Fase fermentativa de la germinación de las semillas García Trenchard, Rebecca, Gutiérrez Merino, María Luisa y Valenzuela Naveda, Myriam. Fisiología Vegetal, Grupo A Introducción Los gases son fuertes determinantes de la germinación de semillas, siendo indispensable un intercambio entre oxígeno y dióxido de carbono para iniciar el proceso de germinación. De forma general, mencionaremos que altas concentraciones de oxígeno favorecen la germinación. Para que una semilla germine, el embrión necesita una cierta disponibilidad de oxígeno en el medio. Este oxígeno es empleado por el embrión para llevar a cabo la respiración, que se puede dividir en cuatro fases: - Fase I: La semilla se comienza a hidratar y comienza la respiración - Fase II: Comienza la glucolisis, y con ella la fermentación láctica y alcohólica, provocando un aumento en la producción de CO2. Esta fase es de respiración anaerobia, todavía independiente del O2. - Fase III: La glucolisis aumenta enormemente, y comienza el ciclo de Krebs y la cadena de transporte de electrones mitocondrial. Esta es la fase de respiración aerobia, es decir, dependiente de O2. - Fase IV: Desciende la respiración y envejecen los cotiledones. Las semillas de la mayoría de las plantas superiores son incapaces de germinar bajo condiciones anaeróbicas porque la ausencia de oxígeno impide llevar a cabo la tercera fase de la respiración. En ese momento, la anaerobiosis inhibe la germinación de la semilla. No obstante, algunas especies son capaces de germinar en ausencia de oxígeno o con bajas concentraciones de dicho gas. Una de las especies más estudiadas es Oryza sativa, porque es un claro ejemplo de las especies que pueden soportar la escasez o ausencia de oxígeno que se da en los terrenos encharcados o sumergidos donde se suelen cultivar. Las semillas se pueden agrupar en distintas clases, basándose en la manera en que responden a la disponibilidad de oxígeno. Las semillas ricas en hidratos de carbono han resultado ser, en general, especialmente tolerantes a la anaerobiosis porque son capaces de mantener un metabolismo de alta energía aunque haya deficiencia de oxígeno, como se verá a continuación. Sin embargo, las semillas ricas en lípidos, tienen menos capacidad de soportar estas condiciones.
Además el comportamiento de las plantas ante estas condiciones de anaerobiosis puede variar interespecíficamente. Mientras que unas condiciones de baja concentración de oxigeno afectan negativamente al crecimiento de la avena y la cebada, que comienza con la emersión de la raíz, el arroz de comporta de forma diferente. En el arroz, cuando germina la semilla en condiciones anaerobias, se produce un crecimiento acelerado de los coleoptilos que pueden llegar a crecer más que los coleoptilos durante la germinación aerobia. Además, la raíz y las hojas primarias dejan de crecer. Esto ocurre así para incrementar la probabilidad de que el coleoptilo tome contacto con la superficie del agua que tendrá mayor cantidad de oxígeno y difundirá internamente hasta la raíz y el endospermo. Como se ha mencionado con anterioridad, Oryza sativa es una de las pocas especies de plantas que puede tolerar la inmersión prolongada gracias a una serie de mecanismos adaptativos. Estos mecanismos adaptativos incluyen la habilidad de elongar los coleoptilos sumergidos con gran rapidez, para que entren en contacto con la superficie y así recuperen la disponibilidad de oxígeno. Además desarrollan un tejido aerenquimático que permite un transporte interno del oxígeno muy eficiente, desde el coleoptilo re-emergido hasta las partes sumergidas como son la raíz o el endospermo del grano. Elongación del coleoptilo bajo condiciones de anoxia Se han propuesto diversas hipótesis para explicar el crecimiento acelerado de los coleoptilos de arroz en anaerobiosis. Se sabe que en general, hay una correlación negativa entre la elongación del coleoptilo bajo agua y la capacidad de supervivencia de las plantas. Esto es porque el coste metabólico del crecimiento acelerado compite con los procesos de mantenimiento de las células por la energía disponible. No obstante, la planta toma la precaución de no formar raíces ni hojas durante este proceso, para que la energía disponible sea utilizada para el crecimiento de los coleoptilos. Mattana propuso un factor de transcripción Mybleu como promotor del crecimiento del coleoptilo y acelerador del metabolismo fermentativo en coleoptilos en anoxia. La capacidad del coleoptilo de arroz de crecer aceleradamente se podría deber a una sustitución de las divisiones celulares por expansiones celulares, que implican procesos que requieren menos energía que la síntesis de proteínas. El modelo de Cosgrove para explicar la extensión de la pared celular implica unas proteínas de pared llamadas expansinas que rompen los puentes de hidrogeno que unen celulosa y hemicelulosa. La actividad de estas expansinas se ve favorecida por la acidificación del apoplasma, que en tejidos anóxicos podría
deberse a la actividad de una ATPasa estimulada por putrescina. EXPA7 y EXPB12 son dos expansinas que podrían estar involucradas en el proceso de elongación porque se ha estudiado su expresión con microarrays y los resultados indican que esta relación es cierta. Metabolismo fermentativo La elongación de los coleoptilos para poder alcanzar la superficie, supone un importante gasto energético. No obstante, el metabolismo de estas estructuras debe adaptarse a la ausencia de oxígeno, para poder obtener suficiente ATP para su crecimiento. Cuando el oxígeno es limitado, la respiración mitocondrial se ve afectada negativamente, y el NADH por la vía glicolítica se vuelve a oxidar por la vía fermentativa produciendo principalmente lactato y etanol. La fermentación láctica consiste en la reducción de piruvato en ácido láctico para oxidar NADH, que pasará a ser NAD +. El lactato se produce principalmente por acción de la lactato deshidrogenasa (LDH). La fermentación alcohólica consiste en primer lugar en la transformación de piruvato en acetaldehído por un proceso de descarboxilación facilitado por la enzima piruvato descarboxilasa (PDC). A continuación el acetaldehído es reducido a etanol por la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH). Estar reducción facilita la oxidación de NADH en NAD +. La enzima piruvato descarboxilasa no consume O 2, sin embargo produce CO 2 que se añadirá al sumatorio producido por la vía aerobia.
No obstante las vías fermentativas solamente rinden dos moléculas de ATP, mientras que la vía aerobia rinde hasta 38 moléculas de ATP. Por esta razón, en condiciones de anoxia e hipoxia, la síntesis de proteínas se centra principalmente en la producción de esas enzimas necesarias para el metabolismo de carbohidratos y la vía fermentativa, por ejemplo la ADH y la LDH. Experimento: Importancia relativa de la fermentacion alcohólica la fermentacion láctica Es evidente que en condiciones de anaerobiosis, la vía fermentativa es imprescindible para la germinación de la semilla. No obstante, se ha tratado de determinar la importancia relativa de cada uno de estos tipos de fermentación. Se midió la concentración de lactato en coleoptilos de Oryza sativa, en condiciones de oxigeno normales y posteriormente en coleoptilos en condiciones deficitarias de oxigeno. El estrés anóxico no incrementó significativamente la concentración de lactato en los coleoptilos, por lo que se determinó que la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa no tiene una importancia muy significativa para la tolerancia a la anoxia. A continuación se determinó la concentración de etanol en coleoptilos germinados en aerobiosis y anaerobiosis. La concentración de etanol aumentó considerablemente en los coleoptilos germinados en ausencia de oxígeno, respecto a los que habían germinado en condiciones normales. Este resultado sugiere que las enzimas alcohol deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa son imprescindibles para la germinación fermentativa. Este hecho se corroboró con otro experimento basado en mutantes deficientes para la alcohol deshidrogenasa. Sin embargo, la relación entre la intensidad de la actividad de la ADH y la tolerancia a la anoxia resulta polémica. Experimento con mutantes deficientes para la enzima ADH En un estudio con coleoptilos de arroz en condiciones de hipoxia, aproximadamente el 92% del flujo de carbono desde piruvato fue a etanol, 7% se destinó a la alanina y el 1% se destinó a lactato, lo que sugiere que la fermentación alcohólica es una fuente más importante de NAD +. Para comprobar si la fermentación alcohólica era esencial para el crecimiento de coleoptilos de arroz en condiciones anaerobias, se realizo un experimento con 2 cepas de arroz: WT (wild type) y rad (reduced adh activity). Se observó que la reducción de la actividad de la ADH, disminuye la velocidad del crecimiento de los coleoptilos sumergidos. En la germinación de semillas totalmente sumergidas, los coleoptilos WT crecen en 5-7 días 51.2-67.4 mm, mientras que coleoptilos rad solo 15.4 8.9 mm en 7 días. La cantidad de ATP en rad era solo el 37% de WT después del primer día, por eso se piensa que crece más despacio.
Cuando se producía la germinación en condiciones aerobias y luego se sumergían los coleoptilos, los coleoptilos WT y rad habían elongado por igual al cabo de 2 días. En condiciones anaerobias juega un papel fundamental la ADH ya que por medio de este experimento se comprobó que los coleoptilos de cepas salvajes se elongaban más que los coleoptilos mutantes deficientes en ADH. Aunque la fermentación alcohólica sea esencial para este proceso, un exceso de actividad puede resultar perjudicial para la célula. En el caso del arroz, una elevada producción de etanol aumenta la tolerancia a la anoxia, sin embargo en otras especias como el algodón o el tabaco, el efecto de la ADH es la de disminuir aún más la tolerancia a bajas concentraciones de O 2. No obstante, la producción de etanol en los coleoptilos de arroz es mayor que la de los cereales intolerantes a la anoxia, por lo que se cree que la toxicidad del etanol no es la principal causa de la sensibilidad de estas plantas a la anoxia. Experimento para comparar el efecto de la anoxia en tres especies diferentes Se realizó un experimento para determinar el efecto de la anoxia en tres tipos de cereales: arroz, cebada y avena. Dicho experimento se basó en los parámetros de elongación del coleoptilo, concentración de etanol y azúcares solubles, y actividad de alcohol deshidrogenasa y α-amilasa. El valor de estos parámetros se determinó bajo condiciones de estrés anóxico tras un proceso de germinación en condiciones aeróbicas. Crecimiento de los coleoptilos La elongación de los coleoptilos de las tres especies, respecto a los coleoptilos control fue de 29% en el caso de la cebada, 25% en el caso de la avena y 71% en el caso del arroz. Por lo tanto, los coleoptilos de arroz son más tolerantes a la anoxia que las otras dos especies.
Concentración de ATP El estrés anóxico redujo las concentraciones de ATP en todos los coleoptilos. La concentración en los coleoptilos, respecto a los coleoptilos control en cebada, avena y arroz fueron de 21%, 18% y 57% respectivamente. Por lo tanto, el arroz mantiene los niveles de ATP en sus coleoptilos con mayor eficacia que la avena y la cebada. - Actividad de Alcohol deshidrogenasa y producción de etanol El estrés anóxico aumentó la actividad de la enzima alcohol deshidrogenasa en todos los coleoptilos. La actividad de la ADH en coleoptilos anóxicos de cebada, avena y arroz, respectivamente, fue 9,3, 8,5 y 26 veces mayor que en los controles. Esto además significa que la concentración de etanol también aumenta bajo dichas condiciones, sin embargo, el aumento de la concentración
de etanol en la coleoptilos de arroz era 3,3 y 3,5 veces mayores que en los coleoptilos de cebada y de avena, respectivamente. Esto significa que la tasa de fermentación alcohólica en arroz en condiciones de anoxia es superior a la de las otras dos especies. - Actividad de α-amilasa La actividad α-amilasa no fue detectada en los coleoptilos de avena, cebada y arroz en ninguno de los dos casos, ni en los coleoptilos control ni en los anóxicos. Sin embargo, dicha actividad sí fue encontrada en los endospermos de las tres especies control y anóxicas. La actividad aumentó en condiciones control durante una incubación de 24 horas, en las tres especies, sin embargo, se vio inhibida con el estrés anoxico. Por lo tanto, no había diferencias significativas en los coleoptilos anoxicos de las tres especies. - Concentracion de azúcares en coleoptilos y endospermas El estrés anóxico redujo la concentración de azúcares tanto en coleoptilos como en los endospermos de arroz, cebada y avena. Los coleoptilos anoxicos de arroz contenían un 69% de los azucares solubles del coleoptilo control. Los coleoptilos anóxicos de
cebada y avena solo contenían un 9% y un 11% del azúcar contenido en los coleoptilos control. Sin embargo, las concentraciones de azúcar en los endospermos de las tres especies en anoxia, no eran significativamente diferentes. Conclusión: El dato más importante obtenido a partir de este experimento se refiere a las concentraciones de azúcares en distintas partes de la semilla que está germinando. La concentración de azúcares solubles en los coleoptilos de arroz anóxicos era superior a la de los coleoptilos de avena o cebada. No obstante, α-amilasa, que cataboliza las reservas de hidratos de carbono para convertirlos en azucares solubles, estaba activa en el endospermo de avena, cebada y arroz anóxicos en cantidades muy similares. Por lo tanto, el efecto del estrés anóxico debe ser necesariamente una reducción en la eficacia del transporte de los azúcares del endospermo a los coleoptilos. Esta eficacia se ve afectada negativamente más en las plantas de avena y cebada que en las de arroz.
Como la disponibilidad de azúcar es esencial para llevar a cabo la glicolisis y la fermentación en las células, la habilidad de transportar los azucares del endospermo a los coleoptilos puede ser una de las maneras de distinguir la tolerancia o intolerancia de las plantas a las condiciones de anoxia. Regulación del ph y acidificación del citoplasma Otro factor importante para la estrategia que confiere tolerancia a la anoxia en plantas es el control del ph citoplasmático. En condiciones de anaerobiosis, el ph citoplasmático tiende a acidificarse por diversos procesos que se activan por la ausencia de oxígeno. Al entrar en condiciones de anaerobiosis, LDH recicla nucleótidos de piridina por fermentación láctica, produciendo lactato y como consecuencia, acidificando el citoplasma. Algunos autores sugieren además, que la acidificación del medio no ocurre directamente por la producción de lactato, sino por los protones liberados que acompañan a la liberación de Pi de los NTP. Este proceso se ha observado inmediatamente después de que las plantas se pongan en anaerobiosis. Otra posible causa de la acidificación del citoplasma puede ser la liberación de protones de las vacuolas. En condiciones de hipoxia, el ph vacuolar aumenta al mismo tiempo que el ph citoplasmático disminuye. El transporte activo de protones del citoplasma a las vacuolas es un importante sistema de regulación del ph citoplasmático. No obstante, la hipoxia afecta negativamente al mantenimiento de este gradiente de protones provocando una acidificación del citoplasma. Las distintas capacidades de las plantas para soportar o evitar la acidificación del citoplasma pueden ser la razón directa que explique las diferencias en su tolerancia a la hipoxia/anoxia. Por ejemplo, Potamogeton pectinatus elonga los coleoptilos de manera mucho más rápida que el arroz. Esta característica es coincidente con la estricta regulación del ph citoplasmático, que apenas sufre de acidificación. En el caso del arroz, este puede mantener su ph anóxico muy similar al ph aeróbico durante horas, mientras que otras plantas intolerantes se acidifican después de unas pocas horas de anoxia. Se ha sugerido que el consumo de protones causado por la síntesis de ATP por fermentación alcohólica, lleva a cabo un papel muy importante en la regulación del ph citoplasmático reduciendo su acidificación. Otra forma de regular este ph es el aumento de alanina y GABA, que tienen el poder de contrarrestar el efecto de la acidificación causada por el lactato. También se ha propuesto una posible función de la reducción de los nitratos como alternativa para la re-oxidación de NADH y NADPH en condiciones de hipoxia. Esto se debe a que la nitrato reductasa se activa a ph bajo. Al reducir el nitrato consume protones elevando así el ph citoplasmático.
Conclusiones Son pocas las plantas cuyas semillas son capaces de germinar en condiciones de anaerobiosis, pero aquellas que si están preparadas para realizar este proceso, han tenido que adquirir diversas adaptaciones. En el caso concreto de Oryza sativa, el mecanismo se basa en un rápido crecimiento de los coleoptilos dotados de aerénquima, para alcanzar la superficie con oxígeno. Gracias al tejido aerénquimático, el oxígeno será transportado de manera eficaz hacia el resto de estructuras. La energía para el crecimiento de los coleoptilos se obtiene principalmente a través de las vías fermentativas, que no requieren oxígeno. No obstante, estos procesos tienen inconvenientes. En primer lugar, la energía obtenida es muy inferior a la de la vía aeróbica, por lo que el gasto de ATP debe estar dirigido a actividades muy concretas como son la síntesis de novo de proteínas necesarias para la germinación. El segundo inconveniente es que la fermentación produce la acidificación del medio. Por esta razón las plantas adaptadas a la germinación fermentativa, deben ser capaces de regular perfectamente el ph del citoplasma. Los azúcares metabolizados para obtener energía, se encuentran en el endosperma de la semilla. Para emplear estas moléculas en el crecimiento de los coleoptilos, estas deben ser trasladadas a dichas estructuras, y cuanto más eficaz sea este proceso de transporte, más probable será que se realiza la germinación fermentativa.