N 1 Junio 2011 Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L. Necochea 3274 Rosario Método Directo para determinar Hemoglobina A1c Inmunoturbidimetría exaltada por látex GT Lab ha introducido un sistema de detección directa de la hemoglobina A1c (HbA1c) que permite realizar la medición sin necesidad de determinar la hemoglobina total, consecuentemente empleando un solo canal en los analizadores automáticos. El método emplea anticuerpos monoclonales y una exaltación de la respuesta inducida por partículas de látex. La primer etapa de la reacción se basa en la unión inespecífica de las proteínas a las partículas de látex. En la segunda fase de la reacción actúan anticuerpos anti humanos altamente específicos que permiten la determinación directa de la HbA1c por turbidimetría. Los reactivos son presentados en forma líquida estables, los que pueden emplearse en analizadores capaces de usar dos reactivos por método. Si bien se proveen cuatro calibradores para cubrir todo el rango útil de la determinación, la notable linealidad del método permite trabajar rutinariamente con dos. Algunos analizadores permiten la realización totalmente automatizada de la determinación sin siquiera necesitar el paso de hemólisis.
INTRODUCCIÓN La HbA1c se forma por conjugación no enzimática de la glucosa al terminal N de la cadena beta de la hemoglobina durante la vida de los eritrocitos, reflejando la concentración media de glucosa en ese período, sirviendo como control en individuos diabéticos. La glucohemoglobina ha sido definida como la fracción rápida que eluye primero en columnas cromatográficas, fracción que incluye HbA1a, HbA1b y HbA1c. El presente método emplea una reacción inmunológica que determina directamente la HbA1c. Hasta la publicación del Estudio de Cuidado y complicaciones de la Diabetes (DCCT por su nombre en inglés: Diabetes Care and Complications Trial) en EEUU en 1993, la idea de un mejor control de la glicemia fue solamente una teoría. Este estudio comparó pacientes que tenían una terapia intensa con los que recibían un cuidado convencional de su diabetes tipo 1. El estudio determinó que aquellos mantenían un nivel menor de glicemia y niveles significativamente menores de HbA1c. Luego, estos pacientes demostraron tener valores de morbilidad y mortalidad mejores que los que habían recibido cuidados convencionales, reduciendo los niveles de retinopatías, nefropatías y neuropatías entre un 40 y un 75%. Así, los niveles de HbA1c fueron establecidos como un indicador crítico del control de glicemia en el largo plazo en pacientes con diabetes Tipo 1. A posteriori de la publicación de la DCCT, el Programa Nacional de Estandarización de la Glucohemoglobina de los EEUU (NGSP por su nombre en inglés: National Glycohemoglobin Standardization Program) estableció los intentos por estandarizar los resultados obtenidos por los diferentes métodos disponibles, refiriéndolos al empleado por el DCCT. Esto produjo una exitosa disminución en el bias entre métodos. Recientemente, la International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) desarrolló y aprobó el método de referencia para la determinación de HbA1c. Se ha notado una diferencia entre los métodos de la IFCC y de la DCCT. Actualmente, la IFCC y el DCCT están trabajando en conjunto para proveer al los médicos y a los fabricantes de reactivos con recomendaciones actualizadas sobre la determinación PRINCIPIO Nuestro método emplea una reacción antígena anticuerpos para determinar directamente el porcentaje de HbA1c en sangre humana. Tanto la hemoglobina total como la HbA1c tienen la misma tasa de absorción sobre partículas de látex, lo que da sustento a la primera reacción, producida al poner en contacto la muestra con 2 el reactivo R1. Al agregar el reactivo R2, que contiene anticuerpo monoclonal anti HbA1c de ratón, se forma un complejo látex-hba1c-anticuerpo que es aglutinado por un anticuerpo de cabra anti-ratón, también contenido en R2. Resulta así el desarrollo de turbidez que es proporcional a la concentración de HbA1c en la muestra, la que puede cuantificarse por comparación con los resultados obtenidos con una curva de calibración. El anticuerpo anti- HbA1c empleado está dirigido específicamente al residuo 2-deoxifructosa-valina de la HbA1c, epitope Fruc-VHLTPEK. COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS PROVISTOS Lisante: azida de sodio 7 mmol/l. Listo para usar. R1: suspensión de partículas de látex 0.13%. R2a: buffer de glicina 80 mmol/l, ph 7.3. R2b: solución de anticuerpo monoclonal de ratón contra HbA1c y anticuerpo policlonal de cabra anti IgG de ratón en buffer glicina 20 mmol/l, ph 7.1. HbA1c Calibradores y Controles (provistos separadamente por GT Lab): Sangre humana liofilizada con concentración indicada en los rótulos del envase. PREPARACION DE LOS REACTIVOS DE TRA- BAJO R2T: este paso es crítico para el correcto funcionamiento del reactivo. Trasvase una pequeña porción de R2a (aproximadamente 1-1.5 ml) al envase de R2b, cierre nuevamente el envase y mezcle por inversión suavemente. Vuelque todo el contenido del frasco de R2b dentro del R2a, empleando pequeñas porciones de la mezcla R2T resultante para arrastrar restos que pudieran quedar en el frasco R2b. Calibradores: agregue 0.5 ml de agua destilada o deionizada CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Kit de HbA1c: Conserve refrigerado (2-8ºC) sin congelar. La estabilidad alcanza la fecha de vencimiento indicada en la caja. R2T: 30 días refrigerado (2-8ºC). Calibradores: 30 días refrigerado (2-8ºC) o 6 mese congelado (-20ºC). 1. MUESTRA Sangre. No es necesaria preparación alguna del paciente ni estar en ayunas. Obtenga la muestra de la manera
usual empleando EDTA como anticoagulante. Homogeneice la muestra por inversión suave antes de ensayar. Nota: Algunos analizadores de química pueden ser programados para realizar el paso de la hemólisis en el instrumento mismo, proveyendo una alternativa de trabajo totalmente automatizada. El ejemplo aplicado a Hitachi puede verse al final de la presentación. VALORES DE REFERENCIA Pacientes no diabéticos: <6% Pacientes diabéticos controlados: <7% Cada laboratorio debe establecer su propio rango de valores normales. EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DE HBA1C DI- RECTO PLUS Estudio de comparación Se realizó un estudio comparando los resultados obtenidos con el presente método y un método comercial basado en HPLC. Se emplearon 30 muestras suministradas por un laboratorio que efectúa la determinación, con un rango de valores de 4.7-11.8%. El método HbA1c Directo Plus fue realizado en un Olympus AU400, empleado sangre entera como muestra y lisando directamente en el instrumento. Se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.992 y una ecuación de regresión y = 0.86 x + 0.32. Los resultados se muestran en la TABLA I y están graficados en el GRAFICO I. Otro experimento se hizo sobre 24 muestras en un Hitachi 717 a los efectos de comparar la hemólisis efectuada en el aparato y como pretratamiento. Se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.985 y una ecuación de regresión y = 0.98 x + 0.34 en un rango de valores de 4.4-10.4% (Tabla II y Gráfico II). ESTUDIOS DE PRECISIÓN La precisión del método GT Lab se evaluó empleando los Controles de como muestra y de acuerdo a la modificación del protocolo EP5-T2 del National Clinical Controls and Laboratory Standards (NCCLS). La evaluación de precisión en el día se realizó corriendo dos muestras en duplicado 20 veces en el mismo día. La evaluación día a día se efectuó procesando dos muestras durante 20 días. Las determinaciones se efectuaron en un Hitachi 917 con hemólisis en el aparato. Los resultados obtenidos son los que se muestran seguidamente. En el día (n=20) Media 4.66 10.4 D.S. 0.06 0.13 C.V.% 1.29 1.25 Día a Día (n=20) Media 4.69 9.52 D.S. 0.18 0.20 C.V. % 3.84 2.10 Los datos a partir de los cuales se obtuvieron estos valores figuran en las tablas III y IV. ESTUDIOS DE INTERFERENCIAS Se estudió la interferencia por ácido ascórbico, bilirrubina, triglicéridos, hemoglobina acetilada y hemoglobina carbamilada, mediante una modificación del protocolo EP7-P del NCCLS. No se observaron interferencias por bilirrubina hasta 50 mg/dl, ácido ascórbico hasta 50 mg/dl, triglicéridos hasta 2000 mg/dl, hemoglobina carbamilada hasta 7.5 mmol/l y hemoglobina acetilada hasta 5.0 mmol/l. Los datos se muestran en la TABLA V. ESTUDIO DE VARIANTES DE HEMOGLOBINA Las variantes de hemoglobina A2, C y S no mostraron interferencias en el uso de. Los estudios con Hemoglobinas F y E no han mostrado aun resultados suficientes para sacar conclusiones. Los datos obtenidos se muestran en las tablas V, VI y VI y en los gráficos III, IV y VII respectivamente. ESTUDIO DE LINEALIDAD El rango útil de linealidad de se estableció a partir de una muestra comercial preparada para dar 25% HbA1c por HPLC, provista por Sandare Chemical of DeSoto, Texas.) El estudio arrojó un rango de uso de 2-16%. Los resultados se muestran en la TABLA IX. ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS, CALIBRA- DORES Y CONTROLES La vida útil de los reactivos, medida en tiempo real, demostró ser de 18 meses en refrigeración. Del mismo modo, los Calibradores y Controles demostraron una estabilidad de 24 meses refrigerados. ESTABILIDAD DE CALIBRACIÓN DEL INSTRU- MENTO La estabilidad de la calibración depende del instrumento, ya que es función de sus características específicas. Por ejemplo, el Beckman Coulter Cx tiene un sistema de medida basado en dos puntos de lectura. Estos sistemas tienen una estabilidad de calibración de 7 a 10 días. 3
Los analizadores Hitachi, por su parte, toman solamente un punto de lectura al final de la reacción. Esto les da una estabilidad de calibración de 21 a 28días. ADAPTACIONES A INSTRUMENTOS AUTO- MÁTICOS Están disponibles adaptaciones para los siguientes analizadores: Abbott Aeroset Abbott Alcyon ATAC 8000 Beckman Coulter Cx Beckman Coulter Lx Dade Dimension Cobas Mira, Mira Plus Express 550 Hitachi 704, 717, 902, 911, 912, 914, 917 Pointe 180 Olympus AU400, 600, 640, 800 RA 500/1000/XT Selectra E Targa 3000 Tokyo Bokei Prestige 24i ADAPTACIÓN A HITACHI 917 ANALYZE TEST NAME [HbA1c ] ASSAY/ POINT [1-POINT ] [10 ] [34 ] [0 ] [0 ] [0 ] WAVE (SUB/MAIN) [none ] [660 ] S. VOL. (NORMAL) [4.0 ] [4.0 ] [200] S. VOL. (DECREASE) [4.0 ] [4.0 ] [200] S. VOL. (INCREASE) [4.0 ] [4.0 ] [200] DILUENT [DW ] [99 ] REAGENT VOL (R1) [150 ] [0 ] [0 ] [0 ] REAGENT VOL (R2) [0 ] [0 ] [0 ] [0 ] REAGENT VOL (R3) [50 ] [0 ] [0 ] [0 ] REAGENT VOL (R4) [0 ] [0 ] [0 ] [0 ] ABS. LIMIT [25000 ] [0 ] [INCREASE ] TWIN: [ ] PROZONE LIMIT: [-32000 ] [0 ] [LOWER ] CELL DETERGENT [Detergent ] 4
CALIBRATION CALIB TYPE [SPLINE ] [ ] POINT [5 ] SPAN POINTE [5 ] WEIGHT [0 ] AUTO TIME OUTN Auto change BLANK [0 ] CHANGE LOT: [0 ] SPAN [0 ] CHANGE BOTTLE: [ ] 2 POINT [0 ] FULL [0 ] SD LIMIT [999 ] DUPLICATE: [99] [32000 ] SENSITIVITY [-99999] [99999 ] S1ABS RANGE: [-32000 ] [32000 ] RANGE TEST CODE [* ] UNITS : [% ] DATA MODE : [ON BOARD ] CONTROL INTERVAL [ ] INST. FACTOR: [(Y=aX=b) : a=[1.0] b = [0.0] ] PANIC VALUE [-99999 ] [99999 ] STANDARD CONCENTRATION *USER DEFINED STANDARD SOLUTION CONC [0.0 ] [* ] [* ] [* ] [* ] [ ] POSITION [* ] [* ] [* ] [* ] [* ] [] SAMPLE : [4.0 ] [4.0 ] [4.0] [4.0 ] [4.0 ] [ ] PRE-DILUENT VOLUME [4.0 ] [4.0 ] [4.0 ] [4.0 ] [4.0 ] [0.0 ] DILUENT [200 ] [200 ] [200 ] [200 ] [200 ] [0.0 ] CALIB CODE: [0.0 ] [0.0 ] [0.0 ] [0.0 ] [0.0 ] [ 0.0] * Definido por el usuario. Se recomienta procesar 2 niveles de Control por día. Para obtener una performance óptima, se recomienda lavar las cubetas después del ensayo. Use la pantalla principal para agregar un lavado de celda emplando la aguja R1 en la posición Wash 3 (1D3) 5
GRAFICO I y = 0.32138 + 0.86426x R= 0.99236 11 10 9 8 7 6 5 4 4 5 6 7 8 9 10 11 12 HPLC Comercial 6
TABLA I HPLC HbA1c Comercial Directo Plus 4.7 4.3 4.8 4.3 5.1 4.6 5.4 4.9 5.5 4.8 5.6 5.2 HPLC comercial 6.1 5.7 Mínimo 4.7000 4.3000 6.1 5.7 Máximo 11.800 10.300 6.2 5.6 Suma 230.90 209.20 6.5 6.0 Puntos 30.000 30.000 6.9 6.5 Mromedio 7.6967 6.9733 6.9 6.3 Mediana 7.9500 7.1000 7.1 6.4 RMS 7.9157 7.1569 7.3 7.0 Desvío Std 1.8807 1.6379 7.9 7.0 Variancia 3.5369 2.6827 8.0 7.2 Error Std 0.3433 0.29904 8.2 7.5 Oblicuidad 0.20291 0.058048 8.4 7.9 Kurtosis 0.93135 0.62994 8.4 7.8 Kurtosis -0.74823-0.80780 8.5 7.6 8.5 7.8 8.7 7.9 8.9 7.9 9.2 8.4 9.2 8.2 9.7 8.9 9.9 8.3 10.6 9.8 10.8 9.4 11.8 10.3 7
GRAFICO II y = 0.3375 + 0.98279x R= 0.98499 11 10 9 Hemólisis en el instrumento 8 7 6 5 4 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hemólisis fuera del instrumento 8
Hemólisis Dentro Fuera 4.6000 4.8000 TABLA II 10.100 9.9000 6.0000 6.5000 6.2000 6.8000 4.4000 4.8000 Hemólisis 7.1000 7.5000 Dentro Fuera 5.1000 6.1000 Mínimo 4.4000 4.8000 7.3000 7.8000 Máximo 10.400 10.600 10.200 10.500 Suma 151.10 156.60 5.1000 5.3000 Puntos 24.000 24.000 7.6000 7.6000 Promedio 6.2958 6.5250 5.4000 5.5000 Mediana 5.7000 5.9000 10.400 10.600 RMS 6.5183 6.7389 5.3000 5.3000 Desvío Std 1.7246 1.7208 5.2000 5.3000 Variancia 2.9743 2.9611 5.6000 5.6000 Error Std. 0.35204 0.35125 6.2000 7.0000 Oblicuidad 1.4057 1.2642 5.1000 5.4000 Kurtosis 0.93135 0.62994 4.9000 4.8000 5.1000 5.2000 6.5000 6.5000 5.8000 5.7000 6.3000 6.6000 5.6000 5.5000 9
TABLA III Precisión intra día NIVEL I NIVEL II 4.6900 10.400 4.8000 10.400 4.7000 10.400 4.6000 10.500 4.7000 10.500 4.6000 10.100 4.7000 10.600 4.6000 10.300 4.6000 10.400 4.7000 10.600 4.6000 10.600 4.7000 10.400 4.7000 10.500 4.7000 10.300 4.7000 10.500 4.6000 10.400 4.6000 10.400 4.7000 10.600 4.6000 10.300 4.6000 10.600 Mínimo 4.6000 10.100 Máximo 4.8000 10.600 Suma 93.190 208.80 Puntos 20.000 20.000 Promedio 4.6595 10.440 Mediana 4.6950 10.400 RMS 4.6599 10.441 Desvío Std 0.059513 0.13139 Variancia 0.0035418 0.017263 Error Std 0.013308 0.029380 Oblicuidad 0.38528-0.63421 Kurtosis -0.67011 0.32063 10
TABLA IV Precisión inter día NIVEL I NIVEL II 4.6000 9.9000 4.7000 9.8000 4.9000 9.5000 5.0000 9.4000 5.2000 9.6000 4.6000 9.9000 4.8000 9.2000 4.5000 9.7000 4.6000 9.5000 4.6000 9.6000 4.7000 9.6000 4.7000 9.5000 4.7000 9.3000 4.6000 9.5000 4.6000 9.5000 4.5000 9.2000 4.4000 9.3000 4.6000 9.3000 4.7000 9.5000 4.7000 9.6000 Mínimo 4.4000 9.2000 Máximo 5.2000 9.9000 Suma 93.700 190.40 Puntos 20.000 20.000 Promedio 4.6850 9.5200 Mediana 4.6500 9.5000 RMS 4.6883 9.5221 Desvío Std 0.18144 0.20417 Variancia 0.032921 0.041684 Error Std 0.040572 0.045653 Oblicuidad 1.2585 0.25583 Kurtosis 1.6930-0.53627 11
TABLA V Estudio de interferencia Acido Ascórbico (mg/dl) 0 10 20 30 40 50 HbA1c (%) 9.5 9.5 9.5 9.6 9.5 9.6 Bilirrubina (mg/dl) 0 10 20 30 40 50 HbA1c (%) 9.5 9.5 9.4 9.5 9.5 9.5 Triglicéridos (mg/dl) 0 400 800 1200 1600 2000 HbA1c (%) 9.5 9.4 9.4 9.4 9.4 9.4 Hb Acetilateda (mmol/l) 0 1 2.5 5 7.5 10 HbA1c (%) 9.1 9.0 9.1 9.2 9.6 10.1 Hb Carbamilada (mmol/l) 0 1 2.5 5 7.5 10 HbA1c (%) 9.1 9.1 9.0 9.1 8.9 8.4 TABLA VI Interferencia de Hemoglobina A2 GT Lab HPLC 4.6 4.9 4.8 4.8 4.9 5 5.3 5.6 6.4 6.5 6.6 7.4 6.7 7.4 7 6.7 7.2 7.1 8.1 7.9 10.2 10.9 Estadísticas de Regresión Múltiplo R 0.977427 R cuadrado 0.955364 Intercepción 0.331388 Pendiente 0.918527 Observaciones 11 12
GRAFICO III Interferencia de HbA2 % HbA1c 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 GT Lab HPLC GRAFICO IV Interferencia de hemoglobina C % HbA1c 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 GT Lab HPLC 13
TABLA VII Interferencia de hemoglobina C GT Lab HPLC 5.6 5.4 4.9 5 4.5 4.9 4.6 4.8 Estadísticas de Regresión Múltiplo R 0.969748 R cuadrado 0.94041 Intercepción -4.30241 Pendiente 1.831325 Observaciones 4 TABLA VIII Interferencia de Hemoglobina S GT Lab HPLC 4.3 4.7 4.4 4.4 4.5 4.2 4.8 5.2 5.0 5.1 5.1 4.9 5.2 5.4 5.2 4.9 5.3 5.5 5.4 4.6 7.3 6.3 Estadísticas de Regresión Múltiplo R 0.830385 R cuadrado 0.689539 Intercepción -0.64029 Pendiente 1.151144 Observaciones 11 14
GRAFICO V Interferencia de Hemoglobina S % Hgb A1c 8 6 4 2 GT Lab HPLC 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 TABLA IX Estudio de linealidad Teórico Recuperado 1 Recuperado 2 Promedio Desv.% 25.0 18.7 18.6 18.7 74.8 21.2 18.2 18.2 18.2 85.8 17.3 17.0 16.9 17.0 98.3 13.2 13.1 13.4 13.3 100.8 9.4 9.4 9.5 9.5 101.1 8.1 8.2 8.3 8.3 101.2 7.4 7.7 7.7 7.7 104.1 6.6 6.9 6.9 6.9 104.4 6.2 6.2 6.4 6.3 101.6 5.4 Error 5.4 5.4 100.0 3.9 4.0 3.9 4.0 102.6 2.2 2.2 2.2 2.2 100.0 15