ANÁLISIS DEL MECANISMO DE CONTROL POR WNT DE LA DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES Mireia Duñach Masjuan Departament de Bioquímica - Facultat de Medicina Universitat Autònoma de Barcelona Antonio García de Herreros Madueño Programa de Recerca en Càncer. IMIM - Institut de Recerca Hospital del Mar PRBB, Barcelona
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1. Resumen del proyecto El proyecto estaba dirigido a la caracterización de los mecanismos moleculares que controlan el proceso de diferenciación de las células madre mesenquimales (MSC), regulado por factores extracelulares Wnt. El interés del estudio radica en la potencialidad de estas células, que pueden originar diferentes tejidos adultos como hueso, músculo y tejido graso, abriendo así la posibilidad de utilizar las MSC en la reparación de tejidos lesionados. Concretamente, el proyecto se ha centado en estudiar cómo los factores de la familia Wnt controlan estos procesos. Curiosamente, aunque estos factores pertenecen a la misma familia, producen sus señales dentro de la célula de manera muy diferente, según activen la ruta denominada canónica (que produce incrementos en la proteína β-catenina) o la no canónica (que la disminuye). Así, los factores Wnt canónicos (como Wnt3a) y los no canónicos (Wnt5a) afectan de manera muy diferente a la diferenciación de las MSC; por ejemplo, Wnt3a inhibe su conversión a adipositos, mientras que Wnt5a no lo hace. En cambio, en otras respuestas, como la estimulación de su capacidad migratoria, los dos tipos de Wnt producen efectos similares. El objetivo principal ha consistido en la caracterización de las etapas iniciales de las vías de señalización inducidas por factores Wnt canónicos y no canónicos. Aunque los ligandos Wnt se unen al mismo tipo de receptores, Frizzled, y requieren la acción de algunas proteínas comunes, como Dishevelled (Dvl), las dos vías divergen rápidamente. Se ha determinado el papel de p120-catenina y de la cinasa CK1ε en ambas rutas y las bases moleculares de esta diferente señalización. Estos resultados permiten evaluar el impacto de la inhibición selectiva de estas vías en el proceso de diferenciación de las MSC. 2. Resultados El grupo ha caracterizado las primeras etapas de la ruta de señalización iniciada por la unión tanto de los factores Wnt canónicos como no canónicos a sus proteínas receptoras. Ambos activan una proteína cinasa, CK1ε, necesaria para que la cascada de reacciones continúe y se den las respuestas finales. Sin embargo, la activación de esta cinasa por los ligandos Wnt canónicos y no canónicos se da mediante mecanismos 3
diferentes. Aunque ambos factores Wnt utilizan una proteína receptora común, llamada Frizzled, esta se une a un correceptor diferente, LRP5/6 para los Wnt canónicos y Ror2 para los no canónicos. Esto permite, por ejemplo, que inhibidores de Ror2 prevengan específicamente la activación de la ruta no canónica. 1. Caracterización del papel de p120-catenina en la vía canónica de Wnt. Nuestros resultados han permitido completar un modelo en el que el complejo p120- catenina/ck1ε/cadherina desempeña un papel clave en el control de esta vía de señalización. Esta ruta induce la estabilización de la β-catenina, inhibiendo su fosforilación por la cinasa GSK3. Este modelo se presenta de manera resumida en la figura 1 y recoge resultados publicados (Vinyoles et al., Mol. Cell 2014, y Vinyoles et al., Oncogene 2017). 4
Figura 1. Modelo de las etapas iniciales de la señalización canónica de Wnt. Papel del complejo cadherina/p120-catenina/ck1ε en la vía de señalización. Los detalles se describen en el texto. 5
Los resultados del grupo indican que la p120-catenina juega un papel clave, primero como proteína acopladora que permite la activación de la CK1ε por Wnt canónico (Wnt3a) y luego, tras su disociación del signalosoma, como elemento necesario para activar Rac1 y facilitar el paso de β-catenina al núcleo. Así, el correceptor de Wnt canónico LRP5/6 se encuentra unido al complejo CK1ε/p120-catenina a través de cadherina (figura 1A). En células estimuladas con el ligando Wnt3a, este factor permite que LRP5/6, con CK1ε/p120-catenina que lleva asociadas, se acerque al receptor Frizzled, que a su vez se encuentra unido a la fosfatasa PP2A/PR61ε. Esto facilita que la fosfatasa active la cinasa CK1ε (figura 1B) y posibilite la fosforilación de Dvl-2 y su reclutamiento a los receptores de Wnt (Vinyoles et al., Oncogene 2017). La unión de Dvl-2 permite que los complejos de receptores se agrupen entre sí (clustering), facilitando la unión de axina, CK1α y GSK3 al complejo receptor y correlaciona con la inhibición de la actividad de GSK3 (figura 1C). GSK3 es posteriormente secuestrada en multivesículas, impidiendo su acceso a β-catenina (figura 1D). Esta internalización en vesículas requiere la separación previa de p120-catenina de la cadherina y promueve la inhibición sostenida de la GSK3, que queda físicamente separada de su sustrato, la β- catenina. Mutantes de p120-catenina y/o cadherina que no se disocian del complejo bloquean la internalización de GSK3 en las multivesículas y atenúan fuertemente la respuesta a Wnt. 2. p120-catenina, CK1ε y la fosfatasa PP2A/PR61ε también son esenciales en la vía no canónica de Wnt Los ligandos Wnt no canónicos comparten las primeras reacciones de la ruta, aunque el correceptor utilizado es diferente, ya que se trata de la pseudocinasa Ror2. Así, Wnt5a induce la formación de un complejo Ror2/Frizzled necesario para la fosforilación de Dvl2 y polimerización de receptores. Hemos demostrado que p120-catenina, CK1ε y la fosfatasa PP2A/PR61ε también se requieren para la activación de esta ruta. En este caso, p120-catenina y CK1ε se encuentran directamente unidas a Ror2 en dominios diferentes; también en este caso la formación del complejo Ror2/Frizzled es necesaria para la activación de CK1ε y la fosforilación y reclutamiento de Dvl2 a Frizzled. El complejo Ror2/Frizzled facilita la activación de CK1ε por la fosfatasa PP2A/PR61ε unida a Frizzled (ver figura 2). La eliminación de p120-catenina, CK1ε o de la PR61ε bloquea la interacción de Dvl2 a Frizzled inducida por Wnt5a, de manera similar a como ocurría con Wnt3a, indicando que también son factores necesarios para formar el signalosoma Wnt5a. La interacción de p120-catenina con Ror2 es dependiente de la fosforilación en 6
tirosinas, ya que se bloquea con inhibidores tirosina cinasas. Además, esta interacción p120/ror2 regula la presencia del receptor Ror2 en la membrana plasmática, evitando su internalización a través de un mecanismo dependiente de clatrina. Un inhibidor de la endocitosis dependiente de clatrina previene la desaparición de Ror2 de la membrana plasmática inducida por Wnt5a o por la eliminación de p120-catenina. Curiosamente, se observó que células deplecionadas de CK1ε presentaban niveles más bajos de Ror2, situación que se asocia a una menor estabilidad de Ror2. Las diferencias entre las rutas aparecen posteriormente; así, con Wnt canónico se libera p120-catenina, que actúa facilitando el transporte de la β-catenina al núcleo y su acción en este compartimento. En la vía no canónica, se activan tirosina cinasas asociadas a Ror2 que producen la estimulación de dos ramas distintas: una implicando a Rac1 y JNK2 y la otra a Fyn y al factor Stat3, y como respuesta final se induce la transcripción de la E3-ubiquitina ligasa Siah2 implicada en la degradación de la β- catenina. Además, Wnt5a también promueve la invasión celular y la polarización de la actina cortical. En consonancia con el papel central de p120-catenina, CK1ε, PR61ε y Ror2 en las etapas iniciales de la ruta Wnt5a, la eliminación de cualquiera de estos genes en las MSC bloquea las respuestas finales mencionadas. Estos resultados revelan la importancia de estos componentes también en la señalización no canónica. Figura 2. Modelo de las etapas iniciales de activación de la señalización no canónica de Wnt. La señalización Fz/Dvl/JNK (C y D) es independiente de Fz/Fyn/Stat3 (C y E). Ambas ramas requieren CK1ε, la fosfatasa PP2A/PR61ε y p120-catenina, además de los receptores Frizzled y Ror2 (A, B y C). 7
3. Análisis del papel del complejo p120-catenina/cadherina en la diferenciación de las MSC a adipocitos y osteoblastos y su regulación por Wnt canónico. Todos estos estudios se han realizado en líneas celulares en cultivo y se han verificado en células madre mesenquimales (MSC) analizando su capacidad de diferenciar. A pesar de las dificultades de manipulación de las MSC transfectadas y con capacidad de diferenciar, se ha podido analizar a nivel molecular esta diferenciación cuando se estimulan las células con los Wnt canónicos y no canónicos. Se ha comprobado de qué modo el tratamiento de las MSC con Wnt3a evita la diferenciación a adipocitos. Esta inhibición también se da cuando el medio contiene Wnt5a además de Wnt3a, demostrando cómo en este contexto la vía canónica predomina sobre la no canónica e impide la diferenciación. Con el fin de validar la relevancia de CK1ε y de la subunidad reguladora PR61ε, se generaron MSC deplecionadas en estos factores. Dado que la vía canónica de Wnt no se puede activar en ausencia de PR61ε ni de CK1ε, las MSC diferenciaron a adipocitos al ser estimuladas con medio de diferenciación y Wnt3a, sugiriendo que son factores esenciales en esta ruta. La vía no canónica, sin embargo, parece no producir ningún efecto en la diferenciación hacia adipocitos. Además de mantener las MSC en su estado indiferenciado, Wnt3a incrementa la migración de las MSC, otro efecto que se previene al eliminar el gen de PR61ε o CK1ε. De hecho, las MSC incubadas con este factor adquieren muchas propiedades similares a las de los fibroblastos activos, también llamados cancer-associated fibroblasts (CAF), un tipo celular que facilita la migración y el crecimiento de las células tumorales epiteliales. Este hecho originó que nos planteáramos investigar cómo Wnt induce este proceso y cómo bloquearlo (apartado 4). 4. MSC e invasión de células epiteliales tumorales. Una relevancia adicional de este estudio viene determinada por el papel que tienen las MSC en tumorigénesis, ya que participan en la generación de fibroblastos activos o CAF. Estas células promueven el crecimiento y particularmente la invasión de las células tumorales epiteliales. La eliminación en las MSC de la respuesta a Wnt, tanto canónico como no canónico, evita la acción estimuladora de estas células sobre las células epiteliales, dando una relevancia patológica adicional a este trabajo. Los resultados obtenidos indican que estas células están implicadas en varios tipos de cáncer, de manera diferente. En primer lugar, son las células que generan los tumores 8
mesenquimales conocidos como sarcomas (Alba-Castellón et al., 2014). Así, mutaciones en p53 en las MSC son suficientes para que generen sarcomas cuando se inyectan en ratones inmunodeprimidos. Por otro lado, las MSC contribuyen al pool de CAF observados en tumores epiteliales. De hecho, ambos tipos de células, los CAF y las MSC en su estado indiferenciado, comparten muchos de sus marcadores, sugiriendo que probablemente se trata de las mismas entidades celulares. La activación de las MSC se produce por citocinas derivadas de las células tumorales, siendo el TGFβ la más relevante, aunque no la única (figura 3). La activación de las MSC incrementa su capacidad invasiva y también la síntesis y secreción de moléculas que facilitan la invasividad de las células epiteliales tumorales. Esta activación requiere la expresión del factor transcripcional Snail1. Así, MSC deficientes en Snail1 no son activadas por el TGFβ. Entre las moléculas expresadas diferencialmente por las MSC activadas, hemos caracterizado varias proteasas, Wnt5a, PDGF y la prostaglandina E2 (PGE2). En las condiciones utilizadas en nuestros ensayos, esta última parece tener un papel principal en la activación de la invasión de las células epiteliales, aunque Wnt5a parece actuar de manera autocrina sobre las mismas MSC que lo han producido. Estos resultados obtenidos in vitro en células en cultivo, han sido verificados en modelos animales: la eliminación de Snail1 en las MSC disminuye la invasión tumoral y el número de metástasis (Alba-Castellón et al., 2016). Figura 3. Cooperación entre las MSC y las células tumorales en la invasión. Citocinas producidas por las células tumorales epiteliales, como TGFβ, estimulan la expresión de Snail1 y la activación de las MSC. Como consecuencia, estas sintetizan la prostaglandina E2 (PGE2) que incrementa la invasión de las células tumorales. Además, las MSC producen proteasas y Wnt5a que contribuyen también a la invasión. 3. Relevancia y posibles implicaciones Se trata de un proyecto de investigación básica y no tiene implicaciones clínicas directas a corto o medio plazo. Sin embargo, la caracterización molecular que se ha descrito y el hecho de conocer las primeras etapas de las vías canónicas y no canónicas de Wnt puede permitir diseñar nuevos fármacos que inhiban de forma selectiva una de las rutas. 9
Por ejemplo, nuestros estudios indican que los inhibidores de CK1 serían inespecíficos (esta enzima se activa en ambas rutas), mientras que los de tirosina cinasa serían mucho más efectivos sobre la ruta no canónica. Así se podría, por ejemplo, controlar mucho más efectivamente la capacidad las células madre mesenquimales de formar de manera más específica hueso y no músculo. 4. Publicaciones M. Vinyoles, B. del Valle-Pérez, J. Curto, R. Viñas-Castells, L. Alba-Castellón, A. García de Herreros, M. Duñach. Multivesicular GSK3 sequestration upon Wnt signaling is controlled by p120- catenin/cadherin interaction with LRP5/6. Molecular Cell 2014, 53, 444-457. L. Alba-Castellón, R. Batlle, C. Francí, M.J. Fernández-Aceñero, R. Mazzolini, R. Peña, J. Loubat, F. Alameda, R. Rodríguez, J. Curto, J. Albanell, A. Muñoz, F. Bonilla, J.I. Casal, F. Rojo, A. García de Herreros. Snail1 expression is required for sarcomagenesis. Neoplasia 2014, 16, 413-421. M. Vinyoles, B. del Valle-Pérez, J. Curto, M. Padilla, A. Villarroel, J. Yang, A. García de Herreros, M. Duñach. Activation of CK1ε by PP2A/PR61ε is required for the initiation of Wnt signaling. Oncogene 2017, 36, 429-438. L. Alba-Castellón, R. Olivera-Salguero, A. Mestre-Farrera, R. Peña, M. Herrera, F. Bonilla, J.I. Casal, J. Baulida, C. Peña, A. García de Herreros. Snail1-dependent activation of cancer-associated fibroblast controls epitherlial tumor cell invasion and metàstasis. Cancer Res. 2016, 76, 6205-6217. J. Curto, B. del Valle-Pérez, A. Villarroel, G. Fuertes, M. Vinyoles, A. García de Herreros, M. Duñach. p120-catenin and CK1e are essential for non-canonical Wnt signaling. 10
Además, la financiación recibida de la Fundació La Marató de TV3 también se cita en otros artículos no directamente relacionados con el proyecto, pero en los que se han utilizado herramientas moleculares generadas durante el desarrollo del mismo. R. Viñas-Castells, A. Frias, E. Robles-Lanuza, K. Zhang, G.D. Longmore, A. García de Herreros, V.M Díaz. Nuclear ubiquitination by FBXL5 modulates Snail1 DNA binding and stability. Nucleic Acids Res. 2014, 42, 1079-1094. V.M. Diaz, R. Viñas-Castells, A. Garcia de Herreros. Regulation of the protein stability of EMT transcription factors. Cell Adh & Migration 2014, 8, 418-428 A. García de Herreros. Epithelial to Mesenchymal Transition in tumor cells as consequence of phenotypic instability. Frontiers Cell Develop. Biol. 2014, e00071. J. Stanisavljevic, J. Loubat, M. Herrera, T. Luque, R. Peña, A. Lluch, J. Albanell, F. Bonilla, A. Rovira, C. Peña, D. Navajas, F. Rojo, A. García de Herreros, J. Baulida. Activated fibroblasts promote wound healing and tumor malignance through a Snail1/RhoA control of the extracellular architecture. Cancer Res. 2015, 75, 284-295. - A. Frías, G. Lambies, R. Viñas-Castells, C. Martínez-Guillamon, N. Dave, A. García de Herreros, V.M. Díaz. A switch in Akt isoforms is required for Notch-induced Snail1 expression and protection from cell death. Mol. Cell. Biol. 2015, 36, 923-940. 11