PRACTICA 5. Antioxidantes y antimicrobianos

Transcripción

1 PRACTICA 5 Antioxidantes y antimicrobianos 5.1 Introducción La estabilidad de los alimentos depende de múltiples factores que dependen de la carga microbiana inicial, el tipo de procesamiento y empaque, así como de las condiciones de transporte y distribución. Desde el punto de vista microbiológico, todos los son susceptibles a alteraciones provocadas por el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos; dentro de ellos se consideran como indicadores a los mesófilos aerobios, enterobacterias, pseudomonas, bacterias lácticas homofermentativas y heterofermentativas, además de los hongos y levaduras. El desarrollo de la flora alterante se acompaña de reacciones de proteolíticas, incremento en el ph y la formación aminas y bases volátiles totales, que en conjunto llevan a cambios significativos en el color aroma y textura. Los antimicrobianos son sustancias capaces de reducir o inhibir el desarrollo de los microorganismos alterantes, sin embargo su eficiencia dependerá de la naturaleza del sustrato, de la carga microbiana y del manejo del producto. Por otra parte, la autoxidación de los lípidos es una de las causas principales del deterioro de los alimentos, la cual da lugar a la aparición de olores y sabores desagradables, por lo que constituye un gran problema en la industria alimentaria. Esta reacción ocurre debido a los ácidos grasos insaturados a través de una serie de reacciones en cadena de radicales libres, que tiene las fases de iniciación, propagación y terminación. Los lípidos reaccionan con el oxígeno generando radicales hidroperóxido que tienen una estructura de dienos conjugados. Los hidroperóxidos se descomponen formando hexanal, pantanal y malonaldehído; además pueden reaccionan en cadena con las proteínas generando grupos carbonilo y alteraciones en las características de aroma, sabor y textura, con la consecuente pérdida del valor nutricional. De esta manera, muchas moléculas de lípidos pueden ser oxidadas hasta hidroperóxidos por muchas formas de iniciación. El ciclo de propagación es interrumpido por las reacciones de terminación, en las cuales hay consumo de los radicales. Las interacciones de radicales libres originan productos no-radicales muy estables. En los alimentos con alto contenido de lípidos, la etapa más importante es la formación y descomposición de los hidroperóxidos, que generan una serie de compuestos oxidados como cetonas, aldehídos, alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad, que determinan el valor sensorial del alimento. Este fenómeno se denomina rancidez. Este deterioro puede ser evaluado por diferentes métodos como el índice de peróxidos (IP), determinación de dienos y trienos por espectroscopía UV y la determinación de sustancias reactivas al ácido 2-tiobarbitúrico (TBARS). Estos métodos son muy simples, sensibles, y reproducibles cuando se llevan a cabo bajo condiciones normalizadas. Sin embargo, existen nuevas metodologías de validez comparable a las tradicionales que resultan más rápidas, con menor preparación de las muestras como la medición de compuestos volátiles en el espacio-cabeza (headspace) por cromatografía gaseosa y la aplicación de la espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo por transformada de Fourier (FT-IR). Los antioxidantes actúan de varias formas para inhibir estas reacciones.

2 5.2 Objetivo Evaluar la eficiencia de antioxidantes y antimicrobianos comúnmente empleados en la industria de alimentos. 5.3 Materiales Materiales y reactivos - Solución de ácido acético-cloroformo (60:40) - Solución saturada de yoduro de potasio (KI) (20 ºC) - Tiosulfato de sodio (0,1 y 0,01 N) - Almidón al 1% - Ácido 2-tiobarbiturico en ácido acético 90% - BHA - BHT - EDTA - Extracto de licopeno (Practica 1) - Extracto betalaína (Practica 1) - alambre de cobre lavado con ácido nítrico 3M - Peróxido de benzoilo - Hexano - Benzoato de sodio - Sorbato de sodio - Propilparabeno - Agar Material de vidrio - Bandeja para baño de hielo - Baño María - Celda de vidrio para espectrofotómetro - Charolas para pesar - Espátula - Gradilla - Mortero - Pinzas para tubo - Pipetas de 5 y 10 ml - Piseta - Probeta graduada de 100 ml - Tabla para picar de 30 x 30 cm - Tubos de centrifuga graduados de 20 ml - Tubos de vidrio 16 x 150 mm con tapón de rosca

3 - Varilla de vidrio - Vasos de precipitados de Cajas Petri estériles - Papel Wathman No. 1 Equipo de laboratorio - Balanza de precisión - Balanza granataria - Centrifuga refrigerada para 10,000 rpm - Espectrofotómetro UV-Vis - Homogeneizador - Parrilla de calefacción 5.4 Metodología Evaluación de la eficiencia de antioxidantes Preparación de muestras 1. Preparar 6 frascos de boca ancha tipo Gerber con 25 g de aceite de soya y rotular con las letras A, B, C, D, E y F. 2. Agregar a cada frasco el material que corresponda: A g de BHT o BHA disuelto en 1 ml de acetona B. 2.5 ml de extracto de licopeno (Practica 1) C. 2.5 ml de extracto betalaína (Practica 1) D g de BHT o BHT y g de EDTA E. 1 cm de alambre de cobre lavado con ácido nítrico 3M F. Control 3. Cubrir los frascos con una película plástica autoadherible permeable al oxígeno, colocarlos en un lugar iluminado y almacenar por 4 semanas 4. Detectar los cambios en el color y aroma comparando con el control 5. Determinar el índice de peróxidos, las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBAR s) o dienos conjugados para evaluar la eficiencia de los antioxidantes. 6. Discutir el efecto de los antioxidantes, EDTA y el alambre de cobre. 7. Para investigar si una substancia es antioxidante, se calcula el factor protector que resulta de dividir el resultado de los índices de cada tratamiento con respecto a la muestra control. Si resulta superior a 1, la substancia es antioxidante; si es inferior, es pro-oxidante.

4 Índice de peróxido Indica en el grado de rancidez oxidativa que ha sufrido el aceite y se define como miliequivalente de peróxido por Kg de grasa. 1. Pesar 5g del aceite en un Erlenmeyer de 250 ml de tapa de vidrio. 2. Añadir 30 ml de la solución de acético:cloroformo (60:40) y agitar para disolver. 3. Añadir 0.5 ml de la solución saturada de KI, agitar vigorosamente y dejar reposar en la oscuridad durante 2 minutos añadir unos 30 ml de agua. 4. Titular inmediatamente el yodo liberado con tiosulfato 0.1 N, agitando vigorosamente hasta que el color amarillo casi desaparezca. 5. Añadir alrededor 0.5 ml de solución de almidón al 1% y continuar titulando (al final de la titulación agitar vigorosamente para extraer todo el yodo de la capa de cloroformo) hasta que el color azul desaparezca. Si se gasta una cantidad menor de 0.5 ml de tiosulfato, repetir la determinación con tiosulfato 0.01 N. 6. Correr un blanco con la muestra (debe ser igual o menor a 0.5 ml de tiosulfato 0.01 N). Restar al resultado obtenido al de la muestra. 7. Expresar el índice de peróxido como meq de peróxido/ Kg de grasa como sigue: IP = Índice de peroxido pm = muestra en gramos V= volumen de tiosulfato gastado menos el blanco N = normalidad del tiocinato Determinación de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBAR s) Se basa en la formación de un compuesto rojo resultante de la condensación de 2 mol de ácido 2 tiobarbitúrico con 1 mol de malonaldehído o de sus tautómeros (epihidrinal y oxiacroleína), derivados de la oxidación del lípido o provenientes de la hidrólisis u oxidación de otros productos de la rancidez, cuya concentración se determina espectrofotométricamente a 532 nm.

5 1. Pesar 0.5 g de aceite en tubos con tapa de rosca adicionar 5 ml de ácido 2- tiobarbitúrico 0.02M en ácido acético glacial al 90% 2. Tapar y colocar los tubos en un baño con agua hirviendo durante 30 minutos. 3. Enfriar a temperatura ambiente y centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos 4. Tomar con ayuda de una pipeta Pasteur 3 ml del fondo del tubo y medir la absorbancia a 532 nm contra un blanco. TBA=7.0 x Abs Determinación de dienos y trienos conjugados por espectroscopía UV El método se basa en la detección de dienos y trienos conjugados que se generan como consecuencia de cambios en las posiciones de los dobles enlaces de los ácidos grasos insaturados. 1. Colocar 20μL de aceite en un matraz aforado de 25 ml. 2. Disolver el aceite en hexano mezclando vigorosamente y llevar al aforo. 3. Obtener la absorbancia a 233 y 268 nm, en celdas de cuarzo y empleando un blanco del solvente 4. Realizar las diluciones correspondientes con el solvente para obtener una absorbancia menor a 1.

6 5. Reportar la concentración de dienos usando el coeficiente de extinción de 25,000M- 1cm-1 y expresar los resultados en mol/mg muestra Agentes antimicrobianos 1. Preparar dos placas Petri con agar bacteriológico una con ph 5 y otra con agar a ph7 2. Marcar las placas en cuatro cuadrantes (a, b, c y d) 3. Colocar un disco de papel filtro estéril en cada cuadrante y depositar 30 microlitos de las siguientes soluciones: a. Benzoato de sodio b. Sorbato de sodio c. Propilparabeno d. Agua 4. Mantener las placas abiertas durante 2 horas, tapar e incubar a mantener a temperatura ambiente por siete días. 5. Comparar el desarrollo de halos de inhibición en cada cuadrante y discutir las diferencias entre cada agente, y con el ph del agar. 5.5 Informe Tabla de datos y cálculo de la eficiencia de cada antioxidante y antimicrobiano Discusión sobre el efecto de los tratamientos aplicados 5.6 Cuestionario 1. Cuál es la clasificación y características de los antioxidantes aprobados para su uso en alimentos. 2. Cuál es la clasificación y características de los antioxidantes aprobados para su uso en alimentos. 3. Investigue las pruebas que deben realizarse para otorgar la aprobación de los antimicrobianos en alimentos. 4. Elabore la ficha técnica de los antioxidantes y antmicrobianos empleados en la práctica. 5.7 Bibliografía Acuerdo por el que se determinan los aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos alimenticios, su uso y disposiciones sanitarias. Diario Oficial (Tercera Sección) Lunes 16 de julio de Miller D.D Química de Alimentos. Manual de Laboratorio. Editorial Limusa México.

7 García-Cruz L, Salinas-Moreno Y. Valle-Guadarrama S Determinación de fenoles solubles totales (FST). Rev. Fitotec. Mex. Vol. 35:1 5. Badui S Química de los Alimentos 5ª Edición Editorial Pearson, México. pp