Bioquímica I - 2013 Enzimas IV Problema 1 a) El valor del coeficiente de absortividad molar de un producto de reacción es de 7300 M -1 cm -1. Calcular para esta molécula cuál será el rango de concentración medible en un espectrofotómetro que resulta confiable entre 0,1 y 1 unidades de absorbancia. Suponer un camino óptico de 5mm. b) Suponiendo que en el procedimiento de laboratorio que se siguió para obtener la muestra anterior se utiliza una parte de una solución de stop cada dos partes de mezcla de reacción, cuál es el rango de concentración del producto en la mezcla de reacción que podríamos determinar en el mismo equipo? Nota: en lo que sigue pueden suponer que las velocidades que mediremos serán velocidades iniciales, es decir que no cambian a lo largo del experimento. Más adelante revisaremos esta suposición. c) Un tiempo cómodo para llevar a cabo la determinación de enzimas en una muestra podría ser de unos 20 minutos. Supongamos además que las muestras pueden tomarse cada un minuto, y que a los efectos de calcular la velocidad de la reacción pretendemos incluir en la regresión lineal al menos 5 puntos. Tomando como referencia el gráfico de la Figura 1, calcular las actividades (velocidades) mínima y máxima que podría tener una muestra a determinarse mediante este protocolo. Usando el valor de = 7300 M -1 cm -1, calcular a cuántas unidades internacionales correspondería el límite superior si la determinación se hizo: i. con concentraciones saturantes de sustrato ii. con una concentración de sustrato S=Km/4 Los cálculos anteriores son aplicables a ensayos donde se quiere determinar la actividad enzimática. Son comunes en química clínica, cuando se quiere averiguar la cantidad de una enzima presente en sangre. En este tipo de ensayos se conocen las propiedades de la enzima (Km). En cambio, en la determinación de los parámetros cinéticos para enzimas michaelianas se mantiene una misma cantidad de enzima y se hacen mediciones cinéticas a distintas concentraciones de sustrato. Para programar un experimento de este tipo es necesario tener una estimación inicial de Km (que es, a su vez, uno de los parámetros que queremos determinar). Esta estimación inicial puede provenir de enzimas similares o de ensayos preliminares.
Problema 2 En un ensayo preliminar a la determinación de los parámetros enzimáticos de una enzima se obtuvieron los siguientes valores de Vo en función de la concentración de sustrato agregada a la mezcla de reacción: [S] (mm) Vo (umol/min) 100 9,74 10 7,65 1 2,48 0,1 0,37 Elegir seis [S] en función del Km estimado aptas para llevar a cabo esta determinación (es decir, entre 0,25 Km y 5Km). Calcular la velocidad inicial que debería presentar cada uno de los experimentos y graficar las curvas esperadas en un gráfico de producto vs tiempo. Para esto supongan que la Vmax en la mezcla de reacción es de 0,7 mol/min. Problema 3. En los cálculos anteriores hemos supuesto que es posible determinar una velocidad de reacción constante a lo largo de los ensayos realizados (es decir, una única Vo para cada mezcla de reacción). Sin embargo, sabemos que a medida que la reacción procede y el sustrato va disminuyendo su concentración, la velocidad debería ir disminuyendo también, según la ecuación de Henry-Michaelis- Menten. a) En base al siguiente gráfico discutir en grupos la dependencia del error introducido Afecta por igual a todas las determinaciones? b) En función de lo anterior evaluar la validez de la siguiente frase: para asegurarnos estar en Vo, no se debe consumir más del 10% del sustrato c) Tomando los datos del Problema 2, y asumiendo que el Km determinado resultó ser de 3mM: i) Para la determinación de menor [S] antes elegida, calcular la concentración final de S luego de 5 minutos de reacción. Sin hacer cálculos, estimar entre qué valores de [S] de los ensayados se ubicará Km. ii) Comparar la velocidad al comienzo de la determinación anterior con la velocidad a los 5 minutos de la reacción En qué porcentaje difieren? Problema 4. Trabajando en lo posible en grupos, elaborar esquemas donde se indiquen los pasos a seguir para las siguientes determinaciones, esquematizar los resultados esperados y el procesamiento de los mismos para obtener el/los parámetro(s) de interés. Incluir cuando sea necesario ensayos preliminares, y explicitar cómo se usarían sus resultados. a) determinar la actividad de una enzima en un tejido del que no se tiene ninguna información previa. b) obtener los parámetros cinéticos de una enzima michaeliana c) indagar sobre la capacidad de una sustancia de actuar como inhibidor de una enzima d) evaluar la estabilidad de una enzima frente al ph (discutir cómo esperan que influyan los tiempos del ensayo en los resultados) e) seguir el proceso de purificación de una enzima
Problemas adicionales Problema 1. Acetilcolinesterasa (EC 3.1.1.7) cataliza la hidrólisis del neurotransmisor acetilcolina a colina y acetato en el sistema nervioso central de animales y humanos. (Acetilcolina -----------> colina + acetato) La actividad de este tipo de enzima es determinada utilizando como sustrato al fenilvalerato (PV), que libera una molécula de fenol que puede ser determinada colorimétricamente a 540nm luego de la adición de aminoantipirina y ferrocianuro de potasio. (PV ------------> valerato + fenol). Con el fin de caracterizar las estereasas presentes en cerebro de conejo, se le encomienda diseñar un protocolo para medir actividad de las estereasas de un homogenado de este tejido. Dispone de las siguientes soluciones: Buffer de reacción ph 6,8 10X Solución stop con reactivos de colorimetría 2X (2%SDS, 1,23 mm aminoantipirina, 1,2 mm ferricianuro de potasio) Solución de PV 0,5 M Homogenado de tejido de cerebro de conejo con actividad acetilcolinesterasa Extracto purificado de acetilcolinesterasa con actividad de 5 UI/ml Espectrofotómetro con rango de linealidad entre 0.2 y 1,2. = 5.9 10 4 M -1 cm -1. Camino óptico 1 cm. Cubetas para el espectrofotómetro que aceptan 1 ml. Km PV = 24,5 um. a) Diseñe en forma DETALLADA el protocolo experimental para determinar actividad de acetilcolinesterasa, incluyendo: Esquema del procedimiento justificando cada uno de los pasos. Número de tubos a incluir en la determinación. Volúmenes de cada solución que integra la mezcla de reacción y orden de agregado. Tiempos y temperatura de incubación. Medidas a realizar. Procedimiento para determinar velocidad de reacción. Blancos. Expresión de los resultados. b) Defina dos unidades enzimáticas diferentes y exprese el rango de actividades por ml de homogenato que es posible determinar con el protocolo propuesto en las unidades por usted definidas.
Problema 2. Se desea caracterizar lipasas de diversos microorganismos para su posible uso en productos de limpieza. Una cepa recientemente aislada posee una lipasa extracelular de gran interés, ya que es resistente al tratamiento con detergentes diluidos y a elevados phs. Para la medición de la actividad de esta enzima se puede utilizar al p-nitrofenil laurato (p-npl). Como sustrato para producir un producto coloreado, p-nitrofenol, que puede medirse espectrofotométricamente por absorbancia a 410 nm, según la siguiente reacción: p-nitrofenil laurato + agua --------> p-nitrofenol + laurato a) Defina una unidad de actividad enzimática que sea utilizable para expresar la actividad de la lipasa b) De acuerdo a lo reportado para otras lipasas, Ud. considera conveniente estudiar la estabilidad térmica de esta lipasa. Esquematice un protocolo que permita a un colaborador suyo realizar el experimento. Debe indicarle todo pues él se restringirá a seguir sus instrucciones. NO debe realizar un protocolo numérico. c) Los resultados que su colaborador obtuvo se muestran en la Tabla 1. Tiempo (min) Temperatura de incubación de la enzima por 60 minutos ( o C). 20 30 45 55 65 80 1 5 11 10 10 4 2,8 2 11 20 22 22 13 6 5 24 48 50 51 35 19 10 52 88 89 88 70 38 Tabla 1. Estabilidad térmica de la enzima. Se reportan las concentraciones de p-nitrofenol (um) obtenidas a los tiempos indicados. Qué conclusiones obtiene respecto a la estabilidad térmica de la lipasa? Ilustre su respuesta mediante un gráfico. d) Los resultados presentados en la Tabla 1 son suficientes para calcular la energía de activación de la reacción catalizada por la enzima? Si su respuesta es afirmativa, calcúlela. Si su respuesta es negativa, indique brevemente qué necesitaría. Con el propósito de profundizar el estudio de la lipasa, Ud. decide determinar los parámetros cinéticos de la misma, utilizando la reacción antes descripta. Para ello Ud. cuenta con un extracto enzimático de 175 UI/ml y el material de laboratorio necesario para la determinación. Dispone de las siguientes soluciones y equipamiento: Buffer ph: 7,5 10X Solución de p-nitrofenil laurato 0,5 M Espectrofotómetro con rango de linealidad entre 0.1 y 1, termostatizado y capaz de tomar medidas en forma continua. ε p-nitrofenol :8 x10 3 M -1 cm -1. Camino óptico 1 cm. Cubetas para el espectrofotómetro que aceptan 1 ml. Kmp-NPL: 1,65 mm Diseñe en forma DETALLADA el protocolo experimental, incluyendo: Esquema del procedimiento justificando cada uno de los pasos. Especifique los volúmenes de cada solución que integra la mezcla de reacción y orden de agregado, los tiempos y temperatura de incubación y las medidas a realizar. Procedimiento para determinar velocidad de reacción. Blancos.
Problema 3. El ácido gamma aminobutírico (GABA) es un neurotransmisor del sistema nervioso central que se sintetiza a partir de ácido glutámico. GABA se degrada a semialdehído succínico (SAS) a través de una reacción catalizada por GABA transaminidasa. Esta reacción ocurre tanto dentro de la neurona como en el espacio sináptico. SAS luego es convertido a ácido succínico a través de la reacción catalizada por la enzima semialdehído succínico dehidrogenasa (SSADH). Con el fin último de evaluar diversos compuestos como inhibidores o estimuladores de esta vía de degradación un grupo de Investigación de la Facultad tiene como objetivo caracterizar cinéticamente a la enzima SSADH. Primeramente se pone a punto un protocolo de purificación a partir de tejido nervioso de rata. La reacción que cataliza la SSADH produce un mol de NADH por cada mol de SAS degradado. En la Tabla que se presenta a continuación se muestran los valores de velocidades iniciales de la reacción obtenidos por Ud. cuando empleó diferentes concentraciones de sustrato. [SAS] mm 1,00 1,25 1,50 1,70 2,00 2,70 vo 6,57 7,59 8,77 9,39 10,40 11,19 Los valores de v o fueron determinados en buffer 100mM Na 2 HPO 4 /NaH 2 PO 4 1mM DTT ph=7,0 a T=22,0 C; midiendo de manera continua espectrofotométricamente a 340 nm la aparición de NADH ( =6220 M -1 cm -1 ). Unidades de Vo=moles de NADH producidos en 1 ml de mezcla de reacción en un minuto. a) Cree que es necesario realizar una marcha de purificación completa si el objetivo por Ud. perseguido se refiere a la caracterización cinética de la enzima? b) La reacción catalizada por esta enzima puede ser utilizada para medir la concentración de semialdehído succínico. Indique cuál es la máxima concentración que podría medirse utilizando esta reacción. Indicar qué controles utilizaría en la determinación. c) Diseñe un protocolo de manera detallada (indicando componentes, cantidades de reactivos en la mezcla de reacción, tiempos de medida y procedimiento) que le permita determinar la actividad de SSADH en distintas muestras del proceso de purificación. Indique el rango de unidades enzimáticas internacionales por ml de muestra que puede ser determinado con su protocolo. Se dispone en el laboratorio de: Espectrofotómetro de medida continua. Cubetas de 0,5 a 2 ml. Rango de linealidad 0,2-1,0 unidades de absorbancia. Camino óptico de 1 cm, Buffer de reacción (incluye cofactores y sales) 5X, solución stock de NAD + 10 mm (K M de NAD + 2 M), solución stock de semialdehído succínico 1,0 M.
Problema 4. Durante la caracterización de la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de Camelus dromedarius, que cataliza la reacción entre gliceraldehído 3 fosfato (G3P), NAD + y fosfato para dar NADH, H + y 1,3 bifosfoglicerato se obtuvieron los siguientes datos: 120 100 80 60 Figura 1. Actividad remanente respecto a la actividad a 25 o C luego de incubar durante 10 minutos el extracto enzimático a la 40 20 0 15 25 35 45 55 65 75 85 Temperatura (ºC) 120 100 80 Figura 2. Actividad obtenida a las temperaturas indicadas. 60 40 20 0 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Temperatura (ºC) Km NAD + a 25 o C: 0,025 mm Km G3P a 25 o C: 21 mm Actividad del extracto enzimático a 25 o C: 26,3 U/mg proteína. Concentración de proteína del extracto: 1 mg/ml. Además usted sabe que ε NADH (340nm) = 6,22 10 6 cm 2 /mol y dispone en su laboratorio de buffer fosfato ph=7,5 10 X, soluciones de NAD + 10 mm, G3P 5 mm y un espectrofotómetro de medición directa con posibilidad de termostatizar la celda (rango 15-80 ºC) con un rango de linealidad entre 0,10 y 1,00 unidades de absorbancia (camino óptico: 1 cm). a) Haga un esquema del protocolo utilizado para obtener los datos de las Figuras 1 y 2. b) Diseñe de manera DETALLADA un protocolo con el fin de determinar el Km por el G3P a 30 o C indicando reactivos, orden de agregado, volúmenes de los diferentes reactivos, tiempos de incubación, procedimiento para determinar velocidades de reacción, blancos. 1 U: cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 mm de NADH en un minuto a 25 o C a concentración de sustrato saturante.