conservamos 31 ANEXO 1 Medios de cultivo y reconstitución de cepas Agar tripticasa de soya (TSA) -Triptona, digestión pancreática de caseína -Peptona de soya, digestión pancreática de harina de soya -Cloruro de sodio (NaCl) -Agar 15,0 g/l 5,0 g/l 5,0 g/l 15,0 g/l Usar agua destilada como diluyente. Se esteriliza en autoclave. Después de la esterilización, el ph del medio debe ser equivalente a 7,2 ± 0,2 cuando se mide a 20 C. Agar extracto de malta (MEA) -Extracto de malta Usar agua destilada como diluyente. Se esteriliza en autoclave. Después de la esterilización el ph del medio debe ser equivalente a 5,6 ± 0,2 cuando se mide a 20ºC. Agar DG-18 30,0 g/l -Peptona de soya 3,0 g/l -Agar 15,0 g/l - Peptona 5 g/l -Peptona de soya, digestión pancreática de harina de soya 5,0 g/l - Glucosa 1 g /L - Sulfato de Magnesio 0,5 g/l - Dicloran 0,002 g/l - Cloranfenicol 0,05 g/l - Agar 15 g/l - Glicerol 220 g/l Usar agua destilada como diluyente. Se esteriliza en autoclave. Después de la esterilización el ph del medio debe ser equivalente a 5,6 ± 0,2 cuando se mide a 25ºC. Reconstitución de las cepas (Pedroza et al., 2007) - Hongos filamentosos: retirar un sobre de cada uno de los hongos del refrigerador. Bajo condiciones de esterilidad destapar el sobre de papel y retirar un disco de papel con cepa preservada. Transferir y sembrar el disco invertido de tal manera que el micelio quede en contacto con el agar PDA. Incubar las cajas a 25ºC por cinco días. Verificar la pureza del aislamiento realizando una preparación con azul de lactofenol y presencia de bacterias por medio de una coloración de Gram.
conservamos 32 - Hongos levaduriformes: retirar un tubo eppendorf del congelador, dejar descongelar el vial a temperatura ambiente. Bajo condiciones de esterilidad destapar el tubo, flamear la boca y tomar una muestra. Sembrar por aislamiento la asada sobre agar PDA. Incubar las cajas a 30ºC por 48 horas. Verificar pureza del aislamiento mediante coloración de Gram. - Bacterias: retirar un tubo eppendorf del congelador, dejar descongelar el vial a temperatura ambiente. Bajo condiciones de esterilidad destapar el tubo, flamear la boca y tomar una muestra. Sembrar por aislamiento la asada sobre agar nutritivo. Incubar las cajas a 37ºC por 24 horas. Verificar pureza del aislamiento mediante coloración de Gram. ANEXO 2 Soluciones de trabajo Diluyente - Solución de cloruro de sodio triptona - Triptona, digestión pancreática de caseína 1,0 g - Cloruro de sodio (NaCI) 8,5 g - Agua destilada 1L Se esteriliza en autoclave. Después de la esterilización el ph del medio debe ser equivalente a 7,0 ± 0,2 cuando se mide a 20 C. Neutralizador recomendado por la NTC 5540 y 5473 - Polisorbato 80 30 g/l - L-histidina 1 g/l - Lecitina 3 g/l Mezclar en solución de cloruro de sodio triptona o en tampón fosfato de concentración 0,0025 mol/l Disolución tampón de fosfato 0,25 mol/l - Potasio dihidrógeno fosfato 34 g - Agua destilada 500 ml Se lleva a volumen a 1000mL y se esteriliza en autoclave. Ajustar a ph 7,2± 0,2 con solución de NaOH 1mol/L.
conservamos 33 ANEXO 3 Características macro y microscópicas de los microorganismos del estudio Microorganismo Características macroscópicas Características microscópicas Penicillium Morfotipo 6 Cladosporium Morfotipo 1 Anverso blanco crema, reverso café en la parte central y verde oscuro en la parte externa de la colonia, con textura pulverulenta, sin pigmento difusible al medio. Anverso verde oscuro, reverso verde oliva con textura pulverulenta, sin pigmento difusible al medio. Hifas hialinas, metula ramificada, conidioforos hialinos, fiálides en forma de botella, conidios esféricos y hialinos. Hifa delgada, conidióforos cortos, conidios ovales y dematiaceos. Aspergillus Morfotipo 1 Anverso blanco, reverso blanco y amarillo en la zona central, textura pulverulenta, sin pigmento difusible al medio. Hifa hialina gruesa, vesícula rodeada por fiálides de las cuales se desprenden conidios hialinos pequeños.
conservamos 34 Microorganismo Características macroscópicas Características microscópicas Rhodotorula Mucilaginosa Bacilo Gram positivo Esporulado Colonias naranjas brillantes, de textura cremosa y húmeda-mucoide. Colonias blancas-crema, de textura cremosa y opacas. Células ovales de 2.5 6.5 um de tamaño, que tiñen con cristal violeta. Bacilos Gram positivos curvos, esporulados y de tamaño mediano. ANEXO 4 Condiciones de captura fotográfica Biblioteca Nacional de Colombia Para la captura fotográfica se tuvieron en cuenta los siguientes parámetros: Tabla 1. Parámetros estandarizados para captura fotográfica CÁMARA SONY 360 ALFA Lente SONY DT 16-105MM Dimensiones de la captura 1014 X 1526 Resolución 350 PPP Profundidad de Bits 24 Punto de foco F/11 Tiempo de exposición 1/5 Velocidad ISO 100 Tamaño 138,800 KB
conservamos 35 Tener en cuenta que las capturas se realizaron en la caja de luz como lo indica la Figura 1, bajo la estandarización de foto documentación con la que se trabaja en la Biblioteca Nacional de Colombia. El fondo de trabajo fue de color negro como se observa en la Figura 2. Figura 1. Caja de Luz para captura fotográfica documental Figura 2. Captura fotográfica de las probetas con fondo negro. ANEXO 5 Cuantificación de azúcares reductores por la técnica del ácido 3,5-dinitrosalicílico Metodología descrita en el manual de laboratorio de procesos biotecnológicos (Pedroza et al., 2007) Curva patrón para la determinación de azúcares reductores - Preparación de las soluciones de concentración conocida (1mM-40mM): preparar las muestras de diferentes concentraciones a partir de la solución stock de glucosa 40mM, teniendo en cuenta la Ley de la Volumetría. - Determinación de la concentración de glucosa por DNS: a partir de cada una de las soluciones de concentración conocida, depositar 0.25mL de cada una en tubos 16x100 mm y seguir el protocolo descrito en la tabla 1.
conservamos 36 Tabla 1. Metodología para elaborar curva patrón de glucosa Concentración mm Reactivo Blanco 1 2 4 6 8 10 Glucosa (ml) - 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 Agua (ml) 0.25 - - - - - - Reactivo DNS (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 Calentar a ebullición los tubos de 16x100 mm sin el papel aluminio por cinco minutos y posteriormente detener la reacción por inmersión de los tubos en hielo durante cinco minutos. Agua destilada (ml) 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 Proteger los tubos de la luz y realizar las determinaciones de absorbancia a una longitud de onda de 540nm, ajustar el cero de la absorbancia con el blanco de la prueba. Absorbancias de la curva patrón Tabla 2. Resultados de la curva patrón de glucosa Absorbancia 540nm [ ] Glucosa Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 Abs Desviación (mm) Estándar 1 0,029 0,024 0,025 0,026 0,0026 2 0,093 0,073 0,089 0,085 0,0106 4 0,205 0,181 0,199 0,195 0,0125 6 0,308 0,342 0,283 0,311 0,0296 8 0,453 0,459 0,485 0,466 0,0170 10 0,59 0,551 0,582 0,574 0,0206 15 1,223 1,24 1,244 1,236 0,0112 20 1,616 1,624 1,537 1,592 0,0481 25 1,996 1,958 1,96 1,971 0,0214 30 2,459 2,222 2,397 2,359 0,1229 35 2,759 2,757 2,801 2,772 0,0248 40 3,113 2,883 3,039 3,012 0,1174
conservamos 37 Figura 1. Curva patrón de Glucosa Representación gráfica de los resultados Depositar 50mL de agua destilada en un vaso de precipitado de 250mL, adicionar 1.6g de hidróxido de sodio y disolver con agitación en plancha magnética a temperatura ambiente. Posteriormente, adicionar lentamente 43.8g de tartrato de sodio y potasio hasta que se disuelva por completo. Para proteger el reactivo de la luz, envolver el vaso de precipitado con papel aluminio y agregar lentamente 1g de DNS. Completar con agua destilada hasta 100mL en un balón aforado de 100mL. Dejar en agitación durante 12 horas en un frasco oscuro. Almacenar a temperatura ambiente y en frasco oscuro. Rotular el frasco con el nombre y concentración de la solución, así como la fecha de preparación y el nombre del responsable del reactivo (Miller, 1959). Reactivos - Ácido 3,5-di-nitrosalicílico (DNS) Componentes: -Ácido 3,5-di-nitrosalicílico 1g -Tartrato de sodio y potasio 43.8g -Hidróxido de sodio 1.6g -Agua destilada - Solución patrón de glucosa 40mM Componentes: -Glucosa anhidra 7.2g - Agua destilada 1L En 500mL de agua destilada disolver 7.2g de glucosa anhidra, completar a 1000mL en un balón volumétrico. Almacenar en tubos falcon de 15mL y congelar a -15 C. Rotular el frasco con el nombre y concentración de la solución, así como la fecha de preparación y el nombre del responsable del reactivo.
conservamos 38 ANEXO 6 ANOVA y pruebas PostHoc Evaluación de agentes químicos Clinafarm
Wescosan conservamos 39
conservamos 40 Timsen
Plata Coloidal conservamos 41
conservamos 42 ANEXO 7 ANOVA y pruebas PostHoc Microorganismos evaluados Aspergillus Morfotipo 1
Cladosporium Morfotipo 1 conservamos 43
conservamos 44 Penicillium Morfotipo 6
Rhodotorula mucilaginosa conservamos 45
conservamos 46 Bacilo Gram positivo Esporulado RI0020
conservamos 47 ANEXO 8 Registros fotográficos Resultados Plata Coloidal frente a Cladosporium Morfotipo 1 A 1 A 2 A 3 B 1 B 2 B3 C 1 C 2 Figura 1. Resultados de la Plata Coloidal frente a Cladosporium Morfotipo 1. A) Viabilidad del Inóculo. B) Evaluación del Agente químico vs. Microorganismo. C) Prueba de la actividad y la toxicidad del Agente Neutralizante
conservamos 48 ANEXO 9 Registros fotográficos Resultados Wescosan frente a Penicillium Morfotipo 6 Figura 1. Resultados de Wescosan frente a Penicillium Morfotipo 6. A) Viabilidad del Inóculo. B) Evaluación del Agente químico vs. Microorganismo. C) Prueba de la actividad y la toxicidad del Agente Neutralizante
conservamos 49 ANEXO 10 ANOVA y pruebas PostHoc Determinación de azúcares reductores Papel Manual 25 Años Papel Industrial 50 Años
conservamos 50 ANEXO 11 Cambio cromático Papel Manual e Industrial Tiempo cero D Figura 1. Registro fotográfico de las muestras de papel industrial y manual para el tiempo cero. Los productos aplicados a las muestras corresponden A) Clinafarm-Papel Industrial, B) Wescosan-Papel Industrial, C) Timsen-Papel Industrial, D) Clinafarm-Papel Manual, F) Wescosan-Papel Manual y G) Timsen-Papel Manual.
conservamos 51 25 años Figura 2. Registro fotográfico de las muestras de papel industrial y manual para 25 años de envejecimiento. Los productos aplicados a las muestras corresponden H) Timsen-Papel Manual, I) Wescosan-Papel Manual, J) Clinafarm-Papel Industrial y K) Timsen-Papel Industrial. Figura 3. Registro fotográfico de las muestras de papel industrial y manual para 50 años de envejecimiento. Los productos aplicados a las muestras corresponden L) Clinafarm-Papel Manual, M) Timsen-Papel Manual, N) Clinafarm-Papel Industrial y O) Wescosan-Papel Industrial.