GUÍAS DE PROBLEMAS Guía Nº1: Problemas de Métodos Enzimáticos Problema 1. Usted está a cargo de un laboratorio de control. Dicho laboratorio emplea para determinar glucosa el método enzimático oficial del AOAC. Un analista nuevo a su cargo analizó jugos concentrados y sus resultados dieron por defecto. Luego de revisar con él los distintos pasos del análisis observó que este empleado realizaba la dilución luego de la reacción y no inicialmente. Por qué sus resultados dieron por defecto? Problema 2. Describa los pasos que seguiría para determinar: a.- la actividad de invertasa en una muestra incógnita. b.- la resistencia térmica de una invertasa en un alimento. Problema 3. Se desea determinar la actividad de la enzima invertasa. a. En condiciones óptimas de reacción, a qué concentración de sacarosa expresada en µg/l trabajaría? b. Si se quisiera usar la enzima del ítem anterior para cuantificar sacarosa en un jarabe cuya concentración aproximada es 10 g sac/100 ml, Cómo realizaría la dilución y con qué material? Datos: M sac = 342 K m = 10-8 M Problema 4. La limonina (PM= 136.21) es un compuesto amargo común en frutas cítricas que se encuentra en niveles de 2-5 mg/l. Una compañía productora de jugos cítricos aisló una limoninasa (enzima que específicamente degrada limonina a un compuesto insaboro) y han estado tratando de mejorar el sabor de un jugo sudamericano reduciendo la concentración de limonina. Sin embargo, sus resultados no han sido buenos. Observaron que al alimentar una columna con la enzima inmovilizada, a mayor concentración de limonina en el jugo, mayor era la velocidad de degradación. Por ejemplo: para una alimentación con [limonina] jugo = 2 mg/l, se degradaban 0.2 unidades arbitrarias/min y para una alimentación con [limonina] jugo = 5 mg/l, se degradaban 0.5 unidades arbitrarias/min a. Cómo se explica que a mayor concentración de limonina la degradación es mayor? b. Se agregan varias concentraciones conocidas de limonina a jugos libres de limonina, y se determina la velocidad de reacción obteniéndose los siguientes resultados. limonina (mg/l) 1 2 4 6 8 10 12 14 velocidad (UA/min) 0,1 0,6 0,9 0,95 0,95 0,96 0,97 0,98 Por qué se realizó este experimento? c. Cuál es el K m y V máx para la enzima? d. Sugiera una solución ingenieril y una solución biológica que pueda hacer que este sistema de enzima inmovilizada trabaje adecuadamente.
Problema 5. Se desea estudiar el efecto de diferentes inhibidores sobre la actividad de la enzima polifenoloxidasa de pera. Para ello se obtiene un extracto de pera realizando un homogenato de 100 g de pera y 100 ml de buffer fosfato 0,5 M, a ph 7 a 4 ºC. Luego se realiza una centrifugación, y el sobrenadante se utiliza como extracto enzimático. Posteriormente se incuba el extracto en presencia de sustrato (ácido clorogénico) y de soluciones 15 mm de ácido ascórbico o ácido cítrico. La actividad de la enzima se sigue midiendo la absorbancia a 420 nm cada 10 segundos durante 90 segundos. Actividad de PPO a 25ºC Absorbancia 420 nm 1.0 Control 0.8 0.6 0.4 0.2 Ácido ascórbico Ácido cítrico 0.0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tiempo, seg. a. Determinar el porcentaje de inhibición para ambos inhibidores empleando la siguiente ecuación: % v = 1 inicial+ inh inhibición 100 vinicial control b. Qué concentración de sustrato deberá emplear para realizar este ensayo? Problema 6. Se desea determinar la concentración de glucosa en un jarabe empleando el método enzimático que contiene las enzimas glucosa oxidasa y peroxidasa. Para ello se pesan 2g de muestra, se llevan a 25 ml en un matraz y se disuelven completamente. Luego se toman 0,25 ml de esta solución y se llevan a 10 ml en un matraz, esta es la muestra sobre la que se realizará la medición. La determinación de glucosa se realiza siguiendo el protocolo correspondiente a las reacciones enzimáticas mencionadas y se mide la absorbancia a 505 nm. Paralelamente se realiza una curva de calibración con una solución de glucosa pura. Absorbancia a 505 nm 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 y= 0.37 x Curva de calibración 0.0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 glucosa, g/l
Explique brevemente: a) Por qué debe realizar una dilución previa del jarabe? b) Por qué se requiere el uso de dos enzimas para realizar esta determinación? c) Cómo procedería si la absorbancia de la muestra diera valores fuera del rango lineal de la curva? d) Si se obtiene un valor de absorbancia a 505 nm de 0,28 para la muestra, qué concentración de glucosa tiene el jarabe? Problema 7. Se desea desarrollar una leche para personas intolerantes a la lactosa con un contenido máximo del 30 % de la lactosa inicial de la leche. Para ello se realizaron estudios previos empleando una enzima lactasa comercial para la hidrólisis de lactosa. Con el fin de seleccionar las condiciones óptimas del proceso, la reacción se llevó a cabo a 30 ºC y a 37 ºC. Se siguió el siguiente procedimiento: 1. Colocar 8 ml de leche en un tubo de ensayo. 2. Agregar 8 ml de agua a cada tubo. 3. Preincubar 10 minutos en baño de agua a 30 ºC ó 37 ºC según corresponda durante 40 minutos. 4. Agregar 100 µl de enzima a cada tubo. 5. Agitar en vortex. 6. Inmediatamente retirar una alícuota de 0,5 ml de cada muestra y colocar en tubos de ensayo, e inactivar la enzima colocando los tubos a 100ºC (baño de agua) durante 3 minutos. 7. Colocar las muestras en baño de agua 30 ºC ó 37 ºC según corresponda. Incubar durante 40 minutos. 8. Al cabo de los 40 minutos, retirar alícuotas de 0,5 ml en tubos de ensayo e inactivar la enzima colocando los tubos a 100 ºC durante 3 minutos. 9. Determinar la concentración de glucosa de las distintas alícuotas mediante un método enzimático (glucosa oxidasa-peroxidasa). Se obtuvieron los siguientes resultados luego de emplear el método enzimático para determinar glucosa: Muestra Absorbancia promedio a 505 nm 0 min a 30 ºC 0.020 40 min a 30 ºC 0.526 0 min a 37 ºC 0.022 40 min a 37 ºC 0.914 Datos: Curva de calibración del método para determinar glucosa: A 505 nm = 0,1 g/l de glucosa PM lactosa= 342 PM glucosa= 180 Concentración inicial de lactosa en la leche= 4,7 % En base a los resultados obtenidos responda brevemente: a) Se logró obtener el producto deseado en alguna de las condiciones estudiadas? b) Qué variables se podrían ajustar para optimizar el proceso? c) Por qué debe realizar una dilución previa de la leche?
d) Por qué se requiere el uso de dos enzimas para realizar la determinación de glucosa? e) Cómo procedería si la absorbancia de la muestra diera valores fuera del rango lineal de la curva de calibración? Problema 8. Se desea determinar la concentración de etanol en vino blanco empleando un método enzimático comercial. La determinación se realiza siguiendo el protocolo correspondiente al método enzimático y se mide la absorbancia a 340 nm. Paralelamente se realiza una curva de calibración empleando un estándar de etanol, sabiendo que el rango lineal del ensayo está entre 0.25 y 20 ug/l de etanol. alcohol deshidrogenasa etanol + NAD + acetaldehído + NADH + H + aldehído deshidrogenasa acetaldehído + NAD + + H 2 O ácido acético + NADH + H + Curva de calibración Absorbancia a 340 nm 0.20 0.15 0.10 0.05 y= 8.913 x 0.00 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 Etanol, µg/l Explique brevemente: a) Por qué se requiere el uso de dos enzimas para realizar esta determinación? b) Determine la concentración de etanol en las siguientes muestras de vino: a. Muestra 1: se toma 1 ml de vino blanco y se lleva a 100 ml (con agua destilada) en un matraz. Luego se toman 0.25 ml y se llevan a 25 ml en un matraz. Sobre esta muestra se realiza la medición de absorbancia a 340 nm y se obtiene un valor de absorbancia de 0,1. b. Muestra 2: se toma 1 ml de vino blanco y se lleva a 100 ml (con agua destilada) en un matraz. Sobre esta muestra se realiza la medición de absorbancia a 340 nm y se obtiene un valor de absorbancia de 0,95. Problema 9. a. Interprete la técnica que el AOAC describe para identificar la presencia de soja en productos cárnicos. b.- Para qué otros analitos y en qué alimentos el AOAC propone como uno de los métodos de análisis un ELISA? Problema 10. Las sulfonamidas son derivados del ácido sulfanílico con actividad antimicrobiana, que se administran tanto a ganado como a colonias de abejas. Esto
puede resultar en residuos ilegales en alimentos. Se han propuesto métodos de ELISA para la determinación de sulfonamidas. Explique en qué consisten Cuáles serían las ventajas de la aplicación de estos métodos? Y las desventajas? Problema 11. La ingesta de proteínas (fundamentalmente gliadinas) de trigo, cebada centeno y avena (TACC) produce en individuos susceptibles (celíacos) cambios a nivel de la mucosa del intestino delgado que conducen al desarrollo de un síndrome de mala absorción. En individuos susceptibles, 100 mg de gliadinas pueden causar la aparición de síntomas clínicos. Se estima que 1 de cada 200 personas padece esta enfermedad. Como laboratorista de un organismo de control, usted debe evaluar si unas galletas, en cuyo rótulo se lee libre de TACC, son realmente aptas para celíacos. Para ello dispone de los siguientes reactivos: - soporte cubierto con Ab1 (anti-gliadina) - Ab2 (anti-gliadina) - Ab3 conjugado a HRP rábano (peroxidasa de rábano) - TMB (sustrato de la peroxidasa) a.- Cómo haría la determinación de gliadinas? Señale paso a paso, esquemática y claramente las etapas a seguir. Además de la muestra, considere al blanco y al testigo. Para armar esta secuencia necesitó hacer alguna suposición? b.- Grafique cómo varía la señal en función de la concentración de analito. c.- Si las señales obtenidas al correr blanco, testigo y muestra son S B, S T y S M respectivamente, cómo haría los cálculos para informar sus datos experimentales? d.- Si en vez del soporte recubierto con Ab1 (anti-gliadina) usted dispusiera de uno recubierto con gliadina, podría hacer la determinación en cuestión? Nota: Salvo la modificación recién indicada, usted dispone del resto de los reactivos citados. e.- Podría usted determinar gliadinas por los métodos más habitualmente usados en el análisis de proteínas? Problema 12. Se desea diseñar un test de ELISA para determinar semillas de maíz transgénicas que toleran glufosinato de sodio (herbicida). Se sabe que estas semillas producen una proteína A que no está presente en las semillas no modificadas genéticamente. Un anticuerpo anti proteína A (anticuerpo 1) se conjugó con una enzima peroxidasa. a. Se desea caracterizar a la enzima conjugada para evaluar si tiene una actividad adecuada para utilizarla en el ensayo de ELISA: i. Explique brevemente cómo lo haría. ii. Qué requerimientos debe cumplir la enzima para poder ser utilizada? b. Diseñe un test de ELISA: i. Elija los materiales a utilizar a partir de los disponibles en la lista. ii. Explique brevemente los pasos a seguir al utilizar el test. Tenga en cuenta el blanco y el control. iii. Para su diseño, indique cómo sería la curva de la señal en función de la concentración. Se dispone de: - Anticuerpo 1 (anti proteína A) - Anticuerpo 2 (anti anticuerpo 1) - Anticuerpo 1 (anti proteína A) conjugado con la enzima peroxidasa - Anticuerpo 1 (anti proteína A) conjugado con la enzima beta-galactosidasa - Enzima peroxidasa
- Soporte multicelda recubierto de proteína A - Soporte multicelda recubierto de anticuerpo anti proteína A - Suspensión de proteínas de maíz transgénico - Suspensión de proteínas de maíz no modificado genéticamente - Sustrato de la peroxidasa - Buffer - Baños termostáticos - Lector de ELISA Problema 13. Existe un ensayo comercial cuantitativo rápido para medir la concentración de deoxinivalenol (DON) en cereales, granos, nueces, y otros productos incluyendo alimento animal (balanceados). Sus características son: Límite de detección: 0,2 ppm. Filtro de lectura: 450 nm La extracción de la muestra se realiza con agua destilada. No son necesarios pasos previos de dilución. Tiempo total de incubación: 15 minutos. Los resultados pueden leerse hasta 1 hora después de haber parado la reacción. Los componentes del producto son: Placa de 96 celdas recubiertas con anticuerpos anti DON. 1 frasco con un estándar o patrón de la micotoxina específica (Deoxinivalenol). Botella con anticuerpo conjugado con enzima peroxidasa. Botella con sustrato de la enzima peroxidasa. Solución STOP (detiene la reacción enzimática). a. Explique brevemente los pasos a seguir para determinar la concentración de DON en cereales empleando este ensayo. Tenga en cuenta el blanco y el control. b. Indique cómo sería la curva de la señal en función de la concentración. Problema 14. Existen individuos que experimentan reacciones del tipo alérgico al consumir distintos alimentos. La β-lactoglobulina que es una proteína que se encuentra en la leche de vaca principalmente es uno de los principales alergenos. Esta proteína es el componente principal del suero lácteo que se obtiene como subproducto en la elaboración de quesos, y como es una fracción rica en proteínas y azúcares suele adicionarse en diversos alimentos con el fin de enriquecer su valor nutricional. Con el fin de evaluar su presencia en los alimentos se desarrolló un kit con el método de ELISA, cuyos reactivos suministrados se enumeran a continuación: Microplaca con: 96 Micropozos revestidos de β-lactoglobulina 96 Pozos de dilución Frascos conteniendo: 5 cada uno con: 1.5 ml de estándares de β-lactoglobulina de (0,1, 0.25, 1.0, 2.5, 5.0 ppm) 25ml de anticuerpo anti β-lactoglobulina. 25ml de anticuerpo anti inmunoglobulina conjugado con enzima peroxidasa 15ml de sustrato Tetrametilbencidina (TMB) 15ml de buffer
15ml ácido sulfúrico (solución STOP) La tetrametilbencidina (TMB) reacciona con la peroxidasa dando un compuesto que al reaccionar con el ácido sulfúrico (solución STOP) da un compuesto amarillo que absorbe a 450 nm. a. Haga un esquema de cómo sería el ensayo teniendo en cuenta el blanco, curva de calibración, control negativo y muestra. b. Indique cómo sería la curva de la señal en función de la concentración. Problema 15. El test de sensibilidad alimentaria detecta elevaciones de anticuerpos IgG anti-alimentarios. La prueba es una técnica ELISA que estudia la sensibilidad del suero de un paciente contra un panel de antígenos alimentarios. La susceptibilidad individual a cada uno de los alimentos estudiados, es lo que determina el test de la intolerancia alimentaria, útil para la creación de una dieta personalizada y adecuada para paliar la sintomatología causada por la ingesta de estos alimentos. Diseñe un test de ELISA para detectar intolerancia a las almendras: Explique brevemente los pasos a seguir para determinar si una persona es intolerante a las almendras empleando un test de ELISA. Tenga en cuenta el blanco y el control. Considere que dispone de todos los materiales que necesita.