k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 k Número de publicación: 2 181 92 21 k Número de solicitud: 01383 1 k Int. Cl. 7 : A61K 38/46 A61P 17/12 k 12 SOLICITUD DE PATENTE A1 22 kfecha de presentación: 14.06.01 71 k Solicitante/s: LIPOTEC, S.A. Santa Eulalia 236-2 08902 L Hospitalet de Llobregat, Barcelona, ES k 43 Fecha de publicación de la solicitud: 16.02.03 k 43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud: 16.02.03 72k Inventor/es: Patente Dueña, Antonio; Garcés Garcés, Josep; Guinea Sánchez, Jesús; García Antón, Josep María; Casaroli Marano, Ricardo; Reina del Pozo, Manuel y Vilaro Coma, Senen 74k Agente: Dávila Baz, Angel k 4 Título: Uso de glicoproteína para el tratamiento y re-epitelización de heridas. ES 2 181 92 A1 k 7 Resumen: Uso de glicoproteína para el tratamiento y re-epitelización de heridas. Uso de una glicoproteína, producida por Pseudoalteromonas antartica, y constituida por 14 % de carbohidratos y 86 % de proteína, en la preparación de composiciones farmacéuticas, veterinarias y cosméticas de aplicación tópica o mucosal, para el tratamiento y re-epitelización de heridas, y en la preparación de composiciones cosméticas para el tratamiento de la piel, cabello o uñas. Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 28036 Madrid
DESCRIPCION Uso de glicoproteína para el tratamiento y re-epitalización de heridas. 1 2 3 4 0 Objeto de la invención La presente invención está relacionada con el uso de una glicoproteína, conocida como Antarticina - NF3, en la preparación de composiciones farmacéuticas, veterinarias y cosméticas, para el tratamiento y re-epitelización de heridas. Estado de la técnica La Antarticina - NF3 es una glicoproteína producida por Pseudoalteromonas antartica, una bacteria Gram-negativa aislada del océano Antártico. Esta bacteria aeróbica heterotrópica presenta un solo flagelo polar y produce una glicoproteína hexopolimérica (la Antarticina - NF3), compuesta por un 14 % de carbohidrato y un 86 % de proteína, que la rodea completamente. La Pseudoalteromonas antartica está perfectamente adaptada a las bajas temperaturas del entorno Antártico y soporta altas concentraciones salinas. La Antarticina - NF3 forma en disolución agregados regulares mediante autoensamblaje. El progresivo aumento de la concentración en disolución de esta glicoproteína produce un progresivo descenso en la tensión superficial de la disolución. Por otra parte, la Antarticina - NF3 es conocida porque presenta una gran afinidad hacia los liposomas de fosfatidilcolina, recubriéndolos y protegiéndolos del efecto permeabilizador de los tensioactivos como el SDS, tal y como se describe en WO98/42731. Adicionalmente la Antarticina - NF3 es conocida porque induce la nucleación del hielo e impide el crecimiento de grandes cristales hexagonales de hielo. Estos datos hacen pensar que la Antarticina - NF3 es responsable de la adaptación de la Pseudoalteromonas antartica a las condiciones medioambientales de su hábitat antártico. Por otra parte, los keratinocitos son un tipo de células que se encuentran en la epidermis constituyendo su capa más profunda. Los keratinocitos generan la capa externa de la piel (estrato corneo) mediante multiplicación, y modificación de su estructura hasta formar la capa de células maduras keratinizadas en la superficie de la piel. La velocidad de curado de las heridas es influenciada, entre otros factores, por la velocidad de proliferación y de migración de los keratinocitos. Cualquier factor que favorezca alguno de estos procesos favorecerá el proceso de curado y cicatrizado de heridas. Descripción de la invención Como resultado de nuestras investigaciones, sorprendentemente hemos encontrado que la glicoproteína soluble procedente de la Pseudoalteromonas antartica, conocida como Antarticina - NF3, constituida por un 14 % de carbohidrato y un 86 % de proteína, mejora selectivamente la adhesión de los fibroblastos dérmicos humanos y promueve el crecimiento celular de los keratinocitos epidérmicos humanos. Por lo tanto la Antarticina - NF3 sorprendentemente se ha revelado como un buen agente mejorador del cicatrizado de heridas. Es pues objeto de la presente invención la utilización de la Antarticina - NF3 en disoluciones o formulaciones galénicamente aceptables para su utilización en el tratamiento y re-epitelización de heridas en el campo farmacéutico y veterinario, así como para tratamientos cosméticos regenerantes. Las concentraciones de uso de la Antarticina - NF3 están comprendidas entre 0 mg/l y 1 fg/ml, y más concretamente entre mg/ml y 0.1 ng/ml. Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características del invento, se incluyen a continuación algunos ejemplos, con carácter explicativo y no limitativo. Esta invención no deberá considerarse limitada a las realizaciones expuestas. Ejemplo n 1 Citotoxicidad en vitro Se realizaron experiencias mediante el test WST-1 que mide la actividad de las deshidrogenasas mitocondriales en un ensayo colorimétrico no radioactivo utilizando sales de formazan. Se testaron diferentes concentraciones de glicoproteína (entre 1 mg/ml y 0.01 µg/ml). Como control negativo se empleó NaCl 0.01 M y como control positivo se empleó SDS 0.02%. 2
Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla: Resultado sobre Resultado sobre testada HDF HEK Control 0.46 0.92 1 Control negativo (NaCl) 0.01 M 0.43 0.7 Control positivo (SDS) 0.02 % 0.17 0.2 1fg --- 0.78 0.1 pg --- 0.92 0.01 ng 0.44 0.92 1ng 0.43 1.02 0.1 µg 0.41 0.97 2 µg 0.42 0.8 1mg 0.44 0.81 3 Como puede apreciarse en la tabla anterior, los ensayos de citotoxicidad mostraron que la Antarticina - NF3 no presenta toxicidad en keratinocitos epidérmicos humanos (HEK) ni en fibroblastos dérmicos humanos (HDF). Ejemplo n 2 Efecto en la adhesión celular Los ensayos de adhesión celular in vitro demostraron que la Antarticina - NF3 presenta un efecto específico en la adhesión de los HDF. Las células de HDF mostraron un importante incremento en la adhesión celular cuando crecían en sustratos recubiertos con 1 mg/ml de Antarticina - NF3 tras 2 y horas de cultivo. Los resultados obtenidos para HDF se muestran en la siguiente tabla: 4 probada Tiempo 2 horas Tiempo horas 0 Control 0.1 0.13 Glicoproteína 0.001 mg/ml 0.11 0.24 1 mg/ml 0.24 0.28 Los resultados obtenidos para HEK se muestran en la siguiente tabla: 3
probada Tiempo 2 horas Tiempo horas Control 0.09 0.1 Glicoproteína 0.001 mg/ml 0.11 0.17 1 mg/ml 0.1 0.19 Como puede apreciarse, en similares condiciones de cultivo, el efecto apreciado sobre HEK no es estadísticamente significativo. 1 2 Ejemplo n 3 Efecto en el crecimiento celular Los experimentos de crecimiento celular in vitro realizados utilizando el método de elución con cristal violeta, pusieron de manifiesto que la Antarticina - NF3 a diferentes concentraciones en presencia o no de un mínimo aporte de suero fetal bovino (2 % FCS) estimula el crecimiento de las células HEK, tal como se muestra en la tabla siguiente: Tiempo 24 Tiempo 48 Tiempo 0 horas probada horas horas Control 0.2 0.16 0.8 glicoproteína µg/ml 0.1 0.78 0.1 µg/ml 0.16 0.77 3 4 0.001 µg/ml 0.18 0.77 Mientras que experimentos similares realizados sobre células HDF no se obtuvieron resultados significativamente relevantes, tal y como puede apreciarse en la tabla siguiente: Tiempo 24 Tiempo 48 Tiempo 0 horas probada horas horas Control 0.21 0.16 0.2 glicoproteína µg/ml 0.17 0.26 0.1 µg/ml 0.17 0.248 0 0.001 µg/ml 0.17 0.249 Ejemplo n 4 Efecto en la regeneración de heridas in vitro Los experimentos de regeneración de heridas in vitro se efectuaron en cultivos de células HEK diferenciadas, en ausencia y en presencia de FCS. La duración de las pruebas fue de siete días. Las concentraciones de Antarticina - NF3 superiores a 0.1 ng/ml mostraron un efecto positivo en la regeneración de la herido en comparación con los cultivos control; este efecto de la Antarticina - NF3 en la regeneración de heridas in vitro se puede observar en la figura n 1, para una concentración de 0.1 µg/ml. 4
REIVINDICACIONES 1. Uso de una glicoproteína producida por Pseudoalteromonas antartica y constituida por 14% de carbohidratosy 86% de proteína, en la preparación de composiciones farmacéuticas, veterinarias y cosméticas de aplicación tópica o mucosal, para el tratamiento y re-epitelización de heridas. 2. Uso de una glicoproteína según la reivindicación1enlapreparación de composiciones cosméticas para el tratamiento de la piel, cabello o uñas. 1 3. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde dicha glicoproteína se emplea en concentraciones entre 0 mg/ml y 1 fg/ml. 4. Uso según la reivindicación 3, en donde dicha glicoproteína se emplea preferentemente en concentraciones entre mg/ml y 0,1 ng/ml. 2 3 4 0
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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA k 11 ES 2 181 92 k 21 N. solicitud: 01383 k 22 Fecha de presentación de la solicitud: 14.06.01 k 32 Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA k 1 Int. Cl. 7 : A61K 38/46, A61P 17/12 DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría Documentos citados Reivindicaciones afectadas A WO 9842731 A1 (UNIVERSIDAD DE BARCELONA) 01..1998, 1 todo el documento. Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones n : Fecha de realización del informe Examinador Página.01.03 A. Maquedano Herrero 1/1