Curso: Biología Molecular y Genómica Enero 2014. Conceptos elementales sobre la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Dr. Juan Venegas Hermosilla Programa de Biología Celular y Molecular Instituto de Ciencias Biomédicas Facultad de Medicina Universidad de Chile Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) El PCR es una técnica enzimática que permite la amplificación de ácidos nucleícos (DNA o RNA), millones de veces. Esto hace que el PCR sea una técnica muy poderosa en amplios campos de la biología, las ciencias, la medicina forense, la biotécnología, etc. 1
La técnica de PCR fué desarrollada por Kary Mullis Científico y surfista de Newport Beach, California. Por este trabajo Kary Mullis ganó el premio Nobel de Química en 1993. El desarrolló la técnica trabajando para la compañía Cetus Corporation en la década del 70. Como el PCR amplifica millones de veces un ácido nucleíco? 2
Como el PCR amplifica millones de veces un ácido nucleíco? El PCR consta de tres etapas: a) Denaturación del DNA blanco b) Hibridización annealing del partidor directo e inverso con el DNA blanco c) Elongación de los partidores mediante una DNA polimerasa termoestable El paso de una etapa a otra, se logra por cambios de temperatura de la mezcla de reacción. Para que ocurra la elongación de los partidores se requiere todo lo necesario para que haya síntesis de DNA, es decir: dntp, Mg 2+, un tampón, sales, además de los partidores. Esquema de la técnica de PCR: Un ciclo de amplificación 3
Técnica de PCR: Segundo ciclo de amplificación. Resultados después de múltiples ciclos de amplificación. - Se ha calculado que después 25 ciclos de amplificación, una molécula de DNA doble hebra se multiplica más de UN MILLON DE VECES - Esto permite VISUALIZAR el PRODUCTO DE PCR o AMPLICON por una simple electroforesis. 4
El producto de amplificación se puede detectar en electroforesis en geles de agarosa Carril 1: marcador ladder, carriles 2-3 muestras de producto de PCR de pol beta de T. cruzi a diferente diluciones. El equipo que lleva a cabo la técnica de PCR se llama Termociclador: Actualmente en el mercado existen una gran variedad de estos equipos, basados en diferentes sistemas para producir cambios rápidos de temperatura Hay equipos pequeños para sólo 16 muestras, hasta equipos múltiples, en los cuales se pueden realizar simultanemente diferentes ensayos de PCR Un par de termocicladores se muestran en la siguiente diapositiva 5
Ejemplo de Termocicladores Algunas aplicaciones de la técnica de PCR Diagnostico medico: Para detectar e identificar agentes infecciosos tales como: virus, bacterias, parasitos, hongos, etc. Detección de enfermedades genéticas: Ejemplo, determinar sí una mutación específica que provoca fibrosis quística ha sido heredada por los hijos. Estudios evolutivos: analizar las relaciones filogenéticas entre especies desaparecidas (muestras arqueologicas) y de especies vivientes. DNA fingerprinting : Perfil de productos de amplificación especificos de cada individuo de una población. Esto permite identificar personas desaparecidas, autores de crimenes, etc. 6
Referencias http://www.accessexcellence.org/ab/gg/polymerase.html http://www.accessexcellence.org/ab/bc/kary_b_mullis.html http://bioweb.uwlax.edu/genweb/molecular/seq_anal/primer_design/primer_design. htm http://www.karymullis.com/ http://www.bioteach.ubc.ca/molecularbiology/polymerasechainreaction/ http://www.emblheidelberg.de/externalinfo/geerlof/draft_frames/flowchart/clo_pcr_str ategy/primer_design.html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/class/nawbis/modules/dna/dna9.html http://www.dnalc.org/shockwave/pcranwhole.html http://www.alumni.ca/~leema3m/bg/pcr.html http://marvin.ibest.uidaho.edu/~heckendo/cs504/students/p/waltari.pdf FIN... 7