UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FAULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS MAESTRIA EN CIENCIAS EN CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Recuento de bacterias mesófilas, psicrófilas y coliformes en Salsa; Recuento de hongos y levaduras en un alimento preparado; Aislamiento y conteo de bacterias a partir de productos lácteos fermentados. ANA PAULINA FLORES GARCIA DANIA ARELY QUEZADA QUIROZ MARÍA EUGENIA ALARCÓN SÁENZ TUTULAR: Dr. IVAN SALMERÓN OCHOA Abril 2016
RESUMEN En el presente estudio se emplearon las técnicas de cuenta en placa y Miles misra. Se realizaron diluciones de 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000 y se analizaron las siguientes muestras: salsa comercial (bacterias mesófilas y psicrófilas), salsa casera y agua de grifo (coliformes), un burrito de bistec (hongos y levaduras), y productos lácteos fermentados (yogurt, chamito y yakult) para recuento de prebióticos. Se obtuvieron resultados positivos para coliformes y productos lácteos fermentados (probióticos). INTRODUCCIÓN La microbiología en los alimentos es de gran importancia para el control de calidad de industrias y establecimientos en los que se procesan y manipulan alimentos para consumo humano, ya que la presencia de microorganismos puede ocasionar la descomposición de los alimentos, de la transmisión de patógenos o toxinas, y por lo tanto, de enfermedades. El contenido microbiano de una muestra de alimento puede proporcionar información que refleja el nivel de calidad del alimento, las condiciones sanitarias bajo las cuales se elaboró y la eficacia del método para su conservación. Dependiendo de las propiedades químicas de cada alimento, éste puede ser colonizado por un determinado organismo o grupos de organismos, que aprovechan los nutrientesdisponibles. El deterioro de los alimentos es probablemente el problema económico más serio en la industria procesadora de alimentos. La mayoría de los alimentos son buenos medios de cultivo para el crecimiento de muchas clases de microorganismos, bajo condiciones favorables. Los grupos predominantes de microorganismos que se desarrollan en los alimentos incluyen bacterias y hongos (mohos y levaduras). La técnica más utilizada para determinar el contenido de microorganismos vivos en un alimento, es la cuenta en placa. Esta técnica se aplica para una gran variedad de microorganismos y su fundamento consiste en contar las colonias que se desarrollan en el medio de elección, después de cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de un solo microorganismo de la muestra en estudio (Olivas, 2004). Las bacterias con una temperatura de crecimiento óptimo entre 15 y 45C son mesófilas, y las que prefieren temperaturas por debajo de 20C son psicrófilas. Para su recuento se inoculan en agar para cuenta estándar (agar triptona-glucosa-extracto de levadura) con la técnica de vertido en placa y el número de colonias contadas constituyen una estimación de la cifra realmente presente en el alimento y refleja si el manejo sanitario ha sido el adecuado (Viramontes, 2010) El grupo coliforme está formado por los géneros: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter., bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a 35 ºC fermentan
lactosa con formación de ácido. El uso de coliformes como indicador sanitario se aplica para la detección de buenas prácticas sanitarias en el manejo y fabricación de alimentos; para la evaluación de un producto en cuanto a su calidad; la calidad sanitaria del agua y hielo, ya que el hábitat de estos es el intestino de humanos y animales. La técnica de diluciones y el recuento en placa según la Norma Oficial Mexicana 113-SSA1-1994 establece utilizar el agar rojo violeta bilis por ser un medio selectivo en el que se desarrollan bacterias Coliformes, ocasionando el vire del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitación de las sales biliares, así como la producción de gas. Las levaduras son microorganismos unicelulares que con frecuencia deterioran mayonesas, salsas, embutidos, jugos y bebidas no alcohólicas, toleran ph acido, algunas utilizan nitritos como fuente de nitrógeno afectando procesos cárnicos. Los mohos, son hongos microscópicos que se caracterizan por su estructura filamentosa con hifas que forman micelio. Los hongos hidrolizan la pectina y reblandecen las frutas y verduras, toleran elevadas concentraciones salinas, originan mal olor, alteran sabor y color en la superficie de los alimentos debido a la metabolización de los carbohidratos, proteínas y lípidos (Rodríguez, 2006). Para cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos según la norma NOM-111-SSAA1-1994 se inocula en agar papa dextrosa por la técnica de vaciado en placa. Los probióticos son microorganismos vivos que incorporados en alimentos, y al ser consumidos en cantidades adecuadas ejercen una acción benéfica sobre la salud del ser humano. Los productos lácteos son utilizados como vehículo para los microorganismos probióticos, entre los que se pueden mencionar: leches fermentadas, yogurt, y quesos. Los microorganismos estrechamente ligados a los productos lácteos son las bacterias acido lácticas que en los últimos años han despertado gran interés tanto en el sector industrial como en el científico, debido a que proveen grandes beneficios a la salud. Entre tales beneficios están: mejorar la inmunidad, reducir el nivel de colesterol en sangre, prevenir el cáncer de colon, mejorar la intolerancia a la lactosa, reducir los efectos de la diarrea, así como algunas infecciones urinarias. Para poder llevar a cabo los beneficios a la salud, la bacteria probiótica debe estar viable y disponible en altas concentraciones, con un límite >10 6 ufc/g en el producto (Hinestroza, 2008). Para el recuento de bacterias prebióticas en productos lácteos fermentados se puede utiliza la técnica de Miles mirsa, que consiste en la preparación de diluciones seriadas de una suspensión bacteriana. Las placas petri son divididas en sectores separados y se inocula cada sector con una gota de suspensión. Se incuba 18 24 h a 37 C. El número de bacterias viables se obtiene calculando la media de casa dilución en las repeticiones realizadas (Corrie, 2002).
OBJETIVOS: Determinar la calidad microbiológica de la Salsa comercial marca Oriental mediante el conteo de bacterias mesófilas y psicrófilas. Determinar la calidad microbiológica de Salsa roja casera y de agua de grifo mediante el conteo de bacterias coliformes. Determinar la calidad microbiológica de productos lácteos fermentados mediante el conteo de bacterias probióticas viables. METODOLOGIA Conteo de bacterias mesófilicas y psicrófilas - Se preparo solución fosfato para adicionar 9ml en 5 tubos de ensayo - Se esterilizo material, solución de trabajo y agar papa dextrosa en autoclave durante 15 min a temperatura de 121ºC - Se preparo una solución madre adicionando 1 ml del producto a analizar, del cual se hicieron 5 diluciones (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000) - Se agrego en cada caja petri 1 ml de cada dilución junto con agar papa dextrosa, se realizo por duplicado y paso a ser incubado a condiciones para el crecimiento de bacterias mesófilicas (35ºC por 48h) y psicrófilas (5h por 7-10 días) Conteo de coliformes totales - Se preparo solución fosfato para adicionar 9ml en 5 tubos de ensayo - Se esterilizo material, solución de trabajo y agar rojo bilis violeta en autoclave durante 15 min a temperatura de 121ºC - Se prepararon soluciones madre de agua de grifo y de salsa, se hicieron 5 diluciones (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000) - Se agrego 1 ml de las diluciones en cajas petri y se hizo por duplicado agregando el agar papa dextrosa, se incubo a condiciones para el crecimiento de coliformes a 35ºC de 24 a 48h Conteo de hongos y levaduras - Se pesaron 10g del alimento a analizar y se agrego a una bolsa de plástico estéril, se adiciono 90ml de agua peptonada y se agitó por 2 min a una velocidad media en un Stomacher - Se agrego 9ml de solución de fosfato en 5 tubos de ensayo - Se esterilizo material, solución de trabajo y agar papa dextrosa en autoclave durante 15 min a temperatura de 121ºC - Se prepararon 5 diluciones (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000) - Se agrego 1 ml de las diluciones en cajas petri y se hizo por duplicado agregando el agar papa dextrosa, se incubo a 25ºC por 4 a 5 días
Recuento de prebióticos - Se esterilizo material necesario, solución de fosfatos y agar M17 durante 15 min a temperatura 121ºC - Se prepararon diluciones de los prebióticos a analizar (yogurt, yakult y chamito) en 4 diluciones (1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000), por duplicado - Se agrego en las cajas petris preparadas con agar M17, una gota de cada dilución y se dejo secar - Para bacterias aerobias se incubo las cajas petri del control y las 4 diluciones de las diferentes bebidas con prebióticos a una temperatura de 37ºC por 18 a 24h - Para bacterias anaerobias se colocaron las cajas petri del control y las 4 diluciones de las diferentes bebidas con probióticos en un frasco, se coloco una vela para eliminar el Oxigeno presente, y se incubo a 37ºC por 18 a 24h RESULTADOS Y DISCUSIÓN Recuento de bacterias mesófilas y psicrófilas Tabla 1. Resultados de crecimiento en agar estándar para Mesófilos y Psicrófilos para la muestra de salsa comercial (Oriental). Dilución Mesófilos Psicrófilos 1:10 Negativo Negativo 1:100 Negativo Negativo 1:1000 Negativo Negativo 1:10,000 Negativo Negativo 1:100,000 Negativo Negativo Después del tiempo de incubación especificado en la norma NOM-092-SSA1-1994, se realizó el conteo de bacterias mesófilas y pscrófilas en la muestra seleccionada, donde se observó crecimiento menor a 10-1 ufc/ml, para ambos cultivos, como se muestra en la tabla 1. Este resultado refleja la inocuidad del alimento en cuanto a este tipo de bacterias, al igual de la eficiencia del método de conservación. Recuento de Coliformes totales en muestra de Salsa roja de un establecimiento (Cafetería, FCQ). Tabla 2. Recuento de Coliformes totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas por 24 2 h a 35 C, en salsa roja cacera. Dilución Salsa Roja (Número Colonias) Control Negativo 1:10 36 1:10 20 1:100 1:100,000 Negativo
Cálculos: Fórmula para Unidades Formadoras de Colonias (número total de bacterias viables por muestra): UFC = No. Colonias Inverso de la dilución ml de muestra Sustitución: No. Colonias = promedio de 36 y 20 colonias, en dilución 10-1 UFC = 28 x 10 1 = 280 UFC ml Fig. 1 Crecimiento en agar bilis violeta de la muestra de salsa roja (no comercial) en dilución 1:10. De acuerdo a la NOM-093-SSA1-1994, establece que las salsas y purés cocidos no deben exceder el límite de 50 UFC/g para coliformes totales. El resultado obtenido fue de 280 UFC/ml, lo cual es un alimento no apto para consumo, y refleja prácticas de higiene y sanidad deficientes en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos. Recuento de hongos y levaduras en un alimento preparado. Tabla3. Recuento de Coliformes totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas por 24 2 h a 35 C, en salsa roja cacera. Dilución Salsa Roja (Número Colonias) Control Negativo 1:10 Negativo 1:100 Negativo 1:1000 Negativo 1:10,000 Negativo 1:100,000 Negativo *Todas las diluciones se realizaron por duplicado Como se muestra en la tabla 3, se presentaron resultados negativos para el conteo de Hongos y Levaduras en la muestra sólida, se consideró este alimento (burrito de bistec) por sus características propicias para el desarrollo de estos microorganismos, sin embargo no se obtuvieron los resultados esperados. En el medio se observó el desarrollo de burbujas y aglomeraciones, esto debido que el tiempo que se utilizó para la preparación de los cultivos se excedió y el medio empezó a solidificar.
Recuento de bacterias viables en productos lácteos fermentados Tabla 4. Numero de colonias presentes en Caldo M17 con agar para las muestras de Yakult, Chamito y Yogurt para beber, en condiciones aerobias y anaerobias. Condiciones Aerobias Dilución Muestra 1 Muestra 2 Promedio UFC/ml Yakult 1:100,000 10 8 9 900,000 Chamito 1:100,000 4 9 7 700,000 Yogurt 1:100,000 40 46 43 4,300,000 Condiciones Anaerobias Dilución Muestra 1 Muestra 2 Promedio UFC/ml Yakult 1:10,000 92 81 87 870,000 1:100,000 16 13 15 1,500,000 Chamito 1:10,000 31 54 43 430,000 1:100,000 12 12 12 1,200,000 Yogurt 1:100,000 38 49 44 4,400,000 En todas las diluciones se observó un crecimiento abundante de bacterias viables por lo que el conteo de colonias se realizó para las diluciones de 1:10,000 y 1:100,000. En general, el Yakult presenta concentraciones apropiadas para considerarse próbiotico por presentar 900,000 UFC/ml, como se muestra en la tabla 4. A pesar de que el Chamito presentó concentraciones inferiores al Yakult, el conteo obtenido es apropiado para un producto probiótico, además es un producto diseñado para consumo infantil, lo cual podría justificar su resultado. El Yogurt presentó un recuento exagerado de UFC/ml que excede el límite de >10 6 ufc/g para considerarse probiótico. Debido a que su concentración incremento en condiciones anaerobias, se sugiere para estudios posteriores realizar un análisis morfológico para la identificación del microorganismo.
Fig. 2 Cultivos de Yakult, Chamito y yogurt por el método de la gota. CONCLUSIÓN En la mayoría de los ensayos realizados se obtuvieron resultados favorables que reflejan un manejo adecuado de los alimentos, buenas prácticas de higiene y seguridad alimentaria. Sin embargo el recuento de coliformes totales sugiere una inspección sanitaria al establecimiento con el fin de mejorar la calidad de los alimentos que en él ofrecen. Los productos lácteos fermentados comerciales son opciones elegibles como alimentos probióticos ya que el recuento de bacterias viables fue adecuado. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA Corrie, et., al. (2002). Métodos de Análisis Microbiológicos de los Alimentos. Ediciones Díaz de Santos, S.A. Madrid España. Hinestroza-Córdoba, López. (2008). Productos lácteos fermentados como vehículo para microorganismos probióticos. Universidad de las Américas. Temas Selectos de Ingeniería de Alimentos 2. P 50-57. Puebla, México. Norma oficial mexicana NOM-092-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Norma oficial Mexicana NOM-093-SSA1-1994, Bienes y servicios. Prácticas de higiene y sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos. Norma oficial mexicana NOM-111-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. Olivas; Alarcón. (2004). Manual de Prácticas de Microbiología Básica y Microbiología de Alimentos: Programa de Nutrición. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Cd. Juárez, México.
Rodríguez, et. al., (2006). Bacteriología General, Principio y prácticas de Laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica. Viramontes; Portillo. (2010). Identificación de Microorganismos: actividades prácticas para el laboratorio. Universidad Autónoma de Chihuahua. México.