3. Capítulo Inmunización activa de ratones de la cepa BALB/c

3. Capítulo 3 Producción y actividad funcional de anticuerpos monoclonales inducidos por pseudopéptidos derivados del antígeno MSP-2 del Plasmodium falciparum producidos en ratones de la cepa BALB/c 3.1 Análisis bioinformático Se realizó un análisis Bioinformático con la secuencias disponibles en plasmo db (http://plasmodb.org/plasmo/) para la proteína MSP-2 de P. falciparum PFB0300c y su secuencia ortóloga en P. berghei PBANKA_124700. Debido a que la proteína MSP-2 no presenta secuencias ortólogas reportadas en P. yoelii, se realizó un análisis blast de proteínas (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) con la secuencia del péptido 4044 contra todas las proteínas reportadas de P. yoelii, encontrándose homología con la proteína hipotética PY05325. Adicionalmente, por este mismo método se encontró identidad con una proteína hipotética de P. berghei PB000459.00.0 Posteriormente, con estas cuatro secuencias se realizó un alineamiento múltiple utilizando Clustal W (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/align_clustalw.pl). Finalmente, se ejecutó análisis de conservación de secuencias a través del software JALVIEW versión 2.5.1 y se calculó el porcentaje de identidad con el programa Bioedit sequence alignment editor versión 7.0.5.3. 3.2. Inmunización activa de ratones de la cepa BALB/c Se seleccionaron grupos de ratones hembra de 4 a 5 semanas de la cepa BALB/c, mantenidos en unidades de aislamiento bajo condiciones controladas para ser inmunizados según esquemas estándar, 6 veces por vía intraperitoneal (i.p) con 50 µg del correspondiente pseudopéptido polimerizado, emulsificado y formulado en adyuvante completo de Freund para la primera inmunización y para las subsiguientes con adyuvante incompleto, en intervalos de 15 días. El grupo control se inmunizó sólo con adyuvante. Para evaluar la inducción de anticuerpos por parte de los pseudopéptidos se tomaron muestras de sangre antes de iniciar el experimento y después de la tercera inmunización hasta finalizar el experimento. 3.3. Fusión celular Se tomaron esplenocitos provenientes de ratones inmunizados con los pseudopéptidos y se fusionaron físicamente con células de mieloma X63Ag8, usando polietilenglicol 3000-3700, de acuerdo con el método de Köhler y Milstein (Köhler & Milstein, 1975), la mezcla de células se dispensó cajas para cultivo celular de 96 pozos y se dejaron en incubación

52 Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria por un período promedio de 10 días. Los pozos reactivos se analizaron utilizando los sobrenadantes del cultivo ricos en inmunoglobulinas por la técnica de ELISA. Los clones reactivos se clonaron por dilución limitante y se realizó una evaluación de especificidad frente a un lisado de proteínas de superficie de Plasmodium falciparum por Western Blot, los subclones 6 y 7 α-ψ-128 (129) y G, M, O y Q α-ψ-130 (131) reconocieron a la proteína nativa presente en el lisado de esquizontes maduros de P. falciparum y fueron cultivados hasta completar un volumen aproximado de 2 litros, para la obtención de una cantidad representativa de anticuerpos monoclonales. 3.4. Inducción del cambio de isotipo por inmunización in vitro de los clones reactivos Las células productoras de los clones y subclones derivados de los análogos ψ-128(129) y ψ-130(131) se distribuyeron de 100.000 células/ pozo en una caja de 96 pozos fondo plano, en medio RPMI suplementado con 15% de SFB. Estas células se pulsaron cinco veces con 200 ng de su respectivo pseudopéptido monómero (ψ-128 y ψ-130) diluido en RPMI 15% de SFB a intervalos de 8 días por pulso. El cambio de isotipo se verificó mediante un ensayo de ELISA empleando el kit Monoclonal antibody Isotyping Kit (HRP/ABTS) de Thermo Scientific (Rockford, IL, USA). Los sobrenadantes provenientes del cultivo de estos clones se recogieron periódicamente. Los anticuerpos presentes en los sobrenadantes provenientes del clon inducido por los análogos ψ-128(129) y ψ- 130(131) se codificaron como 6 y 7 y las inmunoglobulinas presentes en los sobrenadantes provenientes del hibridoma inducido por el ψ-130(131) se codificaron como: G, M, O y Q. Se evaluó la reactividad de los anticuerpos presentes en cada uno de los sobrenadantes provenientes de los clones frente a lisado de P. falciparum cepa FCB2, por la técnica de inmunotransferencia Western Blot. 3.5. Purificación de anticuerpos monoclonales El proceso de purificación de anticuerpos se realizó mediante un sistema de tratamiento en dos etapas, la primera consistente en la precipitación de proteínas con altas concentraciones de sulfato de amonio y la segunda por elución selectiva de las inmunoglobulinas a partir de una resina comatográfica de intercambio aniónico débil. 3.5.1. Etapa de precipitación con sulfato de amonio Las proteínas presentes en los sobrenadantes provenientes de cultivo celular, dentro de las cuales hay gran cantidad de inmunoglobulinas (Ig) se sedimentaron por tratamiento con una solución saturada de sulfato de amonio. En este proceso se estandarizó la concentración requerida de esta sal en ensayos realizados con porcentajes de saturación entre el 10 y el 80%.

3. Capítulo 3 53 Encontramos que a un porcentaje del 40% de saturación el precipitado estaba enriquecido en inmunoglobulinas y el sobrenadante del tratamiento en albúmina y otras proteínas, por lo que se decidió realizar esta primera etapa de precipitación al 40% de saturación con sulfato de amonio. Esta mezcla se incubó durante toda la noche a 4 C para asegurar la precipitación de toda la proteína. Posteriormente se centrifugó a 20000 rpm durante una hora a 4 C y los sobrenadantes se separaron cuidadosamente. El precipitado obtenido se disolvió en un volumen mínimo de la solución amortiguadora de ph Tris HCl 10mM, ph 8,5 y todo el material obtenido se sometió a un proceso de diálisis contra este mismo buffer en una membrana Spectrapore dialysis de 3500 MWCO (Houston, Texas, USA), de 24 a 48 h se hicieron de 4 a 6 cambios de solución amortiguadora de ph durante la diálisis. 3.5.2 Etapa de cromatografía de intercambio aniónico Una vez obtenidos los sedimentos reconstituidos en la solución amortiguadora de ph, enriquecidos en inmunoglobulinas, se sometieron a un proceso cromatográfico de intercambio aniónico débil, usando una resina de DEAE-Sephadex A-25 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) equilibrada previamente con buffer 10mM Tris HCl, ph 8,0. Esta resina se empleó como soporte mediante su empaquetamiento en una columna de vidrio de un volumen promedio entre 140 y 250 ml. Seguidamente, se procedió a servir sobre la columna comatográfica una cantidad aproximada de 5% (v/v) de la muestra con relación al volumen de resina empacada. Las inmunoglobulinas se eluyeron de la columna por incremento progresivo de la fuerza iónica del buffer en etapas de 50 mm, 100 mm y 500 mm de NaCl. Se colectaron 30 fracciones de 10 ml cada una, a una velocidad de flujo constante de 0,5 ml/min. Posteriormente la resina se re-equilibró con el buffer inicial Tris HCl 10 mm, ph 8,5. Todas las fracciones se caracterizaron por Dot directo para detección de anticuerpos. Las fracciones reactivas se mezclaron en grupos o pooles de acuerdo con la pureza de Igs en cada uno determinada por electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y su reactividad por Western Blot. Además se determinó la concentración de proteínas totales por el método del ácido bicinconínico (Bicinchoninic Acid BCA) (Smith, et al., 1985). Finalmente los pooles de fracciones reactivas y caracterizadas se dializaron contra buffer fosfato salino PBS a 4 C y se almacenaron hasta su uso en presencia de azida de sodio al 0,02% (v/v). 3.6. Mantenimiento y cultivo de las cepas de malaria murina P. berghei-anka y P. yoelii XL17 Las cepas del parásito de la malaria de roedores seleccionadas para este estudio, se mantuvieron viables mediante la realización de pases in vivo en ratones BALB/c

54 Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria infectados con 5x10 4 glóbulos rojos parasitados con P. berghei y P. yoelii vía intraperitoneal (i.p), para estimular altos porcentajes de parasitemia en los dos casos. Al obtener los índices adecuados se procedió a la inyección vía intravenosa (i.v) de ratones sanos de la misma cepa para permitir la interacción directa de las formas infectivas del parásito (merozoitos) con glóbulos rojos frescos circulantes, simulando así un efecto parecido al llevado a cabo en el ciclo eritrocítico de la enfermedad en una infección natural. 3.7. Estandarización de modelos de infección con malaria por P. yoelii y P. berghei en ratones BALB/c Con el objetivo de establecer infección de malaria in vivo en ratones BALB/c, obtenidos del bioterio de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia, se descongeló un vial de P. yoelii 17XL y un vial de P. berghei ANKA criopreservados en solución de Krebs (NaCl 0,85%, glucosa 5%, sorbitol 4,2% p/v). Para ello se realizaron tres lavados con medio de cultivo celular RPMI base a 2500 rpm durante 10 minutos y finalmente se administraron 500 µl del contenido de cada vial resuspendido en medio RPMI base (incompleto) por inyección vía intraperitoneal (ip). A partir del sexto día posterior a la infección experimental, se evaluó la presencia de parásito (Plasmodium) diariamente mediante tinción con el colorante de Wright en extendidos frescos de sangre periférica. Para realizar el desafío experimental en ratones BALB/c, se permitió que estos alcanzaran un porcentaje de parasitemia igual al 10%. Posteriormente, se realizó recuento de glóbulo rojos en cámara de Neubauer con laminilla teñida con solución colorante de naranja de acridina para determinar la cantidad de glóbulos rojos parasitados. 3.8. Transferencia pasiva de anticuerpos monoclonales y desafío experimental Para este ensayo se utilizaron grupos de cinco ratones BALB/c para cada una de las muestras a evaluar distribuidos de la siguiente manera: Grupo 1: Control inoculado con solución salina; Grupo 2 transferido con Ig anti ψ-129-6-100 mm; Grupo 3 con Ig anti ψ- 129-7-50 mm, Grupo 4 con Ig anti ψ-129-7-100 mm, Grupo 5 con Ig anti ψ-131-50 mm; Grupo 6 con Ig anti ψ-131-100 mm; Grupo 7 con Ig anti ψ-131-500 mm y Grupo 8 usado como control negativo o muestra de anticuerpos no relevantes para el estudio, se administró con suero policlonal anti partículas semejantes a virus del papiloma VLPs (del inglés Virus Like Particles). Los ensayos de inmunización pasiva se realizaron mediante el siguiente esquema de administración: En el día -1 se hizo la primera inmunización vía intravenosa con 250 µl de anticuerpos (Igs) a cada ratón. En el día 0 se realizó la infección intravenosa con 5x10 4 GRP/µL de P. berghei ANKA diluidos en PBS filtrado. En los días 2 y 4 se hizo la

3. Capítulo 3 55 segunda y tercera inmunización en la misma dosis, respectivamente. Se evaluaron porcentajes de parasitemia desde el día 6 hasta el día 20. En el día 21 se realizó la segunda infección con P. berghei con 1x10 5 GRP/µL por vía intraperitoneal. En los días 25, 28 y 30 se realizaron la cuarta, quinta y sexta inmunización por vía intravenosa (i.v) con la misma dosis inicial. Se evaluaron porcentajes de parasitemia desde el día 25 hasta el día 40. Los grupos de trabajo se distribuyeron de la siguiente manera: Para el ensayo con P. yoelii 17XL se utilizaron grupos de cinco y/o cuatro ratones BALB/c para cada una de las muestras a evaluar: grupo 1 y 10: control (solución salina); grupo 2: cloroquina; grupo 3: Ig anti ψ-129-6-50 mm; grupo 4: Ig anti ψ-129-6-100 mm; grupo 5: Ig anti ψ-129-7-50 mm; grupo 6: Ig anti ψ-129-7-100 mm; grupo 7: Ig anti ψ- 131-50 mm; grupo 8: Ig anti ψ-131-100 mm; grupo 9: Ig anti ψ-131-500 mm. Dada la virulencia de la cepa P. yoelii 17XL, el esquema de inmunización se modificó de la siguiente manera: En el día -1 se hizo la primera inmunización intravenosa con 250 µl de anticuerpos a cada ratón. En el día 0 se realizó la infección con 2000 GRP/µL intravenosamente. En los días 2 y 5 se realizó la segunda y tercera inmunización en la misma dosis, respectivamente. Se evaluaron porcentajes de parasitemia desde el día 6 al día 28. En el día 13 se realizó la segunda infección con P. yoelii 17XL, con 5000 GRP/µL vía intraperitoneal. En el día 15 se realizó la cuarta inmunización intravenosamente con la misma dosis inicial. Para el reto experimental con P. yoelii 17XL en los grupos 7, 8, 9 y 10 se realizó el siguiente esquema. En el día 0 se realizó la 1 inmunización intravenosamente con 100 µl de anticuerpos a cada ratón. En el día 0 se realizó la infección con 2000 GRP/µL intravenosamente de P. yoelii 17XL. En los días 1, 2 y 4 se efectuaron las 2, 3 y 4 inmunizaciones respectivamente con 200 µl a cada ratón. Se evaluó la aparición de parasitemia desde el día 3 hasta el día 9. 3.8.1. Tinción de parásitos del Plasmodium con colorante de Wright Con 50 µl de sangre periférica tomada por la vena lateral de la cola del ratón, se realizaron extendidos sobre una lámina porta objetos la cual se dejó secar al aire, cuando estuvo seca se cubrió con el colorante de Wright durante 10 minutos, al cabo de los cuales se adicionaron unas gotas de agua destilada, suministrando aire hasta que apareció un brillo metálico se dejó actuar durante 10 minutos, se lavó con abundante agua y se secó al aire, se adicionó 1 gota de aceite de inmersión y se observó al microscopio con el objetivo de 100x. 3.9. Ensayo de inhibición de la invasión y desarrollo biológico del P. falciparum in vitro Se empleó la cepa colombiana FCB2 humana del parásito resistente a cloroquina. Los parásitos se mantuvieron en cultivo continuo en eritrocitos humanos O+ infectados y se sincronizaron para homogenizar el estadio de los parásitos antes de cada ensayo.

56 Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria Los anticuerpos anti-pseudopéptidos y los anticuerpos monoclonales purificados se valorarán por su capacidad para inhibir el proceso de invasión del parásito (cepa FCB2) a glóbulos rojos frescos, en ensayos in vitro de acuerdo a los protocolos previamente publicados (Lozano, et al., 1998). 3.10 Actividad in vitro de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos con P. berghei ANKA y P. yoelii 17XL Se efectuó una adaptación de condiciones estándar para el crecimiento in vitro P. yoelii y P. berghei (Smalley, et al., 1975; Mons, et al., 1983; Lewis-Hughes, et al., 1984; Ramaiya, et al., 1987). Para ello, se tomaron 500 µl de sangre de ratón infectado con parasitemia entre 7-10% en PBS 0,1% citrato de sodio. Luego se centrifugó a 800 rpm durante 10 minutos. Se hicieron dos lavados con RPMI Incompleto 0,1% citrato de sodio. Asépticamente, se adicionaron al sedimento, 2.5 ml de medio RPMI completo (20% de SFB, gentamicina 5 mg/ml, antibiótico antimicótico 1%). En cajas de cultivo celular de 24 pozos se adicionaron a cada pozo 400 µl de medio completo, 500 µl de anticuerpos o controles y finalmente 100 µl de glóbulos rojos parasitados ó glóbulos rojos sanos, para un volumen final de 1000 µl/pozo. Se emplearon como controles del ensayo, glóbulos rojos sanos, glóbulos rojos parasitados, cloroquina 2,83 x 10-3 mm y EGTA 55,55 mm. Cada muestra se realizo y evaluó por duplicado. Este ensayo se incubó por 15 horas a 37 C en cámar a de gases suplementada con 90% N 2, 5% CO 2, 5% O 2. En los días 1, 4, 7, 10 y 14 se preparó una mezcla de 500 µl de GR sanos y 7 ml de medio completo, con el fin de adicionar 300 µl de esta mezcla a cada uno de los pozos. Se evaluaron los porcentajes de parasitemia a diario a partir del segundo día por recuento en cámara de Neubauer con naranja de acridina a una dilución 1/500. 3.11 Técnicas inmunoquímicas 3.11.1 Dot directo e indirecto para la detección de anticuerpos Para esta técnica se empleó un papel de nitrocelulosa en el cual se marcaron los pozos de una placa de 96 en cada pozo se sembraron 5 µl de la fracción recolectada (en la cromatografía de intercambio aniónico) para dot directo y para dot indirecto el antígeno, en este caso lisado de Plasmodium falciparum se dejó secar a temperatura ambiente. Para el bloqueo se empleó una solución con leche descremada al 5% en PBS Tween-20 en la cual fue sumergida la membrana e incubada por 1 hora con agitación y se realizaron 5 lavados con PBS-Tween-20. Para el dot indirecto se incubaron las fracciones o grupos de estas toda la noche a 4 C, se realizar on 5 lavados y se incubaron con anticuerpo secundario marcado con peroxidasa por 1 hora a temperatura ambiente con agitación y se realizaron 5 lavados con PBS-Tween-20. La solución reveladora se

3. Capítulo 3 57 preparó en agua destilada, con 3,3,5,5 -tetrametilbencidina (TMB Substrate Kit for peroxidase, Pharmacia, Upsala, Suecia). 3.11.2 Inmunoensayo enzimático en fase sólida (ELISA) Los sueros obtenidos de los ratones inmunizados fueron analizados en cuanto a su reactividad frente a los diferentes antígenos, cada uno de los pseudopéptidos (10 µg/ml) fueron incubados toda la noche a 4 C en cajas de po lipropileno de 96 pozos, se realizaron 4 lavados con buffer PBS-Tween-20, se incubaron durante 2 horas con solución bloqueadora (leche descremada al 4% en PBS). Se realizaron 4 lavados con solución amortiguadora de ph 7,2, PBS-Tween-20, posteriormente fueron incubados a 37 C por 1 hora ( por duplicado), se realizaron 4 lavados con el buffer de lavado y se incubaron por 1 hora a 37 C con el anticuerpo secundario anti-igg de ratón conjugado a peroxidasa, diluido en solución bloqueadora. Los anticuerpos que reconocen específicamente al antígeno (pseudopéptido) se detectaron por medida de la absorbancia a 450 nm (longitud de onda a la cual absorbe el complejo antígeno-anticuerpo formado con transferencia de un electrón al agente aceptor empleado TMB). La Densidad Óptica (DO) de los pozos blanco se sustrae de todos los valores y el promedio más dos veces el valor de la desviación estándar de los controles negativos se usa como punto de corte para el ensayo. 3.11.3 Inmunotransferencia (Western Blot) El lisado de proteínas del P. falciparum se resuelve por electroforesis en gel de poliacrilamida del 10-13%. Posteriormente se transfirió a una membrana de nitrocelulosa a 8 V por 5 horas la membrana fue incubada con los sueros o los sobrenadantes de los clones reactivos y luego se incubó con un anticuerpo anti-igg de ratón conjugado a peroxidasa. Los complejos fueron revelados con una solución cromogénica de Nitro Blue Tetrazolium-5-bromo-4-4-chloro-3 -Indolyphosphate-p-Toluidine Salt (NBT/BCIP) de Pharmacia, Upsala, Suecia. 3.11.4 Inmunofluorescencia Indirecta (IFI). Para esta técnica se empleó como antígeno la cepa FCB2 de Plasmodium falciparum. Este antígeno, fue fijado a las láminas porta objeto y tratado con un agente permeabilizador de la membrana de los eritrocitos, para permitir el acceso posterior de los anticuerpos purificados o presentes en los sueros de los animales inmunizados. El complejo formado se puede visualizar por microscopía de fluorescencia, esta es una prueba de reconocimiento específico antígeno-anticuerpo.

58 Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria 3.12 Resonancia Magnética Nuclear de Hidrógeno ( 1 H- RMN) para análisis de estructura secundaria El péptido MSP- 1 42-61 (1513) y sus análogos pseudopeptídicos ψ- 437, ψ-439, ψ-440, ψ- 441 y ψ-442 y el péptido MSP-2 21 40 (4044) y sus análogos pseudopeptídicos ψ-128(129) y ψ-130(131), se emplearon para análisis de RMN- 1 H en experimentos conducidos en un espectrómetro Bruker DRX-600 MHz a 295 K. Los datos se procesaron y analizaron en una estación de trabajo Silicon Graphics empleando el programa XWIN-NMR 1.3 (Bruker, Darmstadt, Alemania). Se realizaron experimentos por las técnicas bidimensionales denominadas: Double quantum filter-correlation spectroscopy (DQF-COSY), Total Correlation Spectroscopy (TOCSY), y Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (NOESY) con el objetivo de caracterizar y asignar todos los átomos de hidrógeno vecinos en la secuencia de cada molécula. El desplazamiento en 4.75 ppm, corresponde a la señal de los hidrógenos del agua que se empleo como referencia. Los coeficientes de temperatura se determinaron a partir de los espectros TOCSY empleando un rango de temperatura entre 285 315 K. Se obtuvo la pendiente de la curva calibrada para la relación entre el desplazamiento químico versus temperatura para cada uno de los hidrógenos de los grupos amida (- δhn/ T, ppm/k). Las constantes de acoplamiento 3 J HNHα se midieron a partir de la separación de los multipletes de los picoscruzados (cross-peaks) obtenidos en los experimentos unidimensionales DQF-COSY. 3.13 Resultados y Discusión sobre el tercer capítulo. Obtención y análisis de anticuerpos monoclonales inducidos por los pseudopéptidos ψ128(129) y ψ130(131) derivados del péptido 4044 proveniente de la proteína MSP-2 de P. falciparum 3.13.1 Análisis de bioinformático y polimorfismo genético del antígeno MSP-2, diseño y obtención de los análogos El análisis bioinformático muestra residuos conservados entre la proteína MSP-2 y las secuencias analizadas en el motivo de unión y en el sitio donde fueron introducidas las modificaciones en la Figura 3-1 se observa el porcentaje de identidad y el grado de conservación de las secuencias.

3. Capítulo 3 59 Figura 3-1: Análisis bioinformático del péptido 4044 derivado de la proteína MSP-2 de P. falciparum. (A) Alineamiento de la secuencia del péptido 4044 (MSP-2 21-40 ) y las secuencias homólogas de MSP-2. (B) Grado de conservación entre las secuencias. Basados en la secuencia nativa del péptido 4044 ( 21 KMESKYSNFINNAYNMSIR 40 ) ubicado en la región N-terminal de la proteína MSP-2 del P. falciparum que también ha sido propuesto como candidato a vacuna y cuyo motivo de unión a glóbulos rojos definido por el par de residuos 30 I-N 31 sirvió como base para el diseño de los pseudopéptidos ψ- 128 (Phe-Ile) y ψ-130 (Ile-Asn) y a sus correspondientes formas poliméricas ψ-129 y ψ- 131 a los cuales se les hizo una sustitución sitio-dirigida de un enlace peptídico por el isóstero ψ-[ch 2 -NH] en la Tabla 3-1 se muestran las diferentes características del péptido 4044 y sus análogos con sus respectivas formas poliméricas (Figura 3-2).

60 Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria Tabla 3-1: Características del péptido 4044 y sus pseudopéptidos Código Secuencia de aminoácidos PM esperado (Da) Masa experimental m/z (uma) 4044 KMESKYSNFINNAYNMSIR 2388,01 2386,05 4306 CGKMESKYSNFINNAYNMSIRGC 2715,50 2713,13 ψ-128 KMESKYSNF-ψ[CH 2 NH]-INNAYNMSIR 2379,14 2380,03 ψ-129 CGKMESKYSNF-ψ[CH 2 NH]-INNAYNMSIRGC 2706,64 2710,31 ψ-130 KMESKYSNFI-ψ[CH 2 NH]-NNAYNMSIR 2379,14 2380,09 ψ-131 CGKMESKYSNFI-ψ[CH 2 NH]-NNAYNMSIRGC 2706,64 2704,26 Figura 3-2: Diseño de pseudopéptidos derivados de MSP-2 21-40. (A) Representación Esquemática de la MSP-2 de P. falciparum y ubicación del péptido 4044. (B) Diseño de pseudopéptidos amida reducida derivados del péptido 4044.

3. Capítulo 3 61 3.13.2 Generación y cultivo de los clones de anticuerpos monoclonales inducidos por los dos análogos del péptido 4044 Una vez obtenidos los hibridoma reactivos 1H10E5G6 y 1A8A8E7 se clonaron por dilución limitante, este proceso se monitoreó mediante la técnica de ELISA. En la Figura 3-3 se muestra el hibridoma que dio origen a los clones reactivos y el sub-clonaje de estos permitió aislar clones productores de anticuerpos específicos. Los anticuerpos fueron detectados en el sobrenadante, los pozos reactivos se ampliaron y se cultivaron en cajas de 250 ml la reactividad específica fue detectada por western Blot frente a lisado de P. falciparum la Figura 3-4 muestra que los anticuerpos inducidos por el peptido-mimético ψ-130 evidencian una reactividad fuerte y específica por una banda denominada (a) que migra con una movilidad relativa respecto a los patrones de peso molecular de 37,90 kda. Por otra parte los anticuerpos inducidos por el péptidomimético ψ-128 reconocen dos bandas de alta intensidad y especificidad con movilidad relativa más rápida de nominadas (b) y (c) respectivamente. La banda (b) tiene una masa molecular relativa de 34,21 kda y la banda (c) una masa molecular relativa de 30,54 kda. Figura 3-3: Árbol genealógico de los hibridomas que dieron origen a los clones productores de anticuerpos inducidos por los pseudopéptidos ψ-128(129) y ψ-130(131).

62 Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria Datos obtenidos al estimar el valor de la movilidad de cada una de estas bandas en cm en una curva de calibración establecida para la relación entre el log 10 del Peso Molecular (PM) versus la distancia recorrida por cada uno de los patrones (cm). Estas bandas reconocidas por los dos grupos de anticuerpos están de acuerdo con la masa molecular relativa reportada para el antígeno MSP-2 de P. falciparum. Figura 3-4. Reactividad específica de los clones productores de inmunoglobulinas anti-ψ-128(129) y anti-ψ-130(131). De los anticuerpos generados a partir del pseudopéptido ψ128(129) se aislaron 2 clones codificados como 6 y 7, para el anti ψ130(131) se aislaron 4 clones codificados como G, M, O y Q. este grupo de hibridomas presentaron isotipo IgM, que por inmunizaciones in vitro con cantidades de 200 ng del pseudopéptido se indujo el cambio a isotipos de tipo IgG (inmunoglobulina madura) asociada con protección. (Tabla 3-2)

3. Capítulo 3 63 Tabla 3-2: Inducción del cambio de isotipos de inmunoglobulinas por inmunización in vitro Pseudopéptido inductor Clones en cultivo/isotipo inicial Clon % % % % IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 % IgM Anticuerpos purificados/cambio de isotipo in vitro % % % % IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 Fxs (Fuerza iónica) mm ψ-128(129) 6 0,00 0,00 0,00 5,70 94,30 50 6,00 13,80 11,86 62,53 5,78 100 3,59 12,57 11,93 65,04 6,82 7 0,00 0,00 2,95 40,60 56,30 50 16,08 14,31 42,87 10,42 16,36 100 17,28 17,87 36,93 13,15 14,77 ψ-130(131) G 1,70 0,23 0,59 3,52 97,65 50 8,02 5,96 3,91 0,28 81,84 M 1,25 0,00 0,33 1,95 96,50 100 6,08 9,23 7,45 0,02 77,22 O 0,16 0,00 0,23 1,88 97,70 500 3,52 2,39 1,81 0,00 92,28 Q 0,00 0,00 0,18 5,30 94,50 % IgM 3.13.3 Aislamiento, purificación y caracterización de Igs secretadas en los sobrenadantes de los clones inducidos por los pseudopéptidos ψ-128(129) y ψ- 130(131) Una vez alcanzado el volumen de sobrenadante deseado (Tabla 3-3) por clon, se procedió a la precipitación con sulfato de amonio al 40% de saturación de las inmunoglobulinas presentes en este, después del proceso de saturación todas las muestras se reconstituyeron y dializaron frente a un buffer Tris-HCl 10 mm, ph 8,5 para retirar el sulfato de amonio y todas las muestras se sometieron posteriormente a una segunda etapa de purificación por cromatografía de intercambio aniónico débil sobre DEAE- sephadex, en todos los casos excepto el clon 7 ψ-128(129) fueron necesarias varias corridas cromatográficas para una sola muestra.

64 Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria Tabla 3-3: Características de los anticuerpos monoclonales producidos en sobrenadantes de cultivo Clon sobrenadante a precipitar (ml) Precipitado resuspendido Tris-HCl 10mM ph 8.0(mL) Concentrado (ml) No veces concentrado ψ 128(129) 6 1800 200 30,0 60 ψ 128(129) 7 1800 200 12,5 144 ψ 130(131) G 1800 220 20,0 90 ψ 130(131) M 2850 100 15,0 190 ψ 130(131) O 3000 100 20,0 150 ψ 130(131) Q 3000 100 25,0 120 Figura 3-5: Reactividad de las fracciones purificadas por cromatografía de intercambio aniónico. A. Fracciones reactivas anti-ψ-128(129). B. Fracciones reactivas anti-ψ-130(131).

3. Capítulo 3 65 Para la purificación de los anticuerpos presentes en el sobrenadante del clon 6 ψ128(129) fueron necesarias tres cromatografías de intercambio aniónico. El volumen de columna para las tres cromatografías fue de aproximadamente 200 ml, para cada elución se sirvieron 10 ml del extracto proteico concentrado enriquecido en inmunoglobulinas. Las fracciones se reunieron para formar pooles de inmunoglobulinas según el perfil electroforético, dot directo y por fuerza iónica de elución. En el grupo de fracciones eluídas con 500 mm NaCl no se detectó la presencia de anticuerpos. Figura 35A. Para la purificación de los anticuerpos presentes en el sobrenadante del clon 7 ψ128(129) se realizó una sola elución, con un volumen de columna de 157 ml, se sirvieron 12.5 ml de sobrenadante procesado como se describió anteriormente. Los anticuerpos presentes en el sobrenadante del clon G, M, O y Q inducidos por el pseudopéptido ψ-130(131) tenían el mismo isotipo y características electroforéticas semejantes como se observa en la Figura 3-5, estos 4 sobrenadantes fueron mezclados para su purificación, para este fin fueron necesarias ocho cromatografías de intercambio aniónico, el volumen de columna para las ocho cromatografías fue de aproximadamente 200 ml, para cada elución se sirvieron 10 ml de sobrenadante concentrado. La reunión del grupo de fracciones se hizo por el perfil electroforético (Figuras 3-6 y 3-7) y dot directo (Figura 33-5B). Figura 3-6: Perfil electroforético de los clones anti-ψ-130(131).

66 Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria Tabla 3-4: Grupos de fracciones obtenidas por cromatografía de intercambio aniónico Fuerza iónica mm Clon 6 ψ 128(129) Clon 7 ψ 128(129) Clon ψ 130(131) mg/ml (ml) mg/ml (ml) mg/ml (ml) 50 8,54 290 0,29 70 1,51 190 100 23,30 430 0,20 100 0,57 200 500 * * * * 0,05 150 Figura 3-7: Perfil electroforético de las fracciones eluídas por cromatografía de intercambio aniónico de las inmunoglobulinas anti-ψ-130(131). 3.13.4 Estandarización de modelos de infección por malaria con P. berghei y P. yoelii in vivo Figura 3-8: Parasitemia inducida por infección con las cepas de P. berghei ANKA y P. yoelii 17XL Extendido de sangre periférica de ratón aumento 100x. Las letras representan diferentes estadios del parásito, A anillo, T trofozoito, E esquizonte.

3. Capítulo 3 67 Se inocularon intravenosamente ratones hembra de la cepa BALB/c con una dosis letal de 2x10 6 glóbulos rojos infectados con P. berghei y P. yoelii 17XL el conocimiento del ciclo eritrocítico de estas dos cepas permitió evaluar la aparición y el establecimiento de la parasitemia. La infección es evidenciada por la presencia de formas inmaduras del parásito como el estadio de anillos visualizados en las muestras de sangre recolectadas de todos los ratones. El progreso de la parasitemia es indicada por la aparición de diferentes estadios del parásito tales como anillos, trofozoitos y esquizontes inmaduros. Figura 3-8 3.13.5 Ensayos funcionales con las inmunoglobulinas de isotipo definido IgG3b, IgG3 e IgM in vivo vs P. berghei y P. yoelii El establecimiento del modelo de infección con las dos cepas de malaria P. berghei y P. yoelii en ratones hembra de la cepa BALB/c permitió realizar los ensayos funcionales de los anticuerpos monoclonales inducidos por los pseudopéptidos ψ-128(129) y ψ- 130(131). Una vez purificados y caracterizados los anticuerpos monoclonales fueron transferidos pasivamente en ratones BALB/c frente al desafío experimental con dosis letales la cepa de P. berghei ANKA y P. yoelii 17XL en la Tabla 7 se muestran los grupos de ratones evaluados para las dos cepas. Todos los grupos de ratones retados con la cepa P. berghei ANKA fueron infectados vía i.v los grupos control, inoculados con solución salina presentaron cinéticas de infección superiores a las de los demás grupos, en los grupos transferidos con los anticuerpos además de evidenciar un retraso en la aparición de porcentajes significativos de parasitemia lograron manejar niveles mucho más altos de parasitemia evidenciando un efecto modulador de los anticuerpos sobre el desarrollo biológico del parásito. Los grupos de animales a los que se les administró solución salina se infectaron más rápidamente luego del desafío experimental que los grupos de estudio manejando niveles inferiores de parasitemia suficientes para causar la muerte de estos animales lo cual no ocurrió en los otros grupos. Los animales pertenecientes al grupo 2 transferidos pasivamente con anticuerpos inducidos por el ψ-128 (129) controlaron la infección significativamente logrando revertir el efecto infeccioso de la cepa P. berghei. Los animales de los grupos 6 y 7 transferidos pasivamente con anticuerpos inducidos por el ψ-130 (131) controlaron la infección mucho mejor que los demás grupos, evidenciando el potencial funcional de este pseudopéptido frente a la cepa de P. berghei. En la Figura 3-9 se muestra el efecto neutralizador de las inmunoglobulinas evaluadas. La supervivencia de los grupos de animales de experimentación se puede observar en la Figura 3-10, en la cual se evidencia el efecto dramático de los anticuerpos sobre la calidad de vida de los ratones tratados con las inmunoglobulinas.

68 Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria Figura 3-9: Ensayo de actividad funcional in vivo de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos derivados del péptido 4044 vs P. berghei. Tabla 3-5: Grupos de ratones transferidos pasivamente con los anticuerpos monoclonales Infección con P. berghei ANKA Infección con P. yoelii XL17 Grupo Ig Transferida Isotipo N ratón Grupo Ig Tran sferida Isotipo N ratón 1 Control PBS * 1,2,3,4,5 1 Control PBS * 1,2,3,4,5 2 6-100 mm IgG3 6,7,8,9,10 2 Cloroquina * 6,7,8,9,10 3 7 50 mm IgG2b 11,12,13,14,15 3 6-50 mm IgG3 11,12,13,14,15 4 7-100 mm IgG2b 16,17,18,19,20 4 6 100 mm IgG3 16,17,18,19,20 5 131-50 mm IgM 21,22,23,24,25 5 7-50 mm IgG2b 21,22,23,24,25 6 131-100 mm IgM 26,27,28,29,30 6 7-100 mm IgG2b 26,27,28,29,30 7 131-500 mm IgM 31,32,33,34,35 7 131-50 mm IgM 30,31,32,33 8 Control(VLPS) * 36,38,41, 42,44 8 131-100 mm IgM 34,35,36,37 9 131-500 mm IgM 38,39,40,41 10 Control(PBS) * 42,43,44,45