FACULTAD: CIENCIAS DE LA SALUD CARRERA PROFESIONAL: FARMACIA Y BIOQUIMICA CENTRO ULADECH CATÓLICA: TRUJILLO NOMBRE DE LA ASIGNATURA: TECNOLOGIA FARMACEUTICA II CICLO ACADÉMICO: IX DOCENTE: Q.F. GOMEZ VEJARANO NANCY INTEGRANTES: GUERRA ARANDA ROY QUISPE VILCHEZ IRENE CAMPOS CABRERA FERNANDO MARIÑOS GAVIDIA ZARELA ALARCON HURTADO DEYSI GARCIA GUTIERREZ DIANA PRACTICA 02 Página 1
PROCESOS FERMENTATIVOS: PRODUCCION DE PROTEÍNA UNICELULAR O BIOMASA II.- INTRODUCCION: Los microorganismos no tienen un ciclo de vida obligatorio, como otras formas de vida superiores. Cuando se les coloca en un medio nutricionalmente ideal o completo, la célula microbiana crece más y se divide para formar dos células, esto continúa con la producción de una población de células. Este crecimiento celular está basado en la habilidad de cepas para multiplicar el número de individuos viables (no considerando las células muertas o agonizantes) por lo que es importante el empleo de métodos de conteo de colonias y del número más probable. Aunque hay varias técnicas en uso para la estimación de las densidades y concentraciones celulares, no hay ningún método único que determine la masa y la cantidad en una sola operación. Entre los procedimientos ejecutados tenemos: Recuento microscópico en cámara de Neubauer: En este método se coloca un volumen conocido de cultivo y el recuento se hace por microscopía y se puede calcular la cantidad de microorganismos por mililitro. Recuento en placa: Este método consiste en sembrar una alícuota diluida del medio de cultivo en una placa con medio de cultivo sólido, se incuba y cada célula viable va a formar una colonia. Peso Seco: Consiste en secar volúmenes conocidos de cultivo hasta obtener un peso constante. Además de otros métodos como Turbidimetría (recuento basado en absorbancias) y el Número Más Probable (con base en estimaciones estadísticas). Estos métodos permiten una estimación aproximada del número de células 1. PRACTICA 02 Página 2
III.- OBJETIVOS: Conocer y aplicar técnicas de siembra, cultivo y cuantificación del proceso fermentativo para producción de proteína unicelular. IV.- MATERIAL Y METODO 4.1.- MATERIAL: 4.1.1.- Equipos: incubadora Estufa. Autoclave Balanza analítica. 4.1.2.- Reactivos: Levadura de panificación (húmeda). Glucosa. Fosfato de Amonio DiHidrogenado. Sulfato de Magnesio. Fosfato potasico dihidrogenado. NaCl (q.p.) Agar Estracto de Malta. 4.1.3.- Otros materiales: Agua destilada Matraz Erlenmeyer 500 ml Pipetas 10 ml Espátulas Varillas de agitación Termómetro 0-50 C Vasos de precipit. 100 ml Mechero de alcohol Algodón copón Papel blanco hilo Mechero de alcohol 4.2.- METODO: Método de obtención de Proteína Unicelular o Biomasa. PRACTICA 02 Página 3
En la práctica 02 se procedió de la siguiente manera: En primer lugar se mezcló 25g de levadura + 25g de agar sabouraud + 25 ml de agua destilada. Una vez obtenida la mezcla se colocó en la incubadora a 30 C por un tiempo de 12 horas. (ver anexo 01) Después se preparó el medio de cultivo utilizando los siguientes reactivos: Glucosa 10g/L, Fosfato de potasio dihidrog. 0.5 g/l, Fosfato de amonio di hidrogenado 0.5 g/l, Sulfato de Magnesio 0,25 g/l, Minerales (NaCl 0,25 g/l), Agua destilada c.s.p. 500ml. Luego se Preparó 500 ml del medio de cultivo en un matraz Erlenmeyer, se tapó con algodón, se selló con papel e hilo y se llevó a la autoclave a 121 C por 20 min. ( ver anexo 02) Una vez frio el medio de cultivo, se inoculo la levadura (25ml del volumen del medio de cultivo) en condiciones estériles: lejos de polvo, viento, con apoyo del mechero; esto con la finalidad de eliminar la contaminación. (Ver anexo 03) A partir de los 2 días se pudo visualizar el desarrollo microbiano, luego se filtró y se deseco en la estufa a una temperatura de 60 C hasta obtener la biomasa. ( ver anexo 04) V.- RESULTADOS: Tabla N 1: Peso y tiempo de secado de la muestra. Peso Tiempo Capsula de porcelana 87.8g - Cap.+ Muestra 104.7g - Primera desecación 97.5g 30 min. Segunda desecación 93.9g 1:30 min. Fuente: Laboratorio de Tecnología Farmacéutica de la Uladech Trujillo. PRACTICA 02 Página 4
VI.- DISCUSIÓN: En la etapa de la elaboración y preparación de la muestra a trabajar se pudo observar la fase de adaptación del crecimiento microbiano, en la fase exponencial la biomasa se ve incrementada exponencialmente con respecto al tiempo, en esta fase se va a obtener metabolitos primarios y se va a producir la fermentación, además se inocula el medio de cultivo, en la fase estacionaria se priva de micronutrientes a los microorganismos, este origina la detención de la replicación, además se produce los metabolitos secundarios, en la fase de muerte celular, como su propio nombre lo dice es donde se produce el deceso de los microorganismos. Para obtener la biomasa es importante considerar algunos parámetros como son la temperatura, la esterilidad del medio ambiente, el tiempo de secado tal como se muestra en la tabla 01. VII.- CONCLUSIÓN: Al realizar las técnicas de siembra, cultivo y los procedimientos correctos se puede obtener producción de proteínas unicelulares que este a su vez nos va a permitir obtener metabolitos primarios y secundarios. VIII.- CUESTIONARIO: 1.- Qué es la PROTEINA UNICELULAR y cuál es su importancia? El término proteína unicelular (PUC) se emplea para referirse a microorganismos tales como bacterias, levaduras, algas y hongos filamentosos, que son empleados para alimentación humana o animal, principalmente por su alto contenido en proteínas. Importancia: Producción de biomasa como producto fina l. Acá tenemos los lactobacilus utilizados como reconstituyentes de la flora intestinal (Floratil, Enterogermina, Infloran, Lactocereal, etc.), levadura de panificación, cultivos concentrados para inóculos, etc. PRACTICA 02 Página 5
Producción de biomasa para extracción de enzimas : Se aprovechan las enzimas que producen los microorganismos cultivados para luego romper su pared celular y extraer y luego purificar las enzimas de utilidad: Amilasa, proteasas, pectinasas, isomerasa de la glucosa cellulasas, hemicellulasas, lipasas, lactasas, estreptokinasas, etc. Obtención de Metabolitos: o Metabolitos Primarios: Etanol, Ácido Cítrico, glutámico, lisina, vitaminas, polisacáridos, etc. o Metabolitos secundarios: todos los antibióticos por fermentación. Productos Recombinantes : Producidos por uso de ARN en reacciones en cadena de laboratorio o por producción con microorganismos modificados genéticamente: insulina,, interferón, estreptokinase. Biotransformaciones o síntesis: en los medios de cultivo se agregan los fármacos y diseñando el medio de fermentación se logran oxidaciones, reducciones, insertar grupos funcionales, hidrolizar, esterificar, etc. Acá podemos obtener transformación de esteroides, hormonas, obtención de saborizantes, aromatizantes y colorantes orgánicos. 2. En qué fase de desarrollo microbiano obtenemos la biomasa y cómo logramos mantenerla y evitar que el desarrollo avance a la siguiente fase? La biomasa se obtiene en la fase Exponencial, se mantiene administrando el medio de cultivo. 3. Cuál es la razón de inocular previamente la levadura en Agar Nutritivo y que fase de desarrollo microbiano tiene esta etapa? En la fase adaptativa se realiza la inoculación de la levadura al agar nutritivo, se espera que en esta etapa se multipliquen los microorganismos. PRACTICA 02 Página 6
4. Los microorganismos requieren de fuente de carbono, nitrógeno, azufre, minerales, etc. Identifique cuáles son las fuentes en la presente práctica. Grafique en orden secuencial el procedimiento descrito, indicando cada etapa del proceso. Las fuentes de la presente práctica son las siguientes: Glucosa 10g/L, Fosfato de potasio dihidrog. 0.5 g/l, Fosfato de amonio di hidrogenado 0.5 g/l, Sulfato de Magnesio 0,25 g/l, Minerales (NaCl 0,25 g/l), Agua destilada c.s.p. 500ml. VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: 1.- Procesos de Fermentación [sede Web]. Perú: Farmacia y Bioquímica; 2014 [acceso 19 de Abril del 2014]. Fermentacion; [1 pagina]. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/219292961/procesos-de-fermentacion PRACTICA 02 Página 7
IX.- ANEXOS: Anexo 01: Obtención de la muestra. Anexo 02: Muestra en la Autoclave. PRACTICA 02 Página 8
Anexo 03: Inoculación de la levadura al medio de cultivo. Anexo 04: Filtración, desecación y pesada de la muestra. PRACTICA 02 Página 9