Trabajo Práctico 4: PROTEINAS: Generalidades OBJETIVO: -Identificar aminoácidos y proteínas por medio de métodos basados en reacciones químicas. FUNDAMENTOS: Caracterización de las proteínas La caracterización de las proteínas puede ser realizada por reacciones de coloración o de precipitación. Debido a la presencia de diferentes aminoácidos en las uniones peptídicas las proteínas reaccionan con una variedad de compuestos formando productos coloreados. Existen reacciones de coloración que son específicas para aminoácidos de esas proteínas y son importantes tanto para la detección como para el dopaje de aminoácidos y proteínas. Existen también reacciones generales porque sirven para caracterizar grupos comunes a todas las proteínas como grupos amino o uniones peptídicas (ninhidrina y biuret) NINHIDRINA Todas aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo libre, reaccionaran con la ninhidrina. La positividad se manifiesta por la aparición de un color violáceo o amarillo. Debido a que las proteínas y los aminoácidos, poseen esta característica, la reacción sirve para identificarlos. Algunas soluciones de amonio y aminas, dan la coloración característica, aparentemente debido a una oxidación y reducción intramolecular de la ninhidrina en presencia de amoníaco. Los aminoácidos porina e hidroxiprolina, que no poseen grupo amino sino imino (-NH-), dan un color rojo que pasa rápidamente a amarillo. BIURET Es una prueba general para polipéptidos y proteínas ya que sirve para reconocer las uniones peptidicas. La positividad se manifiesta por la aparición de una coloración violeta. La formación de un complejo de coordinación entre los cationes cúpricos en medio alcalino con las uniones peptídicas. Reactivo de Biuret Reacción de la Prueba de Biuret 1
Reacción de la Prueba de Ninhidrina La solubilidad de las proteínas es variable y depende de la distribución y de la proporción de grupos polares y no polares de la molécula. La proteína es soluble cuando ocurre interacción proteina-agua y tiende a ser insoluble cuando ocurre interacción proteina-proteina. Cualquier condición que altere esas interacciones alterará la solubilidad. Desnaturalización Es la modificación que ocurre en la estructura nativa de una proteina, alterando así sus propiedades. Envuelve alteraciones de la estructura 2,3 y 4 de las proteinas. La estructura 1 se mantiene. Existen varios agentes desnaturalizantes: calor, ácidos, solventes orgánicos, sales de metales pesados. Las alteraciones que se observan son disminución de la solubilidad y/o pérdida de la actividad biológica. La disminución de la solubilidad puede ser explicada por la exposición de radicales hidrofóbicos que perjudican la interacción proteína-agua y favorecen la interacción proteinaproteina. 2
La floculación y la coagulación son manifestaciones visibles de la alteración estructural causada por agentes desnaturalizantes. Agentes desnaturalizantes: Calor: la agitación térmica afecta las interacciones que estabilizan la estructura tridimensional de las proteínas (puentes H, interacción hidrofóbica) Ácidos: se combinan con proteinas con carga + formando complejos proteinatos insolubles ej.: tricloroacetato de proteina. Sales de metales pesados: se combinan con proteinas de carga formando proteinatos insolubles ej.: proteinato de plomo Solventes orgánicos: presentan cte dieléctrica inferior al agua entonces la atracción entre cargas opuestas es alta.(precipitación) Preciptación y solubilización de proteinas: Pueden ser precipitadas sin sufrir desnaturalización por variación de ph y por alteración de la fuerza iónica del medio y por acción de solventes orgánicos a baja temperatura. Al variar el ph de la solución de proteina, los radicales de los Aa sufren disociación y en el punto isoeléctrico cuando la molécula esta totalmente disociada la fuerza de atracción electrostática es máxima y la solubilidad decrece. La capacidad de las sales neutras de influenciar la solubilidad de muchas proteinas es función de la fuerza iónica. La concentración baja de sal aumenta la solubilidad de las proteinas porque disminuye la interacción proteina-proteina, fenómeno llamado salting-in. A altas concentraciones de sal ocurre una deshidratación resultando una precipitación o salting-out. Este fenómeno se utiliza para la separación de proteinas. Coagulación Para ver la coagulación de las proteínas se puede utilizar clara de huevo, para conseguir más volumen puede prepararse para toda la clase una dilución de clara de huevo en agua, de forma que quede una mezcla aún espesa. 1. Colocar en un tubo de ensayo una pequeña cantidad de clara de huevo. 2. Añadir 5 gotas de ácido acético y calentar el tubo a la llama del mechero. 3
Reacciones coloreadas Reacción Xantoproteica Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteinas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, tirosina, fenilalanina, triptofano. Una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali y vira a un color anaranjado. 1. Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 ml de solución problema (clara de huevo). 2. Añadir 1 ml de HNO3 concentrado. 3. Calentar al Baño María a 100 C 4. Enfriar en agua fría 5. Añadir gota a gota una disolución de Hidróxido de sodio al 40%. Reacción de Biuret Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados. Tomar un tubo de ensayo y poner unos 3 ml de albúmina de huevo. 1. Añadir 2 ml de solución de hidróxido sódico al 20%. 2. A continuación 4 ó 5 gotas de solución de sulfato cúprico diluida al 1%. 3. Debe aparecer una coloración violeta-rosácea característica. 4
Reacción de aminoácidos azufrados Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separación mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo. 1. Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 ml de albúmina de huevo (clara de huevo). 2. Añadir 2 ml de solución de hidróxido sódico al 20%. 3. Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5%. 4. Calentar el tubo hasta ebullición. 5. Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro de plomo, utilizándose el azufre de los aminoácidos, lo que nos sirve para identificar proteínas que tienen en su composición aminoácidos con azufre. Prueba de Sulfato de amonio: Las proteínas, como otros coloide son precipitadas por soluciones concentradas de sales de amonio[nacl. (NH4) 2 SO4 y NaSO 4 ]. Aparentemente la precipitación se debe a la neutralización y deshidratación de la molécula, seguida de agregación y precipitación. 1. Poner en el tubo de ensayo de 1 ml de albúmina de huevo 2. Añadir 1 ml de solución de sulfato de amonio al 50%. 3. Mezclar, dejar en reposo 10 min. y observar la formación de precipitado. 5
Proteínas: extracción de material biológico y cuantificación OBJETIVO: -Determinar la concentración de proteínas solubles en una muestra biológica mediante el método de Biuret. FUNDAMENTO: Este método es sencillo y su sensibilidad está dentro de un rango de concentración del orden de miligramos. Se basa en la formación de un complejo azul debido a la unión del sulfato de cobre en medio alcalino con compuestos con 2 o más uniones peptídicas. Parte Experimental: Reactivo de Biuret: sulfato de cobre en medio alcalino. EDTA/Cu en hidróxido de sodio Pesar 1 g de material biológico: hígado, pollo y carne. Homogeneizarlo en un Potter con 10 ml de agua destilada. Centrifugar 5 minutos a 3000 rpm. Separar el sobrenadante. (muestra) Blanco Testigo Problema Agua destilada 0,1 ml -- -- Sobrenadante -- -- 0,1 ml Testigo 0,3 g % -- 0,1 ml -- Biuret 3 ml 3 ml 3 ml Incubar 30 minutos a t ambiente y leer a 540 nm, llevando a 0 con el tubo blanco. Calcular la concentración del problema en g % de proteínas solubles. Calcular el % p/p en cada material biológico. 6
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