Dra. Débora Natalia Marcone Investigadora Asistente CIC CONICET Unidad de Virología, CEMIC-CONICET 72º Congreso Argentino de Bioquímica 2017
Familia Picornaviridae Pequeños ( 30 nm) Desnudos Cápside icosaédrica, 4 proteínas Proteínas Estructurales Proteínas No Estructurales VP1: Externa. El MAYOR blanco de la Rta Inmune Cañón: se une a los Rc celulares, blanco de antivirales VP2/VP3: Externas. También contribuyen a la antigenicidad Poliproteína VP4:Interna. Interactúa con el genoma Clivaje Alternativo Genoma ARN (+) cadena simple (7,2 kb) único marco abierto de lectura1 poliproteína origina todas las proteínas por clivaje enzimático
Período de incubación 2 días Síntomas: 7-14 días Con o sin Fiebre Virus más frecuente resfrío común niños: adultos: hasta 12 infecciones/año 3-5 infecciones/año Circulación anual, con dos picos en otoño y primavera Asociados a: IRA alta: resfrío, otitis, sinusitis IRA baja: bronquiolitis, neumonía Sibilancias recurrentes 2/3 50% 45% Exacerbaciones de asma, EPOC y Fibrosis Quística 25% Nuevo Impacto clínico incorporación de métodos moleculares para diagnóstico y tipificación Alto impacto económico: directo (uso de recursos médicos) e indirecto (ausentismo laboral y escolar)
Niños Adultos RN pretérmino Inmunocomprometidos 8-14 días 7-13 días 30 días 1-4 meses RT-PCR y secuenciación permiten diferenciar consecutivas infecciones con distintos tipos de RV de una infección prolongada causada por un único tipo de RV Peltola V, et al. Clin Micro Infect. 2013. 19 (7) Loeffelholz MJ, et al. Pediatrics 2014. 134;1144 Kainulainen L, et al. J Allergy clin Immunol 2010. 126
Contacto directo Fomites: inoculación en nariz, ojos Aerosoles Sept. 2016Vacunas 10, 25 y 50 valente de RV-A en ratones y monos Inactivadas formalina, alta cc Ag IMPORTANTE Lavado de MANOS buenos hábitos de Higiene Unión a la cápside: Pleconaril, Vapendavir, Pirodavir Tremacamra (ICAM-1 soluble) Formulaciones: oral o spray intranasal Inhibidor de 3C proteasa: Ruprintivir Interferón alfa 2 Ninguno demostró ser completamente eficaz y libre de efectos adversos
Diagnóstico: Cultivo: dificultoso, solo RV-A y B RT-PCR en tiempo real basada en 5 NCR Detección (207 pb) Taxonomía (860 pb) 5 NCR Tipificación (549 pb) Tipificación: RT-PCR y secuenciación VP1: asignación de genotipos y clasificación taxonómica VP4/VP2: epidemiología molecular y asignación de genotipos provisionales (pat) 5 NCR Combinación de método diagnóstico (5 NCR) y análisis de filogenia de una región codificante de la cápside
Género Enterovirus: 12 especies (7 humanas) Enterovirus A, B, C, D Rinovirus -A 80 genotipos -B 32 genotipos -C 55 genotipos Basada en divergencia de Nt de secuencias de la cápside: VP1 RV-A y C: 13% RV-B: 12% VP4/VP2 RV-A y C: 10,5% RV-B: 9,5% PAT (provisionally assigned types): basados en VP4/VP2(pendiente VP1/genoma completo) RV-A: pat 1-4 RV-B: pat1-4 RV-C: 11 pat (Simmonds, 2010; McIntyre, 2013; Picornavirus Study Group)
Hospital Universitario CEMIC UNVIR, CEMIC-CONICET
Realizar el diagnóstico de RV Describir su frecuencia, estacionalidad, las coinfecciones y los cuadros clínicos asociados Describir la epidemiología molecular de las cepas de RV circulantes En: I. niños menores de 6 años, internados o ambulatorios II. recién nacidos pretérmino con patologías de base internados III. adultos inmunocompetentes ambulatorios con IRA alta y/o baja, en el Hospital Universitario CEMIC
Junio 2008 a Diciembre 2011 876 Muestras Respiratorias con ficha epidemiológica Procesamiento Base de Datos Inmunofluorescencia Extracción ARN viral (manual con columnas Qiagen) Análisis Epidemiológico Indirecta Directa RT-PCR en tiempo real (5 NCR de RV)
AdV FluB PIV FluA IF Distribución porcentual del diagnóstico de virus respiratorios en 876 niños con IRA IF + RT-PCR hmpv RSV Negativos 58,7% HRV Negativos 26,6% Positivos 41,3% FluB AdV PIV FluA hmpv RSV Positivos 73,4% RSV: 23,6% hmpv: 7,3% FluA: 3,3% PIV: 3,3% AdV: 2,9% FluB: 1,9% HRV: 40,1%
Hospitalizados (n=579) Distribución porcentual de virus respiratorios Negativos 20,0% Ambulatorios (n=297) HRV 45,8% RSV 29,0% HRV 29,0% Negativos 39,4% AdV 3,3% FluB 0,7% PIV 1,7% hmpv 7,9% FluA 2,9% Positivos 80,0% FluB 4,4% AdV 2,0% RSV Coinfecciones Duales 11 % HRV-RSV 58%, HRV-hMPV 19%, HRV-AdV 11%, entre otras PIV 6,4% FluA 4,0% hmpv 6,1% 13,1% Positivos 60,6% Coinfecciones Duales 4,4 % HRV-RSV 23%, HRV-hMPV 23%, HRV-PIV 23%, entre otras
Coinfección RV-RSV: mayor riesgo asociado a gravedad y hospitalización OR 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 24.1 193.4 45.2 44.2 10.1 14.3 5.58 5.90 8.48 3.35 3.22 1 1.43 1.85 2.21 1.72 1 1 1 1 3.67 2.77 Taquipnea Sibilancias Tiraje Bronquiolitis Hospitalización 12.4 Negativo HRV RSV HRV-RSV Marcone, Echavarria, et al (unpublished)
876 Muestras Respiratorias RT-PCR en tiempo real HRV 351 Muestras RV positivas 45 RV positivas seleccionadas RT-PCR (5 NCR/VP4/VP2) Secuenciación Filogenia Reconstrucción demográfica
BA398HM3 20 01 10 Se detectaron las 3 especies: 55% RV-A (n=24) 43% RV-C (n=19) 2% RV-B (n=1) BA193A 04 03 10 BA176HL3 07 10 08 BA305HM3 17 08 09 BA12A 27 06 08 BA158A 13 08 09 BA67A 08 08 08 HRV-C8 HRV-C23 BA178A 13 11 09 BA284HL3 10 07 09 BA120A 18 05 09 BA90A 03 12 08 BA303HL3 14 08 09 BA320HM3 22 09 09 BA413HM3 15 03 10 BA270HM3 27 06 09 89 HRV-C2 78 89 82 HRV-C4 HRV-C20 BA145A16 06 09 BA431HM3 04 05 10 HRV-B5 91 HRV-C5 100 BAA 13 04 09 HRV-B6 HRV-B86 HRV-B27 100 HRV-C9 HRV-C32 BA207HL3 17 03 09 BA424HL3 12 04 1 HEV-B HRV-B14 HEV-A HEV-C 96 100 HRV-C7 BA192HL3 09 02 09 89 BA415HL3 08 03 HRV-C1 HRV-C6 100 BA218HM3 17 04 09 0.5 78 HEV-D 73 BA203HM3 16 03 09 BA188HL3 26 12 08 71 96 HRV-A2 BA184HL3 18 11 08 BA180HM3 21 10 08 98 95 93 96 80 97 98 98 BA102A 20 04 09 BA447HL3 19 05 10 HRV-A18 100 88 HRV-A29 HRV-A66 HRV-A41 78 91 84 BA171A 28 09 09 HRV-A33 97 95 HRV-A101 HRV-A65 HRV-A22 BA82A 12 09 08 HRV-A1B HRV-A88 BA394HL3 13 01 10 BA126HM3 25 08 08 BA50A 23 07 08 BA6HM3 02 06 08 BA27A 14 07 08 BA117HL3 12 08 08 BA69HM3 02 07 08 BA231HM3 05 05 09 BA194HM3 12 02 09 BA94A 02 01 09 BA96A 20 03 09 BA89A 24 11 08 BA182HM3 07 11 08 BA22HL3 11 06 08 Análisis de Máxima Verosimilitud de la región VP4/VP2 de las cepas BA ( ). Los valores en las ramas representan el valor porcentual de bootstrap sobre 1000 pseudoreplicas; sólo se muestran valores superiores a 70%
90 94 100 97 72 97 78 97 93 87 75 84 91 HRV-A39 100 BA171A 28 09 09 HRV-A64 HRV-A94 HRV-A15 HRV-A74 HRV-A22 HRV-A82 HRV-A81 HRV-A56 HRV-A40 HRV-A85 97 HRV-A16 BA82A 12 09 08 HRV-A1 HRV-A1B HRV-A54 HRV-A98 HRV-A63 HRV-A59 BA447HL3 19 05 10 HRV-A43 HRV-A75 HRV-A50 HRV-A34 HRV-A18 HRV-A76 HRV-A33 HRV-A11 HRV-A24 HRV-A90 70 97 HRV-A9 HRV-A32 HRV-A67 BA184HL3 18 11 08 HRV-A55 BA180HM3 21 10 08 HRV-A57 HRV-A96 HRV-A61 HRV-A73 HRV-A13 HRV-A41 83 HRV-A21 HRV-A60 BA102A 20 04 09 HRV-A19 HRV-A38 HRV-A23 HRV-A30 84 98 HRV-A29 HRV-A44 HRV-A25 HRV-A62 90 93 86 90 86 73 89 HRV-A31 HRV-A47 HRV-A66 HRV-A77 HRV-A10 HRV-A100 HRV-A7 80 HRV-A46 BA182HM3 07 11 08 HRV-A80 HRV-A2 HRV-A49 BA415HL3 15 03 10 BA413HM3 08 03 10 BA424HL3 12 04 10 BA398HM3 20 01 10 HRV-A88 HRV-A58 BA394HL3 13 01 10 HRV-A36 HRV-A89 HRV-A8 HRV-A95 HRV-A45 89 BA126HM3 25 08 08 BA117HL3 12 08 08 BA69HM3 02 07 08 BA27A 14 07 08 HRV-A78 BA50A 23 07 08 BA6HM3 02 06 08 HRV-A12 BA231HM3 05 05 09 92 HRV-A20 92 HRV-A68 HRV-A28 70 HRV-A53 BA96A 20 03 09 BA94A 02 01 09 96 BA194HM3 12 02 09 HRV-A101 BA89A 24 11 08 HRV-A65 HRV-A51 HRV-A71 BA22HL3 11 06 08 0.5 A3 A5 A2 A1 A4 84 84 HRV-B3 HRV-B37 HRV-B6 HRV-B14 93 HRV-B72 HRV-B86 HRV-B35 HRV-B79 73 72 HRV-B83 HRV-B92 HRV-B52 HRV-B48 79 HRV-B69 270HM3 27 06 09 HRV-B17 HRV-B97 HRV-B84 HRV-B27 HRV-B93 0.5 94 71 HRV-B4 HRV-B42 HRV-B5 HRV-B70 HRV-B91 HRV-B HRV-B26 Para las 3 especies de RV se obtuvieron topologías similares con los 4 métodos de filogenia: RV-A: 14 genotipos (5 más frecuentes) RV-B: 1 genotipo RV-C: 15 genotipos (2 más frecuentes) Árboles de Máxima Verosimilitud de la región VP4/VP2 de las cepas BA ( ) y de referencia de HRV-A, B y C. Los valores en las ramas representan el valor porcentual de bootstrap sobre 1000 pseudoreplicas; sólo se muestran aquellos valores superiores a 70%. HRV-C9 0.5 84 96 74 71 73 98 75 85 82 72 85 86 BA192HL3 09 02 09 BA207HL3 17 03 09 HRV-C10 BA203HM3 16 03 09 BA218HM3 17 04 09 HRV-C3 HRV-C6 79 HRV-C1 HRV-Cpat14 HRV-Cpat16 HRV-C22 HRV-C43 HRV-C21 98 HRV-C7 BA431HM3 04 05 10 95 HRV-C13 BAA 13 04 09 HRV-C32 HRV-C39 91 HRV-C12 BA305HM3 17 08 09 HRV-C44 BA176HL3 07 10 08 HRV-C42 HRV-C8 HRV-Cpat28 78 92 HRV-C16 HRV-C17 HRV-C31 BA193A 04 03 10 HRV-C28 HRV-Cpat24 HRV-C18 HRV-Cpat27 HRV-C25 BA178A 13 11 09 HRV-C24 HRV-C19 92 HRV-C41 BA12A 27 06 08 HRV-Cpat20 HRV-C30 HRV-C15 BA158A 13 08 09 HRV-C23 BA67A 08 08 08 BA120A 18 05 09 BA284HL3 10 07 09 HRV-C40 HRV-C2 HRV-C47 HRV-C35 98 HRV-Cpat18 HRV-Cpat19 HRV-C33 HRV-C48 HRV-C14 HRV-Cpat22 HRV-C4 BA90A 03 12 08 HRV-C49 HRV-C50 HRV-C46 HRV-Cpat10 HRV-C36 HRV-Cpat21 HRV-C26 HRV-Cpat15 HRV-C37 87 BA145A 16 06 09 80 91 HRV-C20 HRV-C34 HRV-C45 BA303HL3 14 08 09 HRV-Cpat17 HRV-C29 HRV-C27 94 98 90 96 HRV-C11 BA320HM3 22 09 09 HRV-C5 HRV-C38 C1 C2
Distancia-p (entre clados A1 y A2)= 12,5% Criterios para la genotipificación de RV-A consideran que distintos genotipos divergen en más del 10,5% (McIntyre y col, 2013) Clado A2: Posible nuevo genotipo de RV-A Análisis de recombinación: Simplot, Chimera, Bootscan Grupos: A2, 78, 12 (ancestro común con A2 y 78 por bayesianos) y 20 (outgroup) no se encontraron eventos de recombinación en los 420 nt correspondientes a VP4/VP2 Para realizar la confirmación es necesario amplificar y secuenciar VP1/ genoma completo
Perfiles demográficos bayesianos para la región VP4/VP2 de HRV-A y C *Perfil de dinámica poblacional Constante *Tasa de sustitución estimada elevada [2,3.10-2 s/s/a] Las altas tasas estarían reflejando la dinámica de recambio de los distintos genotipos de rinovirus en el tiempo, y no las tasas de mutación de las dos especies, ya que se están analizando genomas de distintos linajes realizar estudio de un genotipo particular. *Perfil de dinámica poblacional Constante *Tasa de sustitución estimada elevada [1,9.10-2 s/s/a]
Comparación de la evolución clínica de niños hospitalizados con HRV-A o C HRV-A HRV-C p (n=16) (n=10) n (%) n (%) Hospitalizados 3 días 7 (43,8) 5 (50,0) Hospitalizados > 3 días 9 (56,3) 5 (50,0) 0,688 Requerimiento de Oxígeno 13 (81,3) 9 (90,0) 0,280 Requerimiento de cuidados intensivos 3 (18,8) 2 (20,0) 0,9 Asistencia Respiratoria Mecánica 2 (12,5) 1 (10,0) 0,9 No existen diferencias significativas en la evolución de la internación entre los niños con HRV-A o C Tampoco existen diferencias significativas entre los antecedentes y la clínica de los niños con HRV-A o C
Distribución estacional de las 3 especies de RV y los 7 clados detectados Circulación simultánea de clados y cepas de RV de distintos genotipos de las 3 especies, principalmente A y C. Los clados mostraron un patrón de circulación estacional, donde un genotipo parece reemplazar a otro
RV es el virus mas frecuente en niños con IRA Circulación anual, con picos otoño y primavera Mayor gravedad en coinfección con RSV Predomino de RV-A y C, con alto número de genotipos co-circulando No se observó asociación de genotipos con mayor gravedad
6 pretérmino que desarrollaron IRA RV único agente etiológico detectado Filogenia: Junio/Julio 2014 RV-C43 (1 caso) RV-C1 (2 casos camas contiguas) Agosto/Septiembre 2014 RV-A pat (2 casos) RV-C6 (1 caso) Distancia-p: entre RV-A pat y referencia A63 10,5% Criterios para la genotipificación de RV-A consideran que distintos genotipos divergen en más del 10,5% (McIntyre y col, 2013) Posible nuevo genotipo de RV-A
SL (27 SEG) C43 C43 C43 - DBP, ductus PL (27 SEG) DBP, ductus CM (30 SEG) DBP HR (29 SEG) C1 C1 C1 C1 C1 C1 - - C1 - - A pat A pat - A103 IT (36 SEG) Trisomía 18 A pat A pat A pat A pat A75 - BP (28 SEG) Ductus, síndrome Distress respiratorio C6 C6 dd/mm/yyyy Invierno Primavera
RV causan IRA baja grave en RN pretérmino con patologías de base Período de positividad: 7 a 28 días Sucesivas infecciones por distintos genotipos Co-circulación de diferentes genotipos en UTIN Posible nuevo genotipo de RV-A Se confirmó la transmisión nosocomial en dos episodios diferentes Marcone, Echavarria, et al (unpublished)
Adultos inmunocompetentes con IRA que concurrieron a Emergencias CEMIC (Abril-Septiembre 2016) 30/112 RV positivos = 27% 23/30 (77%) único agente por Panel Respiratorio- FilmArray, Biofire Flu-A 20%, hcov 11%, RSV 9%, hmpv 6%, PIV 4%, AdV 3%, FluB 2% Diagnósticos clínicos : CVAS 7% Sme gripal 53% Laringotraqueítis 7% Bronquitis 27% Neumonía 3% Cepas de RV aún no tipificadas
Los RV son los virus más frecuentes en niños y adultos con IRA Gran diversidad genética y co-circulación de genotipos En coinfección con RSV pueden asociarse a cuadros de mayor gravedad Importancia de nuestro estudio: Incorporación del Diagnóstico de RV en la rutina del Hospital CEMIC desde 2012 para los pacientes internados
Epidemiología molecular de RV: Conocer las cepas circulantes en distintas poblaciones de la Ciudad de Buenos Aires: niños recién nacidos con patologías de base adultos Describir nuevos genotipos que aparecen en circulación Este conocimiento puede contribuir a la formulación de futuras vacunas para RV
A todos los médicos, bioquímicos, kinesiólogos, enfermeras y personal técnico, por reclutar pacientes, obtención de datos clínicos, de muestras respiratorias y su procesamiento. Proyecto IRAB - PICT 2006.650 Unidad de Virología, Laboratorio de Virología y Departamento de Pediatría Hospital Universitario CEMIC y Mater Dei