Elaborado por: Berta Inés Delgado Fajardo

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Rubén San Martín Pinto
hace 6 años
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1 Práctica experimental Identificación de aminoácidos y proteínas 1. Identificación de -aminoácidos: reacción con la ninhidrina: genera un producto de condensación coloreado. La intensidad del color está relacionada con la concentración del aminoácido, por lo tanto la prueba tiene utilidad tanto para la valoración cuantitativa como para la valoración cualitativa de los aminoácidos. La reacción ocurre de acuerdo con el mecanismo que se describe a continuación: La ninhidrina reacciona rápidamente con el grupo -amino oxidándolo: entre la ninhidrina y el aminoácido ocurre una reacción de adición núcleofilica, donde se eliminan dos moléculas de agua (deshidratación) C C 2 2 C C inhidrina Aminoácido Acido (producto de la (hidrato) adición núcleofilica) En medio alcalino y en presencia de calor, el compuesto formado se descarboxila, produciendo dióxido de carbono y formando la imina correspondiente. C2 C C calor / - C 2 Imina La imina se hidroliza produciendo un anión diceto aminado y un aldehído: C C

2 El producto formado reacciona con un exceso de ninhidrina para producir el complejo coloreado (azul violeta) que se conoce con el nombre de púrpura de uhemann: Complejo coloreado (púrpura de uhemann) Excepto tres aminoácidos. Todos dan el color azul violeta con el reactivo de la ninhidrina. Los tres aminoácidos son: la prolina y la hidroxiprolina que dan una coloración amarilla y el aminoácido asparagina que da una coloración café, debido a la presencia del grupo amido en la cadena lateral. 2. Identificación de los aminoácidos aromáticos: se pueden identificar con diferentes reacciones características de ellos. En éste laboratorio estudiaremos la reacción xantoproteica y la reacción de Millon eacción Xantoproteica. La palabra xantoproteica significa proteina amarilla. La prueba consiste en adicionar ácido nítrico concentrado a la proteina. La proteina toma entonces color amarillo y precipita. Si alguna vez nos hemos salpicado las mano con ácido nítrico recordaremos que la piel toma un color amarillo, por la reacción del ácido con la proteina de la piel (el colágeno). La reacción xantoproteica es positiva para las proteinas que contienen aminoácidos aromáticos como la tirosina, la fenilalanina y el triptófano. Las proteinas que contengan éstos aminoácidos aromáticos, darán positiva la prueba y experimentarán adicionalmente desnaturalización e hidrólisis parcial. El color amarillo que se genera durante el proceso se debe fundamentalmente a la nitración del anillo aromático en posición orto: fenilalanina äcido nítrico o-dinitrofenilalanina agua (color amarillo) 2.2. eacción de Millón. El reactivo de Millón esta formado por mercurio disuelto en ácido nítrico (forma una mezcla de nitratos mercúrico y mercuriosos) Cuando Millón se adiciona a las proteinas que tienen tirosina, éstas forman un precipitado blanco, debido a

3 la presencia del ácido mineral fuerte que las desnaturaliza. Al calentar se obtiene un color rojo ladrillo, debido a la mercurialización, en posición, del anillo aromático de la tirosina. g g 2 3 g 2 3. Determinación de las proteinas. eacción de Biuret: el biuret es una molécula formada por dos de urea, caracterizada estructuralmente por la presencia del enlace peptídico: 2 2 Biuret Esta es la molécula más sencilla que reacciona con el catión cúprico en medio alcalino. La reacción es común a todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos en la estructura. El reactivo de Biuret está formado por sulfato cúprico pentahidratado (CuS ) en un medio fuertemente alcalino. Una proteina en suspensión a la que se le agrega el reactivo de Biuret, produce un color violeta debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones cúprico (Cu +2 ) y los pares de electrones libres de los nitrógenos que forman parte de los enlaces peptídicos:

4 residuo de glicina residuo de cisteina S 2 C 2+ Cu C 2 S 2 2 residuo de glutamina 2 2 Dos cadenas del tripéptido glutatión ( glutamil-cisteinil-glicina: Glu-Cys-Gly) formando los enlaces coordinados con el catión cúprico (reacción de biuret). 4. Propiedades de las proteinas: Las propiedades de estos biopolímeros están relacionadas con su naturaleza coloidal, con la precipitación y con su capacidad amortiguadora aturaleza coloidal. Las proteinas forman dispersiones coloidales 1 en agua. Por ésta razón pasarán a través del papel de filtro pero no a través de una membrana. Esta incapacidad de las proteinas de pasar a través de las membranas es de gran importancia en el cuerpo. Las proteinas presentes en la corriente sanguínea no pueden pasar a través de las membranas y permanecerán en la sangre, por ésta razón el material proteínico no estará presente en la orina. La presencia de material proteínico en la orina indica un daño en las membranas del riñón (posiblemente nefritis). En disolución acuosa los residuos no polares de las proteinas (hidrofóbicos) se agrupan hacia el interior de la estructura, mientras los grupos polares se orientan hacia el exterior y van formando puentes de hidrógeno o atracciones dipolo-dipolo con las moléculas de agua, formándose una capa de solvatación Precipitación. La interacción de la proteina con el agua puede ser modificada por diferentes factores que conducen a una disminución de su estabilidad en solución y la proteina precipita. Los diferentes factores pueden ocasionar neutralización de las cargas superficiales de la proteina o rupturas de puentes de hidrógeno o de puentes disulfuro lo 1 Son partículas coloidales las que tienen un tamaño entre milimicrones. Las partículas que forman soluciones verdaderas son de un tamaño menor a un milimicrón. Las partículas mayores de 100milimicrones forman suspensiones.

5 que lleva a la pérdida de las estructuras de orden superior en las proteinas (secundaria, terciaria y cuaternaria) formándose agregados intermoleculares que finalmente conducen a la precipitación. El cambio en la estructura de la proteina se conoce con el nombre de desnaturalización. Una proteina desnaturalizada solamente cuenta con su estructura primaria por lo que muchas veces el proceso es reversible, una vez se elimina el factor causante de la desnaturalización. Cuando el proceso es irreversible se dice que la proteina coagula y ocurre pérdida total de la solubilidad.. En éste caso generalmente ocurre oxidación de los grupos S y ruptura de la cadena proteinica. Las proteinas desnaturalizadas experimentan diferentes cambios en sus funciones: Cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteina: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión. Disminución de la solubilidad, porque los residuos hidrofóbicos del interior aparecen en la superficie, dificultando la interacción con el agua. Pérdida de las propiedades biológicas. Por ejemplo las globulinas del suero humano una vez desnaturalizadas, son incapaces de cumplir con sus funciones características es decir como anticuerpos. La desnaturalización es producida por agentes físicos (calor, luz) químicos (ácidos, bases, alcoholes, detergentes) y por agentes Los alcoholes coagulan (precipitan) todo tipo de proteinas excepto las prolaminas. El alcohol al 70% se usa como desinfectante por su capacidad para coagular las proteinas presentes en las bacterias. En las soluciones salinas concentradas las proteinas son insolubles y precipitan. Este hecho se debe a que al aumentar la fuerza iónica del medio por efecto de la sal, ésta compite por el agua que solubilizaba la proteina, provocando una disminución en el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la proteina. Esta disminución es ocasionada porque se rompen los puentes de hidrógeno proteina 2, debido a la mayor fuerza iónica de la sal. Esta propiedad se utiliza para separar proteinas presentes en mezclas con otras sustancias. La mezcla se colocan en una solución salina concentrada (tal como acl, a 2 S 4, ( 4 ) 2 S 4 ) donde la proteina precipita por su insolubilidad, y es separada por filtración. A continuación se purifica de la sal remanente por el procedimiento de diálisis 2 Por ejemplo en el cuerpo las membranas en los riñones permiten que el material de desecho soluble pase a través de ellas. Pero la misma membrana no permite que la proteina pase a través de ella, porque las proteinas son coloides. Las sales de los metales pesados como el nitrato de plata, el bicloruro de mercurio y el acetato de plomo, coagulan las proteinas. Muchas de las sustancias venenosas actúan coagulando y destruyendo las proteinas presentes en el cuerpo. Las proteinas que coagulan con metales pesados lo hacen porque tienen en su estructura cargas opuestas a los metales por lo que son atraídas por éstos y precipitan. Los ácidos y las bases fuertes, cambian el p de la solución proteica 2 Proceso que separa partículas en solución de partículas coloidales por medio de una membrana dializante (esta permite el paso de soluto a través de la membrana. ecordemos que una membrana semipermeable permite únicamente el paso de solvente)

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