Práctica #2 EL MICROSCOPIO Y LA ORGANIZACIÓN CELULAR I. - Objetivos Al final del laboratorio el estudiante debe ser capaz de: * Identificar y manejar las diferentes partes de un microscopio compuesto. * Aprender a colocar el microscopio en posición de trabajo. * Aplicarlos procedimientos para preparar materiales y observarlos en el microscopio. * Identificar estructuras celulares y sus respectivas funciones. 1 * Realizar esquemas de las estructuras celulares y rotularlos adecuadamente utilizando el aumento del microscopio. * Familiarizarse con el trabajo en el microscopio. II. Introducción Según la teoría celular, la célula es la estructura biológica más pequeña y simple que posee todas las características básicas de la vida. Todos los organismos vivos están compuestos de una o más células y toda actividad que realiza un organismo vivo está relacionada con las actividades metabólicas de las células. Así, para entender los procesos de la vida se necesita entender la estructura y la función de la célula. Las células, sin embargo, se encuentran por debajo del límite de la resolución del ojo humano, haciendo necesario la utilización de un instrumento con capacidad de amplificación visual y alta resolución. El microscopio es un instrumento diseñado para hacer posible la observación y el examen de objetos muy pequeños, los cuales no podrían ser vistos sin la ayuda de lentes amplificadores. Hay dos tipos de microscopio según la fuente utilizada para su funcionamiento: el microscopio de luz y el microscopio electrónico. Dentro de los microscopios de luz existen variaciones; los más usados y conocidos son los microscopios simples o lupa, el microscopio compuesto y el microscopio binocular estereoscopio. Podemos encontrar otros tipos de microscopios de uso mas especializado en determinados campos de la biología y otras ciencias, tales como el microscopio de contraste de fase, de fluorescencia, UV, de luz polarizada, confocal., etc.) Los microscopios que se utilizan en entornos científicos cuentan con varias mejoras que permiten un estudio integral del espécimen. El microscopio óptico común está conformado por tres sistemas: (a) sistema mecánico, constituido por una serie de piezas en las que van instaladas las lentes, y que permiten el movimiento para el enfoque, (b) sistema óptico que comprende un conjunto de lentes dispuestas de tal manera que produce el
2 aumento de las imágenes que se observan a través de ellas, y (c) sistema de iluminación que comprende las partes del microscopio que reflejan, transmiten y regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar la observación a través del microscopio. Para la formación de la imagen, el microscopio óptico de luz dispone de una distribución específica de grupos de lentes que permiten una gran amplificación. La fuente luminosa es un filamento de tungsteno cuya luz es dirigida hacia un sólo punto mediante la lente condensadora. El haz luminoso incide por debajo de la preparación que debe ser lo bastante fina como para que la luz pueda atravesarla. Al pasar por la muestra, parte de la luz es absorbida por ésta y la diferencia de absorción de la luz en diferentes partes del espécimen produce contrastes que revelan detalles de su estructura. Tras atravesar la muestra, la luz pasa a través de las lentes objetivos localizada por encima de la preparación. Existen diferentes lentes objetivos con diferentes capacidades de amplificación de la muestra y resolución de la imagen que pueden ir intercambiándose a lo largo del estudio. Finalmente, la luz pasa a través de las lentes oculares que, amplificándola aún más, hacen llegar la imagen al observador. Dado que la imagen de la muestra está ampliada muchas veces e invertida, es difícil moverla de forma manual. Por ello los soportes de los microscopios científicos de alta potencia están montados en una plataforma que se puede mover con tornillos micrométricos. Algunos microscopios cuentan con soportes giratorios. Todos los microscopios de investigación cuentan con tres o más objetivos montados en un cabezal móvil que permite variar la potencia de aumento. El tipo de microscopio más comúnmente utilizado es el llamado microscopio compuesto; con éste se obtiene una imagen bidimensional del objeto observado. Para el estudio de las células, en el presente laboratorio se usará el microscopio de luz compuesto. El microscopio monocular compuesto es utilizado con altos poderes de amplificación para hacer observaciones de objetos sumamente pequeños, los cuales tienen que estar finamente cortados y puestos sobre vidrios especiales denominados portaobjetos. Además, deben ser transparentes para que la luz pueda atravesarlos. Es frecuente también cubrir los objetos con otros vidrios especiales más pequeños que los anteriores llamados cubreobjetos. Cuando se trabaja en el laboratorio, es de gran importancia conocer el poder o grado de aumento, el poder de resolución y la distancia de trabajo. El grado de aumento es la magnificación total que sufre la imagen del objeto que está debido al efecto de los lentes oculares y objetivos. Se obtiene multiplicando el número de veces que aumenta el lente ocular por el número de veces que aumenta el lente objetivo. Si el objetivo aumenta la imagen de un objeto 40 veces, ésta al pasar por la lente ocular será nuevamente aumentada. Si el ocular aumenta 10 veces, la magnificación total en este caso será: 10X x 40X = 400X. En la misma forma se procede cuando se trabaja con otros lentes de mayor poder. Este resultado permite saber cuantas veces más grande estamos viendo la imagen de un objeto. Igualmente importante es el poder de resolución, que es la posibilidad de distinguir separados dos puntos muy cercanos entre sí. Cuanto mayor sea el poder de resolución, menor será la distancia entre dos puntos a la cual pueden distinguirse como tales. El poder de resolución de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda de la fuente luminosa y de la apertura numérica (propiedad óptica de la lente).cualquier objeto cuyo diámetro sea menor que 0.1 mm es demasiado pequeño para poder ser observado a simple vista. La mayor utilidad del microscopio es la capacidad de ampliar el poder de resolución de la vista humana para objetos cuyo diámetro es menor que 0.1mm. Por tanto, un microscopio sirve fundamentalmente para dos cosas: primero provee aumento y, segundo, permite ver detalles de objetos tan pequeños que no podrían ser vistos normalmente. De esta forma, el poder de resolución es quizá la característica más importante de un buen microscopio ya que de nada sirve una imagen muy grande del objeto, si ésta se ve borrosa y no pueden distinguirse sus detalles.
3 Finalmente, se conoce como distancia de trabajo a la distancia comprendida entre los objetos en observación y el lente frontal del objetivo. Es inversamente proporcional al aumento; es decir, cuanto mayor sea el aumento del lente objetivo menor será la distancia de trabajo. Cuando se trabaje con un lente de inmersión la distancia de trabajo será mínima. En estos casos es necesario usar aceite de inmersión entre el lente objetivo y la preparación debido a que el índice de refracción para este tipo de lente es la del aceite y no la del aire. Esto permite obtener una imagen de gran tamaño y al mismo tiempo de gran nitidez. III. Procedimiento en el laboratorio. Durante ésta sesión de laboratorio se realizarán seis ejercicios que le permitirán adquirir habilidades y destrezas necesarias para trabajar con un microscopio compuesto de luz. Para ello, cada subgrupo realizará y analizará los 6 experimentos, siguiendo las indicaciones de su instructor Al finalizar los experimentos, se hará una discusión de los resultados obtenidos. Cada subgrupo debe estar preparado para discutir sus resultados Ejercicio 1.- Partes del microscopio Este ejercicio lo realizarán simultáneamente con el instructor al inicio del laboratorio. 1. Con la ayuda del instructor/asistente el estudiante identificará cada componente del microscopio y el estereoscopio y hará una descripción de sus funciones. Rotule los esquemas que se presenta en el reporte. 2. Verifique que conoce en forma detallada, cada uno de los pasos para el uso, funcionamiento y cuidados del microscopio que se presentan a continuación: A.- Método de trabajo y cuidados del microscopio. 1. Coloque el microscopio sobre la mesa de trabajo. Cuando traslade el microscopio, hágalo sosteniéndolo con las dos manos, con la derecha sujete firmemente el brazo y posicione la izquierda bajo la base. 2. Antes de usar el microscopio, observe si todas sus partes se encuentran limpias y en buen estado. Si el ocular y los objetivos se encuentran sucios, proceda a limpiarlos cuidadosamente, utilizando un papel de seda. No utilice cualquier tipo de papel o limpiador. Si aún después de haber limpiado los lentes permanecen sucios u opacos, consulte con el asistente, quien procederá a limpiarlos con xilol. Cualquier daño debe ser informado inmediatamente al instructor. 3. Ponga el objetivo de bajo poder (4x) en línea, haciendo girar el revólver suavemente hasta que el lente quede en posición de trabajo. 4. Encienda la luz y abra el diafragma. La cantidad de luz, regulada por el diafragma, debe ser directamente proporcional al aumento utilizado. Mire por el lente ocular y ajuste el diafragma para que todo el campo óptico esté igualmente iluminado, con el fin de evitar el deslumbramiento. 5. Ponga la preparación a estudiar sobre la platina, asegurándose de que esté bien prensada y que no toque el lente frontal del objetivo. Mantenga seca la platina. 6. Una vez hecha la observación y antes de quitar la preparación, coloque el objetivo de bajo poder en posición de trabajo. R E C U E R D E! Siempre que monte o remueva laminillas de la platina, el lente objetivo colocado en posición vertical debe ser el de de 4x ó e l de 10x. Los objetivos de 40x o 100x quedan muy cerca de la portaobjeto, lo que aumenta Prohibida grandemente la reproducción la probabilidad parcial o total de este rayar manual e l objetivo o romper el portaobjeto.
4 7. La luz debe permanecer apagada mientras el microscopio no está en uso. Asegúrese que el microscopio esté limpio antes de entregarlo al concluir sus observaciones. B.- Procedimiento para enfocar correctamente el microscopio 1. Ponga la preparación de prueba (cuadrado, letra, palabras, etc.) sobre la platina del microscopio, de tal manera que la porción del portaobjetos que contiene la muestra quede directamente sobre la abertura circular. Sujete el portaobjetos con las pinzas del carro. 2. Mientras observa por un lado del microscopio observe cuidadosamente el movimiento del tubo óptico o platina cuando accione la perilla del macrométrico hacia delante o hacia atrás. Anote hacia que dirección debe girar el macrométrico para acercar o alejar la platina (y el portaobjeto) de la preparación. 3. Proceda a girar la perilla del macrométrico de manera que el tubo óptico descienda hasta que el objetivo de bajo poder esté muy cerca del portaobjeto, sin romper el portaobjeto (algunos modelos de microscopios están construidos de tal forma que no es el tubo óptico el que se acciona con las perillas del enfoque, sino que es la platina). 4. Mirando ahora por el ocular, accione lentamente la perilla del macrométrico en la dirección contraria (objetivo de aleja de la preparación). Gire el macrométrico hasta que aparezca claramente la imagen de las letras impresas en el campo óptico. 5. A partir de entonces, será el micrométrico el que se usará para apreciar los detalles y los planos de la preparación. Con la perilla del micrométrico ajuste suavemente el foco hasta obtener una imagen nítida de las letras. Nuevamente, anote hacia que dirección debe girar el micrométrico para acercar la platina con el portaobjeto al objetivo con la cual se está trabajando R E C U E R D E! En general el micrométrico no debe moverse más de 2 vueltas para obtener una imagen nítida. NUNCA DEBE GIRAR EL MACROMÉTRICO USANDO UN OBJETIVO DE ALTO PODER. 6. Mueva el carro de tal forma que la preparación se mueva alejándose de usted y observe por el ocular. En qué dirección se observa el movimiento de la imagen? 7. Mueva ahora el carro de izquierda a derecha cuál es la dirección del movimiento de la imagen observada por el ocular. C.- Procedimiento para enfocar correctamente del estereoscopio El microscopio estereoscópico tiene dos lentes objetivos y posee una profundidad de foco mucho mayor que la del microscopio compuesto; ambas características le permiten producir imágenes tridimensionales. El poder de resolución y de aumento del estereoscopio son mucho menores que las del microscopio compuesto y por esta razón el estereoscopio se usa para estudiar objetos y especimenes relativamente grandes (razón por la cual también se le llama microscopio de disección). Las partes de este microscopio son prácticamente las mismas que las discutidas para el microscopio compuesto. En este ejercicio se aprenderá el uso correcto del estereoscopio. Siga la explicación dada por el Instructor/Asistente 1. Escoja un espécimen. Puede ser una hoja, una flor o un insecto.
5 2. Ponga el espécimen en el campo de observación (platina). Si está húmedo colóquelo sobre una placa Petri o una laminilla. 3. Prenda y ajuste la fuente de luz. Algunos estereoscopios tienen la fuente de luz integrada mientras que otros la tienen aparte. Asegúrese de que la fuente de luz esté iluminando su espécimen. 4. Enfoque el objeto que desea ver y muévalo hacia arriba, hacia abajo y hacia los lados. Hacia dónde se mueve la imagen? Puede explicar estas observaciones? Ejercicio 2.- Medidas microscópicas 1. Haga un dibujo en el reporte de la preparación (lámina con letra) utilizando el lente de bajo aumento 2. Gire el revólver suavemente hasta colocar en posición de trabajo el lente objetivo de mediano poder (10x). Cuando el lente está en la posición correcta, queda aprisionado por una pieza mecánica que sujeta el revólver al cuerpo del microscopio. 3. Observe cuidadosamente la imagen. Mueva el micrométrico cuidadosamente hasta obtener una imagen nítida. 4. Repita los pasos 2 y 3 con el objetivo del alto poder (40x). 5. Cuando se observa con lentes de mayor aumento, es la iluminación igual, mayor o menor, que cuando se observa con el lente de bajo poder? 6. Haga los cambios y ajustes necesarios con el diafragma para obtener una iluminación óptima. Tenga cuidado de mantener el microscopio limpio y seco. 7. Haga un dibujo en el reporte de la preparación utilizando el lente de bajo aumento (4x) y el de alto aumento (40x). Cuando observamos un objeto al microscopio su tamaño aparece tantas veces mayor cuantas veces sea el aumento del microscopio. Por ello para calcular el aumento real de lo que observamos al microscopio bastará dividir el tamaño aparente con que lo vemos por el aumento. La unidad de medición del microscopio es la micra o micrón (una milésima de un milímetro, 0.001 mm) y se designa con la letra griega. En los laboratorios de investigación se utiliza el micrómetro para realizar las mediciones microscópicas. Supongamos que vemos un organismo al microscopio con un tamaño aparente de 0.4 mm, y que el aparato está equipado con un objetivo 20x y un ocular 10x (aumento=200), entonces, el tamaño real del organismo será:
Tamaño real = tamaño aparente = 0,4 = 0,002 mm = 2,0 m. Aumento 200 6 En nuestro caso, por no poseer micrómetros, se obtienen las medidas haciendo una comparación entre el tamaño de la imagen del objeto observado al microscopio y el tamaño real del mismo. Para averiguar el tamaño aproximado del campo óptico, realice los siguientes pasos: 1. Recortar un cuadrado de papel milimetrado fotocopiado en acetato, o colocar la lámina preparada con cuadriculado. 2. Poner en el portaobjeto 3. Utilizando el objetivo de bajo poder (BP), mida el tamaño del campo visual haciendo coincidir una de las líneas del papel milimetrado con el borde del campo visual. Esto da la medida del diámetro del campo visual (D BP ) para éste aumento (AMP BP ) 4. Para calcular el diámetro del campo visual en aumentos mayores (D AP ), hay que recordar que cuanto mayor sea el aumento, el campo visual será proporcionalmente menor, es decir D AP = D BP * AMP BP / AMP AP 5. Una vez calculado el campo visual, se puede obtener el tamaño aproximado del objeto observado dividiendo el valor del diámetro del campo visual entre el número de veces que el objeto cabe en ese campo. 6. Ponga la preparación que tiene la letra e y enfóquela. Compare el tamaño de la letra con el tamaño del campo óptico. Determine el tamaño de la letra Ejercicio 3 - Poder de resolución Siguiendo los pasos anteriores, utilice la lámina que tiene un trocito de papel con puntos, cuente el número de puntos presentes en los tres poderes del microscopio; note las diferencias. Haga dibujos esquemáticos. Este ejercicio es un ejemplo del poder de resolución del microscopio. D.- Preparación del material de estudio Los materiales que son estudiados al microscopio se colocan sobre una lámina de vidrio llamada portaobjetos. Generalmente el material es cubierto con un vidrio pequeño llamado cubreobjetos. Ambos deben estar limpios y secos. En el presente laboratorio, usted examinará las características comunes de las células eucarióticas, sin embargo, no todas las células son iguales. Algunos organismos son unicelulares (una única célula); éstos realizan todas las funciones de respiración, digestión, reproducción y excreción con una sola célula. Otros forman agregados o grupos de células llamadas colonias. Las colonias simples no tienen conexiones fisiológicas pero mantienen una estructura multicelular. Las colonias más complejas tienen conexiones fisiológicas y cierta especialización de tipos de células. Limpie los portaobjetos con agua, tomándolos con los dedos por los bordes, frótelos con un pañuelo limpio y seco o con una toalla absorbente. Los cubreobjetos son muy frágiles y deben ser tratados con mucho cuidado.
7 Ejercicio 4.- Organismos unicelulares 1. Tome una gota de agua de charco, colóquela sobre un portaobjetos, cúbrala con un cubreobjetos, primero a bajo poder; luego a mediano y alto poder. Identifique los organismos que observa. 2. En su reporte, haga un dibujo de lo que observa en el microscopio. Rotule las estructuras que observa. No olvide indicar el aumento utilizado en cada dibujo y el tamaño de cada organismo R E C U E R D E! Siempre manipular los portaobjetos y cubreobjetos por los bordes.. Ejercicio 5.- Organismos multicelulares Células de plantas Los organismos multicelulares tienen un gran número de células con estructura y función especializadas, de modo que una célula de éstas no puede existir aislada. En caso de no contar con una preparación fija, proceda de la siguiente manera: haga un corte de la muestra, póngalo sobre el portaobjetos y con un gotero deposite una gota de agua, cubra la muestra con el cubreobjetos teniendo el cuidado de evitar la formación de burbujas. (A) Células de epidermis de cebolla (Allium cepa) Escoja epidermis de cebolla y colóquela en forma estirada en un portaobjetos con una gota de agua. Cúbrala con un cubreobjetos y obsérvela al microscopio con un aumento de 10 X. Observe los límites de la célula y coloque el objetivo de 40 X. Retire la preparación del microscopio y añada una gota de orceína sin quitar el cubreobjetos (en los bordes de éste), observe la muestra en lente de 10 X y anote los cambios que ocurren. Luego, observe con aumento de 40 X, dibuje e identifique las siguientes estructuras: pared celular, núcleo, citoplasma. (B) Células de hoja de Elodea (planta acuática) Prepare una hoja joven de Elodea sobre un portaobjetos con una gota de agua, cúbrala con el cubreobjetos y observe a 10 X y a 40 X. Observar las siguientes estructuras: pared celular, citoplasma, vacuola central, cloroplasto, núcleo. Observe el movimiento citoplasmático llamado ciclosis. El citoplasma es transparente pero se nota el movimiento de partículas verdes: cloroplastos. (C) Cromoplastos Coloque un corte delgado de epidermis de chile (Capsicum sp); colóquela sobre el portaobjetos, cúbrala con agua y observe la preparación a mayor aumento. Observe las estructuras que presenta.
(D) Amiloplastos 8 Haga un corte muy fino de papa (Solanum tuberosum); colóquelo sobre un portaobjetos, agréguele una gota de lugol y cúbralo. Observe a 10X; luego a 40X. Los amiloplastos tienen color azul al teñirse con lugol. Ejercicio 6.- Organismos multicelulares: Células de animales Un grupo de células íntimamente asociadas y que cumplen una función única específica se denomina tejido. Los tejidos animales generalmente se clasifican en tejido epitelial, conectivo, muscular y nervioso. Cada uno de estos tipos de tejidos está formado por células con tamaño, forma y organización característica. (A) Células epiteliales Con ayuda de una paleta o palillo de dientes, extraiga células epiteliales de la parte interna de sus mejillas. Colóquelas en un portaobjetos, añada una gota de agua y remueva. Luego, añada una gota de orceína y coloque un cubreobjetos. Observe la preparación a 10x; luego a 40x. Identifique: núcleo, nucléolo, citoplasma, membrana celular. (B)Tipos de tejidos: epitelial, muscular y nervioso Observa detenidamente cada una de las láminas disponibles en el laboratorio y describa las características de cada tipo de tejido en base al tipo de célula, tamaño celular, distribución en el cuerpo