Tarea de aula III Caracterizaciones metabólicas Aplicaciones biotecnológicas

Transcripción

1 Fisiología Bacteriana Tarea de aula III Caracterizaciones metabólicas Aplicaciones biotecnológicas

2 Objetivo de la Microbiología: Identificación y caracterización de microorganismos Metabolismo Aplicaciones biotecnológicas

3 Trabajos Prácticos TP 1: Esterilización y técnicas asépticas. TP2: Aisalmiento de microorganismos y medios de cultivo. TP3: Observaciones macroscopicas, microscopicas y tinción. TP4: Caracteristicas metabólicas. Medios especiales. TP5: Aplicaciones biotecnológicas: producción de antibióticos y exoenzimas. TP6: Creciemiento bacteriano y efecto de los antibióticos TP7: Vida comunitaria y columna de Winogradsky

4 Trabajo Práctico N 4: Caracteristicas metabólicas. Medios especiales. OBJETIVOS: Evaluar las capacidades metabólicas de las cepas asiladas de distintos nichos y sus requerimientos nutricionales (concepto de auxotrofía) y respuesta frente al O2.

5 Nutrientes son sustancias químicas del ambiente a partir de las cuales las células sintetizan sus componentes, proteínas, lípidos, etc. Requerimiento de nutrientes Fines energéticos: reacciones de mantenimiento Fines biosintéticos: reacciones plásticas o anabolismo

6 Según los requerimientos nutricionales los microorganismos pueden clasificarse en: Fuente Denominación Posible fuente Fuente de energía Lumínica Química Fotosintetizante Quimiosintetizante Dador de electrones Inorgánico Litotrófico SH 2, NH 3, NO 2-,Fe Orgánico Organotrófico Hidratos de carbono, lípidos, hidrocarburos, proteínas, alcoholes Fuente de carbono Inorgánico Autótrofo CO 2 orgánico heterótrofo Glucosa, aminoácidos, acetato

7 Factores de crecimiento Clasificación de nutrientes Factor o vitamina p-aminobenzoico (PABA) Acido fólico Funciones principales Precursor del ácido fólico Metabolismo de compuestos C1, transferencia de grupos metilo. Biotina Biosíntesis de ácidos grasos; fijación de CO 2 Cobalamina (vitamina B12) Reducción y transferencia de compuestos C1; síntesis de desoxirribosa Niacina (ácido nicotínico) Precursor del NAD; transferencia de electrones en reacciones redox Riboflavina Precursor de FAD y FMN Ácido pantoténico Precursor de la CoA Tiamina (vitamina B1) Descarboxilaciones; transcetolasas. Complejo B6 (piridoxal, Transformaciones de aminoácidos y cetoácidos piridoxamina) Grupo Vitamina K, quinonas Transportadores de electrones (ubiquinonas, menaquinonas, etc.)

8 Clasificación de medios de cultivo Estado físico Composición química Fin experimental Líquido Sólido Semisólido Complejo, indefinido o no sintético Sintético o definido Propósito general Selectivo Diferencial Enrriquecimiento Ensayo metabólico Crecimiento anaeróbico Aislamiento Estudio de movilidad

9 Factores que afectan el crecimiento Temperatura Oxigenación - psicrófilos - mesófilos - termófilos - hipertermófilos - aerobios estrictos - anaerobios estrictos - anaerobios facultativos - anaerobios aerotolerantes - microaerófilos ph Luz - alcalófilos - acidófilos - fotosintéticos - no fotosintéticos

10 Factores que afectan el crecimiento Vel. de crecimiento vs Temperatura

11 Temperatura Factores que afectan el crecimiento Relación entre la temperatura y las velocidades de crecimiento de psicrófilos, mesófilos, termófilos y dos hipertermófilos diferentes. En cada caso, se indican las temperaturas óptimas de microorganismos representativos. Adapado de Brock Biología de los Microorganismos.

12 Clasificación de medios de cultivo Fin experimental Propósito general Selectivo Diferencial Enrriquecimiento Ensayo metabólico Crecimiento anaeróbico Estudio de movilidad Aislamiento Estudio de auxotrofía

13 Clasificación de medios de cultivo Medios selectivos Mezcla de microorganismos Medio de propósito general Medio selectivo

14 Clasificación de medios de cultivo Medios diferenciales Mezcla de microorganismos Medio de propósito general Medio diferencial

15 Caracterizaciones metabólicas Medio Agar Mac Conkey Lac + Lac -

16 Caracterizaciones metabólicas Medio SIM 1- Sin inocular 2- No movil 3- Movil 4- Productora de H 2 S

17 Medio SIM Caracterizaciones metabólicas

18 Caracterizaciones metabólicas

19 Oxigenación Caracterizaciones metabólicas

20 Caracterizaciones metabólicas Test de catalasa con H 2 O 2 + -

21 Fermentación vs respiración Medio OF Control sin inocular O/F o F O No metabolisa glucosa Sellado No sellado Interpretación del metabolismo Verde o azul Algo de amarillo Oxidativo Todo amarillo Todo amarillo Oxidativo/fermentativo o solo fermentativo Solo amarillo arriba Solo amarillo arriba Oxidativo/poco fermentativo o solo poco fermentativo Verde o azul Verde o azul No metaboliza el azúcar

22 Caracterizaciones metabólicas: Auxotrofía

23 Trabajo Práctico N 4: Ejercicios

24 Trabajo Práctico N 4: Ejercicios Día 1: 1 - Ensayos metabólicos: medios SIM, McConkey, manitol salado 2 - Estudio del requerimiento del O 2 : caldo tioglicolato 3 - Respiración y fermentación 4 - Prueba de catalasa 5 - Estudio de auxotrofía de una cepa de B. subtilis

25 Trabajo Práctico N 4: Ejercicios Día 2: Observar, analizar resultados obtenidos.

26 Trabajos Prácticos TP 1: Esterilización y técnicas asépticas. TP2: Aisalmiento de microorganismos y medios de cultivo. TP3: Observaciones macroscopicas, microscopicas y tinción. TP4: Caracteristicas metabólicas. Medios especiales. TP5: Aplicaciones biotecnológicas: producción de antibióticos y exoenzimas. TP6: Creciemiento bacteriano y efecto de los antibióticos TP7: Vida comunitaria y columna de Winogradsky

27 TP N 5 Aplicaciones biotecnológicas OBJETIVOS: Evaluar la producción de antibióticos y exoenzimas de relevancia industrial en las cepas aisladas de diferentes muestras de suelo.

28 Proteasas y Amilasas Uso en detergentes: proteasas, amilasas, lipasas, reductasas, etc. Detergentes: medios alcalófilos ph 9-10 Amilasas y Gucoamilasas en industria alimentaria: Jarabe de cereales rico en fructosa. Reacción de clarificación: a-amilasa (alimdón acortado) Sacarificación: glucoamilasa (genera glucosa) Isomerización: glucosa isomerasa (glucosa en fructosa)

29 Fosfolipasas Se implementó el uso de fosfolipasas (principalmente PLA y PLC) para el proceso de remoción de fosfolípidos del aceite crudo denominado desgomado La enzima Purifine, comercializada por Verenium, es una PLC obtenida por metagenómica, 95% idéntica a la PLC de B. cereus

30 Test fosfolipasas

31 Test proteasas

32 Test amilasas Tinción con Lugol

33 Metabolitos Primarios y Secundarios Sustrato de crecimiento Sustrato de crecimiento Células Metabolito Primario Células Metabolito Primario Las células y el metabolito se producen más o menos simultáneamente Metabolito Secundario Productos Naturales: Antibioticos Después de producidas las células y el metabolito primario, las células convierten el metabolito primario en uno secundario

34 Género Streptomyces Producen 55% ATB de uso medicinal Incluyen: Policetónicos Macrólidos y Aromáticos, Peptidos de Síntesis no Ribosomal, β-lactámicos, Policetónico- NRPS hibridos, Cumarinas y Polipirroles.

35 Aislamiento Microorganismos de la Naturaleza: Identificación de características macroscópicas Streptomyces coelicolor - Colonias secas - Adheridas al agar - Pigmentación - Formación de esporas

36 Aislamiento Tradicional de Productos Naturales Muestra de suelo - Optimizar crecimiento de microorganismos - Preparar extractos celulares - Ensayar contra cepas testigos - Purificar compuesto activo Fuentes alternativas Bacterias no cultivable Ensayos diferenciables - Nuevas técnicas de cultivo: enriquecimiento - Aislamiento de ADN: Expresión de rutas en bacterias cultivables - Ingeniería metabólica en bacterias cultivables

37 Trabajo Práctico N 5: Ejercicios Día 1: - Test de inhibición en estría a partir de estría sembrada durante el TP3 - Test de difusión en agar (TP3-5)

38 - Producción de amilasas - Producción de proteasas - Producción de lipasas Trabajo Práctico N 5: Ejercicios DÍA 2: Análisis de los resultados