Automatización en IHC: Tinción dual

Transcripción

1 Soluciones de Patología Automatización en IHC: Tinción dual Sabrina Nabhen PhD: Especialista en Soluciones Moleculares y de Patologí Gisela Cornalea MD: Especialista en Aplicaciones

2 El Groupo Roche Nuestra Organización Roche Pharma Genentech Chugai Centralised & Point of Care Solutions Molecular Solutions Diabetes Care

3 Roche Diagnostics 3 Areas de Negocio

4 Soluciones para Patología: Plataformas de Tinción Biopsia OP / Biopsy especímen to Obtener obtain a muestra sample Preparación Tissue preparation Tejido Estabilidad tejido stability of tissue soft hard Sectioning Corte Obtener to obtain un a thin corte section fino Staining Tinción visualización visualize Slide Montaje mounting Permitir to allow microscope la lectura en reading MO Tinción Avanzada IHQ ISH Microscopio Analizar el resultado Diagnóstico

5 Plataformas de Tinción: IHQ & ISH ~ 3-4 % de las muestras ~ 15 % de las muestras ISH Ácidos nucleicos IHC proteínas BenchMark GX BenchMark XT BenchMark ULTRA

6 Tecnología de Tinción BenchMark Cuatro pilares que garantizan consistencia y reproducibilidad 6

7 Diagnóstico de Confianza

8 Portafolio: basado en la ciencia que genera certezas ESTAMOS SEGUROS cobas VPH 16/18 CINtec PLUS cytology CINtec histology que el VPH es la principal causa de cáncer de cuello uterino y que los genotipos 16 y 18 del VPH son los dos tipos de mayor riesgo. que la coexpresión de p16 y Ki- 67 en la misma célula indica la desregulación del ciclo celular. que p16 se sobreexpresa como resultado de una infección por VPH transformante. Fuente: Bruni et al., WHO HPV Information Centre Summary Report, 2015; Schmidt et al, Cancer Cytopathology, 2011; von Knebel Doeberitz, Eur J Cancer,

9 CINtec PLUS Citology: ayuda objetiva en el triage CINtec PLUS CINtec PLUS CINtec PLUS Citología cervical Negativo Negativo Enfermedad Subjetivo La expresión del p16 (marrón) indica detención de la división celular. La expresión del Ki-67 (rojo) indica proliferación celular 9 La coexpresión de p16 y Ki-67 (marrón y rojo) indica una anomalía. Depende únicamente de la interpretación de la morfología.

10 Tinción Dual IHQ Plataformas Benchmark picture placeholder

11 Consideraciones Creación del Protocolo

12 Utiliza dos kits de detección diferentes en la misma muestra del paciente: Opción A ultraview DAB ultraview AP Red uv DAB chromogen Horse Radish Peroxidase uv DAB multimer ** **** * ** ** * * * ** AP uv Fast Red chromogen Alkaline Phosphatase uv AP Red multimer Primary antibody #1 Primary antibody #2 Tissue antigen #1 Tissue antigen #2

13 Utiliza dos kits de detección diferentes en la misma muestra del paciente: Opción B OptiView DAB ultraview AP Red

14 Ventajas y Aplicaciones de la Tinción Dual IHQ Requiere menos material (tejido) Observación de poblaciones complementarias xej. células B y T Diferenciar células neoplásicas vs células normales xej. Cáncer de próstata vs la glándula normal

15 Cuáles son los pasos para montar una tinción Dual IHQ? Paso #1 Selección del Anticuerpo Puede ser utilizada toda combinación de Anticuerpos primarios de origen conejo y ratón conejo-ratón conejo-conejo ratón-ratón Antes de determinar cuales Anticuerpos combinar, determinar si ambos pueden ser observados juntos Los dos Acs se superponen? xej. Son los dos nucleares xej. Ambos marcan en linfocitos El rescate Antigénico de uno impide la detección del segundo? xej. La digestión enzimática es necesaria para algunas keratinas pero destruye la membrana de los linfocitos Chequear en los insertos el protocolo de los anticuerpos de ser necesario

16 Paso #2 Kits de Detección a utilizar Tinción Dual IHQ utiliza dos kits de detección combinados ultraview Universal DAB detection kit o optiview Universal DAB detection kit ultraview Universal Alkaline Phosphatase Red Detection kit CD45 con uv DAB (marrón) MART-1/melan-A con uv Red (rojo) Los kits de detección Ventana son libres de Biotina, diseñados con tecnología multímero para lograr una detección específica y sensible para Anticuerpos IgG e IgM de ratón y de conejo Recomendaciones generales: La tinción de Melanocitos generalmente utiliza el kit de detección uv Red Para el antígeno de menor prevalencia utilizar el uv AP Red y para el antígeno de mayor prevalencia el uv DAB Para el Anticuerpo más robusto utilizar el uv DAB

17 Paso #3 Procedimiento Las Plataformas Benchmark tienen disponible en el Software la opción para poder crear un Protocolo para la Tinción Dual Utiliza dos kits de detección IHQ Utiliza un único Protocolo bajo un mismo nombre por lo que no hay que crear protocolos por separado Utiliza un único código de barra para identificar el slide en el que se hará una tinción dual Totalmente automatizado

18 Consideraciones Creación del Protocolo

19 Diseño del protocolo en el Software: Despar & Pretratamiento Primer anticuerpo con ultraview DAB Desnaturalización Segundo anticuerpo con ultraview Red

20 Recomendaciones: Cuando se selecciona el pre tratamiento asegurar que el del primer Ac sea compatible con el segundo Ac En general, como el kit ultraview Red es más sensible, seleccionar Ultra u OptiView DAB Para el Ac más robusto y de mayor expresión ultraview Red Para el Ac menos robusto y de menor expresión

21 Consideraciones generales: El punto más importante es la selección de la marcación y su localización Seleccionar anticuerpos que posean la misma o compatibles condiciones de pre tratamiento. Primero Optimizar la marcación de cada Anticuerpo por separado con el mismo kit de detección que utilizará en el protocolo de tinción dual. Seleccionar anticuerpos con patrones de tinción diferente (diferentes células o localización). Para evitar background en la tinción dual, utilizar el paso de desnaturalización entre las dos marcaciones. Esto ayuda a eliminar todo resto de anticuerpo de la primera marcación.

22 Ki67 & Mart-1 Ki67 and Mart-1 Depar Cell Conditioning Pab Denature* DS Pab Counterstain Post CS Selected Standard CC1 Ki67, 8 min. not selected Melan-a, 16 min. Hem II, 4 min. Bluing, 4 min. Mart-1** and Ki67 Depar Cell Conditioning Pab Denature* DS Pab Counterstain Post CS Selected Standard CC1 Mart-1, 24 min. 90 C, 4 min. Ki67, 8 min. Hem II, 4 min. Bluing, 4 min. * Denature is not recommended when staining Mart-1 as the second stain. Denaturing causes a non-specific interaction which may be misinterpreted as real staining. **It is recommended that the Ki67 be done in brown and Melanoma marker in red as the melanoma marker may mask the Ki67 staining and make interpretation difficult.

23 Ki67 & Melanosome (HMB45) Ki67 and Melanosome Depar Cell Conditioning Pab Denature DS Pab Counterstain Post CS Selected Mild CC1 Ki67, 16 min. 90 C, 4 min. HMB45, 8 min. Hem II, 4 min. Bluing, 4 min. Melanosome and Ki67 Depar Cell Conditioning Pab Denature DS Pab Counterstain Post CS Selected Mild CC1 HMB45, 12 min. 90 C, 4 min. Ki67, 20 min. Hem II, 4 min. Bluing, 4 min. **It is recommended that the Ki67 be done in brown and Melanoma marker in red as the melanoma marker may mask the Ki67 staining and make interpretation difficult.

24 CD 45 & Mart-1 CD45 and Mart-1 Depar Cell Conditioning Pab Denature DS Pab Counterstain Post CS Selected Standard CC1 CD45, 20 min. 90 C, 4 min. Mart-1, 16 min. Hem II, 4 min. Bluing, 4 min. Mart-1 and CD45 Depar Cell Conditioning Pab Denature DS Pab Counterstain Post CS Selected Standard CC1 Mart-1, 24 min. 90 C, 4 min. CD45, 8 min. Hem II, 4 min. Bluing, 4 min.

25 CD20 & CD3 CD20 and CD3 Depar Cell Conditioning Pab Denature DS Pab Counterstain Post CS Selected Mild CC1 CD20, 20 min. 90 C, 4 min. CD3, 24 min. Hem II, 4 min. Bluing, 4 min. CD3 and CD20 Depar Cell Conditioning Pab Denature DS Pab Counterstain Post CS Selected Mild CC1 CD3, 24 min. 90 C, 4 min. CD20, 12 min. Hem II, 4 min. Bluing, 4 min.

26 CD8 & CD4 CD8 and CD4 Depar Cell Conditioning Pab Denature DS Pab Counterstain Post CS Selected CD4 and CD8 Standard CC1 CD8, 32 min. + amp 90 C, 4 min. CD4, 8 min. (ultrablock 4 min) Hem II, 4 min. Bluing, 4 min. Depar Cell Conditioning Pab Denature DS Pab Counterstain Post CS Selected Standard CC1 CD4,12 min. (ultrablock 4 min) 90 C, 4 min. CD8, 32 min.+ amp Hem II, 4 min. Bluing, 4 min.

27 CD45RO & CD20 Lymphatic T issue/lymphoma Dual antibody, dual chromogen stain First antibody is a T-Cell marker, CD45RO, stained with DAB Second antibody is B-Cell marker, CD20, stained with Enhanced V-Red (now ultraview Red) Used to differentiate between B-cell proliferations or tumors and T-Cell proliferations or tumors

28 bcl-6 & bcl-2

29 CD15 & CD30

30 CK20 & CK7

31 Breast: Ki67 (brown) ER (red) Skin: LCA (brown) Pankeratin (red) Skin: Vimentin (brown) Pankeratin (red)

32 Doing now what patients need next