Nta Técnica TRANSFECCIÓN Las técnicas de transfección celular, que se han desarrllad fundamentalmente para permitir la intrducción de ácids nucleics en el interir de las células, han permitid en gran medida ampliar ls cncimients acerca de la regulación génica y de la función de las prteínas en ls sistemas celulares. Actualmente se emplean en gran númer de aprximacines experimentales, en la generación de animales transgénics, en la selección de líneas celulares mdificadas, etc... La intrducción de una cnstrucción de DNA recmbinante en la que se ha situad el CDS (secuencia cdificante) de un gen reprter (luciferasa, 'green flurescent prtein', beta-galactsidasa, clramfenicl acetiltransferasa -CAT-, etc..) baj una secuencia de regulación que se desea estudiar permite medir cn facilidad tasas de expresión génica en diferentes situacines experimentales. Pr el cntrari, la intrducción de un plásmid que cntienen la secuencia cdificante (CDS) de una prteína de interés baj el cntrl de un prmtr (cnstitutiv, regulad, etc...) permite la prducción de la prteína deseada que puede estar n etiquetada ('tagged). En este cas se emplea la célula cm una factría de síntesis de prteínas a la que se le intrduce en frma de plásmid la infrmación de la prteína que se desea sintetice. Tant en el primer cm en el segund cas puede ser imprtante seleccinar las células que han adquirid el plásmid. Para facilitarl se incluyen en ésts genes de resistencia a drgas que permiten a las células que ls han adquirid sbrevivir en medis selectivs. Un de ls sistemas de selección más emplead es el de la resistencia a G418 (resistencia a nemicina) que permite seleccinar clnes celulares de expresión estable. Así diferenciarems entre la transfección tempral transiente y la transfección estable de larga duración. Las técnicas de transfección actuales se pueden clasificar en: MÉTODOS QUÍMICOS. Basads en la frmación de cmplejs que las células sean capaces de adquirir e incrprar, bien sea directamente mediante la ruta endcítica (fsfat cálcic, DEAE dextran) a las membranas (lipfección). MÉTODO DEL FOSFATO CÁLCICO. Basad en la btención de un precipitad entre el clrur de calci y el DNA en una slución salina de fsfats. En esta situación c- Page 1 15/07/2006
Nta Técnica precipitan frmand uns agregads que sn endcitads/fagcitads pr las células. Aparentemente el agregad cn calci prtege al DNA de la degradación pr las nucleasas celulares. El tamañ y la calidad del precipitad es crític para el éxit del prces, que se ve afectad pr factres tales cm pequeñs cambis en el ph de la slución, etc... MÉTODO DEL DEAE DEXTRANO. Basad en la btención de cmplejs entre la resina DEAE y el DNA. Ls plímers de DEAE dextran plybren tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas mléculas de DNA. El DNA acmplejad se intrduce en las células mediante chque smótic mediante DMSO glicerl. El us de DEAE dextran se limita a las transfeccines transientes. Page 2 15/07/2006
Nta Técnica MÉTODO DE LIPOFECCIÓN. Se basa en la famción de cmplejs entre lípids catiónics y DNA. El cmplej tiene afinidad pr la membrana y permite la entrada del DNA en el citsl. Una de las psibles vías es la incrpración de lipsmas a la membrana y la entrada flip-flap. Existen un gran númer de lípids que se emplean en lipfección, aunque existe una estructura cnsens de un lípid catiónic sintétic, a partir de la cual se han diseñad muchas variantes (pr ej. DOPE). Es esencial ptimizar las cndicines específicas de transfección para btener buenas eficiencias, que suelen ser en buenas cndicines de entre el 70 y el 90% de las células de la placa. Las desventajas del métd es, aparte del elevad preci de ls lípids, el hech de que n tds ls lípids funcinan en tds ls tips celulares, y que hay que ptimizar el ensay para cada tip celular. Ls parámetrs a ptimizar sn la relación entre lípid y DNA (relación de cargas), la cantidad de DNA emplead, el tiemp que se expnen las células al cmplej y la presencia ausencia de suer. Tienes una buena revisión en la página de la Universidad Vanderbilt dedicada a ls lípids catiónics. Page 3 15/07/2006
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Nta Técnica MÉTODOS FÍSICOS. Basads en la intrducción mecánica de las mléculas en el interir de la célula. MICROINYECCIÓN DIRECTA. Es una técnica muy efectiva aunque labrisa. Es el métd que se emplea en la intrducción del DNA recmbinante en las células embrinarias en el prces de btención de animales transgénics. ELECTROPORACIÓN. 'bilistic particle delivery'. Intrducción del DNA adherid a micrpartículas que se disparan sbre las células. Una vez intrducida la mlécula de DNA recmbinante en el interir de las células prducirá su efect permitiend, pr ejempl : seleccinar células que hayan incrprad el DNA. Este sería el cas del aislamient de clnes celulares que presentaran expresión de un determinad prduct. Es psible pr la incrpración en el prpi vectr de marcadres de selección, típicamente la resistencia de G418 (nemicina),... a las pcas hras días detectar la presencia de la prteína cdificada pr el plásmid. Page 5 15/07/2006