ANÁLISIS DE MICROBIOLOGÍA DEL AGUA: La precisión importa en la protección de la salud pública.

1 ANÁLISIS DE MICROBIOLOGÍA DEL AGUA: La precisión importa en la protección de la salud pública.

AGENDA ASPECTOS GENERALES DE LAS PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS ESTUDIO DE LA WATER RESEARCH FOUNDATION QUÉ IMPLICA PARA LA SALUD PÚBLICA? IDEXX 2

HISTORIA DE LAS COLIFORMES: Las primeras pruebas de calidad del agua fueron pruebas para determinar las bacterias totales, que se presentaron en el siglo XIX. El concepto de bacteria coliforme comenzó a utilizarse en el siglo XIX. Al poco tiempo se descubrió que los patógenos presentes en el agua se encontraban en concentraciones muy bajas. Se reconoció que la E. coli y las bacterias coliformes fermentaban la lactosa. Las bacterias que viven en el intestino son capaces de crecer ante la presencia de sales biliares. 3

QUÉ SON LOS ORGANISMOS INDICADORES? Originalmente, los organismos indicadores se utilizaron para expresar la calidad general del agua. Fueron sustituidos por el requisito de indicar la posible presencia de materia fecal. John Snow demostró que había más probabilidades de que el agua recolectada en lugares con salida a los desagües de aguas residuales fuera la causa de enfermedades entéricas como el cólera. 4 Esto llevó al desarrollo de pruebas de indicadores de materia fecal.

BIOINDICADORES virus, bacterias, parásitos, cianobacterias CUALIDADES DE UN BIOINDICADOR Se encuentran en abundancia Resistente a las condiciones ambientales Fácil Asociación Fácil determinación 5 2012 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved. 5

QUÉ INDICAN LAS COLIFORMES Y LA E. COLI? Coliformes totales: eficacia de la desinfección, ingreso y recrecimiento o biopelícula. E. coli: contaminación por materia fecal reciente (posible presencia de patógenos). Indicadores complementarios: Enterococos: contaminación por materia fecal. Bacteriófago: supervivencia de virus. 6

COLIFORMES TOTALES: DEFINICIÓN La definición depende del método y se define según el método. Las coliformes totales no constituyen un grupo definido de manera taxonómica. MacConkey (1907) definió el término coliformes de la siguiente manera: Son organismos similares a Bacterium coli. Crecen en presencia de sales biliares. Producen ácido a partir de la lactosa. Con el tiempo, la definición cambió para incluir una prueba para detectar la producción de gas, que posteriormente se eliminó debido a que la producción de gas varía dentro de las cepas de la misma especie. 7

COLIFORMES TOTALES: DEFINICIÓN ACTUAL o La Organización Internacional de Normalización (International Organization for Standardization, ISO) define las coliformes totales de esta manera:...miembros de las Enterobacteriaceae que producen la enzima β-d-galactosidasa. o Todas las bacterias coliformes que fermentan la lactosa cumplen con esta definición. Sin embargo, existen muchas bacterias coliformes (del 10% al 15%) que NO FERMENTAN LA LACTOSA. 8

MÉTODOS BASADOS EN LACTOSA: LIMITACIONES Mediante los métodos basados en lactosa, no se puede detectar la cantidad de coliformes según métodos similares en función de la β-d-galactosidasa. Los métodos que utilizan β-d-galactosidasa son específicos. 9

LACTOSA VERSUS β-d-galactosidasa La fermentación de la lactosa depende de dos enzimas fundamentales: la lactosa permeasa y a β-d-galactosidasa. La lactosa permeasa permite que la lactosa se transporte activamente a la célula. La β-d-galactosidasa divide a la lactosa en glucosa y galactosa. 10

LACTOSA VERSUS β-d-galactosidasa Muchas bacterias coliformes no presentan lactosa permeasa y, por lo tanto, no fermentan la lactosa rápidamente. Sin embargo, pueden dividir la β-d-galactosidasa. Estos organismos no se detectan mediante métodos de filtración de membrana basados en lactosa. 11

MÉTODOS BASADOS EN ENZIMAS Y LACTOSA m-endo Se utiliza principalmente en Norteamérica para la detección de coliformes en el agua potable. La fermentación de la lactosa produce aldehídos que reaccionan con el sulfito de fucsina básica en el medio y producen una colonia con brillo. Tergitol TTC Se utiliza principalmente en Europa para la detección de coliformes en el agua potable. La fermentación de la lactosa se detecta mediante un cambio en el color del azul de bromotimol. Colilert Es una prueba de 24 horas en la que se utilizan los indicadores de nutrientes ONPG y MUG como fuentes de carbono y energía, divididos por la β-dgalactosidasa y β-dglucuronidasa en coliformes y E. coli. Colilert-18 Se utiliza la misma tecnología de sustrato definido Defined Substrate Technology que la de Colilert con resultados en 18 horas. Tanto Colilert como Colilert-18 se pueden utilizar en pruebas de presencia o ausencia, o de cuantificación. Basado en lactosa Basado en enzimas 12

MÉTODO BASADO EN ENZIMAS SUSTRATO DEFINIDO Colilert 13 2012 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved. 13

COLILERT- MÉTODO BASADO EN ENZIMAS Determinación Cuantitativa de Coliformes totales y E.coli con Quanti-tray 1 Incubación: 24 horas 35 C. 14 2012 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved. 14

IMPORTANCIA DE LOS MÉTODOS Y VOLÚMENES DE MUESTRA DE E. COLI, Y MEDICIONES DE COLIFORMES TOTALES Estudio de investigación financiado en conjunto por la fundación para la investigación del agua Water Research Foundation (EE. UU.) y el cuerpo de inspectores de agua potable Drinking Water Inspectorate (Reino Unido). Análisis integral de los métodos de agua potable en todo el mundo. 15 Los métodos basados en enzimas como Colilert superaron los tradicionales y anteriores métodos de filtración de membrana (membrane filtration, MF) basados en lactosa (p. ej., m-endo).

MÉTODOS BASADOS EN ENZIMAS: DETECTAN COLIFORMES CON MAYOR PRECISIÓN m-endo Colilert Colilert-18 Cantidad de pocillos/colonias 227 226 219 Cantidad de coliformes confirmadas 192 219 214 Índice de confirmación 84.6 97.1 97.7 16 Índice de falsos positivos 15.4 2.5 2.3

QUÉ INDICAN LAS COLIFORMES? Son útiles para determinar la eficacia de la desinfección. Son más resistentes a la desinfección que la E. coli. Son buenos indicadores de ingreso. Sobreviven más tiempo que la E. coli. Son más numerosos que la E. coli. Pueden indicar la formación de biopelículas. 17 Se desconoce la importancia de las bacterias coliformes en las biopelículas.

COLIFORMES AMBIENTALES: MITO N.º 1 Las bacterias coliformes no tienen valor como indicadores, ya que no indican contaminación por materia fecal. 1 2 3 18 Si bien las coliformes totales no son siempre un indicador de contaminación por materia fecal, su presencia en el agua potable puede ser un indicio de varias cosas. La presencia de coliformes en la planta de tratamiento del agua indica una desinfección inadecuada. La presencia de coliformes puede indicar ingreso, crecimiento de biopelícula y bajo nivel de contaminación.

COLIFORMES AMBIENTALES: MITO N.º 2 Las bacterias coliformes que no fermentan la lactosa no tienen importancia en la higiene. 1 2 3 19 No hay una relación entre la fermentación de la lactosa y la importancia en la higiene. Una pequeña proporción de E. coli (3%) no es capaz de fermentar la lactosa. La importancia de detectar coliformes no siempre radica en que se trata de un indicador de contaminación por materia fecal, sino de ingreso o crecimiento de biopelícula.

COLIFORMES AMBIENTALES: MITO N.º 3 La presencia de coliformes totales en ausencia de E. coli no tiene importancia en la higiene. 1 2 3 4 20 En el agua contaminada por aguas residuales, las coliformes totales pueden superar la cantidad de E. coli en 10:1 o más. Las coliformes totales son más resistentes a la desinfección que la E. coli, pero menos resistentes que muchos patógenos. Las bacterias coliformes que están presentes en el medio ambiente de forma natural pueden introducirse en los sistemas de distribución del agua a través del ingreso. El agua de ingreso puede contener patógenos humanos, pero es posible que la E. coli se haya muerto.

E. COLI: DEFINICIÓN Fermenta la lactosa a 44.5 o C con producción de ácido y gas, y produce indol a partir de triptófano. Producción de β-d-galactosidasa y glucuronidasa. En EE. UU., también es aceptable el uso de la fermentación de la lactosa y la producción de β-dgalactosidasa. La definición de la ISO es miembros de las enterobacterias que producen β-d-galactosidasa y glucuronidasa. 21

E. COLI: HECHOS Alrededor del 5% de las cepas no crecen a 44 o C. Alrededor del 9% no produce gas a partir de la lactosa a 44 o C. Alrededor del 3% no fermenta la lactosa. Alrededor del 15% no produce fluorescencia en el caldo de EC-MUG. 22

23 CONFIRMACIÓN DE E. COLI: EC-MUG

EC-MUG: UN MEDIO DE CONFIRMACIÓN DEFICIENTE? La β-d-glucuronidasa es una enzima inducible que se produce en diferentes niveles mediante distintas cepas. La enzima también es sensible al ph, con un ph óptimo de 7.5 aproximadamente. Es posible que las cepas que crecen en la prueba m- Endo no tengan la β-d-glucuronidasa activada. Las cepas que crecen en la prueba m-endo están sujetas a utilizar lactosa para el crecimiento. El ph bajo generado en el caldo de EC-MUG junto con los factores mencionados anteriormente implica que algunas cepas aparecen negativas en el EC-MUG. 24

ÍNDICE DE FALSOS NEGATIVOS m-endo Colilert Colilert-18 Cantidad de pocillos/colonias 235 218 227 Cantidad confirmada como coliformes 31 6 4 Índice de falsos negativos 13.2 2.8 1.8 25

RESULTADOS FALSOS NEGATIVOS: REPERCUSIONES 26 Permiten que el agua contaminada pase sin ser detectada. Ponen en peligro la salud pública. Aumentan el riesgo de formación de biopelícula. Disminuyen la confianza pública. Potencial de litigios.

RESULTADOS FALSOS POSITIVOS: REPERCUSIONES Nuevo muestreo Pruebas adicionales Falta de confianza Mayor costo Mejor prevenir que lamentar 27

MÉTODOS BASADOS EN ENZIMAS: MÁS VENTAJAS Defined Substrate Technology (DST ) Es la tecnología patentada de IDEXX que utiliza indicadores de nutrientes (sustratos) metabolizados por las enzimas β-d-galactosidasa y β-d-glucuronidasa presentes en las coliformes y la E. coli. 1 2 3 4 La DST cumple con las mejores prácticas del mundo. La DST proporciona resultados confirmados con mayor rapidez e identifica más coliformes. La DST detecta la presencia de la E. coli con mayor precisión. Tiene un costo probablemente similar para las muestras negativas y más bajo para la DST con muestras positivas. 28

RESULTADOS FALSOS POSITIVOS: REPERCUSIONES Colilert contiene un inhibidor de Aeromonas, mientras que la mayoría de los medios de membrana no lo tienen. Aeromonas imita las coliformes totales. 29

FLORA DE FONDO: MITO N.º 1 Me gusta ver los recuentos de fondo al emplear la filtración de membrana. 1 2 3 30 La incapacidad de un medio de coliformes y E. coli para inhibir el crecimiento de fondo es una falla del medio. La flora de fondo puede inhibir el crecimiento de coliformes o alterar la capacidad para reconocer colonias de coliformes. Los recuentos de fondo no se correlacionan con los recuentos de bacterias totales.

PUNTOS FINALES: Falla en de sensibilidad y especificidad de algunos métodos en detector las bacterias presentes. En estudios repetidos, se demostró que la DST de IDEXX es más sensible y más específico. La sensibilidad protege la salud pública y la especificidad, ahorra dinero! 31

PUNTOS FINALES Los métodos basados en galactosidasa y glucuronidasa son más precisos que los basados en lactosa. Con Colilert y Colilert-18 se obtienen menos falsos negativos y falsos positivos que con los métodos basados en la fermentación de la lactosa. Si desea conocer la realidad del agua que utiliza, seleccione el mejor método. 32

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: PREGUNTAS Y RESPUESTAS Si desea obtener más información, visite http://al.idexx.com/water/wa ter-testing-solutions.html. 34