Vigilancia de Vibrio cholerae Instituto de Salud Pública de Chile Dr. Juan Carlos Hormazábal O. Jefe Subdepto. Microbiología Clínica Instituto de Salud Pública de Chile
Enfermedades Transmitidas por Alimentos EDUCACIÓN MARCO REGULATORIO DETECCIÓN PACIENTES/AMBTE/VET CONTROL AUTURIDAD SANIT. LOCAL SIST. VIGILANCIA DET. BROTES BUENAS PRACTICAS INDUSTRIA ALIMENTOS INOCUOS POBLACIÓN SALUDABLE
El Vibrio cholerae Bacilo curvo Gram Negativo Móvil, flagelo polar Prolifera en el ambiente en agua dulce y salada Familia Vibronaceae 139 serotipos diferentes Algunos serotipos de V. cholerae son capaces de producir diarrea. Los casos mas severos V. cholerae O1 y O139 toxigénicos Enfermedad de Cólera
Solo las cepas de serogrupos O1 y O139 han sido causa de brotes pidémicos y estos casos deben ser reportados a la OMS como Cólera.. cholerae O1 dos biotipos Clásico El Tor Cada biotipo tiene dos serotipos diferentes, Inaba y Ogawa. Reservorio: Las aguas salobres o marinas cálidas representan el reservorio natural del agente etiológico del cólera. No existen hospederos animales (no humanos) para el Vibrio cholerae.
Confirmación de Laboratorio V. cholerae en Chile Aislamientos de Origen Humano: Resultado 2005 2006 2007 2008 2009 2010 V.cholerae No O1, No O139 9 4 6 9 15 13 Total Vibrio spp 920 655 589 1117 342 92 Desde el último brote en 1997, No se ha detectado la presencia de V. cholerae Toxigénico O1 O139 en nuestro país Laboratorio Referencia Vibrios, Sección Bacteriología.
Aislamiento (TCBS) Identificación Bioquímica Caracterización Serológica
Reacción de la Polimerasa en Cadena: Métodos Rápidos de Detección gen Vc-m (16S-23S): codifica fragmento específico para Vibrio cholerae de 16S y 23S del rdna. gen ctxa : codifica para la subunidad A de la toxina colérica (CT ). gen tcpa :codifica para la proteína efectora (subunidad del pili) específico del Biotipo El Tor.
Reacción de la Polimerasa en Cadena: Métodos Rápidos de Detección 451 pb 564 pb tcpa ElTor ctxa 300 pb Vc-m (16S-23S)
V. cholerae, Estudio de Susceptibilidad Brote Haití 2010: Perfil de Resistencia Antimicrobiana: Sensible: Tetraciclina (Doxiciclina) Ciprofloxacino Kanamicina Resistente: Trim-Sulf Furazolidona Ac. Nalidíxico Streptomicina Circular Ministerio Salud
Estudio de Susceptibilidad Antimicrobiana: AMP NIT SXT TET Doxiciclina CIP CHL NIT Furazolidona NAL TET ERY? Metodología Lancet 363:223 233 (2004) N. Engl. J. Med. 354:2452 2462.(2006) Clin Infect Dis. 15; 49(10): 1473 1479 (2009) East African Medical Journal 77 (7): 350-3 (2000
Capacidad detección brotes, nuevas tecnologías: Implementación de Métodos Moleculares
Epidemiología Molecular Aplicación e integración de la Biología Molecular a las investigaciones epidemiológicas. Estudio a nivel genético de la etiología, distribución y prevención de las enfermedades infecciosas en las poblaciones humanas, animales, vegetales y sus posibles interacciones. Identificación de subtipos microbianos Determinación de relaciones entre aislamientos
Aislamiento Aislamiento - Cepa Clon Conceptos Cultivo Único Proviene directamente de su fuente de origen (persona, animal, alimento, etc.). Cepa Uno o varios aislamientos con similares características feno y genotípicas que los diferencian de otros aislamientos de la misma especie. Clon Aislamiento/cepas muy semejantes que sugieren origen común Aislamiento microbiano que se recuperó independientemente de diferentes fuentes, en diferentes localizaciones y quizás en diferentes momentos, que muestran tantas características feno y genotípicas idénticas que la única explicación posible para esa identidad es que tengan un origen común. (F.Oskov, J Infect Dis 148:346-354, 1983)
Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, ISP. Tipificación Bacteriana Métodos de Laboratorio: Biotipificación Serotipificación Perfiles de Resistencia Antimicrobiana Fagotipia Tipificación Molecular Subtipificación
Evolution of Subtyping for Bacteria Serotyping Phage typing Bacteriocin typing Plasmind profiles MEE REA Ribotyping PFGE RAPD AFLP MLVA MLST MBMS* 1920 1940 1960 1980 2000 *Microarray-based multi-targed sequencing Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, IS
Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, ISP. Herramientas Moleculares en Vigilancia Criterios de Selección: Capacidad de tipificación Reproducibilidad de la técnica Poder discriminatorio Estabilidad de los marcadores involucrados Facilidad técnica Facilidad de interpretación
Origen de la diversidad genética Mutaciones: Cambios hereditarios en la secuencia de ADN Sustituciones Inserciones Deleciones Translocaciones Inversiones Transferencia Horizontal Transformación (ADN libre) Conjugación (plásmidos) Transducción (fagos) Recombinación: elementos genéticos de dos genomas distintos se combinan en una nueva unidad
Modelos de Poblaciones Estructuradas y No Estructuradas
Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, ISP.
Diversificación de Genotipos Clonal Clonal débil No Clonal
Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, ISP. Tipificación Molecular en la Detección, Investigación y Control de Brotes Identificación del microorganismo causal Relación de casos aparentemente esporádicos Confirmación de asociación con vehículo o fuente Fuente de contaminación Rutas de diseminación Comparación simultánea de resultados Análisis CONTROL Investigación Interpretación
Tipificación Molecular: Limitaciones Distinto poder discriminatorio Dificultades tecnicas Costo Registro, análisis y comparación de datos Interpretación Mismo genotipo no implica misma fuente Coexistencia diferentes subtipos en misma muestra Dinámica de eventos genéticos Genéticamente idénticos - relacionados Utilizar métodos complementarios
Electroforesis de Campo Pulsado DNA Fingerprinting Huella Genética de Identificación
PFGE Modelo
Criterios de Tenover para la interpretación de perfiles de PFGE Categoría Nº bandas diferentes Nº eventos genéticos Interpretación epidemiológica Indistinguible 0 0 Aislamiento es parte del brote Muy relacionado 2\3 1 Aislamiento probablemente es parte del brote Posiblemente relacionado 4\6 2 Aislamiento posiblemente es parte del brote Diferente >=7 >=3 Aislamiento no es parte del brote Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, ISP.
PFGE : Cambios en los patrones frente a eventos genéticos Cambios en el ganancia de \pérdida de inserción de \deleción de Fragmento de 400 kb ninguno sitio de restricción un fragmento de 50 kb Fragmentos resultantes Lane Kb 600 400 250\150 600 450 350 A B C D E PFGE gel 500 400 Nº of diferences 200 100 75 0 3 3 2 2
PFGE y estudios de brote
Capacidad detección brotes, nuevas tecnologías: Huella Digital Bacteriana: PFGE PulseNet International, CDC, PAHO/WHO Standars, Capacitación, Certificación Capacidades Tipificación PFGE Tres Equipos PFGE Bionumerics software Capacitación continua y certificación PulseNet E. Coli O157:H7 Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Yersinia enterocolitica Salmonella Listeria Shigella sonnei Clostridium perfringens Otros E. coli
Tipificación Molecular V. cholerae: Electroforesis de Campo Pulsado: Análisis filogenético de cepas chilenas de Vibrio cholerae no O1 Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] PFGE-NotI PFGE-NotI Base de Datos Genética Nacional Patrones genéticos de cepas de V. cholerae O1 Haití. Bases de datos regional PulseNet 80 90 100 359-09 373-09 052-10 083-10 207-09 086-10 093-10 095-10 096-10 097-10 430-09 462-09 077-10 078-10 090-10 069-09 070-09 142-09 218-09 267-09 240-09 092-10 104-10 475-09 143-09 071-10 Patrones genéticos de cepas de V. cholerae no Bases de datos nacional PulseNet
Capacidad de Detección de Brotes y Clones Circulantes: Implementación de Tipificación Genética y Análisis Bioinformático Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] PFGE-NotI PFGE-NotI Comparación de Aislamientos 95 100 005-91 011-91 Haiti 1 Haiti 2 Chile Chile Aislamientos V.cholerae de Chile año 1991, comparadas con patrones genéticos de aislamientos de Haití año 2010 Estándares PulseNet International, Centers for Disease Control, Atlanta EEUU, OPS
Capacidades Instituto de Salud Pública: El laboratorio de Referencia del Instituto de Salud Pública dispone de las metodologías para la confirmación microbiológica de los aislamientos sospechosos. Identificación bacteriana Caracterización serológica de los aislamientos. Paralelamente se dispone de herramientas de epidemiología molecular para la tipificación de aislamientos ante un escenario de brotes. El laboratorio de Referencia se ha mantenido en permanente contacto con la Red GFN (Global Food Network) y PulseNet International (CDC OPS) para la implementación de técnicas de diagnostico y tipificación.
Plan Cólera: Fortalecimiento Lab. Referencia Instituto Salud Pública Identificación y Serotipificación rápida, con inclusión de métodos moleculares abreviados Tipificación genética por Electroforesis de Campo Pulsado, Según protocolo CDC-PulseNet, para definir clones circulantes. Refuerzo de los Laboratorios Locales Envío de medio recultivo TCBS a los laboratorios de los hospitales Base del país. Envío de medio de transporte Cary-Blair a los laboratorios de los hospitales Base del país. Capacitación y Transferencia Tecnológica: Coprocultivo e Id. de Vibrio cholerae
Instituto de Salud Pública: Cólera http://www.ispch.cl/colera