UNIVERSIDAD MAYOR FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA BIOQUIMICA PRACTICO N 1: ESPECTROFOTOMETRIA 1.- INTRODUCCIÓN Utilizando términos quizás excesivamente simplistas puede definirse la espectrofotometría de absorción, como la medida de la atenuación que el material a estudiar (muestra) efectúa sobre una radiación incidente sobre el mismo con un espectro definido. En general, las medidas se realizan dentro del espectro comprendido entre 220 y 800 nm, y este espectro, a su vez, puede dividirse en dos amplias zonas: la zona de la radiación visible, situada por encima de 380 nm, y la zona de la radiación ultravioleta situada por debajo de estos 380 nm. La región del infrarrojo se sitúa por encima de los 800 nm. La energía de una onda electromagnética está dada por la ecuación: E = hν, donde h es la constante de Planck y v es el número de onda (el recíproco de la longitud de onda λ). La energía de la luz UV y visible es capaz de excitar electrones π y electrones no enlazantes desde su estado basal a un nivel energético mayor (estado excitado) y, en consecuencia, se dice que la molécula que contiene estos electrones absorbe luz a la longitud de onda correspondiente. Generalmente, este tipo de electrones se encuentran en moléculas conjugadas (moléculas que poseen dobles enlaces separados por un enlace simple). La conjugación aumenta la longitud de onda de la absorción al disminuir la diferencia energética entre el estado basal y el estado excitado, de modo que un dieno conjugado absorbe luz de alrededor de 215 nm, mientras que un compuesto con un alto número de enlaces conjugados, como el β-caroteno absorbe a 450 nm. La estructura de enlaces conjugados que permite la absorción de luz se denomina cromóforo. Si una luz blanca pasa a través de una solución que contiene compuestos que actúan como cromóforos, ciertas longitudes de onda son absorbidas selectivamente. El color resultante de la solución se debe a la luz transmitida. La absorción de luz por parte de una sustancia es una propiedad característica de ella, que puede ser utilizada para su identificación y cuantificación, ya que un compuesto determinado tiene un espectro de absorción característico, por lo tanto la comparación del espectro de este compuesto puro con los espectros de compuestos conocidos permitirá su identificación.
Leyes de la absorción de energía radiante Se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el que es absorbida la energía radiante. En términos generales, puede decirse que hay dos variables capaces de afectar al grado de absorción: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a través de la solución. La Ley de Lambert - Beer establece que la absorción es proporcional al número de moléculas de la sustancia absorbente presente en la solución por donde pasa el haz electromagnético. La expresión matemática para esta ley es: A = ε l c Donde ε es la absortividad molar (una medida de la radiación absorbida), que es un valor constante para cada sustancia a cada longitud de onda λ. Cuando la concentración, c, es expresada en moles por litro se denomina coeficiente de extinción molar y cuando es expresada en gramos por litro coeficiente de extinción específico. El término l representa el espesor de la capa absorbente y está en unidades de cm. Cuando las medidas se efectúan utilizando siempre la misma cubeta (o bien un grupo de cubetas estandarizadas que posean un paso de luz constante) y los efectos ópticos debidos a la cubeta son reproducibles, el término l de la expresión de la absorbancia se hace constante. Dado que ε, es también constante para un determinado absorbente y una concreta longitud de onda, resulta entonces que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración: A = k c (k = ε l). La absorbancia es adimensional, presenta valores entre O y 2 unidades de absorbancia o densidad óptica, dentro de cuyo rango generalmente se cumple la Ley de Lambert - Beer
Características de un espectrofotómetro La medida de absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotómetro: Estos equipos contienen los siguientes componentes básicos: Posee una fuente de luz capaz de emitir luz a las longitudes de onda que se quiere medir. El selector de longitud de onda permite el paso de la luz a la longitud de onda deseada. Una rendija u orificio define la intensidad de luz incidente sobre la muestra dispuesta en una celda o cubeta que posee un diámetro de 1 cm y no interfiere con el paso de la luz, y finalmente, la luz emitida después de su paso por la celda es cuantificada por un detector. La fuente de luz emite un rango continuo de longitudes de onda y es regulada por voltaje. Generalmente, la luz del rango visible es emitida por una lámpara de tungsteno (340-900 nm) y la luz UV es emitida por una lámpara de deuterio (200-360). Las cubetas empleadas son de vidrio para el rango visible y de cuarzo para el rango UV (el vidrio no es transparente a la luz UV). Los espectrofotómetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el porcentaje de transmitancia (%T). La relación entre ambos es: A = 2 - log % T La ventaja fundamental que ofrece el empleo de la Absorbancia en lugar de la Transmitancia es que la relación existente entre la concentración y la absorbancia es lineal, cosa que no sucede con el %T. 100 80 % 60 Absorbancia Transmitancia 40 20 concentración (g/l) concentración (g/l)
La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisión. Curvas de calibración Una curva de calibración relaciona las A ó %T con las concentraciones y su empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentración del absorbente. Siempre que sea posible, es aconsejable la construcción de una curva de calibración que cubra la zona de concentraciones que se van a encontrar en la práctica. La elaboración de la curva debe ser la fase primera al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotométrico. Las concentraciones pueden expresarse en cualquier tipo de unidades de medida; sin embargo, la medida más conveniente es emplear para las curvas las mismas unidades en las que se debe expresar el resultado final. Ejemplo: curva de la Hemoglobina. Dado que la Absorbancia es proporcional a la concentración, tendremos que: Donde: A1 / A2 = C1/ C2 A1 = Absorbancia del problema A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida C1 = Concentración del problema C2 = Concentración del estándar Concentración (problema) = A1 (problema) / A2 (estándar)* Concentración estándar
2.- OBJETIVOS Una de las aplicaciones prácticas de mayor interés de la espectrofotometría de absorción UV-Visible es la del análisis cuantitativo, basada en la aplicación de la ecuación de Lambert- Beer. Mediante el siguiente práctico se buscará: - Aprender a usar correctamente el espectrofotómetro - Conocer y aplicar los principios básicos de la espectrofotometría 3.- PARTE EXPERIMENTAL Uso del espectrofotómetro 1.- Preparación de soluciones de colorantes: 1.1.- Prepare las siguientes soluciones: a) 250 ml de solución de Eosina Amarilla al 0,04 % p/v b) 500 ml de solución de Violeta de Genciana al 0,02 % p/v c) 250 ml de solución de Fuccina ácida al 0,05 % p/v d) 500 ml de solución de Verde Malaquita al 0,05 % p/v 1.2.- A partir de las soluciones anteriores, realice diluciones para preparar: a) 100 ml de solución de Eosina Amarilla 20 ppm b) 100 ml de solución de Violeta de Genciana 2 ppm c) 100 ml de solución de Fuccina ácida 5 ppm d) 100 ml de solución de Verde Malaquita 5 ppm 2.- Realice el espectro de absorción de su colorante: Para el uso del espectrofotómetro siga las siguientes instrucciones: l. Encendido de lámparas: 1.1.- Lámpara de tungsteno (Zona del visible, 900 a 340 nm), encendido instantáneo 1.2.- Lámpara de Deuterio (Zona del UV, 340 a 200 nm aprox), encienda el equipo 30 min antes de usarlo 2. Oprima la tecla A/T/C para accionar el modo absorbancia 3. Seleccionar la longitud de onda con el mando correspondiente. 4. Inserte el blanco en el portaceldas y cierre la puerta del compartimiento de muestras 5. Oprima la tecla 0 ABS para llevar a cero absorbancia 6. Saque el blanco e inserte la muestra problema en el portaceldas, cierre la puerta del compartimiento. 7. Lea la medición de absorbancia en la pantalla. Importante: las cubetas empleadas en el espectrofotómetro (1 cm de espesor) deben estar escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras esmeriladas u opacas. No es conveniente secarlas con papel corriente por el carácter abrasivo de éste sino con un papel suave.
Actividad: Siguiendo las instrucciones anteriores sobre la utilización del equipo: - Seleccione una longitud de onda de 400 nm. en el modo absorbancia. - Inserte el blanco y calibre a cero - Saque el blanco, coloque su muestra y determine el valor de absorbancia a 400 nm - Seleccione una nueva longitud de onda en 420 nm - Vuelva a calibrar con el blanco - Lea absorbancia de la muestra a 420 nm - Repita el procedimiento hasta los 700 nm para obtener el espectro visible de su colorante. - Registre sus valores en la siguiente tabla: Longitud de onda Absorbancia Longitud de onda (λ) (λ) 400 550 Absorbancia 425 575 450 600 475 625 500 650 525 675 - Realice el gráfico de la absorbancia en función de la longitud de onda en papel milimetrado. 3.- Determine el coeficiente de extinción molar: Cuando tenga el espectro determine la longitud de onda del máximo de absorción y calibre el equipo a dicha longitud de onda (λ máx). Prepare 5 diluciones seriadas de su colorante (1/2, 1/4, 1/8 y 1/16) y mida la absorbancia. No necesita recalibrar el equipo al no cambiar la longitud de onda. Grafique en papel milimetrado absorbancia v/s concentración y determine el coeficiente de extinción molar de su colorante. Dilución Absorbancia Concentración (ppm) 1/2 1/4 1/8 1/16