutación en gen DMD Destruye la pauta de lectura del gen Restaura la pauta de lectura del gen Creación de un codón de terminación prematuro Ausencia expresión distrofina (o < 5%) Expresión distrofina Proteina alterada semi-funcional: alteración en tamaño o cantidad Déficit secundario proteínas complejo DGC Formación complejo DGC Fenotipo severo tipo Duchenne Fenotipo leve tipo Becker IHQ anti-distrofina paciente Duchenne Excepciones aprox. 10% IHQ anti-distrofina paciente Becker

15 DIAGNÓSTICO GENÉTICO CÓMO? La longitud del gen y su complejidad (2,4 Mb y 79 exones) implica un estrategia diagnóstica 1. Grandes reordenamientos intragénicos (pérdida o ganancia de uno o más exones): Deleciones Duplicaciones Cuantificación número de exones Tecnología: PCR múltiple MLPA: Mulitplex Ligation-dependent Probe Amplification 2. Mutaciones puntuales (alteración de una o pocas bases): Mutaciones nonsense (codón de stop prematuro) Mutaciones de splicing (procesamiento anómalo del mensajero) Inserciones / duplicaciones (1-5bp) Mutaciones missense (cambio de aminoácido) Creación exones crípticos Secuenciación DNA Secuenciación mrna Tecnología: Secuenciación masiva (NGS): multiplicom DMD, MiSeq Illumina Sanger

16 SECUENCIACIÓN DEL ADN Next Generation Sequencing: NGS Sistemas de NGS Bench Sec. Sanger Sistemas de NGS 1. Acortar el tiempo de respuesta 2. Reducir costes 3. Aumentar la sensibilidad (secuenciación de moléculas) 4. Análisis sencillo de resultados (no bioinformático) El poder obtener un número muy elevado de secuencias al mismo tiempo eleva significativamente el rendimiento a un menor coste. 2010: resultado de 8 pacientes genes DMD en 4 meses 2016: resultado de 8 pacientes genes DMD en 1 semana

17 SECUENCIACIÓN DEL ADN

18 Polimorfismos/Variantes vs. Mutaciones El orden de la secuencia de las bases es la única variable en la molécula del DNA. Polimorfismos y Mutaciones: cambios en la secuencia de las bases. Criterios de clasificación: 1) Efecto patogénico: El polimorfismo no tiene significación clínica. La mutación tiene efecto patogénico. 2) Frecuencia: Una variante genética de la población general, detectable en al menos el 1 por 100 de individuos: Polimorfismo No obstante: A menudo el umbral del 1p. 100 no se alcanza: Variante Rara

19 ANÁLISIS DE PATOGENICIDAD DE UN CAMBIO LA SECUENCIA EN EL GEN DMD Base de datos LOVD, Universidad de Leiden Programas software ALAMUT Polyphen-2 Mutation tester SpliceSiteFinder MaxEntScan NNSplice GeneSplicer HumanSplicingFinder Segregación del cambio en la familia

20 LISTADO (propio) POLIMORFISMOS GEN DMD Name HGVS Position Name HGVS Position Name HGVS Position ex1 ex11 c.1225a>t ex26 c dupa ex2 c t>a c a>g c c>t ex3 c g>a c g>a c _ del c.94-17_94-16inst ex12 c A>G ex27 c.94-9dupt ex13 c g>t ex28 *c g>a c.152t>a c g>a c c>t c a>t c a>t *c g>a ex4 ex14 c.1635a>g ex29 *c c>a ex5 *c.303t>c c t>c ex30 *c a>g *c c>a ex15 c a>g c a>g c g>a ex16 c.1869c>t ex32 *c.4447a>g ex6 c g>a *c g>t *c.4472a>c ex7 c t>g ex33 *c a>c ex8 c t>c c t>c ex34 c g>a c.802t>c ex17 c t>c c g>a *c _ dup ex18 *c a>g c.4790g>a c _ del ex19 ex35 c g>a ex9 c A>G ex20 c.2391t>g c t>a *c c>t c a>g c a>g c _832-17delinsga c c>g ex36 c.837g>a ex21 c.2645g>a ex37 c.5234g>a c del ex22 ex38 *c a>g *c t>c ex23 c.3021g>a c a>t ex10 c a>g ex24 c a>g ex39 *c.5419c>t c g>c c c>t c _ dup c.1098a>t ex25 c _ del

21 LISTADO POLIMORFISMOS GEN DMD (cont) Name HGVS Position Name HGVS Position Name HGVS Position ex40 *c g>t ex52 c t>a c g>a c g>t ex53 c.7728t>c ex69 ex41 c _ del ex54 c c>t ex70 c t>c c g>a ex55 ex71 ex42 c.6105g>t ex56 ex72 c a>g c _ dup ex57 c c>t ex73 ex43 c.6143g>a ex58 c c>t ex74 c t>a c c>g ex75 c.10789c>t *c g>a ex59 c.8729a>t c g>a c g>a c.8810a>g c g>c *c T> c.8762a>g ex76 c c.8734a>g ex77 c.8767g>t ex78 ex44 ex60 ex79 ex45 c.6463c>t ex61 c g>t c c>t ex62 c g>t ex63 c a>t ex64 c t>c ex46 c c>t *c c>t ex47 c _ dup ex65 c c>t c a>t ex66 c T>C ex48 c.7096c>a ex67 c c>g ex49 c c>g ex68 c.9938g>a ex50 *c delc c.9947g>t c t>c c dela ex51 c a>g c dup c c>g c dela

22 Mutaciones puntuales ESTUDIO GENÉTICO DEL GEN DMD Paciente DMD Cambio de una base que genera la formación de un codón de terminación prematuro. Tipo de mutación puntual más frecuente en DMD. Mutación nonsense (creación codon stop) DNA: c.7657 C>T Prot.: p.arg2553* Exón 52 : CGA TGA Arg STOP

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25 5 DNA mrna maduro Proceso de splicing Gen Exón 1 Intrón 1 Exón 2 Intrón 2 Exón 3 CAATGCTCGAGTC gtgagctag ACCGCACG gtaagttag TTTGTTGGTGACA GTTACGAGCTCAG cactcgatc TGGCGTGC cattcaatc AAACAACCACTGT 3 5 mrna inmaduro Transcripción CAAUGCUCGAGUC gugagcuag ACCGCACG 2 guaaguuag UUUGUUGGUGACA maduración de RNA por corte y empalme 5 CA AUG CUC GAG UC A CCG CAC G UU UGU UGG UGA CA... 3 Traducción 3 Proteína Met Leu Glu Pro Ser Val Cys His Trp Stop Ribosoma

26 Mutaciones puntuales ESTUDIO GENÉTICO DEL GEN DMD Mutación indel (inserción-deleción) Paciente DMD Exón 36: la deleción de AG e inserción de T desplaza la pauta de lectura. Se crea un codón stop 7 codones más allá, en el exón 37. DNA: c.5139_c.5140del AG_insT Prot.: p.lys1713asn_fs*8 EXÓN 36 Intrón 36 EXÓN 37 CAA AAA GAA GAC GTG CTT AAGgtagcaaa..ggaatatagCGT TTA AAG GCA GAA Normal EXÓN 36 Intrón 36 EXÓN 37 CAA AAT AAG ACG TGC TTA AGgtagcaaa..ggaatatagC GTT TAA AGG CAG AA Mutado

27 Mutaciones puntuales ESTUDIO GENÉTICO DEL GEN DMD Mutación indel (inserción-deleción) Paciente DMD Exón 36: la deleción de AG e inserción de T desplaza la pauta de lectura. Se crea un codón stop 7 codones más allá, en el exón 37. DNA: c.5139_c.5140del AG_insT Prot.: p.lys1713asn_fs*8 EXÓN 36 Intrón 36 EXÓN 37 CAA AAA GAA GAC GTG CTT AAGgtagcaaa..ggaatatagCGT TTA AAG GCA GAA Normal Gln Lys Glu Asp Val Leu Lys Arg Leu Lys Ala Glu EXÓN 36 Intrón 36 EXÓN 37 CAA AAT AAG ACG TGC TTA AGgtagcaaa..ggaatatagC GTT TAA AGG CAG AA Mutada Gln Asn Lys Thr Cys Leu Ser Val Stop Arg Gln

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30 ESTUDIO GENÉTICO DEL GEN DMD Paciente DMD con mutación missense Exón 38 DNA: c.5444 A>G Prot.: p.asp1815gly DNA: sustitución A>G No descrita en LOVD EXON 38 intrón 38 EXON 39 AAT AAA GAT ATGgtaaattggttg......tttttgatcagAAT GAA GAC Secuencia normal EXON 38 intrón 38 EXON 39 AAT AAA GGT ATGgtaaattggttg......tttttgatcagAAT GAA GAC Secuencia mutada

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32 El diagnóstico genotípico directo sobre mrna El método de RT-PCR permite retrotranscribir el mrna gracias a la transcriptasa inversa y así obtener un cdna de doble cadena que podrá ser secuenciado directamente La exploración de los mrna patológicos permite visualizar las consecuencias de las mutaciones de splicing, ya se trate de: - un salto de exón (skipping) - una activación de nuevos sitios de splicing El diagnóstico prenatal se realizará mediante secuenciación del DNA fetal

33 Alteración del splicing ESTUDIO GENÉTICO DEL GEN DMD Creación de un nuevo sitio donador de splicing Paciente DMD con mutación splicing El efecto de la mutación solo detectable en RNA RNA cdna: deleción 5 bp DNA: substitución A>G EXON 38 intrón 38 EXON 39 AAT AAA GAT ATGgtaaattggttg......tttttgatcagAAT GAA GAC DNA: c.5444 A>G Prot.: p.asp1815gly EXON 38 intrón 38 EXON 39 AAT AAA GGT ATGgtaaattggttg......tttttgatcagAAT GAA GAC RNA: r.5444_r.5448del DNA: c.5444 A>G Prot.: p.asp1815glu_fs*2 EXON 38 intrón 38 EXON 39 AAT AAA Ggtatggtaaattggttg......tttttgatcagAA TGA AGA CAA

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35 Deleción/Duplicación detectada DISTROFINOPATÍA CONFIRMADA 1. MLPA Deleción/Duplicación no detectada 2. Secuenciación DNA genómico Mutación puntual detectada Mutación puntual no detectada 3. Análisis de distrofina (biopsia muscular) Distrofina normal Distrofina ausente/alterada Otras proteínas alteradas? (disferlina, sarcoglicanos, caveolina, calpaína ) 4. Análisis RNA para identificación de mutación puntual Estudio otros genes

36 SECUENCIACIÓN DEL ADN NGS: tres aproximaciones diferentes SECUENCIACIÓN DE PANELES (PS) Análisis de docenas a cientos de genes Hasta 96 muestras (códigos de barras) Cobertura ALTA-> sensibilidad y especificidad muy altas Bajo coste No unsolicited findings Aplicación directa la diagnóstico No bioinformático SECUENCIACIÓN DE EXOMA COMPLETO (WES) Análisis de secuencias de todos los genes que codifican a proteínas kits comerciales disponibles Cobertura/sensibilidad/especificidad menos que en PS Costes más elevados No restringido a genes conocidos Bioinformático SECUENCIACIÓN DE GENOMA COMPLETO (WGS) Incluye las zonas no codificantes de todos los genes y reg. intergénicas No hace falta enriquecimiento Servicios comerciales atractivos Bioinformático Cuándo se deben utilizar? Cuál es su utilidad en el diagnóstico?

37 PANEL DE GENES MIOPATÍAS DE DISEÑO PROPIO AARS ACTA1 ACVR1 AGRN ALG13 ALG14 ALG2 ANO5 B3GALNT2 B3GNT1 BAG3 BIN1 CAPN3 CAV3 CCDC78 CFL2 CHAT CHKB CHRNA1 CHRNB1 CHRND CHRNE CHRNG CNTN1 COL12A1 COL6A1 COL6A2 COL6A3 COLQ CRYAB DAG1 DES DMD DNAJB6 DNM2 DOK7 DPAGT1 DPM1 DPM2 DPM3 DYNC1H1 DYSF EMD FHL1 FKRP FKTN FLNC GAA GARS GFPT1 GMPPB GNE GTDC2 HSPB8 IGHMBP2 ISPD ITGA7 KBTBD13 KLHL40 KLHL41 KLHL9 LAMA2 LAMB2 LAMP2 LARGE LDB3 LMNA LMOD3 LRP4 MEGF10 MSTN MTM1 MTMR14 MUSK MYBPC3 MYF6 MYH2 MYH7 MYO18B MYOT NEB PABPN1 PLEC PLEKHG5 POMGNT1 POMT1 POMT2 POMT2 PREPL PTPLA PTRF RAPSN RYR1 SCN4A SEPN1 SGCA SGCB SGCD SGCG SGK196 SPEG STIM1 SYNE1 SYNE2 SYT2 TCAP TIA1 TMEM43 TMEM5 TNNT1 TNPO3 TPM2 TPM3 TRIM32 TRPV4 TTN VCP

38 Servicio de Genética, Hospital de Sant Pau, Barcelona Grupo Distrofias Musculares: Lidia González-Quereda, Mª José Rodríguez Andres Nascimento, Carlos Ortez, Jaume Colomer Unidad de Enfermedades Neuromusculares Hospital Sant Joan de Deu, Barcelona Francina Munell Servicio de Neurología Hospital Materno Infantil Vall d Hebró, Barcelona

39 Servicio de Genética Hospital de Sant Pau, Barcelona Grupo Distrofias Musculares Lidia González-Quereda, Mª José Rodríguez Andres Nascimento, Carlos Ortez, Jaume Colomer Unidad de Enfermedades Neuromusculares Hospital Sant Joan de Deu, Barcelona Francina Munell Servicio de Neurología Hospital Materno Infantil Vall d Hebró, Barcelona

40 DNA 5 Bases Nitrogenadas 3 5 Transcripción mrna (inmaduro) Cadena de aminoácidos mrna (maduro) Proteína Met Arg Asp Tyr Leu Tyr Val Lys Stop codon AZUCAR + Grupo FOSFATO Traducción Ribosoma NÚCLEO CITOPLASMA Adenina (A) Guanina (G) Citosina (C) Timina (T) Bases Nitrogenadas Adenina (A) Guanina (G) Citosina (C) Uracilo (U)

41 GEN DE CLASE II Genes que codifican para una proteína. Son transcritos por la RNA pol II. Regiones reguladoras facultativas Sitio inicio transcripción Sitio inicio traducción INTRONES Señal de reconocimiento para el corte del transcrito primario AATAAA 10 a 20 pb CAAT TATA ATG Codon stop Sitio de poliadenilación a a -25 Región promotora Región adyacente 3 Región adyacente 5 Regulación Secuencia no transcrita EXONES Secuencia exónica traducida Secuencia exónica no traducida (transcrita y presente en el mrna maduro) Secuencia intrónica no codificadora (transcrita pero ausente en el mrna maduro)

42 exón 50 T T GCA CGA TGA A TT exón 52 A exón 53 Deleción 51 Frameshift (se desplaza) T CT CT AAG CGA A TT Normal 50 exón 50 CT AAG exón 51 exón 52 exón 53 T TT Deleción In Frame (se restaura) exón 50 exón 53 Deleciones en el gen DMD

43 PANEL DE GENES DE DISEÑO PROPIO Contiene 117 genes que representan 646,7 Kb Cobertura Media= 249X Uniformidad de Cobertura= 95,3% Region a cobertura mínima 20X= 97,8% Region a cobertura mínima 50X= 94%

44 ESTUDIO GENÉTICO DEL GEN DMD: Algoritmo diagnóstico Sospecha Clínica Estudio Genético gen DMD Estudio anatomo-patológico Biopsia muscular Búsqueda Deleciones / Duplicaciones Exonicas Inmunohistoquímica Western-Blot MLPA Alteración número exones Distrofina ausente o alterada SI NO Búsqueda mutaciones puntuales SI NO Sec. DNA genómico Otras proteínas alteradas? MUTACIÓN NORMAL Sec. RNA muscular Biopsia disponible Estudio otros genes: disferlina, sarcoglicanos, caveolina, calpaína