ENFERMEDAD POR EL VIRUS ÉBOLA Aspectos Microbiológicos Luis Martínez Martínez Departamento de Biología Molecular Universidad de Cantabria Servicio de Microbiología Hospital Universitario Marqués de Valdecilla Santander Santander, 20 de octubre de 2014
VIRUS PRODUCTORES DE FIEBRES HEMORRÁGICAS FAMILIA ARENAVIRIDAE BUNYAVIRIDAE FILOVIRIDAE FLAVIVIRIDAE Ejemplos Arenavirus del Viejo Mundo: Lassa, Lujo Arenavirus del Nuevo Mundo: Chapare, Guaranito, Junin, Machupo, Sabiá Hantavirus, Crimea-Congo, Fiebre del valle del Rift Ébola Marburg Fiebre amarilla, Dengue, Kyasanur, Alkhurma, Omsk
VIRUS EBOLA. Taxonomía Orden Mononegavirales Familia Filoviridae (1967) Género Ebolavirus Especies Zaire (1976) Sudan (1976) Taï Forest [Costa de Marfil] (1994) Bundibugyo (2007) Reston (1989) Marburgvirus: Marburg Cuevavirus: Lloviu Denominación Oficial Mayo 2014 (ej. "Ebola virus H.sapiens-rec/COD/1995/Kikwit-abc1" OMS: Patógeno del Grupo de Riesgo 4 (Contención: Nivel de Bioseguridad 4): Causa enfermedad mortal para la que no existe tratamiento ni vacuna eficaces
1976. * (Junio) Nzara, Sur de Sudán: 234 casos y 151 muertes *(26 de agosto) Yambuku, 100 km al sur del río ÉBOLA (EBOLA) en el Norte de [Zaire] la RD del Congo): 318 casos y 280 muertes
ARN monocatenario: 18.959-18.961 bases No segmentados Negative-sense (RNA polimerasa viral) Nucleocápside: NP, VP35,VP30, L VP40, VP24 Cubierta externa derivada del huésped Glucoproteína GP (7-10 nm) y sgp GP: GP1 y GP2 Regiones Leader y Trailer NO se transcriben
Aprox. 800 x 80 nm NP, VP30, L VP35 Replicación y transcripción del genoma Inhibición de la respuesta mediada por Interferón GP GP1 Unión a células del huésped; pérdida de contacto célula célula VP40 VP24 GP2 sgp Leader, Trailer Fusión con de las membranas celulares del virus y del huésped Liberación de citoquinas, inhibición migración leucocitos, neutralización Ac anti GP Liberación viral Inhibición de la producción de interferón; ensamblaje de la cápside control de la transcripción, replicación y enpaquetamiento
Ebolavirus: Se inactivan con: Radiación gamma 60ºC, 60 min Ebullición, 5 min Son sensibles a hipoclorito y otros desinfectantes Pueden sobrevivir durante días en líquidos y material seco No se inactivan por refrigeración ni por congelación
REPLICACIÓN VIRAL Entrada en las células del huésped -NPC1 (Niemann-Pick C1, transportador de colesterol) -TIM-1 (T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 ; se une a la fosfatidil-serina de la envoltura viral) Endocitosis-macropinosomas (Fusión de membranas) Traducción: Síntesis de mrnas (3-5 ) empleando el (-)ssrna viral y la maquinaria celular del huésped Replicación: (-)ssrna viral (+)ssrna (-)ssrna viral Encapsidación Liberación por gemación de las nuevas partículas virales.
Noda et al, J Virol 2002, 4855-4865
El suero/plasma de convalecientes aumenta la infección de células renales de primate por el virus. La respuesta está mediada por Ac Anti-GP y por C1q: Estabilización de la unión del virus a la células huésped Takada et al, J Virol 2003, 7539-7544
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO La detección de Ebolavirus, de su ARN, sus Ags o de Ac frente al mismo debe realizarse en laboratorios adecuadamente equipados, con personal entrenado tanto en aspectos técnicos como de BIOSEGURIDAD
Cultivo Ebolavirus: Laboratorio con contención BSL4 Inactivación de muestras: BLS3 (incl. cabina BS III y EPP) RT-PCR y ELISA con muestras NO inactivadas: BLS3 RT-PCR y ELISA con muestras SÍ inactivadas: BLS2
CENTROS COLABORADORES DE LA OMS PARA CONFIRMACIÓN DE ENFERMEDAD POR VIRUS ÉBOLA Institut Pasteur de Lyon (France) Bernhard-Nocht Institute for Tropical Medicine (Hamburg, Germany) Centre International de Recherches Médicales de Franceville (Gabon) Kenya Medical Research Institute (Nairobi, Kenya) Institut Pasteur de Dakar (Senegal) National Institute for Communicable Diseases (Johannesburg, South Africa) Uganda Virology Research Institute (Entebbe, Uganda) Centers for Disease Control and Prevention (Atlanta, United States of America) National Microbiology Lab. Public Health Agency Canada (Winnipeg, Canada) Otros Laboratorios UE BLS-4 Otros Laboratorios UE de VHF PHE, Porton Down, Salisbury, UK Instituto Nacional Saúde Dr Ricardo FOCP, Spiez, Switzerland Jorge, Lisboa, Portugal INMI, Rome, Italy Robert Koch Institute, Berlin, Germany NCE, Budapest, Hungary Bundeswehr Institute of Microbiology, PUM, Marburg, Germany Munich, Germany FOHM, Solna, Sweden ISCIII, Madrid, Spain
ECDC Algoritmo para el diagnóstico microbiológico de la EVE
TOMA DE MUESTRAS: Pacientes vivos: Sangre completa (>= 4-5 ml) anticoagulada con EDTA en tubo de plástico (es aceptable usar otros anticoagulantes como SPS o citrato) Otras muestras: Saliva, Orina ( Diagnóstico tardío!), Torunda oral Pacientes fallecidos: Torunda oral en medio de transporte (menor sensibilidad que sangre) Las muestras deben tomarse idealmente cuando el paciente está sintomático El diagnóstico serológico puede hacerse en sangre recogida a partir de los 8 días tras el inicio de los síntomas
Las muestras pueden guardarse: Hasta 24 h. a Tº amb. Hasta una semana a 0-5ºC (para RT-PCR) A largo plazo a -70ºC
CONFIRMACIÓN MICROBIOLÓGICA Una o más de las siguientes: Detección del ARN viral por RT-PCR en tiempo real [RT-LAMP] (baja variabilidad evolutiva del genoma viral) Detección de Ag de virus Ébola Detección de IgM anti virus Ébola [Cultivo del virus: Vero E6; IF Ac policlonales de ratón/rt-pcr] [Métodos rápidos en desarrollo]
Leroy EM eta al, J Med Virol 2000, 463-467
Variaciones en la secuencia del genoma de Ebolavirus Gire SK et al,science 2014 1369
CONFIRMACIÓN MICROBIOLÓGICA Habitualmente la RT-PCR es positiva en el día -1 de los síntomas La cuantificación por RT-PCR permite seguir la evolución de la viremia La viremia puede tardar 3 días en aparecer tras la sintomatología. Deben obtenerse dos resultados negativos de RT PCR, realizados con una diferencia de al menos 48 h para dar de alta a un(a) paciente asintomático(a) [Otras determinaciones microbiológicas: Plasmodium spp., otras fiebres hemorrágicas, infecciones bacterianas ]
CONCLUSIONES Los Ebolavirus son filovirus (ssarn, envueltos ) que incluyen 5 especies, de las que 4 son patógenas para el ser humano y produciendo fiebre hemorrágica con muy alta mortalidad Varios de sus componentes estructurales bloquean la respuesta inmune del huésped El diagnóstico microbiológico requiere BLS 3 ó 4. Habitualmente se basa en la detección en sangre del virus por RT-PCR