KIT PARA ESTUDIO MOLECULAR DE LA TRANSLOCACIÓN t(11;14) Nº CAT. MAD-003998M-2/5 (20 DETERMINACIONES) Los linfomas del manto son un subtipo de linfomas no Hodgkin s que se originan a partir de un grupo de células B vírgenes de la zona del manto de los folículos primarios de los órganos linfoides periféricos. Histológicamente se caracterizan por la expansión neoplásica de la zona del manto, remedando patrón nodular o infiltrando difusamente el tejido linfoide adyacente. Representan menos del 10% del total de linfomas no Hodgkin s en adultos. El linfoma del manto se caracteriza genéticamente por la translocación t(11;14) que yuxtapone el locus del gen Bcl-1 ubicado en la banda 11q13 del cromosoma 11, con el gen IgH de las inmunoglobulinas en la región JH del cromosoma 14. Esta translocación está presente en el 60-70% de todos los linfomas del manto. El gen Bcl-1 codifica para la proteína ciclina D1 implicada en la regulación del ciclo celular. Tiene un tamaño de 15 kb y cinco exones y a pesar de las rupturas cromosómicas, durante la translocación no se interrumpe su secuencia por lo que en los tumores portadores de ella se produce la sobreexpresión de ciclina D1, que juega un importante papel patogenético en el crecimiento del tumor, probablemente desregulando el control del ciclo celular por superar el efecto supresor de la proteína del retinoblastoma (Rb) y p27kip1. Existen numerosos puntos de ruptura en el cromosoma 11 implicados en esta translocación. Uno de ellos, el mayor (MTC), se encuentra a 110 Kb en dirección 5 al gen Bcl-1. Otros sitios conocidos como sitios menores (mtc1 y mtc2), se encuentran más próximos al gen Bcl-1. Estudios previos han demostrado que el 80% de las rupturas se producen en la región MTC. Los ensayos basados en detectar el cluster de translocación MTC mediante amplificación del DNA son capaces de detectar la mayoría de los reordenamientos Bcl-1. Puesto que los linfomas del manto muestran una morfología heterogénea, su clasificación como una entidad diferente fue controvertida durante años. En este momento y considerando que este tipo de tumor puede ser de reconocimiento histológico difícil y de tratamiento relativamente específico, la identificación de las células malignas mediante inmunohistoquímica es obligada (positividad para CD5 y ciclina D1). Pese a ello, el diagnóstico de algunos casos resulta problemático, por lo que el análisis molecular de la t(11;14) es necesario sobre todo en aquellas biopsias en que el estudio primario no haya sido del todo concluyente. Debido a la simplicidad y alta sensibilidad de la técnica de amplificación de DNA, la detección por este método de la translocación del gen Bcl-1, proporciona nuevas perspectivas en el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad. Además este ensayo permite estudiar la enfermedad mínima residual en pacientes con linfoma de manto, y contribuye a mejorar la determinación del estado de la enfermedad y evaluar el efecto de la terapia. El fragmento de fusión entre el gen Bcl-1 y la IgH se detecta mediante amplificación de DNA empleando cebadores específicos de las secuencias MTC y JH. PRESENTACION DEL KIT Se presenta en formato monotest con tubos individuales listos para uso que contienen el tampón de reacción, los dntp y los cebadores específicos. La amplificación se lleva a cabo con cebadores específicos que flanquean a las regiones MTC y JH mediante dos reacciones de amplificación encajadas, la segunda con cebadores internos a la primera: - 20 viales con la mezcla para la primera ronda de amplificación M1-J1-20 viales con la mezcla para la segunda ronda de amplificación M2-J2, que genera un fragmento con un tamaño aproximado entre 250-450 pb. También se incluyen 20 tubos que contienen la mezcla de reacción para amplificar un fragmento de 274 pb de DNA del tejido correspondiente al exón 5 del gen p53, que se utiliza como control interno para comprobar que el procesamiento de la muestra ha sido correcto y que el DNA es de calidad óptima. El resultado de la amplificación se puede visualizar mediante electroforesis en geles de agarosa y tinción con Bromuro de Etidio. 1
PRESENTACIONES: Tubos de 0.2 ml Ref: 003998M-2 Tubos de 0.5 ml Ref: 003998M-5 COMPONENTES DEL KIT (20 DETERMINACIONES): Para reacción de amplificación: - Mezcla para la 1ª ronda de amplificación M1-J1(Tubo verde): 20 viales x 46,5 µl - Mezcla para la 2ª ronda de amplificación M2-J2(Tubo rojo): 20 viales x 48,5 µl - Mezcla control interno (Tubo amarillo): 20 viales x 46,5 µl - DNA polimerasa (2 U/µl): 1 vial X 60 µl - DNA control + (linfoma B del manto)*: 20 µl *NOTA: Se deben evitar excesivas congelaciones/descongelaciones del DNA. Con objeto de impedir la degradación del mismo, se recomienda mantener el DNA control a 4ºC una vez haya sido descongelado la primera vez. MATERIAL REQUERIDO NO SUMINISTRADO: Instrumentación específica: Termociclador Microcentrífuga Baño termostatizado/estufa Fuente de alimentación Cubeta de electroforesis para DNA Transiluminador para luz ultravioleta Sistema de fotografía Polaroid Material fungible: Xileno (u octano) Etanol absoluto 100% Ficoll y PBS (para extracción de linfocitos a partir de sangre total) Tubos eppendorf 1,5/0,6 ml libres de DNasa/RNasa Reactivos para llevar a cabo la extracción de ADN genómico a partir de muestras de sangre, botones celulares, tejidos frescos, o tejidos fijados en formalina tamponada e incluidos en parafina. Todos los reactivos están incluidos en el Kit de Master Diagnóstica S.L.: KIT DE EXTRACCIÓN DE DNA TOTAL Ref: MAD-003951M Reactivos para llevar a cabo la electroforesis del DNA amplificado (geles de agarosa o poliacrilamida, tampón TBE, tampón de carga, EtBr, marcador de peso molecular). Todos los reactivos están incluidos en los Kits de Master Diagnóstica S. L.: ELECTROFORESIS DE DNA EN GELES DE AGAROSA y POLIACRILAMIDA Ref: 003980M Y OO3990M respectivamente. PRECAUCIONES: Durante todo el desarrollo de la técnica es aconsejable el empleo de guantes desechables. Dada la elevada sensibilidad de la técnica de amplificación de DNA se recomienda que la reacción de amplificación se lleve a cabo utilizando puntas de pipeta con filtro para evitar contaminación. La mayor fuente de contaminación suele ser el propio producto amplificado, por lo cual es recomendable llevar a cabo la manipulación de los productos amplificados y la posterior electroforesis en zonas de trabajo separadas de la zona donde se procesen las muestras y emplear pipetas distintas en cada caso. Transporte y almacenamiento: El Kit se transporta y almacena a -20ºC. Una vez descongelada la solución de lisis se puede guardar a 4ºC sin necesidad de volver a ser congelada. El DNA control incluido en cada kit también se debe almacenar a 4ºC una vez descongelado. 2
PROTOCOLO 1. EXTRACCIÓN DEL DNA: Antes de comenzar con la extracción de ADN, descongelar los reactivos suministrados en el kit: aceite mineral, solución de lisis y un vial de solución de proteasa. Tras su uso, el aceite mineral y la solución de lisis se pueden almacenar a 4º C. La solución de proteasa se debe almacenar congelada a -20 ºC y evitar repetidas congelaciones/descongelaciones. 1.1. A PARTIR DE TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA: 1. Tomar 2-6 secciones de tejido de 10 µm de grosor (según la cantidad de material presente en cada sección) y colocar en tubo de microcentrífuga de 1,5 ml valiéndose de una aguja o unas pinzas finas. 2. Extraer la parafina con 1 ml de xileno y agitar en vortex durante 2-5 minutos hasta que la parafina quede completamente solubilizada. 3. Centrifugar 5 minutos a velocidad máxima en microcentrífuga. Retirar el sobrenadante cuidadosamente para no arrastrar tejido (se puede hacer con un capilar obtenido a partir de una pipeta Pasteur). 4. Repetir los pasos 2-3. 5. Resuspender el pellet en 1 ml de etanol 100%, agitar y centrifugar 2 minutos a velocidad máxima. Retirar el sobrenadante y repetir el lavado con etanol dos veces más. 6. Eliminar muy bien los restos de etanol y dejar secar al aire. El tejido se debe quedar completamente seco, (para facilitar el secado se puede introducir en un horno ó estufa y calentar a 40-50ºC). Una vez seco el tejido se pueden guardar las muestras a temperatura ambiente durante varias horas o días. Nota: La parafina también puede ser eliminada calentando los cortes en presencia de aceite mineral (incluido en el kit) siguiendo las siguientes instrucciones: Añadir 600 µl de aceite mineral, agitar en vortex y calentar en termociclador a 95ºC durante 2 min. Centrifugar 2 min a velocidad máxima. Eliminar 480 µl de aceite mineral sin arrastrar restos de tejido. Repetir el proceso. 7. Al botón de tejido resultante añadir 50 µl de solución de lisis y 1 µl de solución de proteasa (se descongela justo en el momento de usar y se mantiene en hielo). Agitar varias veces con la micropipeta, centrifugar 5 segundos para eliminar las burbujas e incubar durante 3 horas a 55ºC con agitación suave. *El volumen de solución de lisis y solución de proteasa se pueden aumentar de forma proporcional si la sección de tejido de partida es de gran tamaño, hasta conseguir que el tejido quede en suspensión en la solución de lisis. Este punto es muy importante para conseguir un buen rendimiento de DNA y degradar los restos celulares contaminantes, que podrían interferir en la posterior amplificación de dicho DNA. 8. Calentar a 95ºC durante 8-10 min para inactivar la proteasa. 9. Centrifugar 5 min a velocidad máxima y RECOGER EL SOBRENADANTE (contiene el DNA) evitando tomar restos de tejido del fondo del tubo. Usar 3 µl de esta solución de DNA para amplificar. La muestra se puede almacenar a -20ºC hasta ser analizada, siendo estable al menos durante una semana. 3
1.2. A PARTIR DE TEJIDO CONGELADO: 1. Cortar varias secciones finas del tejido congelado valiéndose de una hoja de bisturí y colocar en un tubo ependorf estéril de 1,5 ml. 2. Añadir 50 µl de solución de lisis y 1 µl de solución de proteasa (se descongela justo en el momento de usar y se mantiene en hielo). Agitar varias veces con la micropipeta, centrifugar 5 segundos para eliminar las burbujas e incubar durante 3 horas a 55ºC con agitación suave (se puede prolongar la incubación a 24 horas). *El volumen de solución de lisis y solución de proteasa se pueden aumentar de forma proporcional si la sección de tejido de partida es de gran tamaño, hasta conseguir que el tejido quede en suspensión en la solución de lisis. Este punto es muy importante para conseguir un buen rendimiento de DNA y degradar los restos celulares contaminantes, que podrían interferir en la posterior amplificación de dicho DNA. 3. Calentar a 95ºC durante 8-10 min para inactivar la proteasa. 4. Centrifugar 5 min a velocidad máxima y RECOGER EL SOBRENADANTE (contiene el DNA) evitando tomar restos celulares del fondo del tubo. Usar 3 µl de esta solución de DNA para amplificar. La muestra se puede almacenar a -20ºC hasta ser analizada, siendo estable al menos durante una semana. 1.3. A PARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE TOTAL: Nota: No usar sangre total heparinizada. Se recomienda el uso de EDTA o Citrato Sódico como anticoagulantes. 1. Transferir 1,5 ml de sangre total a un tubo estéril de centrífuga de 10-15 ml con fondo cónico. 2. Extraer los linfocitos por centrifugación en gradiente de Ficoll siguiendo protocolo estándar: - Diluir el volumen de partida de sangre con 1 volumen igual de tampón PBS. - Colocar en un tubo de centrífuga de 10-15 ml y fondo cónico 2 ml de Ficoll - Añadir sobre el Ficoll la sangre diluida (3 ml), dejando caer suavemente por las paredes del tubo para que no se mezcle con el Ficoll del fondo. - Centrifugar a 900g 30 min a Tª ambiente. Al final de la centrifugación, los linfocitos quedan distribuidos en una anillo blanquecino en la interfase Ficoll-sobrenadante. - Aspirar con pipeta Pasteur la capa de linfocitos de la interfase Ficoll-sobrenadante y transferir a un tubo eppendorf de 1,5 ml. Se debe tomar el mínimo volumen de Ficoll y sobrenadante ya que el exceso del primero origina contaminación con granulocitos y el exceso de sobrenadante contaminación con proteínas plasmáticas. - Añadir PBS hasta 1,5 ml y centrifugar en microcentrífuga a velocidad media para precipitar los linfocitos. Repetir el lavado. 3. Sobre el botón de linfocitos resultante continuar con el protocolo general de extracción de DNA del Kit de linfomas B/T: 4. Añadir 50 µl de solución de lisis y 1 µl de solución de proteasa (se descongela justo en el momento de usar y se mantiene en hielo). Agitar varias veces con la micropipeta, centrifugar 5 segundos para eliminar las burbujas e incubar durante 3 horas a 55ºC con agitación suave (se puede prolongar la incubación a 24 horas). 4
*El volumen de solución de lisis y solución de proteasa se pueden aumentar de forma proporcional si la sección de tejido de partida es de gran tamaño, hasta conseguir que el botón de células quede en suspensión en la solución de lisis. Este punto es muy importante para conseguir un buen rendimiento de DNA y degradar los restos celulares contaminantes, que podrían interferir en la posterior amplificación de dicho DNA. 5. Calentar a 95ºC durante 8-10 min para inactivar la proteasa. 6. Centrifugar 5 min a velocidad máxima y RECOGER EL SOBRENADANTE (contiene el DNA) evitando tomar restos celulares del fondo del tubo. Usar 3 µl de esta solución de DNA para amplificar. La muestra se puede almacenar a -20ºC hasta ser analizada, siendo estable al menos durante una semana. 2. REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN 1ª ronda de amplificación: Por cada muestra de DNA se realizarán en una primera ronda 2 reacciones de amplificación: - Reacción con la mezcla para reordenamiento M1-J1 (Tubo verde) - Reacción con la mezcla control interno de DNA ( tubo amarillo) Descongelar 1 tubo verde, y 1 tubo amarillo por cada muestra, mantener en hielo y añadir a cada tubo: - 0.5 µl de DNA-polimerasa - 3µl de la muestra de DNA* * Si se dispone de DNA de concentración conocida, determinada espectrofotométricamente, se recomienda poner 300-500ng de DNA. Mezclar bien los tubos, añadir 50 µl de aceite mineral (opcional según el tipo de termociclador) y centrifugar 5 segundos en microcentrífuga. Nota: Es importante mantener los tubos en hielo hasta el momento de colocar en el termociclador para evitar uniones inespecíficas de los primers. Colocar todos los tubos en el termociclador y programar las siguientes condiciones: Condiciones de amplificación: 94ºC 5 min. 35 ciclos: 94ºC 45 sg 60ºC 45 sg 72ºC 45 sg 72ºC 4 min Mantener los tubos refrigerados a 4ºC cuando finalice la reacción. Si no se van a procesar las muestras en el momento, se pueden almacenar a -20ºC. Los tubos de control de DNA (amarillo) se reservan para hacer la electroforesis y los tubos con la mezcla de reacción M1-J1 (verde) servirán como DNA molde para la segunda ronda de amplificación ( nested ). Nota: Para tubos de 0,2 ml se pueden reducir los tiempos en cada ciclo: 94ºC 30 seg - 60ºC 30 seg - 72ºC 30 seg. 5
2ª ronda de amplificación: Por cada muestra de DNA se realizará en esta segunda ronda una reacción de amplificación con la mezcla para reordenamiento M2-J2 (Tubo rojo) Descongelar 1 tubo rojo por cada muestra, mantener en hielo y añadir a cada tubo: -0.5 µl de DNA-polimerasa -1 µl del producto de PCR para M1-J1 obtenido en la primera ronda de amplificación (tubo verde). Mezclar bien los tubos, añadir 50 µl de aceite mineral (opcional según el tipo de termociclador) y centrifugar 5 segundos en microcentrífuga. Nota: Es importante mantener los tubos en hielo hasta el momento de colocar en el termociclador para evitar uniones inespecíficas de los primers. Colocar todos los tubos en el termociclador y programar las siguientes condiciones: Condiciones de amplificación: 94ºC 5 min. 20 ciclos: 94ºC 45 sg 55ºC 45 sg 72ºC 45 sg 72ºC 4 min Mantener los tubos refrigerados a 4ºC cuando finalice la reacción. Si no se van a procesar las muestras en el momento, se pueden almacenar a -20ºC. Nota: Para tubos de 0,2 ml se pueden reducir los tiempos en cada ciclo: 94ºC 30 seg - 55ºC 30 seg - 72ºC 30 seg. ELECTROFORESIS DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS: Precauciones!: Dada la elevada sensibilidad de la técnica de amplificación que genera cantidades elevadas de un fragmento específico de DNA, dicho producto amplificado representa una potente fuente de contaminación en el laboratorio. Es recomendable llevar a cabo la manipulación y electroforesis de los productos amplificados en una zona de trabajo alejada del lugar donde se realiza el procesamiento de las muestras para evitar la contaminación de éstas con el DNA amplificado que podría conducir a falsos diagnósticos positivos. El revelado de los productos amplificados se puede llevar a cabo tanto en geles de agarosa al 3% con tampón TBE 1X. Master Diagnóstica dispone de Kits para electroforesis de DNA en geles de agarosa listos para uso que incluyen además todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la electroforesis: marcador peso molecular, tampón de carga, tampón TBE concentrado, EtBr. (Nº de Cat.: 003980M). PROCEDIMIENTO: Por cada muestra de DNA se cargan en la electroforesis los productos amplificados de los tubos rojo y amarillo, correspondientes a la 2ª amplificación del gen Bcl-1 (M2-J2) y a la amplificación del control de DNA interno. 6
Tomar 20 µl del producto amplificado, pasar a un tubo eppendorf y añadir 4 µl de tampón de carga 6X. Cargar las muestras en los pocillos y colocar en uno de los carriles 10 µl del marcador de peso molecular. Dejar resolver la electroforesis 1 hora a 100 Voltios. Teñir con EtBr y visualizar en transiluminador con luz ultravioleta. 4. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS CONTROL INTERNO: Amplificación del exón 5 del gen p53 (Tubo amarillo): En todos los casos debe aparecer una banda intensa de 274 pares de bases, lo que indica que el proceso de manipulación de la muestra y la calidad del DNA han sido adecuados. Si el control de DNA no ha funcionado, puede haber ocurrido: 1. El tejido no ha sido fijado en condiciones adecuadas, con lo cual el rendimiento, así como la calidad del DNA serían muy bajas. En este caso se puede mejorar la calidad del DNA obtenido prolongando la incubación del tejido con el tampón de lisis hasta 48 horas. También se puede mejorar la calidad del DNA mediante purificación posterior con extracción fenólica y precipitación con etanol 100% o bien con Kits comerciales similares. 2. El problema puede estar en la cantidad de material de partida: si el tamaño de la muestra es muy pequeño (una pieza de <2mm 2 ), convendría repetir incrementando el número de secciones de parafina o de cortes de tejido congelado. Translocación t(11;14): La translocación t(11;14) fusiona el gen Bcl-1 ubicado en la banda 11q13 del cromosoma 11, con el gen de la inmunoglobulina IgH del cromosoma 14 a nivel de la región JH. Está presente en el 60-70% de los linfomas de manto y empleando cebadores de la región de ruptura MTC se consiguen detectar la mayoría de los reordenamientos Bcl-1 ya que el 80% de las rupturas se producen en esta región. Si se ha producido esta translocación, tras la amplificación en la que se han empleado cebadores que flanquean las regiones translocadas de cada uno de los cromosomas (11 y 14) debería aparecer una única banda del tamaño esperado (entre 250-450 pb). Si no ha ocurrido la translocación los cebadores empleados estarían hibridando con dos cromosomas distintos y por tanto no sería posible obtener producto amplificado. Bcl1 / t(11;14) 500 pb - 404 pb - 331 pb - 242 pb - 7
5. BIBLIOGRAFÍA Rimokh R, Berger F, Delsol G, Digonnet I, Rouault JP, Tigaud D, Gadoux M, Coiffier B, Bryon PA and Magaud JP. Detection of the chromosomal translocation t(11;14) by polymerase chain reaction in mantle cell lymphomas. Blood 1994; 83:1871-1875. Chim CS, Chan ACL, Choo CK, Kwong YL, Lie AKW and Liang R. Mantle cell lymphoma in the Chinese: clinicopathological features and treatment outcome. Am. J. Hematol. 1998; 59:295-301. Fan H, Gulley ML, Gascoyne RD, Horsman DE, Adomat SA and Cho CG. Molecular methods for detecting t(11;14) translocations in mantle-cell lymphomas. Diagn. Mol. Pathol. 1998; 7:209-214. Rev.: AO Oct 2012 8