ESTUDIO DE LAS ALTERACIONES PLAQUETARIAS MEDIADAS POR ARN DE DOBLE CADENA EN UN MODELO DE RATÓN.

Transcripción

1 Concurso: Proyecto Química ORT del Genoma Humano Subsidios a la Investigación en: Bioquímica Molecular y Genética Año 2013 ESTUDIO DE LAS ALTERACIONES PLAQUETARIAS MEDIADAS POR ARN DE DOBLE CADENA EN UN MODELO DE RATÓN. Directores del Proyecto: Dr. Roberto Pozner y Lic. Leonardo Rivadeneyra Lugar del trabajo: Laboratorio Trombosis Experimental Instituto de Medicina Experimental (CONICET-Academia Nacional de Medicina) Pacheco de Melo Ciudad Autónoma de Buenos Aires Proyecto Laboratorio Trombosis Experimental IMEX (CONICET-ANM) :: Pag. 1

2 Generalidades sobre las plaquetas y sus funciones Las plaquetas, son fragmentos celulares derivados de los megacariocitos (MCs) residentes de la médula ósea. Estas células desempeñan un papel crítico en la hemostasia y la trombosis. En condiciones normales, las plaquetas circulantes no se adhieren a la superficie endotelial, ni entre ellas, debido al equilibrio existente entre los mecanismos pro y anti-trombóticos. La lesión de un vaso sanguíneo (por traumatismo, intervención quirúrgica o enfermedad) desencadena la hemostasia primaria que se caracteriza por la adhesión de las plaquetas a proteínas de la matriz expuestas por la injuria vascular. Las plaquetas retenidas en la superficie subendotelial se activan y secretan y/o generan mediadores solubles que actúan como activadores plaquetarios, tanto para sí mismas como para otras plaquetas circulantes. Esto permite la generación y el crecimiento de un trombo, creando un sistema de retroalimentación positiva de activación plaquetaria. Durante la hemostasia secundaria, la amplificación de la estimulación plaquetaria desencadena su actividad procoagulante generando trombina y la formación de un coágulo estable de plaquetas y fibrina. Si bien la formación del trombo plaquetario es un elemento clave de la hemostasia normal, la activación plaquetaria en lugares inapropiados (por ejemplo: ruptura de placas de ateromas) da lugar a las trombosis arteriales que son la principal causa del infarto de miocardio y del accidente cerebro vascular. Sin embargo, en la actualidad se considera que, además de su función hemostática, participan también en importantes procesos como la inflamación y la remodelación tisular. Figura 1. Esquema de la función hemostática de las plaquetas. Las plaquetas pueden realizar funciones tan variadas debido a su capacidad de establecer diversos tipos de interacciones: intercelulares (tanto homotípicas como heterotípicas) y con moléculas de la matriz extracelular. Además poseen la capacidad de Proyecto Laboratorio Trombosis Experimental IMEX (CONICET-ANM) :: Pag. 2

3 liberar potentes moléculas bioactivas que participan en los procesos de quimiotaxis, angiogénesis, degradación de la matriz extracelular y regulación de diferentes vías de señalización en varios tipos celulares. Estas características también vinculan a las plaquetas con el desarrollo de patologías como la enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, diabetes, asma y cáncer. Desde el punto de vista morfológico, las plaquetas son pequeños elementos sanguíneos (1-3 µm), con una membrana celular que se invagina formando los denominados sistemas canalicular abierto y tubular denso. El primero constituye una serie de canales abiertos hacia el espacio exterior que facilitan el proceso de secreción y permiten el acceso de sustancias hacia el interior de la plaqueta. El sistema tubular denso se forma a partir de componentes del retículo endoplásmico del MC y constituye el sitio principal de almacenamiento de Ca 2+. Inmediatamente, por debajo y alrededor de toda la membrana plasmática se presenta un haz microtubular y una red de microfilamentos con propiedades contráctiles que constituyen el citoesqueleto de la plaqueta. En el citoplasma plaquetario se encuentran las organelas, partículas de glucógeno y diferentes tipos de numerosos gránulos (figura 2A). Los gránulos densos contienen ADP, ATP, serotonina y Ca 2+, mientras que los gránulos α (los más numerosos) contienen sustancias vasoactivas y diversas proteínas como factores de crecimiento, factores de coagulación, inmunoglobulinas y proteínas de adhesión. Cuando las plaquetas reaccionan, por ejemplo frente a una injuria vascular, sufren diversos cambios morfológicos y bioquímicos. El primero de ellos es el cambio de forma discoide a esférica junto con la emisión de pseudópodos que permiten una mayor exposición de los receptores de superficie favoreciendo la adhesión de la plaqueta a las estructuras subendoteliales (figura 2B-E). Entre los mediadores generados localmente cabe mencionar la trombina, ADP, Adrenalina (ADR) y tromboxano A 2 (TXA 2 ). La interacción de estas moléculas con sus respectivos receptores plaquetarios induce una compleja cascada de señales que son transducidas desde la membrana al citoplasma y caracterizan a la plaqueta activada. Proyecto Laboratorio Trombosis Experimental IMEX (CONICET-ANM) :: Pag. 3

4 Figura 2. Micrografía electrónica de plaquetas en reposo o activadas. Las micrografías de escaneo electrónico (SEM) muestran la forma discoide de plaquetas circulantes en reposo (B, aumento=20.000) y el cambio a una forma más esférica con varios pseudopodos (C, aumento=10.000). Las micrografías de transmisión electrónica muestran una plaqueta en reposo (D, aumento=21.000) y otra activada (E, aumento=30.000) que muestra la constricción del anillo de microtúbulos alrededor de los gránulos centralizados y la formación de pseudopodos. Uno de los eventos más tempranos que tienen lugar durante la activación plaquetaria es el aumento de Ca 2+ intracelular que contribuye a la exposición de los sitios de unión para el fibrinógeno y el Factor von Willebrand (FvW) en las glicoproteínas (GPs) IIb/IIIa (integrina α IIb β 3 ) y Ib/V/IX respectivamente, fenómeno esencial para la unión plaqueta-plaqueta y la consolidación del trombo. Entre los cambios bioquímicos que ocurren en las plaquetas, el aumento en los niveles de Ca 2+ permite la liberación de ácido araquidónico (AA) y formación de TXA 2 y a la hidrólisis del fosfatidilinositol 4,5 difosfato (PIP 2 ) generando diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP 3 ) respectivamente. Tanto el IP 3, a través de la movilización de Ca 2+, como el DAG por activación de la proteína quinasa C fosforilan proteínas del citoesqueleto y permiten la secreción de los gránulos Figura 3. Representación esquemática de los principales eventos involucrados en la activación plaquetaria. TS: tromboxano sintasa, PGG 2 y PGH 2 : prostaglandina G 2 y H 2, CO: ciclooxigenasa, MLCK: quinasa de cadenas livianas de miosina, MLC: cadenas livianas de miosina. Dentro de los círculos coloreados aparecen los factores de coagulación. Proyecto Laboratorio Trombosis Experimental IMEX (CONICET-ANM) :: Pag. 4

5 plaquetarios (figura 3). La trombina, además de ser considerada como la proteasa más importante de la cascada de la coagulación, es el agonista plaquetario más potente identificado hasta la fecha. La trombina genera cascadas de señalización intraplaquetaria al interactuar con dos receptores de membrana acoplados a proteínas G, pertenecientes a la familia de receptores activados por proteasas (PAR) y denominados PAR1 y PAR4. Su activación tiene lugar mediante un proceso de proteolisis: la unión de la trombina a estos receptores produce la escisión de su extremo amino terminal y genera nuevas secuencias terminales (SFLLRN para PAR1 y GYPGKF para PAR4), capaces de activar procesos de señalización intracelular (figura 4). Estos son los dos receptores de trombina en plaquetas humanas, mientras que las de ratón poseen también PAR4 pero no expresan el PAR1 sino el 3. Figura 4. Receptores plaquetarios de trombina en humanos. Antecedentes y contribuciones de nuestro grupo de trabajo al tema Una de las principales líneas de trabajo de nuestro laboratorio se ha focalizado en evaluar nuevos moduladores de la formación de plaquetas y/o la función de las mismas. Para esto utilizamos un modelo in vitro de generación de plaquetas humanas, junto con estudios realizados en plaquetas humanas provenientes de dadores voluntarios sanos o pacientes con patologías que permiten explicar alguna respuesta de activación en particular. Además, trabajamos con plaquetas murinas lo cual nos permite modelizar in vivo y poder así estudiar el comportamiento de las plaquetas en animales que reciben diferentes tratamientos farmacológicos pudiendo abarcar un espectro más amplio de efectos biológicos. En los últimos años nos interesó estudiar los mecanismos involucrados en la disminución de plaquetas asociada con la Fiebre Hemorrágica Argentina (FHA). Esta es una enfermedad endemo-epidémica causada por el virus Junín que afecta principalmente a los trabajadores agropecuarios. Desde 1958, la distribución geográfica de la enfermedad se ha extendido desde el noroeste de la provincia de Buenos Aires al sur de las provincias de Santa Fé y Córdoba. La trombocitopenia adquiere un gran valor ya que el diagnóstico de esta Proyecto Laboratorio Trombosis Experimental IMEX (CONICET-ANM) :: Pag. 5

6 enfermedad se basa en datos clínicos y de laboratorio como por ejemplo un recuento plaquetario menor a /mm 3 y glóbulos blancos por debajo de 2.500/mm 3. Es por ello que nos preguntamos si la trombocitopenia presente en esta patología podía ser explicada por una megacario/trombopoyesis ineficaz. Nuestros resultados muestran que la infección de células progenitoras hematopoyéticas con virus Junín causa una inhibición en la generación plaquetas in vitro debida a la producción parácrina de interferón alfa y/o beta, ambos del tipo I (IFN I), sin alterar la generación de MCs. Un aspecto interesante de este trabajo fue que este efecto selectivo ocurre sólo en concentraciones bajas de IFN I (10 U/ml), mientras que usando concentraciones de 100 U/ml o mayores también observa el efecto antiproliferativo en MCs ya descrito para esta citoquina. Además, el poly (I:C), un análogo sintético del producto de la replicación de la mayoría de los virus y potente inductor de la síntesis endógena de IFN I reprodujo los efectos inhibitorios de la trombopoyesis mencionados, sugiriendo un mecanismo que puede ser generalizado a otros virus y no especifico del virus Junín. En suma, nuestros resultados indican que el IFN I tiene un rol crítico en el proceso de biogénesis plaquetaria y permitirían explicar la trombocitopenia asociada no sólo a la FHA sino a otras infecciones virales. Por otra parte, son la primera evidencia de un efecto selectivo sobre la trombopoyesis por un mediador soluble endógeno (como son los IFN I). El IFN es uno de los principales componentes humorales involucrados en la resistencia a infecciones virales y constituye una de las primeras líneas de defensa ya que es producido rápidamente luego de la infección. De los tres tipos de IFN descritos en el humano, el IFNα, miembro del tipo I, es uno de los más estudiados y es utilizado en el tratamiento de diversas patologías. Los IFN I actúan a través de la unión a su receptor induciendo una cascada de señalización que incluye la fosforilación del receptor y la activación de las proteínas quinasas Tyk 2, JAK1, STAT-1 y 2 que conlleva a la activación transcripcional de genes específicos. Los IFN I recombinantes son utilizados clínicamente para tratar infecciones virales, tumores sólidos, desórdenes mieloproliferativos, neoplasias hematopoyéticas y enfermedades autoinmunes tales como esclerosis múltiple, dado que conduce a una detención del crecimiento celular. Sin embargo, los efectos antiproliferativos del IFNα no son selectivos y alteran la homeostasis normal del organismo con los consecuentes efectos adversos asociados al uso de esta droga. Entre ellas, reviste gran interés su acción supresora de la hematopoyesis, que, si bien es útil para el tratamiento de Proyecto Laboratorio Trombosis Experimental IMEX (CONICET-ANM) :: Pag. 6

7 desórdenes hiperproliferativos, resulta nociva cuando se lo administra para controlar infecciones virales, tumores sólidos o enfermedades autoinmunes. En este sentido, la trombocitopenia es una de las causas más frecuentes de suspensión de la terapéutica con IFNα. Si bien esta alteración no ha sido totalmente caracterizada, Wang y col. demostraron que el IFNα inhibe directamente la generación in vitro de MCs de ratón. Posteriormente Yamane y col. reportaron que el tratamiento con IFNα disminuye la producción de plaquetas in vitro sin alterar la generación de MCs humanos. El presente proyecto planea profundizar nuestros hallazgos previos, poniendo énfasis en determinar si el ARN doble cadena poly (I:C) induce una disfución cuali y/o cuantitativa en plaquetas. Además de los antecedentes mencionados, nuestro grupo de trabajo ha abarcado y continúa investigando diferentes aspectos acerca de la generación de plaquetas y la función de las mismas, incluyendo estudios sobre la regulación de la sobrevida de progenitores hematopoyéticos, o el rol de los nucleóticos cíclicos y de los macrófagos en la regulación de la generación de MCs. Los resultados de nuestras investigaciones han sido publicados en revista de alto impacto en la especialidad -Stem Cells. 14(2): (1996); Stem Cells. 16(1): 61-5 (1998); J Lab Clin Med. 137(4): (2001); Br J Pharmacol. 145(3): (2005); Exp Hematol. 34(10): (2006); Br J Haematol. 148(1): (2010); J Thromb Haemost. 9(12): (2011); Exp Hematol. 39(7): (2011); Thromb Haemost. 107(1): (2012); FASEB J. 26(7): (2012); Viruses. 21;5(1): (2013); Biol Chem. (en prensa); J Pharmacol Exp Ther. (en prensa)-. Más aún, algunos de nuestros trabajos han recibido el reconocimiento de ser editorializados por las revistas en las que fueron publicados -J Lab Clin Med. 137: (2001); Br J Pharmacol. 145, (2005)- y otro ha recibido el premio cuadrienal "Alois Bachmann" al mejor trabajo experimental o clínico de Microbiología -Otorgado por la Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires (2010)-. Finalmente, algunos de los resultados presentados en congresos han recibido distinciones como el premio de la Sociedad Internacional de Hemostasia y Trombosis para su presentación en el XVIII Congreso de dicha Sociedad (2001), el primer premio en la Sesión de Comunicaciones Orales y el premio al mejor póster en Investigación Básica para trabajos presentados en el VII Congreso Argentino de Hemostasia y Trombosis(2006), así como otro Proyecto Laboratorio Trombosis Experimental IMEX (CONICET-ANM) :: Pag. 7

8 de los trabajos fue seleccionado para ser presentado al premio Leon Cherny durante la LIV Reunión de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (2009). Objetivos Evaluar el efecto in vivo de diferentes dosis del ARN doble cadena poly (I:C) sobre los parámetros hematológicos y la funcionalidad plaquetaria. Para esto se inocularán ratones con poly (I:C) y luego del tratamiento se les extraerá sangre para realizar un recuento hematológico completo y evaluar funciones hemostáticas o proinflamatorias de sus plaquetas, de tal modo que los alumnos podrán correlacionar las diferentes dosis de poly (I:C) con sus efectos. Las metodologías a utilizar se detallan en el Anexo. Modalidad de trabajo Para realizar este proyecto, los alumnos recibirán una clase introductoria sobre el manejo de animales y algunas nociones básicas sobre vías de inoculación y extracción de sangre. A continuación, serán instruidos en métodos de separación de los distintos tipos celulares presentes en la sangre a fin de obtener las plaquetas necesarias para realizar los ensayos funcionales. Además, los alumnos recibirán literatura básica en el tema de trabajo y protocolos a utilizar en los diferentes ensayos que se realizarán a lo largo del proyecto. Estos incluirán los siguientes procedimientos: 1. Anestesia y manipulación de animales de laboratorio. 2. Diferentes vías de inoculación en animales de experimentación. 3. Diferentes métodos de extracción de sangre en ratones. 4. Procesamiento de la sangre para la realización de recuentos hematológicos. Análisis de los diferentes parámetros incluidos en un recuento hematológico clásico. 5. Aislamiento de plaquetas periféricas. 6. Realización de ensayos funcionales en plaquetas, incluyendo la determinación de p-selectina y la capacidad de unión de fibrinógeno. Proyecto Laboratorio Trombosis Experimental IMEX (CONICET-ANM) :: Pag. 8

9 7. Nociones básicas de citometría de flujo, necesarias para la adquisición de los datos provenientes de ensayos propuestos. 8. Manejo de software libre (WinMDI) para el análisis de los datos obtenidos por citometría de flujo. 9. Comparación de los diferentes resultados obtenidos mediante la utilización de diferentes pruebas estadísticas. Los alumnos realizarán prácticas de laboratorio sobre todas las técnicas mencionadas en el párrafo anterior. En cada experimento, tendrán oportunidad de analizar los resultados y conceptualizarlos dentro del marco de los objetivos planteados para poder luego incluirlos en su informe de pasantía. Además, confeccionarán un informe que incluya los fundamentos, resultados y conclusiones de cada práctica para poder hacer un seguimiento del aprendizaje de cada uno de ellos y su grado de avance en el proyecto. Cronograma y factibilidad El laboratorio cuenta con financiamiento de la Agencia Nacional de Producción Científica y Tecnológica (ANPCyT) mediante tres subsidios para proyectos de investigación científica y tecnológica (PICT , PICT , PICTO-2011 GLAXOSMITHKLINE- 0009). La manipulación de animales se llevará a cabo en el bioterio del Instituto de Medicina Experimental (IMEX) que posee un área destinada al trabajo con animales de experimentación. Los recuentos hematológicos y ensayos de la funcionalidad plaquetaria se llevarán a cabo en el Laboratorio Trombosis Experimental del IMEX (CONICET- Academia Nacional de Medicina) que cuenta con un sector apto para la realización de las diferentes técnicas anteriormente mencionadas, además de un espacio común de uso general y una oficina. El mismo está equipado con todos los equipos necesarios para la realización de los experimentos propuestos en este proyecto, incluyendo: Contador hematológico Abacus Jr. Vet Centrífuga y microcentrífuga refrigeradas Material de vidrio Balanza analítica Baño termostatizado Proyecto Laboratorio Trombosis Experimental IMEX (CONICET-ANM) :: Pag. 9

10 Heladeras con freezer Freezer de -20ºC Computadoras con impresora Conexión a Internet Programas de análisis de datos e imágenes, de análisis estadístico y de procesamiento de datos y texto. El Instituto de Medicina Experimental cuenta con la estructura edilicia necesaria para desarrollar este proyecto y en el mismo se encuentran disponibles para todo el personal del Instituto un citómetro de flujo equipado con un laser de Argon de tres líneas cromáticas y tres fotodetectores, freezers de -78 C y autoclaves. Los fondos obtenidos mediante la presente convocatoria serán utilizados para la adquisición de reactivos y material descartable necesarios para la realización del proyecto. Bibliografía relacionada al proyecto Pozner RG y col. "Junin virus infection of human hematopoietic progenitors impairs in vitro proplatelet formation and platelet release via a bystander effect involving type I IFN signaling". PLoS Pathog 6(4), e (2010). J. N. Thon J.N. y Italiano J.E. "Platelet formation" Semin Hematol 47 (3), (2010). Thon J.N. y col. "Cytoskeletal mechanics of proplatelet maturation and platelet release," J Cell Biol 191 (4), (2010). Pestka S. "The interferons: 50 years after their discovery, there is much more to learn" J Biol Chem 282 (28), (2007). Platanias L.C. "Mechanisms of type-i- and type-ii-interferon-mediated signalling". Nat Rev Immunol 5 (5), (2005). Romaniuk MA y col. Binding of galectin-1 to α IIb β ₃ integrin triggers "outside-in" signals, stimulates platelet activation, and controls primary hemostasis. FASEB J. 26(7): (2012). Jurk K, Kehrel BE. Platelets: physiology and biochemistry. Semin Thromb Hemost 2005; 31: Colman, RW y col. Overview of Hemostasis, in Hemostasis and Thrombosis. Basic Principles and Clinical Practice, 5 th Edition, R.W. Collman, et al., Editors. 2001, Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia. Proyecto Laboratorio Trombosis Experimental IMEX (CONICET-ANM) :: Pag. 10

11 Anexo Materiales y métodos Procedimientos: Todos los procedimientos de laboratorio se realizarán siguiendo las normas de ética y bioseguridad estipuladas por los comités de ética y de higiene y seguridad de los Institutos de la Academia Nacional de Medicina. Reactivos: Todos los reactivos utilizados durante el proyecto serán provistos por las firmas argentinas Becton Dickinson, Greiner Bioone, Sigma Aldrich, Invitrogen, Trading New Technologies y GE-Amersham Pharmacia y las estadounidenses Santa Cruz Biotechnology y Polysciences. Ratones: Se utilizarán ratones de la cepa C57BL/6 libres de patógenos endocriados en el bioterio del Instituto de Medicina Experimental. Se utilizarán animales de la misma edad y sexo en todos los experimentos. El manejo de los animales y los procedimientos experimentales serán realizados acorde con las guías institucionales para el cuidado y buen uso de animales. Tratamiento de los ratones con poly (I:C): Se utilizarán ratones hembra (3 en cada grupo), de 8 a 10 semanas los cuales serán anestesiados mediante la inoculación intraperitoneal de 2,2,2 Tri-bromo-etanol. Seguidamente serán inoculados por vía intravenosa (seno retroorbital) con 100 µg de poly (I:C) o un volumen similar de PBS. En caso de obtener diferencias significativas por el tratamiento en los parámetros evaluados (se describen a continuación), se realizará una curva concentración-respuesta con este mimético de ARN doble cadena. Si bien se considera que el trabajo de los alumnos con los ratones es otra forma de aproximación al trabajo científico, el mismo no será obligatorio para ellos, aunque deberán aprender las diferentes vías de inoculación y la dinámica del trabajo con animales de experimentación. Análisis hematológico: Se extraerán 80 µl de sangre del seno retro-orbital de cada ratón utilizando capilares heparinizados y la sangre será transferida a tubos conteniendo EDTA como anticoagulante. Luego se realizará un recuento de los diferentes parámetros hematológicos estándar, incluyendo el recuento de plaquetas, utilizando el autoanalizador Abacus Jr. Vet. En caso de detectar otras alteraciones hematológicas, también serán consideradas. Proyecto Laboratorio Trombosis Experimental IMEX (CONICET-ANM) :: Pag. 11

12 Parámetros de activación plaquetaria Toma de muestra: Luego de la extracción de sangre para recuento hematológico, los animales serán sangrados a blanco, recolectando la sangre en un tubo conteniendo citrato de Na 3,8% de manera de obtener una relación final 9+1 de muestra y anticoagulante respectivamente. A continuación los ratones serán eutanizados y finalmente en algunos animales se recolectarán órganos como el bazo y la médula ósea que serán utilizados para otro proyecto relacionado a este. Respuestas protrombóticas: Como consecuencia de la activación plaquetaria, la integrina α IIb β 3 sufre un cambio conformacional exponiendo un sitio de unión al fibrinógeno, lo que permite la formación de puentes interplaquetarios. La capacidad de unión del fibrinógeno será evaluada por citometría de flujo incubando previamente las plaquetas con fibrinógeno conjugado con el fluorórforo Alexa-488 en presencia de diferentes concentraciones de Trombina como agonista plaquetario. Respuestas proinflamatorias: Las plaquetas activadas son capaces de reclutar células inflamatorias mediante la exposición en su membrana de moléculas de adhesión como la p- selectina, la cual se encuentra oculta en la membrana de compartimentos intracelulares como los gránulos α de plaquetas circulantes en reposo. Frente a diversos estímulos, esta selectina es externalizada y puede ser reconocida por sus contra-receptores presentes en los leucocitos circulantes, principalmente polimorfonucleares y monocitos, promoviendo esta interacción heterotípica que favorece el el reclutamiento de glóbulos blancos hacia sitios injuriados o inflamados. La exposición de p-selectina será determinada mediante citometría de flujo incubando previamente las plaquetas con una anticuerpo monoclonal específico conjugado con el fluorórforo isotiocioanato de fluoresceína (FITC) en presencia de diferentes concentraciones de Trombina como agonista. Análisis citofluorométrico: Los alumnos serán capacitados para poder realizar los análisis de citometría de flujo mediante un software de uso libre como el WinMDI. De esta manera ellos podrán analizar los resultados bajo la supervisión de un profesional y luego discutirlos con el resto del equipo de trabajo. Brevemente, se realizarán gráficos biparamétricos de puntos y/o de contornos que presenten las características de tamaño vs. complejidad intracelular lo cual permitirá identificar la poblaciones celulares respecto del debris celular, a partir de lo cual se realizará una región analítica que contenga solo a las plaquetas. Luego se graficará el histograma de fluorescencia con el cual se podrán analizar los diferentes parámetros Proyecto Laboratorio Trombosis Experimental IMEX (CONICET-ANM) :: Pag. 12

13 estadísticos que el software calcula automáticamente. Mediante el uso de cursores se podrá analizar también el porcentaje de células positivas, el cual tiene un gran valor diagnóstico, especialmente para la evaluación de la externalización de p-selectina. En la figura 5 se puede observar un clásico análisis de una muestra de plaquetas marcadas con el anticuerpo anti p- selectina conjugado con FITC, las cuales fueron estimuladas con dos concentraciones crecientes de Trombina. A B C Figura 5. Ejemplo de gráficos generados para realizar el análisis citofluorométrico de la expresión de p-selectina en plaquetas murinas. La figura presenta los datos de una muestra no estimulada (A), estimulada con una concentración baja (0,025 U/ml, B) o sub-máxima (0,05 U/ml, C) de trombina. Proyecto Laboratorio Trombosis Experimental IMEX (CONICET-ANM) :: Pag. 13