Determinación de proteínas, carbohidratos y lípidos en semillas

Transcripción

1 Determinación de proteínas, carbohidratos y lípidos en semillas de ajonjolí germinadas y sin germinar Objetivo: encontrar la variación de los compuestos de reserva de la semilla de ajonjolí en su germinación para llegar a plántula y su relación metabólica. Palabras clave: germinación, lípidos, carbohidratos, proteínas, ajonjolí, ciclo del glioxilato. Germinación de las semillas de ajonjolí El ajonjolí es una semilla con un alto contenido de aceite que va del 55 al 50% de su peso total. La semilla de ajonjolí requiere temperaturas altas y uniformes de entre 27 y 30 C para germinar. Es muy importante lavarse muy bien las manos antes de iniciar las manipulaciones para evitar que las semillas se contaminen. Pese tres lotes de semillas de ajonjolí, cada uno de 0.5 g. Cada lote de semillas se coloca en un frasco Gerber NO estéril. Las semillas se desinfectan con 25 ml de una solución de hipoclorito de sodio al 1% por 5 min., para facilitar el lavado el frasco se tapa con una capa de gasa sujetada por una liga y las semillas se enjuagan perfectamente con agua estéril, hasta que el olor del cloro desaparezca. Etiquete sus frascos Gerber estériles y humedezca el papel filtro del frasco con agua estéril, introduzca las semillas a cada frasco (con la ayuda de una espátula) cuidando que no queden por debajo del papel filtro, agrégueles agua estéril resbalándola por la pared del frasco, suficiente para iniciar el proceso, pero sin dejar a las semillas totalmente cubiertas de agua para evitar que se ahoguen. Ponga a incubar sus frascos a 28 C, y revise sus semillas al siguiente día para verificar que tengan el agua suficiente; si es necesario agrégueles más agua. OJO NO confundan las raicillas con contaminación! Las semillas se dejan incubar cuatro días. El día de la práctica pese tres lotes de semillas de ajonjolí, cada uno de 0.5 g. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS 1. Los lotes de semillas sin germinar y germinadas se muelen en morteros fríos, y se les agrega a cada uno 10 ml de amortiguador de fosfatos ph 7.5, MgCl 3 mm para homogeneizarlos. 2. Los homogeneizados se centrifugan a rpm durante 15 min. 3. Si es necesario, los sobrenadantes se filtran para que queden claros y se mantienen en frío mientras se utilizan. 4. Se toman 150 μl y se colocan en un tubo de microfuga, se agregan 75 μl de TCA 10%, esto se hace por duplicado para cada lote. Se agita en un vórtex. 5. Los tubos se centrifugan a rpm, por 5 min en una microfuga. 6. El sobrenadante se descarta y el precipitado se resuspende en 3 ml de una solución 1:1 de SDS 10% y NaOH 0.8 N.

2 7. Se lee a 280 nm contra un blanco de la solución SDS/NaOH. 8. Para realizar los cálculos de concentración de proteínas tome en cuenta los valores del Ε y el PM de la albúmina. DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS Tabla Los lotes de semillas sin germinar y germinadas se muelen en morteros fríos, y se les agrega a cada uno 5 ml de etanol al 75% frío, se filtran los homogeneizados en tubos de centrifuga, se agregan 5 ml mas de etanol a cada mortero para lavarlos y añadirlo a los tubos. 2. Los homogeneizados se centrifugan a rpm durante 15 min. 3. Si es necesario, los sobrenadantes se filtran para que queden claros y se mantienen en frío mientras se utilizan. 4. Preparar tubos con los reactivos que se indican en la tabla 1: Sol. patrón de glucosa (ml) H 2O destilada Extracto enzimático sin germinar diluido 1: Extracto enzimático sin germinar diluido 1: Extracto enzimático germinado diluido 1: Extracto enzimático sin germinar diluido 1: Los tubos se agitan en el vórtex Los siguientes pasos se realizan en la campana de extracción!!! Fenol 5% (ml) Los tubos se agitan con cuidado en el vórtex H 2SO Agite con cuidado en el vórtex pues la reacción es exotérmica y la temperatura puede aumentar hasta 110 C. Deje enfriar a temperatura ambiente no en hielo.

3 Lea los tubos a 485 nm en el espectrofotómetro. El tubo 12 corresponde al blanco de reactivos. DETERMINACIÓN DE LÍPIDOS 1. Se pesan dos vasos de precipitados de 50 ml y se marcan: lote sin germinar y lote germinado. 2. Los dos lotes de semillas se muelen en morteros fríos y se homogeneizan con 10 ml de cloroformo-metanol frío, evite que las semillas germinadas lleven agua séquelas con papel. 3. Los homogeneizados se filtran con gasa en tubos de centrífuga de 50 ml. 4. Se centrifuga a rpm durante 5 min. 5. Se colectan los sobrenadantes en otros tubos de centrifuga con ayuda de una pipeta pasteur. 6. Los precipitados se vuelven a homogeneizar con 5 ml de cloroformo-metanol cada uno y los sobrenadantes se pasan a otros tubos de centrífuga. 7. Se centrifuga a 3000 rpm durante 5 min. 8. Si se observa que los sobrenadantes tienen agua, se agregan 10 mg de sulfato de sodio anhidro. 9. Los dos sobrenadantes de cada lote de semillas, se juntan en sus respectivos vasos con ayuda de una pipeta pasteur. 10. Se eliminan los solventes mediante calentamiento en baño maría. 11. Los vasos se pesan. 12. Calcule la cantidad de lípidos presente en cada muestra por diferencia de pesos entre los vasos vacíos y los vasos con lípidos después de eliminar los solventes (si usó sulfato de sodio, descuente el peso de éste del peso final de su vaso de precipitado). RESULTADOS Reporte para cada lote de semillas germinadas y sin germinar: mg de proteína/ml de homogeneizado semillas sin germinar semillas germinadas (4 días) mg de proteína/g de semilla µ g de carbohidrato/ ml de homogeneizado µ g de carbohidrato/ g de semilla mg de lípido/g de semilla

4 Análisis Conclusiones Apéndice Composición Nutricional: Los datos de la composición nutricional se deben interpretar por 100 g de la porción comestible. COMPUESTO CANTIDAD Calorías 570 Kcal Agua 3 g Proteína g Grasa 48 g Cenizas 8 g Carbohidratos g Fibra 9.3 g Calcio 420 mg Hierro 2.51 mg Fósforo 762 mg Vitamina C 0.0 mg Fuente: La planta contiene entre 50% y 60% de aceites los cuales son de alta estabilidad, dada la presencia de antioxidantes naturales como la sesamolina, sesamina y sesamol. La composición de sus aceites varía según las variedades.

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