Enraizamiento in vitro de citrus macrophylla en medios salinos: parámetros fisiológicos y de crecimiento O. Pérez-Tornero, C.I. Tallón, S. Andujar, B. García-Olmos, I. Porras, y J.M. Navarro Departamento de Citricultura. IMIDA. C/Mayor s/n, 30150 La Alberca, Murcia (España). E-mail: olalla.perez@carm.es Palabras clave: clorofila, compuestos de amonio cuaternario (CAC), crecimiento, cultivo in vitro, iones, prolina, salinidad. Resumen La salinidad es uno de los mayores estreses abióticos que afectan a la agricultura en todo el mundo. En el presente estudio ha sido analizado el efecto del estrés salino sobre diversos parámetros fisiológicos y de crecimiento de explantos in vitro de Citrus macrophylla en medio de enraizamiento. Para este propósito, explantos micropropagados de este patrón de cítricos fueron cultivados en medio de enraizamiento con seis concentraciones diferentes de NaCl (0, 20, 40, 60, 80 y 100 mm). Después de cuatro semanas en cultivo, los parámetros de enraizamiento (porcentaje de enraizamiento, longitud de los brotes, número y longitud de las raíces) disminuyeron de manera significativa con la salinidad, lo cual estuvo acompañado por síntomas visibles de daños producidos por la sal en los brotes. El porcentaje de enraizamiento disminuyó desde un 87% con 0 mm de NaCl hasta un 30% con 100 mm de NaCl, y el número de raíces por explanto desde 3.9 a 1.8 con estas concentraciones salinas. Los explantos exhibieron una apariencia clorótica desde 60 mm de NaCl, mostrando una disminución significativa de la clorofila total con el aumento de la concentración de NaCl. La concentración de Na + y Cl - en los explantos aumentó de manera significativa con la salinidad. Aunque no se observaron diferencias significativas para el K +, Mg 2+ o el Fe, las concentraciones de Ca 2+, NO 3 - y P disminuyeron de manera significativa con la sal. Las concentraciones de prolina y compuestos de amonio cuaternario (CAC) no estuvieron afectadas por la sal. Los resultados de este estudio muestran el potencial de la utilización del cultivo in vitro de tejidos vegetales para la evaluación de la tolerancia de los cítricos a la salinidad. INTRODUCCIÓN La salinidad es uno de los mayores estreses abióticos que causan efectos adversos en el crecimiento de las plantas y en la productividad de los cultivos (Zhu, 2002). El estudio de los mecanismos de tolerancia al estrés salino es crítico para entender las respuestas de las plantas a la salinidad. Los cítricos son un cultivo sensible a la salinidad (Maas, 1990) que sufren cambios fisiológicos y reducción del crecimiento incluso en condiciones de baja salinidad (Walker et al., 1982). Estudios de salinidad en cítricos son muy necesarios. El cultivo de plantas in vitro es un sistema simple que ofrece una alternativa al estudio de los mecanismos fisiológicos de tolerancia a la salinidad, ya que proporciona una respuesta relativamente rápida en un tiempo de generación corto y con unas condiciones controladas, especialmente en especies leñosas que tienen ciclos reproductivos largos (Torregrosa y Bouquet, 1993). 117
En el presente trabajo de investigación se muestra la respuesta de explantos de Citrus macrophylla cultivados in vitro en un medio de enraizamiento con diferentes concentraciones de NaCl, en relación a varios parámetros fisiológicos y de crecimiento. MATERIALES Y MÉTODOS Para los ensayos de enraizamiento se utilizaron brotes de 20 mm de longitud procedentes de cultivos en proliferación de Citrus macrophylla. El medio de enraizamiento utilizado estuvo formado por macronutrientes, micronutrientes y vitaminas de DKW (Driver y Kuniyuki, 1984), suplementados con 4.9 µm de ácido indol-butírico (IBA), 5.7 µm de ácido indol-acético (IAA), 25 mg L -1 de Floroglucinol, 30 g L -1 de sacarosa y 6 g L -1 de agar (Hispanlab). El estrés salino fue producido utilizando 6 concentraciones diferentes de NaCl (0, 20, 40, 60, 80 y 100 mm). Cada tratamiento estuvo formado por 4 repeticiones (tarros) con 10 explantos por tarro. La toma de datos se hizo a las cuatro semanas desde el comienzo del ensayo y se midieron parámetros de crecimiento (porcentaje de enraizamiento, longitud del brote, número y longitud de las raíces), el número de hojas caídas y dañadas, estado nutricional y concentración de clorofila. Para la determinación de los parámetros fisiológicos se utilizaron hojas y tallos. Las plantas se pesaron en fresco y se liofilizaron. Las muestras secas y molidas se digirieron por vía seca y se analizó la concentración de Na +, K +, Mg 2+, Ca 2+ y Fe mediante un ICP (Varian MPX Vista). Los iones Cl - y NO - 3 se extrajeron con agua bidestilada utilizando el método de Guilliam (1971), y se determinaron mediante un cromatógrafo iónico Dionex ICS-3000 con una columna de intercambio aniónico AS11- HC. El contenido de clorofila se determinó mediante el procedimiento descrito por Inskeep y Bloom (1985) utilizando 20 mg de material liofilizado. El malondialdehido (MDA) se midió siguiendo el procedimiento descrito por Heath y Packer (1968) y la prolina se analizó utilizando una modificación del método de la ninhidrina ácida (Bates et al., 1973). Los compuestos de amonio cuaternario (CAC) se determinaron mediante el método de Grieve y Grattan (1983), utilizando 25 mg de material liofilizado. Los datos obtenidos fueron sometidos a tratamiento estadístico realizando un análisis de la varianza (ANOVA) y la diferencia entre las medias fue determinada con un test de separación múltiple de medias LSD (Least Significant Difference). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Después de 4 semanas en cultivo, los parámetros de crecimiento estuvieron afectados significativamente por la salinidad. Todos los parámetros disminuyeron desde 40 mm de NaCl y los valores más bajos se obtuvieron con 80 ó 100 mm de NaCl (Tabla 1 y Figura 1a). El porcentaje de enraizamiento disminuyó desde un 87% con 0 mm de NaCl hasta un 30% con 100 mm de NaCl (Figura 1a). Estos resultados son diferentes a los observados por Shiyab et al. (2003) en explantos de naranjo amargo cultivado in vitro a partir de semillas. Este material produjo un 80% de enraizamiento con 0, 50 o 100 mm de NaCl y los explantos no enraizaron cuando fueron cultivados con 150 mm de NaCl o más. El número y la longitud de las raíces por explanto enraizado también disminuyeron con la salinidad. Los dos parámetros se redujeron en aproximadamente un 45% al aumentar la sal desde 0 hasta 100 mm NaCl (Tabla 1). Otros autores también han observado el efecto negativo de la salinidad en estos parámetros. En explantos de maíz, el 118
número y la longitud de las raíces disminuyeron cuando fueron expuestos a 100 mm de NaCl, con respecto al control (Evlagon et al., 1992) y resultados similares fueron también observados en otras especies (Munns, 1993; Smith et al., 1992). La salinidad también afectó de manera significativa a la longitud de los brotes (Tabla 1). Está bien establecido que la fotosíntesis disminuye con el estrés, y esto viene acompañado por la degradación de la clorofila (Srivastava et al., 1988). Diferentes autores han observado que altas concentraciones de NaCl aplicadas en condiciones in vitro redujeron de manera significativa el contenido de clorofila en los explantos (Charbaji y Ayyoubi, 2004; Sotiropoulos, 2007). En nuestro estudio, la concentración de clorofila total en los explantos disminuyó de manera significativa con el aumento de la salinidad. Con 100 mm de NaCl la clorofila disminuyó en un 62% con respecto a 0 mm de NaCl (Figura 1b) y se observaron explantos con hojas cloróticas desde una concentración de 40 mm de NaCl. Las concentraciones de Na + y Cl - aumentaron significativamente con la salinidad en los explantos de Macrophylla (Figura 2). Este aumento es una respuesta esperada y común y se ha observado en otras especies cultivadas in vitro (Mills et al., 2001; Sotiropoulos, 2007). En plantas con una pobre capacidad de excluir de iones salinos, pueden producirse daños en las hojas debidos a la acumulación de Na + y/o Cl - (Munns, 1988; Flowers y Yeo, 1986). En Citrus macrophylla también se observaron daños producidos por la sal con la presencia de alguna hoja dañada con 40 mm de NaCl y hojas dañadas y caídas desde 60 mm de NaCl (Tabla 1). En cítricos cultivados in vivo, la acumulación de cloruro es la principal causa de toxicidad producida por la sal (Moya et al., 2003). En explantos de Macrophylla, el contenido de sodio y cloruro en los explantos aumentó 6.8 y 7.7 veces, respectivamente, en 100 mm de NaCl con respecto al control (Figura 2). Las concentraciones de NO - 3, Ca 2+ y P en las plantas estuvieron también afectadas por la salinidad del medio de cultivo. El NaCl redujo de manera significativa las concentraciones de Ca 2+ y P (Tabla 2); resultados similares fueron observados en naranjo amargo por otros autores (Shiyab et al., 2003). Las concentraciones de Fe, Mg 2+ y K + no estuvieron afectadas de manera significativa por el aumento de la salinidad (Tabla 2). Con respecto al NO - 3, la salinidad redujo significativamente su concentración en los explantos de Macrophylla cultivados in vitro. Esto podría ser debido a un efecto antagónico del Cl - en la absorción de NO - 3 (Grattan y Grieve, 1999). Cerezo et al. (1997) mostraron que la acumulación de Cl - en cítricos redujo de un 70-80% la concentración de NO - 3. En explantos de Citrus macrophylla cultivados in vitro la concentración de NO - 3 en 100 mm de NaCl se redujo un 64% con respecto al control. La prolina y los compuestos de amonio cuaternario (CAC) se encuentran normalmente involucrados en sistema de tolerancia a la sal (Flowers et al., 1986; Giridara et al., 2000). El análisis de tolerancia a la sal relacionado con la producción de osmolitos en el cultivo de tejidos ha ganado interés en los últimos años (Singh et al., 2000; Watanabe et al., 2000; Zhang et al., 2004). Estos autores han observado un aumento de estos compuestos en condiciones de salinidad. Aunque la salinidad produjo un incremento tanto de la prolina como de los CAC en explantos de Citrus macrophylla en enraizamiento, este aumento no fue significativo en ninguno de los dos casos (Tabla 3). 119
Agradecimientos Esta investigación ha sido financiada por el Instituto Nacional de Investigación Agraria a través del proyecto RTA2007-00094-00-00. Referencias Cerezo, M., García-Agustín, P., Serna, M. D. and Primo-Millo, E. 1997. Plant Science 126:105-112 Charbaji, T. and Ayyoubi, Z. 2004. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 40:221-224. Driver, J.A. and Kuniyuki, A.H.. 1984. HortScience 19:507-509. Evlagon, D., Ravina, I. and Neumann, P.M. 1992. J. Plant Nutr. 15: 795-803. Flowers, T.J. and Yeo, A.R. 1986. Austral. J. Plant Physiol. 13:75-91. Flowers, T.J., Hajibaguerri, M.A. and Clipson, M.C.W. 1986. Quart. Rev. Biol. 61: 313-337. Giridara, K.S., Madhusudhan, K.V., Sreenivasulu, N. and Sudhakar, C. 2000. Indian J. Exp. Biol. 38: 192-195. Grattan, S.R. and Grieve, C.M. 1999. Sci. Hort. 78: 127-157. Maas, E.V. 1990. Crop salt tolerance. pp: 262-304. En: Tanji, K.K. (ed.), Agricultural Salinity Assessment and Management. American Society of Civil Engineers. Manual and Reports on Engineering Nº 71, ASCE: New York. Mills, D., Zhang, G.F. and Benzioni, A. 2001. J. Plant Physiol. 158: 1031-1039. Moya, J.L., Gómez-Cadenas, A., Primo-Millo, E. and Talon, M. 2003. J. Exp. Bot. 54:825-833. Munns, R. 1988. Plant Cell Environ. 11:283-289. Munns, R. 1993. Plant Cell Environ. 16: 15-24. Shiyab, S. M., Shibli, R. A. and Mohammad, M. M. 2003. J. Plant Nutr. 26: 985-996. Singh, S.K., Sharma, H.C., Goswami, H.M., Datta, S.P. and Singh, S.P. 2000. Biol. Plant. 43: 283-286. Smith, M.A.L., Spomer, L.A., Shibli, R.A. and Knight, S.L. 1992. J. Plant Nutr. 15: 2329-2341. Sotiropoulos, T.E. 2007. Biol. Plant. 51:177-180. Srivastava, T.P., Gupta, S.C., Lal, P., Muralla, P.N. and Kumar, A. 1988. Ann. Arid Zone. 27: 197-204. Torregrosa, L. and Bouquet, A. 1993. Prog. Agri. Vit. 5/6: 113-114. Walker R.R., Törökfalvy, E. and Downton, W.J.S. 1982. Austral. J. Plant Physiol. 9: 783 790. Watanabe, S., Kojima, K., Ide, Y. and Sasaki, S. 2000. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 63: 199-206. Zhang, F., Yang, Y.L., He, W.L., Zhao, X. and Zhang, L.X. 2004. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 40:491-494. Zhu, J.K. 2002. Annu. Rev. Plant Biol. 53: 247-273. 120
Tabla 1. Efecto de distintas concentraciones de NaCl sobre diferentes parámetros de crecimiento y el porcentaje de hojas dañadas y caídas de explantos de Citrus macrophylla cultivados en medio de enraizamiento. Longitud del brote (mm) Número de raíces Longitud de las raíces(mm) Hojas dañadas (%) Hojas caídas (%) 0 28.8a 3.2a 25.8a 0c 0b 20 30.3a 3.1ab 23.6ab 0c 0b 40 26.3b 2.9ab 20.7bc 10.0c 0b 60 25.4bc 2.5bc 17.5c 12.5bc 5.0b 80 24.3c 2.0c 18.6c 26.7b 3.3b 100 24.2c 1.8c 13.5d 67.5a 20.0a ANOVA NaCl *** *** *** *** *** Medias seguidas de la misma letra en la misma columna significan diferencias no significativas de acuerdo al test LSD. *** indica diferencias significativas a un nivel de probabilidad P<0.001. Diferencias no significativas a un nivel de probabilidad de 0.05 se muestran con n.s. Tabla 2. Efecto de diferentes concentraciones de NaCl sobre las concentraciones de Ca2+, Fe, K+, Mg2+, P y NO3- (mmol kg-1 MS) de explantos de Citrus macrophylla cultivados en medio de enraizamiento. Ca 2+ K + Mg 2+ P Fe NO 3-0 230.8a 506.0 73.9 125.5a 3.2 52.4a 20 187.8b 540.9 80.2 127.4a 4.2 45.5a 40 183.9b 602.0 75.0 119.5a 3.8 44.7a 60 184.8b 636.5 73.9 98.0b 4.3 23.2b 80 164.8b 579.7 70.4 93.6b 3.7 25.5b 100 189.7b 618.8 74.4 95.0b 4.3 19.1b ANOVA NaCl * n.s. n.s. * n.s. *** Medias seguidas de la misma letra en la misma columna significan diferencias no significativas de acuerdo al test LSD. *, *** indican diferencias significativas a niveles de probabilidad P<0.05 y P<0.001, respectivamente. Diferencias no significativas a un nivel de probabilidad de 0.05 se muestran con n.s. Tabla 3. Efecto de diferentes concentraciones de NaCl sobre las concentraciones de prolina y compuestos de amonio cuaternario (CAC) de explantos de Citrus macrophylla cultivados en medio de enraizamiento. CAC Prolina (g kg -1 MS) 0 6.5 1.6 20 7.2 1.6 40 8.6 1.8 60 9.0 2.1 80 9.5 2.0 100 10.7 2.1 ANOVA NaCl n.s. n.s. Diferencias no significativas a un nivel de probabilidad de 0.05 se muestran con n.s. 121
100 a 5 b Enraizamiento (%) 80 60 40 20 NaCl *** NaCl *** Clorofila (g kg -1 MS) 4 3 2 0 1 Fig. 1.- Porcentaje de enraizamiento (a) y concentración de clorofila (b) de explantos de Citrus macrophylla cultivados en medio de enraizamiento con concentraciones crecientes de NaCl (0, 20, 40, 60, 80 y 100 mm). *** indica diferencias significativas a niveles de probabilidad P<0.001. 1000 800 a b 1400 1200 Na + (mmol kg -1 MS) 600 400 1000 800 600 400 Cl - (mmol kg -1 MS) 200 NaCl *** NaCl *** 200 0 0 Fig. 2.- Concentraciones de sodio (a) y cloruro (b) en explantos de Citrus macrophylla cultivados en medio de enraizamiento con concentraciones crecientes de NaCl (0, 20, 40, 60, 80 y 100 mm). *** indica diferencias significativas a niveles de probabilidad P<0.001. 122