Tema IV. Genética Bacteriana Por qué podemos hablar de Genética Bacteriana? Las bacterias son haploides (Un cromosoma) No hay alelos dominantes y recesivos. Se reproducen de manera asexual Sin embargo, hay una alta diversidad genética: Se encuentra en una población resistencia a antibióticos, resistencia a bacteriófagos, diversidad metabólica (síntesis de aminoácidos, vitaminas etc.) La principal fuente de variabilidad genética en bacterias es la mutación. Mutación espontánea : cambios que ocurren durante la duplicación del DNA Mutación inducida: cambios que ocurren por daño al DNA Tasa de mutación en E. coli Escherichia coli Genoma: 4.4 x 10 6 pares de bases. La replicación del genoma implica la polimerización de 8.8 x 10 6 nts La DNA polimerasa que replica el genoma de E. coli, en cooperación con otros mecanismos, comete un error cada 10 10 nucleótidos incorporados. Si cada genoma implica la incorporación de 8.8 x 10 6 nts, habría un error aprox. cada 1136 divisiones (10 10 / 8.8 x 10 6 ) Un ml de un cultivo de bacterias en fase exponencial tiene: 1 x 10 9 células. Como habría un error cada 1136 replicaciones, si se dividen todas las células, 1 x 10 9 / 1136 = 8.8 x 10 5 mutaciones en una generación. Mutación espontánea : cambios que ocurren durante duplicación del DNA Cadena de DNA nueva Cadena de DNA molde Sin corrección del error Siguiente ronda de replicación Corrección del error Mutación inducida: cambios que ocurren por daño al DNA Experimento de Luria y Delbrück. Prueba de fluctuación Inocular el cultivo con el fago Diluir el cultivo Escherichia coli sensible a bacteriófagos Muchos subcultivos Desaminación oxidativa del DNA Una hipoxantina se aparea con una citosina Determinar el número de colonias resistentes al fago: 142/ 146/ 155/ 140/ 132/ 123/138/149 Inocular y determinar el # de colonias resistentes al fago: 67/ 159/ 117/ 291/75/ 135/ 220/ 0 1
Experimento de Luria y Delbrück. Prueba de fluctuación Experimento de Lederberg y Tatum La resistencia al bacteriófago se debe a mutaciones en algún(os) gen(es) de la bacteria. Se observa mayor variabilidad en el número de colonias resistentes al fago en los cultivos independientes: las mutaciones ocurren espontáneamente, en ausencia del bacteriófago. E. coli E. coli La alta variabilidad se explica porque en cada cultivo, la mutante resistente se dio en distintas generaciones. Medio mínimo Genética Bacteriana. Análisis fenotípico en bacterias. AUXOTROFÍA Las cepas silvestres son protótrofas (crecimiento en medio mínimo), se pueden identificar mutantes incapaces de sintetizar algún metabolito esencial, por lo que este debe ser añadido al medio (bio -, arg -, met -, ad - ) FUENTE DE ENERGÍA Capacidad de las bacterias para utilizar determinados sustratos como fuentes de energía, generalmente carbohidratos (galactosa; gal - /gal +, lactosa; lac - /lac +, melobiosa, RESISTENCIA/SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS Capacidad de crecen en presencia de inhibidores, como antibióticos (estreptomicina, ampicilina, kanamicina, etc. str R /str S ; amp R /amp S Otras características como morfología colonial y pruebas bioquímicas también se emplean. Experimento de Lederberg y Tatum Medio mínimo Se requiere contacto físico entre las bacterias para que ocurra este intercambio 2
Mecanismos mediante los cuales las bacterias adquieren nueva información genética Transformación El transporte del DNA del medio extracelular al citoplasma es un proceso muy complejo que todavía no está bien entendido. Se requieren proteínas que están involucradas en los sistemas de secreción, así como de una translocasa de DNA en la membrana. Conjugación Transducción 1. TRANSFORMACIÓN En la transformación, DNA exógeno es introducido a la célula e incorporado al DNA cromosomal por recombinación. Una de las dos cadenas es hidrolizada y el DNA de cadena sencilla que queda es protegido por SSB y está disponible para recombinarse con el DNA cromosomal. También puede entrar la doble hebra de DNA. CONJUGACIÓN E. coli tiene dos tipos de células: donadores/machos y receptoras/hembras. La diferencia radica en la presencia del plásmido F (plásmido sexual/ factor de Fertilidad) F + /F - El plásmido F contiene unos 100 genes, algunos de ellos codifican proteínas involucradas en la replicación del DNA. Otros genes codifican proteínas tubulares que forman el pilus. 3
Conjugación es el proceso de apareamiento de bacterias mediante el cual se transfiere información genética. Involucra el contacto físico entre bacterias (F + y F - ) Conjugación. Apareamiento entre bacterias (F + y F - ) La célula F + inicia la conjugación al sintetizar y extender el pilus que se adhiere a la superficie de la célula F - El pilus se retrae y acerca a las dos células. La célula F + sintetiza el pilus El plásmido es activado para transferencia cuando una endonucleasa corta una cadena en el origen de transferencia La cadena complementaria de ambos plásmidos se sintetiza Conjugación El pilus entra en contacto con la célula F - El pilus se retrae causando que las céls. donadora y receptora se unan. El plasmido F se transfiere como DNA de cadena sencilla La cadena de DNA recién transferida también se replica. Las dos células contienen un plásmido F integro, por lo que ambas son F + Una de las cadenas del DNA F es cortada y se separa de la otra cadena. Se transfiere esa cadena a la otra célula, mientras que se comienza a replicar el DNA de la cadena que se quedó en la célula F + 4
Células Hfr (high frequency recombination). Otra propiedad que tiene el plásmido F es su capacidad de integrarse al cromosoma bacteriano, incrementando el tamaño de éste. Episoma. Fragmento de DNA que puede existir como plásmido y que se puede integrar al cromosoma. CONJUGACIÓN F En células Hfr ocurre con baja frecuencia que F se escinda del cromosoma y forme un plásmido circular nuevamente. Cuando esto ocurre, F acarrea consigo genes adyacentes del cromosoma que ahora se encuentran formando parte del plásmido F. Entonces, a éste se le llama plásmido F. La célula Hfr mantiene su capacidad de conjugación, por lo que se puede aparear con una célula F - CONJUGACIÓN F Ocurre transferencia de material genético, sin embargo, no se transfiere el cromosoma completo pues las células se separan. La secuencia correspondiente al plásmido F no se transfiere. Los plásmidos F también pueden ser transferidos por conjugación Como se transfirió un fragmento del DNA cromosomal, hay homología con el cromosoma de la célula receptora y ocurre recombinación con alta frecuencia (Hfr) Con esta transferencia se pueden crear células diploides parciales (merocigotos). 5
Una característica importante del apareamiento Hfr /F - es que la transferencia del cromosoma Hfr ocurre a una tasa constante a partir de un punto fijo determinado por el sitio donde está insertado el episoma F. Experimento de Conjugación a tiempos controlados. Cepa Donadora Hfr: thr + ; leu + ; azi s ; ton s ; lac + ; gal + ; str s Cepa receptora (F-): thr - ; leu - ; azi r ; ton r ; lac - ; gal - ; str r Esta propiedad permite controlar la cantidad de información genética transferida y mapear la posición de los genes transferidos con respecto a la secuencia F de acuerdo al tiempo de conjugación. 1. Poner en contacto a las dos cepas 2. Interrumpir por agitación la conjugación a distintos tiempos 3. Sembrar en medio con streptomicina (elimina a la cepa donadora) 4. Evaluar el fenotipo de las bacterias conjugantes Mapeo de genes en E. coli por conjugación El tiempo que se requiere para que los genes entren en la célula receptora está asociado con el ordenamiento en el cromosoma bacteriano. El cromosoma Hfr es transferido linealmente a la célula F - receptora. Si se interrumpe la conjugación a distintos tiempos ocurrirán transferencias parciales de los genes. El orden de los genes a lo largo del cromosoma se puede deducir al determinar los genes transferidos durante apareamientos cortos y comparados con apareamientos largos. Resultados del Experimento Tiempo de conjugación (min) % de colonias que sobreviven con los genotipos indicados thr + leu + azi s ton s lac + gal + 6
Mapa genético del cromosoma de Escherichia coli Clasificación de fagos por su estructura. Punto de inicio Icosahédricos sin cola (φx174) Icosahédricos con cola (λ) Las unidades son minutos. Se refiere al tiempo que tardan los genes en entrar a una bacteria F- receptora durante el experimento de conjugación Filamentosos (M13) Están formados por un ácido nucleico (DNA/RNA) y una cápside de proteína TRANSDUCCIÓN. Transferencia de material genético entre bacterias a través de un bacteriofago. Se adsorbe a la superficie de una bacteria susceptible, penetra el ácido nucleico del fago, se replica su DNA, se expresan los genes del fago, se sintetizan las proteínas y se ensamblan nuevas partículas virales. Ciclo lítico de un bacteriófago. 1. El bacteriófago se adhiere a la superficie de la bacteria. 2. El DNA del bacteriófago penetra a la célula. 3. Se sintetiza el DNA y proteínas del bacteriófago. 4. Se ensamblan los componentes del bacteriófago formando nuevas partículas. 7
Ciclo lítico de un bacteriófago. Integración del DNA del fago al cromosoma bacteriano El cromosoma del bacteriófago lambda (λ) en estado libre es circular. El sitio de integración λ es una región del cromosoma que se alinea en un sitio del cromosoma bacteriano (entre los genes gal y bio). 5. La célula se lisa y se liberan las partículas virales Ocurre un entrecruzamiento recíproco entre el fago circular y el cromosoma bacteriano resultando en la integración. Esta integración es mediada por los genes del bacteriofago y no por el sistema de recombinación de la bacteria. Al DNA del fago integrado al cromosoma se le llama profago. Ciclo lisogénicode un bacteriófago. TRANSDUCCIÓN Plásmidos. Son moléculas de DNA circulares extracromosomales que se encuentran en la mayoría de las bacterias y en algunas células de eucariontes. Inducción del ciclo lítico La escición del DNA del fago acarrea DNA cromosomal Replicación del fago Lísis celular y liberación del fago La célula receptora adquiere nuevos genes. Integración del DNA del fago al cromosoma El fago infecta a la célula receptora 8
Muchos plásmidos usan la misma maquinaria de replicación del DNA cromosomal y contienen un origen de replicación que es reconocido. En general, los plásmidos se clasifican en aquellos que se encuentran en un bajo número de copias por célula (1-10) y los que están presentes en un alto número de copias (10-100). Los plásmidos autoregulan su número de copias a través de un represor (proteína o RNA) que impide que se repliquen muchas copias del plásmido. Estos represores también pueden actuar sobre otros plásmidos relacionados, excluyéndolos así de la célula. Mecansimos de resistencia a antibióticos y su transmisión Impermeabilidad y eflujo. Gram+ (peptidoglicano); Gram- (capa de LPS). Proteínas de eflujo. Los genes responsables pueden estar en plásmido o en cromosoma. Modificación e inactivación del antibiótico. β-lactamasa, enzimas modificadoras de aminoglicósidos, cloramfenicol acetil transferasa. Modificación del blanco. Dominios de transpeptidasa con menor afinidad por las β-lactamas. Vías alternativas de síntesis. Síntesis de tetrahidrofolato insensible a sulfonamidas. Los plásmidos codifican una diversidad importante de funciones que le permiten a la bacteria que los contiene sobrevivir en tipos de habitats muy variables. 1. Propiedades de Resistencia. Antibióticos (aminoglicósidos, cloramfenicol, β-lactamas) Metáles pesados (Hg, Ni, Co, Pb, Cd, Bi) Aniones tóxicos (arsenato, arsenito, boratos, cromatos) 2. Propiedades metabólicas. Producción de bacteriocinas Metabolismo de carbohidratos Metabolismo de compuestos carbonados 3. Factores que intervienen en la interacción con hospedero. Enterotoxina y hemolisinas (Escherichia coli) δ- endotoxina (Bacillus thuringiensis) Neurotoxina (Clostridium tetani) Infección y nodulación de leguminosas (Bradirhizobium sp.) Transposones La transposición es otro tipo de recombinación de DNA en el cual un elemento transponible o transposón se mueve de una molécula de DNA a otra. Fueron descubiertos originalmente en maíz por Barbara Mc Clintock, y su presencia se ha documentado también en otras especies, desde bacterias a humanos. 9
Transposones El tamaño de los transposones varía entre 10 3 a 10 4 pb dependiendo del tipo de transposón. La secuencia integra del transposón se puede insertar en un sitio particular del cromosoma. La transposición involucra recombinación entre secuencias no relacionadas que son los extremos flanqueantes del transposón y el sitio del cromosoma donde se insertó. Mecanismo de Transposición (Tn5) Unión de la transposasa a la región flanqueante Formación del asa (complejo sináptico). Los extremos del transposón se acercan. Corte del DNA y escición del transposón Unión del transposón al DNA blanco La transposasa cataliza la inserción del transposón al DNA blanco. Transposasa. Enzima que corta al DNA blanco en sitios al azar y une los extremos del transposón. Secuencias repetidas invertidas. Funcionan como el sitio de reconocimiento de la transposasa. Como las secuencias son invertidas, son idénticas. Marcador de selección. La inserción del transposón confiere una ventaja ecológica a la célula, que puede ser la resistencia a algún antibiótico. Kan S Kan R Transposón Tn5: 5,800 pb y regiones flanqueantes de 1,530 pb. Genes de resistencia a Kan, Bleo, Strp. 10