Making quality control easy

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Materiales de referencia microbiológicos 26 de octubre 2011

Preguntas más frecuentes 1. Qué es un material de referencia? 2. Qué es un material de referencia certificado? 3. Qué características principales tienen los materiales de referencia microbiológicos desarrollados por Labaqua? 4. Qué son los productos BACuali, BACuanti, BAControl, BACuanti PCR y BACuanti DNA desarrollados por Labaqua? 5. Qué diferencia existe entre los diferentes materiales presentados por Labaqua? 6. Qué proporciona el uso de los materiales de referencia y materiales de referencia certificados? 7. Qué vantajas presentan estos materiales frente a las cepas habituales procedentes de Colecciones de Cultivo?

Preguntas más frecuentes 8. Son los productos BACuali, BACuanti, BACuanti PCR, BAControl y BACuanti trazables con cepas de Colecciones de Cultivo? 9. En que actividades del laboratorio puedo emplear estos materiales? 10. Es obligatoria la realización de todas estas actividades? 11. Qué es validar un método de ensayo? 12. Cuales son los controles de calidad que debe efectuar un laboratorio? 13. Cuales son los controles de calidad internos que debe realizar un laboratorio? 14. Qué son los controles externos de calidad? 15. Con que periodicidad debe un laboratorio realizar las actividades internas de control de calidad?

Materiales de Referencia Material de Referencia (ISO 17025) Material o substancia una o más de cuyas propiedades tienen valores suficientemente homogéneos y claramente establecidos como para poder ser utilizados en la calibración de un aparato, la evaluación de un método de medida, o la asignación de valores materiales. Material de Referencia Certificado (ISO 17025) Material de referencia, acompañado de un certificado, en el cual uno o más valores de sus propiedades han sido certificados mediante un procedimiento que establece su trazabilidad a una realización exacta de la unidad en la que se expresan los valores de dichas propiedades. Cada valor certificado se acompaña de una incertidumbre y el nivel de confianza correspondiente.

Materiales de Referencia Cepa de Referencia (ISO 11133) Microorganismo definido por lo menos al nivel de género y especie, catalogado y descrito según sus características y preferiblemente de origen conocido. Cepa de Reserva (ISO 11133) Cepas idénticas logradas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia, o lo que es lo mismo, una serie de alícuotas de cultivos idénticos elaboradas en el laboratorio por subcultivo de la cepa de referencia. Cepa de Trabajo (ISO 11133) Subcultivos primarios obtenidos de una cepa de reserva, a fín de ser empleados en los ensayos pertinentes.

G-ENAC-04: Utilización de cepas de referencia

Un material de referencia debe ser: Representativo Valor de la propiedad (Identidad) Homogéneo Estable

Material liofilizado clásico 1. Ampolla conteniendo material liofilizado 2. Rotura de la ampolla con diamante 3. Rehidratación en medio líquido apropiado 4. Extensión en medio sólido apropiado 5. Crecimiento y preparación de cepas de reserva TIEMPO: 24-48 h

Material liofilizado clásico 1. Preparación suspensión bacteriana 2. Preparación de diluciones seriadas 3. Incubación y recuento del título TIEMPO: 24-48 h

Inconvenientes de los materiales de referencia microbiológicos NECESIDAD DE NUEVOS MATERIALES DE REFERENCIA - Estabilidad (microorganismos) - Homogeneidad (bajas concentraciones)

Nuevos Materiales de Referencia BACuanti BAControl BACuali

Objetivo Desarrollo de un material de referencia microbiológico GUÍA-ISO 34 General requirements for the competence of reference materials producers -Fácil de preparar -Homogéneo -Estable Guia ISO 35 e ISO 13528 -Fácil de usar -Aplicable a diferentes microorganismos

Material de Referencia: Preparación I Hidratación de la cepa de una Colección de Cultivos Tipo Comprobación de la identidad de la cepa mediante secuenciación del gen rdna 16S Realización de la titulación del microorganismo

Material de Referencia: Preparación II Realización de los cálculos a partir del título obtenido Pastillas de rango bajo (<2 log) Pastillas de rango alto (>2 log) Preparación y dispensación de una mezcla homogénea : Caldo de mantenimiento + suspensión bacteriana

Material de Referencia: Preparación III Proceso de estabilización (liofilización) Resultado: PASTILLA Desemblistado y conservación a -18ºC

Material de Referencia: Controles de calidad I 1. Reconstitución del Material de Referencia 2. Controles de esterilidad De cada cepa empleada De cada mezcla preparada De cada lote fabricado

Material de Referencia: Controles de calidad II 3. Homogeneidad 10 pastillas, 2 réplicas de cada pastilla ISO 13528: Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons T: Test estadístico de Cochran T 2 /(I-1) 2 (Heisterkamp et. al.,1993) ANOVA p-valor>0.05 s s 0.3 σ (σ: desviación estándar diana)

Material de Referencia: Controles de calidad II Homogeneidad Ejemplo 1: Test T Lote PCP11088 C. perfringens ESTUDIO DE MATERIAL DE REFERENCIA HOMOGENEIDAD PASTILLAS (11/02/08) Lote PCP11028 Microorganismo: Clostridium perfringens (UFC/1 ml) Dilución: 1/10 Cápsula Réplica 1 Réplica 2 1 42 36 2 30 48 Media 39,5 3 40 46 Nº cápsulas 10 4 39 44 5 37 34 Limites 6 44 37 T-1 (97.5%) T-1(2.5%) 7 41 43 T-1: 6,22 3,25 20,48 8 37 37 T-1/I(J-1): 0,57 9 41 39 T-2 (5%) 10 38 36 T-2: 2,67 16,92 T-2/(I-1): 0,30 Media geométrica 39,2 St. dev. (log) 0,027 RESULTADO: T-1 T-2 HOMOGENEO HOMOGENEO

Material de Referencia: Controles de calidad II Ejemplo 1: ANOVA, Homogeneidad Lote PCP11028 C. perfringens Análisis de varianza de un factor RESUMEN Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza Fila 1 2 3,179551791 1,589775896 0,00224094 Fila 2 2 3,158362492 1,579181246 0,02083248 Fila 3 2 3,264817823 1,632408912 0,00184211 Fila 4 2 3,234517284 1,617258642 0,00137225 Fila 5 2 3,099680641 1,549840321 0,00067428 Fila 6 2 3,211654401 1,6058272 0,00283135 Fila 7 2 3,246252312 1,623126156 0,00021393 Fila 8 2 3,136403448 1,568201724 0 Fila 9 2 3,203848464 1,601924232 0,00023586 Fila 10 2 3,136086097 1,568043049 0,00027568 ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de los Valor crítico F Probabilidad variaciones cuadrados libertad cuadrados para F Entre grupos 0,013184202 9 0,001464911 0,48000145 0,857775864 3,020382947 Dentro de los grupos 0,030518894 10 0,003051889 Total 0,043703096 19 Ss= 0,028168937 Ss/sigma= 0,06 < 0.3

Material de Referencia: Controles de calidad II Homogeneidad ESTUDIO DE MATERIAL DE REFERENCIA Ejemplo 2: Test T Lote PEC08027 E. coli ESTUDIO HOMOGENEIDAD PASTILLAS (08/02/07) Lote PEC08027 Microorganismo: Escherichia coli (UFC/1 ml) Dilución: Cápsula Réplica 1 Réplica 2 1 10 13 2 9 13 Media 12,1 3 15 13 Nº cápsulas 10 4 17 15 5 12 14 Limites 6 17 13 T-1 (97.5%) T-1(2.5%) 7 6 10 T-1: 8,74 3,25 20,48 8 9 15 T-1/I(J-1): 0,79 9 8 8 T-2 (5%) 10 17 7 T-2: 10,49 16,92 T-2/(I-1): 1,17 Media geométrica 11,5 St. dev. (log) 0,104 RESULTADO: T-1 T-2 HOMOGENEO HOMOGENEO

Material de Referencia: Controles de calidad II Ejemplo 2: ANOVA, Homogeneidad Lote PEC08027 E. coli Análisis de varianza de un factor RESUMEN Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza Fila 1 2 2,11394335 1,05697168 0,00649154 Fila 2 2 2,06818586 1,03409293 0,01275218 Fila 3 2 2,29003461 1,14501731 0,00193118 Fila 4 2 2,40654018 1,20327009 0,00147738 Fila 5 2 2,22530928 1,11265464 0,00224094 Fila 6 2 2,34439227 1,17219614 0,00678677 Fila 7 2 1,77815125 0,88907563 0,02460843 Fila 8 2 2,13033377 1,06516688 0,02460843 Fila 9 2 1,80617997 0,90308999 0 Fila 10 2 2,07554696 1,03777348 0,07424765 ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F Entre grupos 0,19622884 9 0,0218032 1,40534808 0,300849328 3,02038295 Dentro de los grupos 0,15514451 10 0,01551445 Total 0,35137335 19 Ss= 0,05607474 Ss/sigma= 0,21 < 0.3

Material de Referencia: Controles de calidad II Homogeneidad Ejemplo 3: Test T Lote PLPQ28036 L. pneumophila Q-PCR Estudios de Homogeneidad (04/08/02) Lote PLPQ28036 Microorganismo: Legionella pneumophila (ct/7.1 ul) Pastilla Replica 1 Replica 2 1 39,07 37,84 2 36,1 37,23 Media 37,2 3 36,67 36,58 Nº Pastillas 10 4 35,74 37,71 5 39,92 36,51 Limites 6 36,06 38 T-1 (97.5%) T-1(2.5%) 7 36,48 38,02 T-1: 0,39 3,25 20,48 8 37,42 37,76 T-1/I(J-1): 0,04 9 36,73 38,84 T-2 (5%) 10 36,28 35,94 T-2: 0,28 16,92 T-2/(I-1): 0,03 Media geométrica 37,2 St. dev. (log) 0,009 Resultados: T-1 T-2 HOMOGENEO HOMOGENEO

Material de Referencia: Controles de calidad III 4. Estabilidad Dos pastillas por triplicado durante X días Estudios previos: Temperatura de conservación: ambiente, 4ºC y 18ºC. Estabilidad medio plazo: Período de tiempo de 15-20 días Estabilidad largo plazo: 9 meses Estudiado tanto por cultivo como por Q-PCR (L. pneumophila) Estudios estadísticos (ISO 13528): /X-Y/ < 0.4 σ (X:media homogeneidad; Y:media cada día estudiado; σ:desviación estándar diana) L.pneumophila: Análisis de varianza (p-valor>0.05) Gráficas de evolución temporal

Material de Referencia: Controles de calidad III 4. Estabilidad Temperatura de conservación Escherichia coli ESTABILIDAD LOTE PEC160 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 Conservar a 18ºC E.coli Tª amb. E.coli Nevera E. coli Congelador 0.5 0 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112 119 126 133 140 147 154 161 168 175 DIAS

Material de Referencia: Controles de calidad III 4. Estabilidad Estabilidad a corto plazo 6,0 ESTABILIDAD LOTE PCF25115 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 0 5 10 15 DIAS Citrobact er f. Lineal (Citrobac ter f.) y = 0,0045x + 5,1686 Citrobacter freundii 0,1600 0,1400 0,1200 0,1000 0,0800 0,0600 0,0400 0,0200 0,0000 ESTABILIDAD DIANA PCF25115 0 4 7 11 15 /X-Y/ 0,4xSs

Material de Referencia: Controles de calidad III 4. Estabilidad Estabilidad a largo plazo Enterococcus faecium ESTABILIDAD LOTE 160 PEF28084 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Caducidad 6 meses E.faecium Lineal (E.faecium) 0,0 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112 119 126 133 140 147 154 161 168 175 DIAS y = -0,0002x + 2,9436

Material de Referencia: Controles de calidad III 4. Estabilidad Estabilidad a largo plazo Legionella pneumophila Lote PLP18065 Means and 95,0 Percent LSD Intervals 1,8 RESULTADOS 1,7 1,6 1,5 1,4 0 7 14 21 28 38 42 49 57 63 70 77 84 DIAS p-valor=0,5898 DIAS 0 7 14 21 28 38 42 49 57 63 70 77 84 Box-and-Whisker Plot 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 RESULTADOS

Estudios de certificación I Condiciones: - 7 laboratorios acreditados por ENAC - 2 pastillas por triplicado - mismas condiciones de ensayo Microorganismo Medio cultivo Tiempo/ Temperatura incubación Escherichia coli Tergitol-7 agar 24 h a 37ºC Citrobacter freundii Tergitol-7 agar 24 h a 37ºC Enterococcus faecium Slanetz-Bartley agar 48 h a 37ºC Clostridium perfringens TSC agar 24 h a 44ºC (Anaerobiosis) Legionella pneumophila BCYE-α 4 días a 37ºC Staphylococcus aureus Chapman manitol 48 h a 37ºC Pseudomonas aeruginosa Agar Cetrimida 48 h a 37ºC

Estudios de certificación II BOLETÍN DE RESULTADOS (*) Resultados: - fecha envío resultados - boletín de resultados - tratamiento estadístico (Guía ISO 35: Certification of reference materials. General and statistical principles) Diferencias entre pastillas? Diferencias entre réplicas? Diferencias entre laboratorios? LABORATORIO: MICROORGANISMO: LOTE: PASTILLA 1 2 RESULTADOS MEDIO ESPECÍFICO RESULTADOS MEDIO GENERAL (en su caso) PASTILLA 1 2 UNIDADES UNIDADES RÉPLICA R1 R2 R3 RÉPLICA R1 R2 R3 NOTA: En caso de que los resultados correspondan a una dilución, indicar a cual corresponde. OBSERVACIONES: (*)Realizar tantas copias de este boletín como lotes se hayan analizado

Estudios de certificación III Enterococcus faecium PEF01028 (19/02/2008) Slanetz Bartley (ufc/pastilla) Pastilla 1 Pastilla 2 R1 R2 R3 R1 R2 R3 Lab 1 1400 1600 2800 2000 3000 2600 Lab 2 1980 1800 1740 1760 1940 1800 Lab 3 1220 1740 1580 2140 1560 1800 Lab 4 2200 2000 1600 2600 1400 1400 Lab 5 2000 1800 1600 2000 1600 2000 Lab 6 1600 1200 2000 2800 2600 2000 Lab 7 1620 1880 1760 2080 2200 1960 AMC Robust Statistics V1.0 Calcular la estadística robusta para obtener H15 mean y H15 Std Dev!!! ROBUST STATISTICS SUMMARY Estimate Estimate value Parameters Median 3,263512308 A15 mean 3,268905864 c=1.5: Convcrit=0.001 H15 mean 3,271059179 c=1.5: Convcrit=0.001 MAD 0,016808962 MADe 0,024920982 smad 0,024920982 H15 Std Dev 0,029790253 c=1.5: Convcrit=0.001 Asignar valor de n (Nº de laboratorios)!!! TOTAL media robusta 3,271 desviación estandard 0,030 X S 3,3318 0,1364 3,2635 0,0231 3,2174 0,0811 3,2591 0,1109 3,2611 0,0476 3,2912 0,1359 3,2803 0,0483 Incertidumbre=s/raiz n 0,011 Intervalo confianza(i)=t*s/raiz n 0,02755238 % 0,344 3,244 Intervalo (media-i; media+i) 3,299 VALORES CERTIFICADO Valor medio/pastilla 1,87E+03 Incertidumbre (%) 0,34 1,75E+03 Intervalo confianza 1,99E+03 Asignar valor de t en la tabla, para (n-1)!!!

Certificados de análisis: Cuantitativos BACuanti Guía Caducidad ISO 31: Contenido 6 mesesde Certificados de Materiales de Referencia Descripción Código: L060046 Microorganismo: Citrobacter freundii V318 precedente de NCTC 6272, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleada Lote: PCF05028 Fecha de preparación: 05/02/08 Fecha de caducidad: 05/08/08 Valor medio por pastilla, en las condiciones de análisis indicadas Resultados Porcentaje Conservar del lote a analizado: 18ºC 10% Valor medio por pastilla: 2.06x10 3 ufc Incertidumbre: + 1.82% Intervalo de confianza 95%: 1.46x10 3 2.89x10 3 ufc

Certificados de análisis: Cuantitativos BAControl Guía Caducidad ISO 31: Contenido 6 mesesde Certificados de Materiales de Referencia Descripción Código: L060046 Microorganismo: Citrobacter freundii V318 precedente de NCTC 6272, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleada Lote: PCF07028 Fecha de preparación: 07/02/08 Fecha de caducidad: 07/11/08 Resultados Valor por pastilla, en las condiciones de ensayo del fabricante Conservar a 18ºC Valor por pastilla obtenido por el fabricante: 8.87x10 3 ufc

Certificados de análisis: Cualitativos BACuali Descripción Código: Caducidad L060031 9 meses Microorganismo: Citrobacter freundii V318 precedente de NCTC 6272, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleada Lote: PCF25117 Fecha de preparación: 25/11/07 Fecha de caducidad: 25/08/08 Certificación de la identidad de la cepa suministrada Conservar a 18ºC Control de calidad Contaminación: Correcto Homogeneidad: Homogéneo Estabilidad: Estable

Certificados de análisis: Cuantitativos para PCR BACuanti- PCR Caducidad 12 meses Descripción Código: L060047 Microorganismo: Legionella pneumophila L2949 precedente de ATCC 33152, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleada Valor Lote: PLPQ21018 medio por pastilla, en las Fecha de preparación: 21/01/08 condiciones de análisis indicadas Fecha de caducidad: 21/01/09 Resultados Porcentaje del lote analizado: 10% Valor medio por pastilla: 3.15x10 8 células Incertidumbre: + 0.98% Intervalo de confianza 95%: 1.84x10 8 5.37x10 8 células Conservar a temperatura ambiente

Certificados de análisis: Cuantitativos para PCR BACuanti- DNA Descripción Código: L060024 Microorganismo: Caducidad Legionella 6 meses pneumophila L2949 precedente de ATCC 33152, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleada Lote: LN31018 Fecha de preparación: 17/01/08 Fecha de caducidad: 17/07/08 Valor medio por vial, en las condiciones de análisis indicadas Resultados Porcentaje del lote analizado: 10% Valor medio por pastilla: 12 µg (2.8x10 9 unidades genómicas) Incertidumbre: + 2.6% Intervalo de confianza 95%: 11.32-12.70 µg/vial Conservar a temperatura ambiente

Material de Referencia: Guía rápida de utilización (BACuanti/BACuali) Recepción del material Conservar a -18ºC Rasgar la bolsa de aluminio Extraer el dispositivo Extraer el dispositivo Romper precinto seguridad Girar siguiendo flecha Liberar la pastilla en 20 ml Incubar 10 min. Suspensión bacteriana Tratar como una muestra Comparar con el valor certificado

Material de Referencia: Guía rápida de utilización (BAControl) Recepción del material Conservar a -18ºC Extraer el vial Romper precinto seguridad Adicionar 20 ml Incubar 10 min. Tratar como una muestra

Materiales de referencia disponibles BACuanti Escherichia coli Citrobacter freundii Entrococcus faecium Clostridium perfringens Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Legionella pneumophila BAControl Material cuantitativo Cada pastilla contiene un número determinado de células viables y cultivables Útil para la validación de métodos y controles de calidad cuantitativos Disponibilidad de rango bajo (<2log) y rango alto (>2log) Material cuantitativo Cada pastilla contiene un número determinado de células viables y cultivables Útil para el control de calidad rutinario (controles de proceso, gráficos de control, control de calidad de medios de cultivo, etc.) Disponibilidad de rango bajo (<2log) y rango alto (>2log)

Materiales de referencia disponibles BACuali Escherichia coli Citrobacter freundii Entrococcus faecium Clostridium perfringens Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Legionella pneumophila Salmonella enterica subsp. enterica Material cualitativo Se certifica la identidad de la cepa suministrada Útil para la validación de métodos y controles de calidad cualitativos

Materiales de referencia disponibles BACuanti- PCR BACuanti- DNA Legionella pneumophila Material cuantitativo Cada pastilla contiene un número determinado de células inactivadas Útil para la validación de métodos moleculares y control de calidad del proceso analítico completo DNA liofilizado de Legionella pneumophila Material cuantitativo Cada vial contiene un número determinado de unidades genómicas Útil para la validación de métodos moleculares y control de calidad de la fase de amplificación por PCR

Materiales de Referencia: Ventajas SENCILLEZ: la preparación del material es extremadamente simple, gracias al formato en pastilla que se suministra en un vial o en un dispositivo plástico estéril de muy fácil uso, que evita manipulaciones engorrosas RAPIDEZ: el tiempo de reconstitución se reduce a 10 minutos SEGURIDAD: al reducirse las manipulaciones al mínimo, se reduce el riesgo de contaminación TRAZABILIDAD: las cepas empleadas son trazables a diferentes Colecciones de Cultivos tipo CALIDAD: el material va acompañado de una Guía Rápida de Uso y el correspondiente Certificado de Análisis FLEXIBILIDAD: el material está disponible en dos rangos de concentraciones, baja (<2 log.) y alta (>2 log.) SERVICIO: además de las especies disponibles en stock, se ofrece la posibilidad de preparar material de referencia a una concentración predefinida por el cliente

Material liofilizado clásico 1. Ampolla conteniendo material liofilizado 2. Rotura de la ampolla con diamante 3. Rehidratación en medio líquido apropiado 4. Extensión en medio sólido apropiado 5. Crecimiento y preparación de cepas de reserva 1. Preparación suspensión bacteriana 2. Preparación de diluciones seriadas 3. Incubación y recuento del título TIEMPO: 24-48 h TIEMPO: 24-48 h

Material de referencia: BACuanti BACuali - BAControl 1. Sacar del congelador 2. Abrir el sobre de aluminio/extraer el vial de la caja 3. Abrir el dispositivo de dispensación/desprecintar el vial 4. Servir una pastilla/adicionar el agua 5. Incubar a Tª ambiente 10 min. 6. Material preparado TIEMPO: 15 min

TIEMPO: 48-96 h TIEMPO: 15 min

Uso de los materiales de referencia junto con los kits de qpcr www.ielab.es

Kits de diagnóstico molecular KITS PARA CADA UNA DE LAS FASES DEL PROCESO CONCENTRACIÓN DE MUESTRAS DE AGUA EXTRACCIÓN & PURIFICACION DE DNA -Kit aguas limpias -Kit aguas sucias ANALISIS POR PCR - Confirmación bacteriológica por PCR - Detección cualitativa de Legionella - Detección cuantitativa de Legionella

Kits de diagnóstico molecular KITS PARA CADA FASE DEL PROCESO 1. KIT DE CONCENTRACIÓN DE MUESTRAS DE AGUA 2. KIT EXTRACCIÓN & PURIFICACIÓN DE DNA - Membranas de filtración - Tubos de recogida - Tubos de concentración AGUA LIMPIA AGUA SUCIA

Kits de diagnóstico molecular KITS PARA CADA FASE DEL PROCESO 3. ANALISIS POR PCR 3.1. Confirmación bacteriológica por PCR (confirmación simultánea de hasta 10 especies) 3.3. Kit de detección cuantitativa de Legionella spp. y L. pneumophila CONTROLES POSITIVO & NEGATIVO CONTROL INTERNO POSITIVO 3.2. Kit de detección cualitativa de Legionella spp. y L. pneumophila

Kits de diagnóstico molecular KITS DE DETECCIÓN CUALITATIVA DE Legionella spp. y L. pneumophila Analysis Description conditions Method: Code: amplification I060002 by PCR and electroforesis in agarose Specificity: gel analysis Legionella pneumophila Thermocycler: Batch: CLN11068 GeneAmp PCR System9700, Applied Manufacturing Biosystems date: 11/June/2008 Quality Amplification Expiry controls date: program: 11/Dec/2008 Denaturation at 95ºC 4 Positive min, Number 35 cycles control of tests: of amplification: 95ºC 70 30 s., 58ºC right 30 s., 72ºC 1 Negative min. and final control extesion amplification: at 72ºC 10 right min. Internal positive control amplification: right

Kits de diagnóstico molecular KITS DE DETECCIÓN CUANTITATIVA DE Legionella spp. y L. pneumophila Analysis Used fungible material Description conditions Method: TaqMan Environmental Master Mix, Internal Code: amplification positive ED000864 by real time PCR Thermocycler: control (plamidic DNA), primers, probe Specificity: 7500 Legionella Real-Time spp. PCR System, Applied Quality and Legionella controls spp. ATCC 33152 DNA as Positive Batch: Biosystems positive QLS030909 Amplification control amplification: right Negative Manufacturing program: control date: 50ºC amplification: 08/June/2009 2 min, 95ºC 10 min. right Internal Expiry and 42 positive date: cycles 08/March/2010 of 95ºC 15 s. and 60ºC 1 min. control amplification: right Number of tests: 70

Ejemplo de aplicación: Legionella pneumophila Control de proceso en qpcr RM Dispensar la pastilla en un tubo con 4 ml de agua estéril Incubar durante 10 min a Tª ambiente Preparación de la muestra de trabajo cuantitativa Analizar como una muestra de rutina Analisis por qpcr Extracción/Purificación de DNA Elución Concentración

Ejemplo de aplicación: Legionella pneumophila Control de proceso en qpcr El Control de Calidad Interno permite establecer la Tasa de Recuparación del proceso completo de PCR (concentración de muestra, extracción/ purificación de DNA, etc.) El uso de RM ayuda en la Validación de métodos PCR methods, porque facilita la preparación de muestras cuantitativas y la determinación de la Exactitud y Precisión del método. Análisis directo (1.49x10 5 células/pastilla) Proceso completo (6.72x10 4 células/pastilla)

Ejemplo de aplicación: Legionella pneumophila Rectas de calibrado Curva de calibrado Ct=-3,028 log[dna] +39,6148 Ct 50 40 R²= 0,94743 r= -0,9733 0 Certificación Multisector 30 20 10 STANDARD CURVA ESTANDAR CURVE 0 2 4 6 8 10 Log Nº copies

Ejemplo de aplicación: Legionella pneumophila BACuanti-PCR Routine qpcr control RM Dispensar la pastilla en un tubo con 4 ml de agua estéril Incubar durante 10 min a Tª ambiente Preparación de la muestra de trabajo cuantitativa Analizar como una muestra de rutina Concentratción Analysis por qpcr Extración/purificación de DNA Elución BACuanti-DNA

Conclusiones PTs, Materiales de Referencia y Kits qpcr: 1. Facilitan la aplicación de métodos normalizados y validados. 2. Ahorra tiempo de implementación. 3. Ofrecen un sistema rápido y fácil de implementar sistemas intenos y externos de control de la calidad.

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