Aplicación de los microarrays de DNA al estudio de la resistencia a isoniazida en Mycobacterium tuberculosis
PNAS, 22: 12833-12838 (1999)
Tuberculosis La tuberculosis es una enfermedad crónica infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis. A pesar del desarrollo de vacunas y fármacos, continua siendo una importante causa de mortalidad. Tuberculosis y SIDA son las principales causas de muerte por enfermedades infecciosas (3 millones/año). Se estima que hay 7 millones de nuevos casos por año. La infección por HIV incrementa la mortalidad por tuberculosis al disminuir la resistencia.
Mycobacterium tuberculosis Después de varias décadas de retroceso debido al desarrollo de fármacos efectivos, la incidencia de la tuberculosis comenzó a incrementar a mediados de los 80. Una causa del aumento de la tuberculosis es la aparición de cepas de M. tuberculosis resistentes a antibióticos. El creciente problema de la resistencia a fármacos combinado con la incidencia global de esta enfermedad pone en evidencia la urgente necesidad de nuevas terapias antituberculosas. La pared de M. tuberculosis, cuya integridad resulta esencial para la viabilidad de la bacteria, proporciona toda una batería de potenciales dianas para el desarrollo de nuevos fármacos.
Mycobacterium tuberculosis La primera línea de defensa contra la mayor parte de las infecciones bacterianas incluye a los macrófagos, células del sistema inmune que fagocitan a las bacterias y las atacan con agentes químicos y bioquímicos. El stress oxidativo es parte de la defensa natural del huésped a la infección bacteriana. Excepcionalmente, M. tuberculosis está adaptado a sobrevivir dentro del macrófago: parte de esta adaptación se debe a su pared celular que tiene una baja permeabilidad. La bacteria también realiza cambios sustanciales en los perfiles de expresión génica, para adaptarse al estado fisiológico del macrófago (bajo ph y stress oxidativo).
Isoniazida (INH) Un fármaco primario utilizado en la prevención y tratamiento de la tuberculosis es la isoniazida (hidracida del ácido isonicotínico). La isoniazida ataca a M. tuberculosis al interferir en la síntesis de la pared celular, sin la que la bacteria no puede sobrevivir. Evidencias genéticas y bioquímicas indican que las dianas de la isoniazida incluye enzimas que participan en la biosíntesis de ácidos micólicos (principales componentes de la pared celular): InhA, enoil ACP reductasa KasA, β-cetoacil ACP sintasa Las micobacterias presentan una pared celular muy compleja con abundancia de lípidos (algo excepcional en bacterias Gram +).
Pared celular de M. tuberculosis
Ácidos micólicos Los ácido micólicos son α-alquil-β-hidroxiácidos grasos de cadena larga (60-90 átomos de carbono) y son los lípidos mayoritarios de la pared celular de micobacterias. Los ácidos micólicos están compuestos de una cadena α de ácidos grasos lineales saturados de tamaño intermedio (R 1 =C24- C26), y una cadena larga (R 2 >C50) de ácido meromicólico. La isoniazida bloquea múltiples componentes del sistema FAS-II (sistema de la ácido graso sintasa tipo II) que se requieren para la completa extensión de la cadena de ácido meromicólico.
Sistema FAS-II En la biosíntesis de las cadenas acil (R 1 y R 2 ) de los ácidos micólicos intervienen dos sistemas: El sistema FAS-I que lleva a cabo la síntesis de novo de ácidos grasos y genera precursores de 14-26 carbonos. El sistema FAS-II actúa sobre los productos de FAS-I unidos a AcpM (acyl carrier protein), elongándolos para generar ácidos grasos de 24-56 carbonos. A continuación, los ácidos meromicólicos son modificados: un meromicolato se condensa con un ácido graso para dar un β- oxomicolato, que se reduce para formar el ácido micólico.
Sistema FAS-II
Sistema FAS-II El sistema FAS-II es dependiente de AcpM (acyl carrier protein). Aunque el mecanismo preciso de toxicidad de la isoniazida no ha sido descrito, la acción inhibidora de la isoniazida en forma activa (INH*) parece ser el resultado del efecto sobre tres dianas en el sistema FAS-II: InhA, KasA y AcpM. Por un lado la isoniazida se une al NADH en el sitio activo de InhA (enoil ACP reductasa dependiente de NADH). Pero además forma un complejo ternario al unirse covalentemente con las enzimas KasA (β-cetoacil ACP sintasa encargada de la elongación de los ácidos grasos) y la AcpM (acyl carrier protein).
Sistema FAS-II
Resistencia a isoniazida Después de la absorción por la bacteria, la isoniazida se tiene que convertir a una forma activa (INH*). La enzima catalasa KatG efectua la activación de la isoniazida y está posiblemente implicada en la resistencia antibiótica. Su función natural es eliminar peróxidos en situaciones de stress oxidativo. La isoniazida es el fármaco más utilizado entre el arsenal de fármacos antituberculosos y al que más frecuentemente emerge la resistencia. La resistencia a isoniazida emerge frecuentemente debido a mutaciones que inactivan KatG.
Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica La era post-genómica en la investigación y diseño de nuevos fármacos antituberculosos se inició a partir de la secuenciación del genoma de M. tuberculosis H37Rv. Esto hizo posible el primer abordaje genómico a la biología de este patógeno y al estudio de la resistencia a fármacos. Objetivo: Examinar cambios en la expresión génica de cepas de M.tuberculosis susceptibles y resistentes durante la exposición a fármacos (isoniazida y etionamida). Aunque previamente se habían realizado estudios bioquímicos que implicaban a algunas proteínas en la resistencia, se llevó a cabo un estudio general para identificar el mayor número de posibles dianas para fármacos antituberculosis.
Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica La etionamida está relacionada estructuralmente con la isoniazida y se utiliza como antibiótico de segunda linea. A diferencia de la isoniazida, no tiene el requerimiento de la activación mediada por KatG. Isoniazida y etionamida inhiben la biosíntesis de ácidos micólicos y tienen como dianas las mismas enzimas del sistema FAS-II. Hipótesis: la etionamida genera un perfil similar de respuesta génica que la isoniazida en M. tuberculosis.
Microarray de DNA de M. tuberculosis H37Rv Amplificación con primers específicos de cada ORF, tamaño de los amplicones: 200-1000 bp. Impresión robótica en portas recubiertos de polylisina. Control DNAs: DNA genómico total y DNA ribosómico. Construcción de 3 series de microarrays: Version completa: 3.834 ORFs del total de 3.924 ORFs (97%). Versiones reducidas: 203 ORFs seleccionadas conteniendo genes que codifican enzimas lipogénicas o lipolíticas (29%).
Perfiles de expresión génica con un Microarray de DNA Preparar Microarray Clones DNA PCR Purificar productos Impresión robótica Aislar RNA y marcaje Muestra A Aislar RNA Marcaje con Cy5 Muestra B Aislar RNA Marcaje con Cy3 Mezclar, hibridar sondas y analizar datos Hibridación microarray Lavado Analizar datos
Proceso para el análisis de microarrays de DNA Cepa M. tuberculosis sin fármaco Cepa M. tuberculosis con fármaco Crecimiento en medio 7H9 Tratamiento con fármaco: INH o Etionamida Aislamiento RNA Marcaje con Cy3-dUTP Marcaje con Cy5-dUTP Combinar los dos cdnas Hibridación, 63 C, 4-6 h Lavado Escaneado
Proceso para el análisis de microarrays de DNA Cultivos líquidos de M. tuberculosis en fase de crecimiento exponencial. Toma de muestras bacterianas a intervalos definidos durante las 8 primeras horas de tratamiento con el fármaco. Marcaje cdnas: Inicio de tratamiento: t = 0, marcaje con Cy3 Resto de intervalos(20 min, 40 min, 1 h, 4 h, 8 h): marcaje con Cy5 Para cada intervalo de tiempo, los dos cdnas marcados (Cy3/Cy5) se mezclaron e hibridaron con el microarray de DNA de M. tuberculosis H37Rv.
Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica M. tuberculosis 1254: cepa sensible a isoniazida y etionamida. Microarray de DNA version completa (3.834 ORFs).
Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica La exposición a isoniazida aumenta significativamente la transcripción de dos clases de genes que codifican proteínas fisiológicamente relevantes para el modo de acción del fármaco: A. Genes implicados en la síntesis de la pared celular, incluyendo un cluster de 5 genes (Rv2243-Rv2247) que codifica componentes del sistema FAS-II y fbpc (trehalosa dimicolil transferasa). B. Genes implicados en procesos de respuesta a los efectos tóxicos del fármaco: efpa, fade23, fade24 y ahpc que codifica la alkil-hidroperóxido reductasa. La etionamida genera un perfil similar de respuesta génica que la isoniazida en M. tuberculosis 1254.
Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica Microarray de DNA version reducida (203 ORFs) de M. tuberculosis 1254. Tratamiento isoniazida a 4 h. Posiciones B13-16: cluster de genes FAS-II (Rv2244-Rv2247). Posiciones P2-P3: DNA control premarcado con Cy3 y Cy5. Posiciones A1, P1 y P16: DNA genómico. Posiciones A4-A10: DNA ribosómico.
Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica M. tuberculosis 4309A: resistente a isoniazida sensible a etionamida. M. tuberculosis 4309A no presenta un perfil de expresión génica dependiente de isoniazida. El tratamiento de M. tuberculosis 4309A con etionamida produce un perfil de expresión génica similar al de la cepa 1254 tratada con isoniazida: inhibición del sistema FAS-II.
Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica Tratamiento isoniazida Tratamiento etionamida Microarray de DNA version reducida (203 ORFs) de M. tuberculosis 4309A.
Perfil de expresión génica temporal de M. tuberculosis 1254 en presencia de isoniazida ( ) - inha ( ) - fas (o) - kasa ( ) - fade24 (+) - ahpc ( ) - efpa
Confirmación de los perfiles de expresión génica de M. tuberculosis 1254 en presencia de isoniazida El análisis de microarrays muestra que la expresión de inha y fas no cambia en presencia de isoniazida: InhA, enoil ACP reductasa dependiente de NADH del sistema FAS-II Fas, sistema FAS-I Para comprobar los resultados obtenidos en los experimentos de microarrays, se realizaron experimentos de RT-PCR: comparación de la abundancia de transcritos kasa, efpa y ahpc en M. tuberculosis sin tratamiento y tratada con isoniazida. La expresión inducida por isoniazida de estos genes se confirmó mediante RT-PCR.
Confirmación de los perfiles de expresión génica de M. tuberculosis 1254 en presencia de isoniazida
Perfiles de expresión génica en presencia de isoniazida La inducción de estos genes se detecta desde los 20 minutos después del tratamiento con isoniazida. Por tanto, la inhibición del sistema FAS-II se detecta rápidamente y provoca una respuesta a nivel transcripcional. Las células de M. tuberculosis tratadas con isoniazida reconocen los efectos del fármaco, y se activan mecanismos de respuesta mediante un aumento de la expresión de estos genes para tratar de compensar las actividades reducidas. Como consecuencia del tratamiento con isoniazida, no se producen ácidos micólicos y ocurre una acumulación de precursores, ácidos grasos saturados (C24-C26), y una reducción de ácidos micólicos.
Perfiles de expresión génica en presencia de isoniazida La acumulación de ácidos grasos saturados (C24-C26) probablemente refleja la etapa de la síntesis de ácido meromicólico que es interrumpida por la acción de la isoniazida. La acumulación de precursores está asociada con un incremento de la producción de KasA y AcpM. La inducción de estos genes es la consecuencia de un mecanismo de retroregulación que detecta el desequilibrio de precursores y la reducción de ácidos micólicos. También es probable que la isoniazida induzca genes que codifican otros componentes relacionados de la ruta biosintética de ácido micólico.
Perspectivas La investigación y desarrollo de fármacos antituberculosis es un reto continuado. Los resultados de microarrays de DNA confirman las observaciones de estudios bioquímicos e indican nuevos genes directamente implicados en los procesos inhibidos por isoniazida. Los resultados derivados de este tipo de estudios con microarrays de DNA pueden definir nuevas dianas para fármacos y sugieren nuevos métodos para identificar componentes que inhiben estas dianas.