PARTE I Biotecnología y Agricultura

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1 PARTE I Biotecnología y Agricultura Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 15

2 16 IZQUIERDO, Juan

3 I.-Capítulo1 Hacia una agricultura sustentable: las alternativas de las ciencias de la vida y de la biotecnología Izquierdo, Juan 1 El contexto del debate En línea con las conclusiones de la última Cumbre de la Alimentación de la FAO y diez años después de la Cumbre de Río y de la adopción de la Agenda 21, la Cumbre Mundial sobre Desarrollo Sustentable organizada en Johannesburgo, Africa del Sur, por el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA), reforzó que la sostenibilidad es cada vez más un precepto crucial, ampliamente aceptado y prioritario en el plano internacional dentro de un contexto integral que involucra la lucha contra la pobreza, el hambre y la malnutrición, la lucha contra las enfermedades infecciosas, la cooperación tecnológica, la educación y la liberalización de los intercambios. Las previsiones indican un importante aumento de la demanda alimentaria, especialmente en los países en vías de desarrollo, lo que implica que para poder dar respuesta a este reto una de las posibilidades es aumentar la superficie de terrenos cultivados. Sin embargo, estos terrenos adicionales, limitados por la protección indispensable de los entornos naturales, tan sólo representarían una quinta parte del crecimiento de la producción mundial de cereales. Por consiguiente, resulta obligatoria la mejora del rendimiento y/o la adaptación a condiciones extremas de producción (sequía, salinidad, frío, altas temperaturas y otras) en zonas poco aptas para la agricultura convencional que permitan intensificar a los cultivos alimenticios y diversificar, sobre la base de especies de cultivos introducidas o autóctonas, alimenticias o volcadas al agroprocesamiento, la base productiva de los países de la región. En este desafío, en donde las ciencias de la vida y la biotecnología tienen un rol central, deben estar juntos todos los actores del proceso del desarrollo (científicos, legisladores, expertos en desarrollo, agricultores y los representantes de la sociedad civil) para abordar los aspectos tecnológicos y económicos, más urgentes y polémicos, relacionados con el desarrollo y utilización segura de las biociencias y su capacidad de ofrecer soluciones sustentables para la producción de alimentos y la reducción de la pobreza. En este contexto, la cooperación entre el mundo desarrollado y el mundo en vías de desarrollo resulta crucial si se quieren lograr los objetivos relativos a la sostenibilidad. La seguridad y el uso de organismos genéticamente modificados (OGM) implican a priori, situar a la ciencia en un contexto de desarrollo mucho más amplio, tratando de asegurar que los agricultores de los países en vías de desarrollo formen parte del proceso colaborativo de investigación. Compartiendo el derecho de la sociedad civil a cuestionar, sobre bases bien informadas, los avances científicos y las consecuencias que de ellos eventualmente pudieran derivar, debe tomarse nota de que un cierto grado de escepticismo es un elemento saludable y esencial del «proceso de demostración» que permite dar a conocer las cuestiones científicas apropiadas para así poder proceder a un debate en toda regla. 2 Movilizar los recursos El proceso anterior significa movilizar recursos tanto para apoyar a la innovación y a la investigación en biotecnología, así como para desarrollar un marco regulatorio alcanzable dentro de las realidades de los países de la región, acompañado por canales de información tecnológica confiables y honestos, que permitan y promuevan una percepción pública crítica pero realista de las ventajas que ofrecen los nuevos desarrollos de las ciencias de la vida y la biotecnología. Este proceso es, en la actualidad, el centro vital de la cooperación horizontal que lleva adelante la red REDBIO/FAO ( con más de 12 años de existencia y un cuerpo de laboratorios de más de 650 instituciones de 32 países de América latina y el Caribe. Si la solución a tal desafío dependiera en primer y único lugar de la movilización de los recursos humanos y de los medios financieros, los progresos actuales y futuros de las Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 17

4 ciencias de la vida y de la biotecnología, representarían un potencial nada desdeñable para el impulso de una agricultura sustentable y segura en los países en vías de desarrollo. En concreto, dicha acción podría permitir abandonar el uso de métodos más agresivos para el ambiente como, por ejemplo, los métodos mecánicos y químicos que inciden en los costos de producción, en sus efectos desfavorables sobre las fuentes hídricas, la fauna y la flora y sobre la salud de los agricultores. Este planteamiento no queda exento de fuertes reticencias en ciertos sectores de la opinión pública mundial y especialmente en Europa, que expresan su desconfianza en cuanto al uso de organismos modificados genéticamente en el ámbito de la agricultura y la alimentación. Estas fuerzas compuestas de variados actores de la sociedad civil representan, a su vez, un fuerte desafío que limita la movilización de los recursos. El tema de los OGM es ineludible pero no supone más que una parte de la totalidad del debate. La salud de los suelos y de los cultivos, el conocimiento real del estado de la biodiversidad, las producciones vegetales en los límites ecoclimáticos y la emancipación tecnológica en las zonas rurales son también temas que revisten la misma importancia. 3 Un contexto propicio para la acción La producción agrícola en los países en vías de desarrollo ha de aumentar en la medida en que continúe creciendo el número de bocas que alimentar. Este incremento se ha de lograr en gran medida con los terrenos agrícolas existentes y mediante el uso de métodos que no agoten los recursos de la tierra o causen daños medioambientales duraderos. Las perspectivas de las generaciones venideras resultarán dañadas irreversiblemente si no se emplean adecuadamente formas sustentables de cultivar la tierra. La adopción de métodos agrícolas sustentables es un elemento importante en todo el proceso del desarrollo rural. La Agenda 21 indica que: Con el fin de crear las condiciones para la agricultura y el desarrollo rural sustentables es preciso reajustar considerablemente la política agrícola, ambiental y macroeconómica, a nivel tanto nacional como internacional, en los países desarrollados y en los países en desarrollo. El principal objetivo de la agricultura y el del desarrollo rural sustentables es aumentar la producción de alimentos de manera sustentable y mejorar la seguridad alimentaria. La reciente conferencia «Rio+10», celebrada en Johannesburgo en septiembre de 2002, reforzó el compromiso mundial con los principios del desarrollo sustentable. Entre los muchos logros importantes de la cumbre hay que destacar el mejor entendimiento de lo que representa el desarrollo sustentable y, en particular, en cuanto a la interrelación entre la pobreza, el medio ambiente y el uso de los recursos naturales. América latina y el Caribe, como región productora y exportadora de alimentos, debe transformarse en uno de los protagonistas en el campo de las ciencias de la vida y la biotecnología. Dentro de este interés superior por ayudar al desarrollo de nuevas tecnologías no se debe olvidar la necesidad de generar, acceder y compartir los avances con el mundo desarrollado de un modo justo y responsable. La región debe preparar y endosar una declaración de política en donde «las ciencias de la vida y las biotecnologías son una opción estratégica para los países» ( biotechnology/pdf/com _en.pdf) subrayándose con claridad la necesidad de poner los medios necesarios a la disposición de los países en vías de desarrollo. El progreso en estos ámbitos ayudará a la investigación y a la evaluación cuidadosa de las aplicaciones potenciales, con el fin de cubrir los temas de seguridad medioambiental y las necesidades locales relacionadas con la reducción de la pobreza, la mejora de la seguridad alimentaria y el aumento de la calidad nutricional. El desarrollo rural sustentable y la seguridad alimentaria son componentes importantes de las estrategias regionales contra la pobreza. Habida cuenta de que el sustento de la población rural depende de una agricultura sostenible, no se podrá erradicar la pobreza sin una modernización sustancial de la producción agrícola en los países en vías de desarrollo. 4 Alimentar sin destruir Según las estadísticas de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación 18 IZQUIERDO, Juan

5 y la Agricultura (FAO), hay alrededor de 800 millones de personas en el mundo que sufren malnutrición. Muchas más dependen de aprovisionamientos poco fiables de alimentos a causa de problemas naturales, económicos o políticos. Las prácticas agrícolas no sustentables tan sólo vienen a sumarse a todas estas dificultades. El uso adecuado de las ciencias de la vida y de la biotecnología puede contribuir al logro de aumentos sustentables de la producción agrícola mediante la transferencia de prácticas de gestión mejoradas, un mejor rendimiento, la resistencia a plagas y enfermedades y el aumento de la tolerancia al estrés abiótico de las cosechas, el ganado y la pesca. La selección adecuada de estas tecnologías reducirá la necesidad de recurrir a sustancias agroquímicas, de modo que se protegerá el medio ambiente y a los agricultores de sus efectos negativos. Además, las ciencias de la vida y la biotecnología pueden contribuir a la conservación de la diversidad genética. Por ejemplo, ya hay proyectos en marcha que evalúan cómo se explotan y se extenúan los ecosistemas a causa del uso humano de los recursos naturales. Con la información recopilada se puede lograr un uso más razonable de los ecosistemas que reduzca el riesgo de pérdida de especies esenciales. 5 La creación de un diálogo responsable Organizar y promover una Plataforma de Debate sobre las Ciencias de la Vida, que permita a los científicos participar en un debate con las diversas «partes implicadas» interesadas en las aplicaciones beneficiosas y en la divulgación de los nuevos conocimientos, es parte del proceso. En este sentido se debe organizar un debate informativo y plural sobre el papel de las ciencias de la vida en un contexto de urgencia económica y social, centrado en las necesidades de los países en vías de desarrollo y apoyar foros de debate con la sociedad civil presentando estudios de científicos nacionales, cada uno claramente ubicado en su contexto social y económico. Las presentaciones deben realizarse en un lenguaje comprensible para los legos en la materia, porque se evitarán las referencias a teorías e ideologías y se prestará atención a las soluciones prácticas a problemas concretos. Estas presentaciones servirán de valiosa introducción general a los diversos temas e irán dirigidas a un público amplio, con el fin de que ofrezcan una base para el inicio del debate público. 6 Reforzar los conocimientos Las «ciencias de la vida y biotecnología» ( biotechnology/pdf/com _en.pdf) son pilares en el contexto de la construcción de una sociedad y una economía basada en el conocimiento. Las inversiones en investigación y desarrollo, en educación y formación y en los nuevos enfoques de gestión tienen una importancia clave para hacer frente a los desafíos de la biotecnología y las ciencias de la vida. Coherente con lo anterior, el reforzamiento de los vínculos entre la investigación y otras políticas socioeconómicas y la necesidad de la participación de los científicos en el proceso de creación de un consenso es parte de la creación de nuevas asociaciones de investigación entre los países desarrollados y los países en vías de desarrollo, a fin de aprovechar al máximo las ventajas de tecnologías prometedoras y el potencial de la biodiversidad. El libro «Biotecnología y Mejoramiento Vegetal», para el cual he tenido el honor de escribir este capítulo, es producto del trabajo de un número importante de investigadores jóvenes latinoamericanos. La obra representa una contribución significativa a la realidad de las instituciones académicas y de investigación en ciencias agronómicas y biológicas al aportar conocimientos y el estado del arte y llenar el vacío temporal en la disponibilidad de un libro en español de consulta actual, dando seguimiento a la obra pionera «Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fundamentos y Aplicaciones» realizada en 1991 y llevada a cabo por el Centro Internacional de Agricultura Tropical bajo la edición de los Drs. William Roca y Luis Mroginski. La Oficina Regional de la FAO para América Latina y el Caribe colaboró con la edición de dicho libro y reafirma el interés por este tipo de material, que provee un conjunto de documentación consolidada para el uso de estudiantes y profesionales. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 19

6 I.-Capítulo 2 El papel de las nuevas biotecnologías en la producción agropecuaria Pagliano, Daniel 1 Introducción La nueva economía determina que aquellas naciones que pretendan crecer y generar riqueza deberán necesariamente aceptar el desafío que implica el aprender a utilizar los idiomas «digital y genético». Es así entonces que las empresas e instituciones basadas en el uso intensivo del conocimiento son fundamentales en la creación de prosperidad. Empresas de distinto porte han evolucionado y crecido en el sector de la biotecnología generando, directa e indirectamente, cientos de miles de puestos de trabajo en todo el mundo 1 como resultado de inversiones que se realizaron tanto en el sector público como en el privado, y que hoy «se consolidan» a través de la generación de un modelo productor de bienes y servicios. Entender este continuum es vital. Pero el punto principal es la creación de comunidades con visión competitiva. Es así que desde un tiempo a esta parte muchos países desarrollados están implementando diferentes estrategias para impulsar el sector de la biotecnología como un área prioritaria de su economía, no sólo por lo que significa en términos productivos sino también por lo que significa culturalmente. Para los países latinoamericanos es entonces fundamental entender que hay que buscar un lugar dentro de esta nueva economía, que es una economía de conceptos más que una economía de toneladas, y a la vez tratar de establecer parámetros de desarrollo sustentables que generen inversión, empleo genuino y valor agregado. El incremento de la demanda por factores de productividad y calidad en el producto terminado exige la utilización de tecnologías que introduzcan calidad en el material inicial y que la continúen y expandan hasta 1 The economic contributions of the biotec industry of the US economy. Informe realizado por Ernst & Young, Mayo la obtención de un producto final de mayor calidad. Considerando que los sectores productivos más importantes son la producción animal, de granos, hortifruticultura y forestales, la biotecnología incide fundamentalmente desde el inicio de las cadenas productivas. Son básicamente nuevas semillas, plantas o animales con nuevas características genéticas que confieren caracteres sanitarios, de calidad o adaptativos, los que llevan un valor agregado biotecnológico. A modo de ejemplo, si consideramos al sector lácteo, las demandas comenzarían en pasturas con especies forrajeras de alta productividad, seguirían en una genética animal que aporte la mejor capacidad de una producción de calidad, se continúan en la industria con elaboración de productos diferenciados y más aún, sigue en la valorización de los desechos industriales. Hay un continuum tecnológico donde la suma de los valores agregados en cada tramo expande el valor agregado final. Por otra parte, la agricultura y la industria farmacéutica comparten ahora una misma caja de herramientas. El desarrollo de tecnologías que pueden ser usadas en cualquier campo de la vida es un elemento dinamizador nuevo que permite que un logro en un campo pueda ser rápidamente traspasado a otro. Los códigos usados en genómica, bioinformática, química combinatoria y proteómica también son compatibles. Por todo esto, se habla de una industria de las ciencias de la vida. Los países de la región poseen una especial habilidad para el agregado de valor a su producción agropecuaria mediante la utilización de conocimientos de base biológica. Los países poseen no sólo el «know how» (conocimiento) sino también la experiencia de haber llevado esos conocimientos al campo productivo, como lo demuestran las industrias láctea, forestal, citrícola, cafetera y el complejo ganadero, entre otros. Pero es necesario comprender que la actual revolución existente en las ciencias de la vida modificará o sustituirá progresivamente tecnologías existentes, permitiendo superar límites técnicos básicos, haciendo viables nuevos parámetros de productividad y de calidad para productos y procesos existentes, sentando la base de nuevas industrias. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 21

7 Esto generará cada vez más cambios sustanciales en toda la cadena productiva agroalimentaria, donde nuevos patrones tecnológicos serán los responsables de la aparición de nuevos productos en los mercados. Estar preparados o ser parte de estos cambios se torna una cuestión de soberanía. 2 Desarrollo de una visión La sociedad de un país, como sistema humano, se mueve en dirección a las preguntas que se formula, y actúa en función de éstas. Para el diseño de una visión, la región debe lograr entender los cambios que en el plano mundial se están procesando. Cualquier tecnología compleja necesita para su desarrollo de una infraestructura sustentada en una comunidad que involucra la investigación, el gobierno, la educación, los negocios, las finanzas, la legislación y otros. Se requiere de varios actores para hacer que una tecnología pase por etapas de prueba de concepto, desarrollo, maduración, extensión y finalmente termine con su adopción. Es fundamental tener una capacidad de seguimiento de lo que ocurre mundialmente en el desarrollo de nuevos productos, programas marcos de investigación, prioridades estratégicas de programas de ciencia y tecnología, etc. Luego de tener estas tendencias mundiales es menester generar una estrategia regional de desarrollo y posicionamiento en el contexto mundial. Los ejercicios de prospectiva tecnológica son una herramienta válida en este sentido. De acuerdo con la definición de la OCDE (Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico), prospectiva tecnológica es «un conjunto de intentos sistemáticos para mirar a largo plazo el futuro de la ciencia, la tecnología, la economía y la sociedad, con el fin de identificar aquellas tecnologías genéricas emergentes que probablemente generarán los mayores beneficios económicos y/o sociales». El objetivo central de una prospectiva tecnológica es la estimación de las tendencias futuras para llevar a cabo en forma anticipada acciones para diseñar el futuro deseado. En este sentido la prospectiva tecnológica identifica aquellas tecnologías emergentes y estima el impacto de éstas sobre el mundo de los negocios y la sociedad en general. Históricamente, la región ha invertido de forma sistemática en programas de I+D (Investigación y Desarrollo) en apoyo a la investigación biológica aplicada, lo cual ha permitido mantener y aumentar la competitividad de los sectores productivos de base natural. En la actualidad, es prioritario para los sistemas de I+D y producción de la región tener una visión prospectiva para poder alcanzar un nuevo paso en su nivel de desarrollo. Es prioritario que los líderes comprendan la profundidad del cambio, los cambios tecnológicos, económicos, culturales y que se promuevan las reformas y los cambios estructurales necesarios para lograr desarrollar sistemas de innovación propios en biotecnología. Esto permitirá a la región seguir liderando el desarrollo de productos y procesos de base biológica. Las estrategias de «Usuario de Biotecnología» son una posibilidad para aquellos países que tengan importantes industrias agrícolas y agroindustriales, pero que carecen de industrias productoras de insumos biológicos. Sin embargo, países que quieran potenciar estas últimas y ser parte del «mercado del conocimiento», se verán forzados a acciones más proactivas y ambiciosas. 3 Interacción sistema académico y sector privado Hoy, la mayor parte de la infraestructura y de las capacidades disponibles en la región se encuentran fuertemente orientadas a la investigación. Esto es fundamental para avanzar hacia las etapas de desarrollo y posteriores, que permitan alcanzar los mercados con productos y servicios. Estas etapas sucesivas necesitan ser practicadas y es fundamentalmente en el sector privado donde deben articularse, contando con un sistema productivo organizado para hacer demandas al sistema científico. La ciencia pura es tan pertinente como la aplicada, pero en el mediano y largo plazo la única forma de competir seriamente es a través de productos y servicios innovadores. En la nueva sociedad del conocimiento el rol que cumplen las universidades se torna aún más clave. Es importante que las universi- 22 PAGLIANO, Daniel

8 dades de la región puedan analizar y canalizar lo que está pasando en países como Estados Unidos, Inglaterra, Bélgica, Canadá y Australia, donde existe una fuerte integración de las carreras científico-tecnológicas con escuelas de negocios, integrando la visión comercial al desarrollo de la ciencia y la tecnología. En este sentido la región posee una excelente capacidad científica-tecnológica, pero debe complementarla con la capacidad de «gestión» de la tecnología. Se requiere, por ejemplo, del «marketing» (mercadeo) para poder vender productos fuera de la región, para lo cual habrá que estudiar y comprender los mercados que van a recibir nuestros productos. Para esto, es menester lograr sinergias entre científicos y empresarios, y potenciar la formación de nuevas empresas a partir del reconocimiento de la capacidad de la biotecnología de la región. 4 Conclusiones Para la región es muy importante, sin duda, continuar trabajando en el camino emprendido, buscando forjar las alianzas estratégicas entre los ámbitos público y privado de las bioindustrias, coordinando esfuerzos en investigación y desarrollo hacia objetivos que potencien las capacidades. De esta forma se podrán lograr mejores parámetros de competitividad global que permitan continuar con la creación de emprendimientos y puestos de trabajo altamente calificados y así contribuir al desarrollo. La región tiene una gran oportunidad generada por la globalización pero, para aprovecharla, necesita entender que es indispensable involucrar a la comunidad entera y participar activamente para capturarla. Se debe promover una cultura que favorezca a los emprendimientos y genere un mayor grado de asociatividad entre las empresas y la capacidad científica, así como la formación de redes de capital de riesgo que permitan la generación de nuevos negocios. Albert Einstein afirmaba que «todos los imperios del futuro van a ser imperios del conocimiento, y solamente serán exitosos los pueblos que entiendan cómo generar conocimientos y cómo protegerlos, cómo buscar a los jóvenes que tengan la capacidad para hacerlo y asegurarse que se queden en el país. Los otros países se quedarán con litorales hermosos, con iglesias, minas, con una historia fantástica; pero probablemente no se queden con las mismas banderas ni con las mismas fronteras ni, mucho menos, con un éxito económico». Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 23

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10 PARTE II Herramientas Básicas Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 25

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12 II.-Capítulo 1 Morfogénesis in vitro Radice, Silvia 1 Introducción La embriogénesis somática y la organogénesis son dos procesos morfogénicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales. La embriogénesis somática es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar al embrión zigótico sin que medie la fertilización de las gametas, mientras que por organogénesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores. Estos órganos son inducidos a partir de una célula o de un grupo de células que, según las condiciones de cultivo, tienen la propiedad de mantenerse en activa división. Esta totipotencialidad celular había sido anunciada por Haberlandt en 1902, quien propuso la teoría de que todas las células vegetales tienen la capacidad de regenerar plantas completas. Este autor, sin embargo, no pudo demostrar su hipótesis debido a que no pudo lograr la división celular porque los medios de cultivo que empleaba no incluían reguladores del crecimiento, aún desconocidos en ese entonces. Los avances en cultivo de tejidos fueron muy lentos en sus inicios. En 1934, White pudo mantener en forma ilimitada el crecimiento de raíces en medios líquidos a partir de ápices de tomate. Al mismo tiempo se identificó el ácido indol acético (AIA), que posibilitó el mantenimiento indefinido in vitro de callos de zanahoria y tabaco. Posteriormente se descubrió el efecto de la leche de coco como estimulante de la formación de callo sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. Skoog y Tsui en 1948, trabajando con cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia de una regulación química en la parte aérea y en la raíz. Trabajos posteriores en callos de tabaco y con el agregado de cinetina, la primera citocinina descubierta, fue posible demostrar que la diferenciación de brotes, raíces o de ambos, era regulada por el balance de auxinas/citocininas. 2 Tipos de morfogénesis. Definiciones En condiciones de cultivo in vitro, las células somáticas pueden regenerar embriones (Fig. 1) o brotes, raíces y/o flores (Fig. 2) como respuesta a un determinado estímulo. La re- Figura 1: A-F) Embriogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. A, C y E) Embriogénesis somática en diferentes fases de crecimiento observada en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l -1 de BAP. B, D y F) Embriogénesis somática obtenida en diversos cultivares de Prunus sp a partir de embriones zigóticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l -1 de ANA + 1 mg l -1 de Kin con una previa inducción en MS + 2 mg l -1 de 2,4-D. Las barras representan 5 mm. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 27

13 Figura 3: Esquema de los diferentes procesos morfogénicos obtenidos a partir de la siembra in vitro de diferentes explantes. Las líneas continuas expresan organogénesis o embriogénesis directa mientras que las líneas quebradas indican que la morfogénesis se obtiene por vía indirecta. generación es un proceso que comprende diferentes fases que se suceden de manera similar para los tres tipos de morfogénesis citadas. De Klerk y colaboradores en 1997 denominaron a estas diferentes fases como fase de adquisición de la competencia, fase de inducción y fase de realización. En la primera fase las células no responden al estímulo organogénico pero adquieren esa competencia durante una fase de desdiferenciación. En la segunda fase o fase de inducción, las células son receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación directa entre el tipo, concentración y combinación de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase de realización, la célula sufre las sucesivas divisiones para formar el órgano determinado. A partir de la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones adecuadas, puede inducirse la formación de nuevos órganos de manera directa sin la formación de callo. Si la formación es de brotes, raíces o flores se denomina organogénesis directa. Si en cambio se induce la formación de embriones somáticos, este proceso se denominará embriogénesis directa (Fig. 1 y Fig. 3). Si por el contrario, a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferación de células en forma desordenada y sin ninguna función predeterminada, se iniciará la producción de callos o suspensiones celulares (Fig. 2 A y Fig. 3). La diferenciación de órganos a partir de callos o morfogénesis indirecta, estará condicionada a la previa formación de los meristemoides. La denominación de morfogénesis directa o indirecta fue descripta por primera vez por Hicks en Figura 2: A-E) Organogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. A) Callo organogénico obtenido en Abelia sp. (André) Rehder cultivada en MS + 1 mg l -1 de picloran. B) Inicio de brotes (flechas) en hojas crecidas in vitro de «Crimson Gold» (Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1 mg l -1 de ANA + 1 mg l -1 de Kin. C) Brotes de Gerbera jamesonii Bolus obtenidos a partir del cultivo de capítulos florales en MS 0,05 mg l -1 de IBA mg l -1 de BAP + 0,1 mg l -1 de GA 3. D) Brotes florecidos in vitro de Abelia sp. (André) Rehder cultivados en MS + 1 mg l -1 de BAP. E) Raíces (flechas) crecidas de callo de Abelia sp. (André) Rehder cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l -1 de 2iP, previamente inducidas con 1 mg l -1 de picloran. Las barras representan 5 mm. 28 RADICE, Silvia

14 3 Histología de la morfogénesis Después de 48 horas de realizada la siembra del explante en el medio de cultivo adecuado, a partir de una célula epidérmica o del mesófilo foliar, como ocurre en las coníferas, se suceden una serie de divisiones mitóticas. Así se pueden observar, a través del estudio histológico, pequeñas masas de células que contienen un citoplasma denso y grandes nucléolos. Este conjunto de células agrupadas a modo de esferas fueron denominadas meristemoides por Torrey en 1966, y son los responsables de la diferenciación de los nuevos órganos. Este tipo de meristema puede iniciarse en forma directa a partir de células diferenciadas, pertenecientes a un explante cultivado in vitro o, indirectamente, a partir de una célula o grupo de células diferenciadas que promueven la proliferación celular (Fig. 4 A). Su evolución determinará el crecimiento de un órgano como, por ejemplo, una yema adventicia (Fig. 4 B). Las células embriogénicas son similares a las células meristemáticas debido a que no son demasiado voluminosas, tienen gran cantidad de ribosomas, citoplasma denso, un nucléolo agrandado y pequeños granos de almidón. Estas células en general se agrupan y pueden variar en tamaño y número. Dentro de un grupo de células embriogénicas, el desarrollo de las mismas no está sincronizado. Estas células son capaces de dividirse o de transformarse en embriones según las condiciones del medio de cultivo. Seguidamente, las células que no desarrollan proembriones comienzan el proceso de diferenciación, es decir, se vacuolizan, disminuye el volumen de núcleo y nucléolo y desaparecen los gránulos de almidón. Las experiencias demuestran que las células embriogénicas se desarrollan sólo cuando se modifican las condiciones de cultivo. En general ocurren cuando se reducen las cantidades de auxina y citocinina o cuando se elimina la auxina. Las células embriogénicas desarrollan como embriones cuando las condiciones experimentales permiten que éstas expresen su potencial. Pueden ocurrir dos situaciones ontogénicas diferentes, es decir que su origen sea unicelular o pluricelular. En el caso de iniciarse a partir de una célula, ocurre que estas células embriogénicas se aíslan unas de otras por una importante modificación en su pared celular, en particular por la gelificación de la laminilla media. Esta célula, que está rodeada por un polisacárido mucilaginoso, sufre divisiones polarizadas formando un embrión globular, en donde pueden diferenciarse deposiciones de almidón en una etapa previa a la polarización de este proembrión. Luego ocurre la formación de la epidermis y adquiere la simetría bilateral. Sucesivamente se observa el crecimiento de uno o más cotiledones, el desarrollo de los tejidos provasculares, la iniciación de los ápices radicales y de tallo y una progresiva acumulación de sustancias del tipo almidón, lípidos y proteínas. En el caso de que los embriones somáticos se originen de un grupo de células pue- Figura 4: A-E) Cortes histológicos de diferentes explantes cultivados in vitro. A) Meristemoides (flechas) observados en cultivo de Silybum marianum L. en MS + 1 mg l -1 de AIA + 5 mg l -1 de BAP 10 x. B) yemas adventicias (flechas) en ápices de Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l -1 de IBA mg l -1 de BAP + 0,1 mg l -1 de GA 3 4 x. C) grupo de células embriogénicas (flechas) en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l -1 de tidiazurón. 20 x. D) Embriones somáticos en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l -1 de tidiazurón 10 x. E) Embriogénesis secundaria en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l -1 de tidiazurón 10 x. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 29

15 den observarse diversos patrones. Los embriones somáticos se forman a partir de grupos de células epidérmicas y subepidérmicas (Fig. 4 C). Este tipo de ontogenia de origen multicelular se llama comúnmente budding o embriogénesis adventicia. Estas células pequeñas tienen una alta relación núcleo/ citoplasma, un denso citoplasma y un nucléolo voluminoso y teñido. Se diferencian de las células embriogénicas por la falta de sustancias de reserva, por su delgada pared celular y su frecuente división celular. Estas estructuras pueden ser denominadas como proembriones globulares (Fig. 1 A y B). En una etapa posterior, desarrollan una epidermis, un tejido provascular, acumulan material de reserva y también sufren la polarización. Estas estructuras globulares producen cotiledones y se transforman en embriones somáticos con la formación de ápices de tallo y raíz. Para una misma especie puede ocurrir uno u otro tipo de inicio según las condiciones de cultivo. El desarrollo de un embrión somático de origen unicelular es comparable a la de un embrión zigótico. En dicotiledóneas, la etapa globular es seguida por una etapa corazón que se corresponde con la adquisición de la simetría bilateral: desarrollo de la epidermis, de los estratos procambiales y, de manera sucesiva, el desarrollo del ápice radical. El ápice de tallo se desarrolla más tarde en la etapa de cotiledonar. En los embriones somáticos de algunas especies hay una etapa intermedia entre la globular y corazón llamada oblonga, que corresponde a la individualización del ápice de la raíz y al procambium en respuesta a la elongación axial del embrión somático debido al transporte de auxinas (Fig. 1 C). Los embriones de origen multicelular obtenidos por budding muestran la misma ontogenia que los zigóticos, así como también la producción de sustancias de reserva. Sin el seguimiento histológico detallado, la formación del embrión somático sólo puede ser confirmado por la germinación (Fig. 1 F). Sin embargo debido al bajo porcentaje de embriones que llegan a esta etapa, esta tarea es casi imprescindible para una correcta evaluación de las respuestas encontradas con los diversos medios de cultivo empleados. Los embriones somáticos, comparados con los embriones zigóticos de la misma especie, frecuentemente desarrollan de manera anormal o son inmaduros. La anomalía más frecuente es la formación doble o triple del sistema vascular, causada por la pobre polarización del transporte de auxinas. También se puede encontrar un contenido excesivamente alto, reducido o ausente de las reservas de almidón y/o proteicas, que el meristema apical o radical no estén desarrollados o que la embriogénesis sea repetitiva o secundaria (Fig. 4 E). La falta del meristema apical o de una escasa deposición de sustancias lipoproteicas observada en los embriones somáticos de algunas especies, no debe ser tomada como una anormalidad sino que puede ser síntoma de inmadurez debido a la rápida formación de los mismos. En este caso una etapa intermedia que permita la maduración de las estructuras formadas permitirá incrementar el porcentaje de embriones somáticos capaces de germinar. 4 Factores que afectan los procesos morfogénicos Los cuatro factores principales que condicionan la obtención y el crecimiento de nuevos órganos en condiciones in vitro son: el genotipo las condiciones químicas seleccionadas para realizar el cultivo las condiciones físicas seleccionadas para realizar el cultivo el explante El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfogénicos desde la capacidad del explante para su establecimiento en condiciones in vitro así como también para la proliferación de callo, o la diferenciación y crecimiento de nuevos órganos. Por esta causa, no es posible generalizar metodologías o protocolos de trabajo debido a que los medios de cultivo como las condiciones de cultivo seleccionados, deben ser específicos para cada situación en particular. Un ejemplo de ello es el protocolo empleado por Stamp y Meredith en diferentes cultivares de Vitis vinifera. En cuatro de ellos fue posible la obtención de embriones somáticos a partir de embriones zigóticos, pero estos resultados no se repitieron con el cultivar «Pinot Noir». 30 RADICE, Silvia

16 Varios son los compuestos químicos que influyen en los patrones morfogénicos in vitro dentro de los cuales podemos considerar: 1. La composición salina del medio de cultivo. La composición salina más empleada para inducir la formación de callo, la organogénesis directa o indirecta en la mayoría de las especies vegetales, es la de Murashige & Skoog (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseñadas para inducir determinados patrones morfogénicos. Existe, además, una estrecha relación entre la composición hormonal del explante y la concentración de reguladores del crecimiento agregada al medio de cultivo. 2. Reguladores del crecimiento. Estos compuestos pueden promover la morfogénesis aun cuando la concentración salina no sea la adecuada. En condiciones óptimas de cultivo pueden incrementar significativamente la diferenciación de órganos. En muchas de las especies vegetales, para la inducción de embriones somáticos, es necesario el agregado de auxinas como ocurre en Tilia spp.; sin embargo, para otras, como es el caso del crotón (Codiaeum variegatum), es suficiente con el agregado de thidiazurón. El genotipo y el tipo y concentración de reguladores del crecimiento empleados están estrechamente relacionados. 3. Antibióticos. En procesos de transformación es muy común el agregado de antibióticos del tipo cefotaxime, kanamicina y carbenicilina para la eliminación de Agrobacterium tumefaciens. En explantes de hoja de diferentes cultivares de Malus domestica se ha encontrado que 250 mg. L 1 de cefotaxime aumentan significativamente la regeneración de brotes mientras que 500 mg. L 1 de carbenicilina promueven la formación de callo y la kanamicina inhibe los procesos morfogénicos. 4. Carbón activado. En general se usa para absorber compuestos tóxicos de la microatmósfera gaseosa o el exceso de reguladores del crecimiento presentes en el medio de cultivo. E.K. Pettersson y su equipo de colaboradores de la Swedish University of Agriculture, Suecia, demostraron que este compuesto puede promover la embriogénesis somática debido a ciertos compuestos que se incorporan por difusión al medio de cultivo. 5. Agar. Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio de cultivo. Puede emplearse como semisólido o líquido. El agente gelificante más empleado en el cultivo in vitro es el agar extraído de diversas algas marinas. Las diferentes calidades existentes en el mercado modifican la expresión morfogénica debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chinensis, cultivadas en una solución de MS con el agregado de 0,1 mg.l -1 de AIA + 1 mg.l -1 de BAP, donde se observó una respuesta morfogénica diversa según el tipo de agar seleccionado. Por ejemplo, cuando el gelificante empleado fue Chubut-agar, de producción nacional, se observó una gran diferenciación de yemas adventicias, mientras que con el agregado de agar SIGMA R sólo se indujo la proliferación de callo. En caso de seleccionar medios de cultivo líquidos, la respuesta morfogénica observada varía de manera considerable. El cultivo líquido es imprescindible cuando se busca promover la morfogénesis indirecta a través de suspensiones celulares. Para ello es necesario cultivar los callos en medio líquido con agitación para permitir que las células se disgreguen y puedan diferenciar raíces, brotes o embriones somáticos en forma aislada. La selección del medio de cultivo líquido o sólido depende, además, de la especie empleada. En Cymbidium spp, por ejemplo, se ha observado que el empleo de medio de cultivo líquido promueve una mayor diferenciación de protocormos respecto del mismo medio gelificado. A su vez, este proceso puede mantenerse durante varios subcultivos mientras que en medio de cultivo gelificado se observó que los protocormos tienden a formar tallos. 6. Atmósfera gaseosa. Es un factor determinante en los procesos morfogénicos y está condicionada por el tipo y tamaño de envase seleccionado así como también el sistema de cobertura del mismo. Las tapas usadas en cultivo in vitro varían desde el tapón de algodón, papel de aluminio, película de resinite transparente o tapas rígidas de polipropileno. El intercambio gaseoso es di- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 31

17 ferente para cada tipo de tapa; en consecuencia, la atmósfera interna también sufrirá variaciones. En condiciones in vivo la atmósfera contiene 78 % de nitrógeno; 21 % de oxígeno y 0,035 % de dióxido de carbono. En cultivos in vitro se han registrado, además, etileno y otros compuestos hidrocarbonados. El nivel de oxígeno disponible para el explante condiciona el crecimiento y los procesos morfogénicos. En general se necesita una buena aireación para obtener cualquier tipo de proceso morfogénico. En alfalfa se puede obtener un buen incremento de material a partir de suspensiones celulares embriogénicas cuando la solución se satura con 70% de oxígeno en la solución. Por el contrario, una tensión de oxígeno del 5 % estimula la producción de plantas a partir de anteras de tabaco. La concentración de dióxido de carbono (CO 2 ) en la atmósfera gaseosa in vitro varía según la respiración y la actividad fotosintética de las plantas. En condiciones de oscuridad, el CO 2 se incrementa mientras que, en condiciones de luz disminuye. En trabajos realizados con Ficus lyrata se han encontrado concentraciones variables que van del 0,5 al 8,5 %, según el tipo de sello o tapa empleados. Estas concentraciones superiores a 1 %, generalmente tóxicas para las condiciones in vivo, probablemente no son limitantes para la actividad fotosintética. La presencia de etileno en condiciones in vitro promueve diversas respuestas. Para el cultivo de células, callos y anteras, su acumulación tiene efectos inhibitorios. La cantidad de etileno producida in vitro varía con la especie, el tipo de explante, la concentración de citocininas en el medio de cultivo, el tipo de agar seleccionado y con la luz. Una forma de incorporar etileno al envase de cultivo es a través de la esterilización del material de disección realizada con el material embebido en alcohol y flameado con mechero Bunsen. En muchos casos, el etileno actúa como promotor de la morfogénesis, pero luego es inhibitorio del crecimiento de los órganos diferenciados. Entre las condiciones físicas podemos mencionar los efectos de la temperatura, la humedad relativa y la luz. 1. La temperatura de incubación de los cultivos es un factor importante a tener en cuenta. Si bien en las condiciones naturales de cultivo las plantas tienen diferencias térmicas durante el día y la noche, las temperaturas in vitro se mantienen casi estables. Es importante señalar que cuanto más se asemejen las condiciones in vitro a las óptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor será la respuesta esperada. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a diferentes temperaturas, se observó que la regeneración mayor de brotes se obtuvo a 12 ºC, mientras que por encima de los 30 ºC casi no hubo diferenciación. 2. La humedad relativa (HR) como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmósfera gaseosa, es otro de los parámetros físicos a tener en cuenta. La HR dependerá del sello o cobertura del envase empleado. Si este cierre es hermético, la humedad interior será del 100 %. Si existe la posibilidad de un intercambio gaseoso, la humedad interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. Este importante descenso del contenido de HR puede promover una pérdida veloz de agua del medio de cultivo, variando la concentración de sus compuestos hasta llegar a niveles tóxicos (Debergh, comunicación personal). 3. La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad y período de suministro. La respuesta morfogénica de un explante puede variar según se le proporcione luz o no. Para estimular la formación de callo es común que se prefiera la oscuridad. El suministro de luz favorece la diferenciación de órganos. Tal como ya se señaló anteriormente, los procesos morfogénicos dependen del genotipo seleccionado, pero, además, debe sumarse el efecto del explante seleccionado. El tratamiento de la planta madre, las condiciones físicas y fisiológicas en las que ésta se encuentre y el sector del cual se tome el explante determinarán a su vez la respuesta morfogénica en condiciones in vitro. Un ejemplo muy interesante es la diferente respuesta morfogénica observada sobre hojas de Camellia japonica cultivadas en un mismo medio de cultivo, según la porción de la lámina que se cultive. Estos resultados fueron obtenidos por Pedroso y Pais (1993) des- 32 RADICE, Silvia

18 pués de seis semanas de cultivo in vitro previa inmersión del explante en una solución de IBA (1 mg l 1 ) durante 20 minutos (Fig. 5). 5 Lecturas recomendadas BUDDENDORF-JOOSTEN, J.M.C. and WOLTERING, E.J Components of the gaseous environment and their effects on plant growth and development in vitro. Plant Growth Regulation 15: DE KLERK, G.J., Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. and Neumann K.H Regeneration of roots, shoots and embryos: physiological, biochemical and molecular aspects. Biologia Plantarum 39 (1): GEORGE, E Plant propagation by tissue culture Part 1 The technology. Butler and Tanner Ltd (ed). Gran Bretaña. 1361pp. Figura 5: Esquema de las diferentes respuestas morfogénicas obtenidas después de seis semanas de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L. según la porción de la lámina cultivada. 1. organogénesis indirecta, 2. embriogénesis somática directa, 3. regeneración directa de raíces, 4. callo organogénico. HICKS, G.S Patterns of organ development in plant tissue culture and the problem of organ determination. Bot. Rev. 46: WILLIAMS, E.G. and MAHESWARAN, G Somatic embryogenic factors influencing coordinated behavior of cells as an embryogenic group. Ann. Bot. 57: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 33

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20 II.-Capítulo 2 Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales Mroginski, Luis; Sansberro, Pedro; Flaschland, Eduardo 1 Introducción El cultivo de tejidos en su acepción amplia puede ser definido como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos células desprovistas de pared celular células, tejidos u órganos) se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. La imprecisión de esta definición puede generar muchas polémicas, pero es actualmente aceptada. Generalmente es común dividir las técnicas del cultivo de tejidos en dos grandes grupos: a) cultivos en medios semisólidos y b) cultivos en medios líquidos, los que a su vez pueden ser agitados (mediante el empleo de agitadores de uso continuo) o estacionarios. También es frecuente dividir al cultivo de tejidos atendiendo a los niveles de complejidad en cultivo de órganos, cultivos celulares y cultivo de protoplastos. Para el establecimiento de los cultivos utilizando cualquiera de los sistemas es necesario tener en cuenta algunos aspectos generales comunes relacionados con el explante, la asepsia, el medio de cultivo y las condiciones de incubación. La discusión de estos aspectos constituye el objetivo de este capítulo. Adicionalmente se incluye el tema de la aclimatación de las plantas regeneradas in vitro, que es de gran importancia en la mayoría de las aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura. 2 Explante Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la elección del explante apropiado para el establecimiento de los cultivos in vitro, entre ellos: 1. Objetivo del cultivo: si bien es difícil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos, se podría esquematizarlas en aplicaciones para: Estudios básicos. En este caso, los explantes cultivados pueden ser diversos. Si lo único que se quiere lograr es un sistema de callos para estudiar algún proceso fisiológico, se puede cultivar cualquier órgano, tejido o célula viva. En este caso en que lo único que se busca es la inducción de callos lo ideal es cultivar explantes jóvenes, derivados de semillas en germinación, donde se obtienen respuestas rápidas y, en general, hay menores problemas de contaminación con microorganismos. A veces se hace uso del cultivo de tejidos porque representa un sistema experimental que simplifica la complejidad generada por los fenómenos de correlación entre las distintas partes que normalmente están presentes en una planta entera. El explante que se usará estará condicionado por lo que se quiere estudiar. Un buen ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fecundados del tomate para estudiar los requerimientos nutricionales durante el crecimiento de los frutos. Asimismo, el cultivo de óvulos ha sido muy útil para estudiar aspectos relacionados con la formación de las fibras en algodón. El cultivo de discos de tallos brindó una valiosa ayuda para estudiar la rizogénesis in vitro. Obtención de plantas con sanidad controlada. Es muy común la utilización del cultivo de tejidos para la obtención de plantas libres de virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios foliares. Micropropagación. En este caso dependerá del sistema que se quiere utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotación de meristemas, los ápices terminales y los segmentos uninodales de ramas jóvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de tejidos debe conocer perfectamente la biología de la reproducción de la planta para aprovechar aquellos explantes que en forma natural son propágulos. En cambio, si se pretende micropropagar mediante el empleo de semillas sintéticas (ver Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 35

21 V.-2) el explante original deberá posibilitar la inducción de la embriogénesis somática. En este caso, la utilización de embriones zigóticos inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes. Obtención de híbridos interespecíficos. Una de las primeras aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituyó su empleo como ayuda para la obtención de híbridos derivados de cruzamientos interespecíficos, donde se produce el aborto temprano de embriones. En estos casos, el explante cultivado es el embrión cigótico en estadios tempranos de su desarrollo. Con la misma finalidad también se utilizan ovarios u óvulos fecundados. Obtención de plantas de semillas con embriones rudimentarios. Para esta finalidad los explantes pueden ser semillas (por ej. orquídeas) o bien, se aíslan los embriones en un estado temprano de desarrollo («corazón») como en el caso de yerba mate o de algunas variedades de duraznero. Obtención de plantas haploides (considerando como haploide a un esporofito que contiene el complemento gamético de cromosomas). En este caso, los explantes más utilizados son las anteras, aunque también pueden emplearse microsporas aisladas, óvulos y ovarios no fertilizados. Inducción de variación somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero si la finalidad de su utilización es la aplicación en planes de mejoramiento genético de plantas, los explantes utilizados deben posibilitar la regeneración de plantas enteras. Producción y/o conversión de sustancias útiles. Se puede utilizar una gran variedad de explantes. Explantes de raíces suelen ser muy utilizados. Obtención de híbridos somáticos. Para esta finalidad se recurre a la fusión de protoplastos. En la mayoría de los casos se aíslan los protoplastos de mesófilos de hojas y de suspensiones celulares. Conservación e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los explantes preferidos para el desarrollo de sistemas de conservación a mediano y largo plazo (crío- conservación con nitrógeno líquido) y para el intercambio de material genético. Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los cultivos a partir de explantes extraídos de semillas en germinación (hipocótilo, epicótilo, cotiledones, raíces). 2. Posibilidad de contaminación con microorganismos. De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas dadoras que crecen en condiciones de invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminación. Por otra parte, es recomendable evitar el uso de «explantes sucios» (raíces, rizomas) que provienen de plantas crecidas en macetas o en el campo, dado que en la mayoría de los casos no es posible conseguir una buena desinfección de los mismos. 3. Edad fisiológica. Este es un aspecto de gran influencia en la morfogénesis. Como regla general se puede decir que cuando más joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor será su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la micropropagación de plantas leñosas, la edad del explante es un factor crítico. Si los tejidos son jóvenes, la micropropagación tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas dadoras de explantes. 4. Tamaño. En general, cuanto más grande sea el explante mayores serán las posibilidades de inducir la proliferación de callos o la regeneración directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. También es necesario tener en cuenta que existe un tamaño mínimo del explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fácil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeños suelen requerir del empleo de medios más complejos o de los denominados medios acondicionados. 5. Epoca del año. Es un factor que suele tener mucha importancia en la micropropa- 36 MROGINSKI, Luis; SANSBERRO, Pedro; FLASCHLAND, Eduardo

22 gación y que generalmente está asociado al grado de dormición que presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y también con la posibilidad de mayor o menor proliferación de microorganismos. 3 Asepsia Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminación de los mismos con diversos tipos de microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus). El ambiente generado por explantemedio de cultivo-condiciones físicas de incubación es altamente propicio para la proliferación de muchos de estos microorganismos que pueden provocar la destrucción de los cultivos. Es difícil cuantificar el impacto de estas pérdidas, pero en promedio, en laboratorios dedicados a la micropropagación se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los nutrientes del medio de cultivo o bien lo modifican. Es muy difícil conseguir cultivos estrictamente asépticos dado que en la mayoría de los casos es altamente probable que los mismos contengan virus y fitoplasmas, por lo que en la práctica, cuando se refiere a cultivos asépticos, en general se quiere significar que son cultivos donde no se produce la proliferación de hongos y bacterias. Dos son las fuentes de contaminaciones: a) microorganismos presentes en el interior o en la superficie de los explantes y b) fallas en los procedimientos de cultivo en el laboratorio. La correcta detección de estas fuentes y del tipo de microorganismo son aspectos importantes para el éxito de los cultivos, pues por un lado ayuda a determinar la fuente de contaminación y por otro lado, ayuda a la planificación de los procedimientos para controlarlos. Varios géneros de bacterias (Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Mycobacterium, Corynebacterium) y de hongos filamentosos (Aspergillus, Penicilium, Fusarium, Alternaria, Cladosporium y Neurospora) están frecuentemente en los cultivos. Es conveniente inspeccionar visualmente con la ayuda de un microscopio estereoscópico los cultivos en forma periódica (por lo menos semanalmente). También se pueden realizar pruebas con medios de cultivo diferenciales y «test» bioquímicos específicos. Para evitar y/o minimizar las contaminaciones de los cultivos con microorganismos es necesario: 1)Conocer el material vegetal con que se trabaja y los posibles contaminantes específicos. 2) Realizar una adecuada preparación de la planta dadora de explantes, cultivándola preferentemente en invernaderos tratadas con productos químicos que eliminen patógenos y eventuales microorganismos endófitos. 3) Proceder a la desinfección superficial de los explantes mediante el uso de compuestos químicos con el objeto de eliminar los microorganismos con el menor daño posible para el explante. Si bien no es posible recomendar un procedimiento general, se puede señalar que el procedimiento más popularizado consiste en una doble desinfección mediante la inmersión de los explantes en etanol (70%v/v) durante segundos seguido de hipoclorito de sodio 1-3%, contenido en el agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza del explante. Algunos procedimientos se basan en el empleo de únicamente etanol o de hipoclorito de sodio. Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada estéril. En este último punto hay que aconsejar que se utilice agua destilada estéril de reciente preparación, dado que está demostrado que el almacenaje prolongado del agua estéril puede ser la causa de contaminaciones con bacterias. Es aconsejable realizar estas operaciones de desinfección superficial en una cámara de transferencia con aire estéril. En lugar del hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclorito de calcio (6-12 %) o el cloruro de mercurio (0,1-1,5%). Es preciso recomendar extrema cautela con el empleo de este último compuesto, dado que es altamente tóxico y además no es removido con facilidad del explante. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 37

23 En los casos en que no se utilice etanol, la adición de agentes tensoactivos junto con el desinfectante es una práctica recomendada. Entre los más usados figuran Tween-20 (0,01 0,1%) o unas gotas de Triton. El lavado previo de los explantes con agua corriente y detergentes, ayuda a una mejor desinfección. La inmersión de los explantes en soluciones conteniendo sustancias antibióticas y /o antimicóticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, ampicilina, tetraciclina, carbenicilina, sulfato de gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifampicina, anfotericina B, benomil, carbendazim) puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados en casos excepcionales. Estos productos tienen el inconveniente de que alteran la composición de los medios de cultivo y además pueden ser metabolizados por los explantes. Ultimamente han aparecido soluciones biocidas que matan bacterias y hongos, previenen la germinación de esporas y a altas concentraciones pueden eliminar contaminaciones de microorganismos endófitos. Uno de estos compuestos es el PPM (Plant Preservative Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, un compuesto derivado de los furfurales de la caña de azúcar. Este compuesto, químicamente: 1-(5-bromofur-2-il)-2- bromo-2-nitroeteno fue desarrollado en la Universidad Central de las Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y fungicida de amplio espectro. En los casos en que se utilicen plántulas crecidas in vitro como plantas dadoras de explantes, es necesario desinfectar las semillas para su cultivo y germinación y luego es aconsejable desinfectar también las plántulas resultantes. En algunos materiales vegetales se utiliza la preincubación de los explantes mediante lo cual éstos son desinfectados suavemente y precultivados durante 24 horas en un medio conteniendo sacarosa, y finalmente son desinfectados nuevamente y cultivados. 4)Emplear medios e instrumentos de cultivo esterilizados, es decir, liberados completamente de cualquier microorganismo vivo o esporas. Para la esterilización, en la mayoría de los casos se hace uso del calor en sus diversas formas: llama directa, calor húmedo (en forma de vapor abierto o bajo presión), calor seco (aire caliente). Se pueden usar hornos a microondas. El agua caliente también puede ser usada. En el caso de sustancias termolábiles, la esterilización se puede hacer mediante filtración a través de filtros bacteriológicos. No es posible recomendar ningún sistema de esterilización dado que la exitosa destrucción de los microorganismos depende de múltiples factores entre los que interesan el tamaño del recipiente, el tiempo de esterilización y la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sin embargo, se pueden dar algunas sugerencias: La esterilización en estufas mediante calor seco (aire caliente) es recomendable para esterilizar recipientes de vidrios secos (pipetas, cápsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4 horas en estufas a ºC brindan excelentes resultados. La esterilización con calor húmedo con vapor bajo presión (en autoclave o en una «olla a presión»), es el procedimiento más empleado para la esterilización de los medios de cultivo (salvo, como se indicó más arriba, para aquellos que posean componentes termolábiles). En este caso, lo más común es usar una presión de 1.46 kg.cm -2 durante 20 minutos, con lo que prácticamente se destruyen todas las formas de vida. Es importante que en todos los puntos del autoclave se alcance dicha temperatura, para lo cual hay disponibles cintas detectoras colorimétricas. 5)Cultivar los explantes en una cámara de transferencia con aire estéril («gabinete de flujo laminar»), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en forma directa). La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el área del aire estéril. Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminación, por lo que es recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabón y se desinfecten con etanol al 70 %. La 38 MROGINSKI, Luis; SANSBERRO, Pedro; FLASCHLAND, Eduardo

24 utilización de guardapolvos, guantes y máscaras protectoras de la boca y de la nariz, así como los gorros protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminación. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cápsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser usados, se deben flamear cuidadosamente en la llama de un mechero. También es necesario flamear la boca de los recipientes que contienen los medios de cultivo antes y después de cultivar el explante. 6)Incubar los cultivos en cámaras o cuartos de cultivo, cerrados, libres de corrientes de aire y bien higienizados. En lo posible se debe restringir la circulación de personas, y los recipientes con cultivos contaminados deben ser rápidamente eliminados de este sector. Es conveniente que antes del lavado, estos cultivos sean esterilizados. 4 Medios de cultivo Un medio de cultivo puede ser definido como una formulación de sales inorgánicas y compuestos orgánicos requeridos para la nutrición y manipulación de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Para dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles, George y col., luego de revisar más de trabajos científicos describen en dos tomos (casi páginas en total) más de medios de cultivo. También dos empresas multinacionales ofrecen para la venta más de 60 medios cada una, listos para su utilización especialmente en la micropropagación comercial de plantas. En la Tabla 1 se presentan tres medios que son muy usados en la actualidad. Básicamente, los medios de cultivo se componen de: Una fuente de carbono Nutrientes minerales Sustancias vitamínicas Sustancias reguladoras del crecimiento Agente gelificante (en el caso de medios semisólidos) Otros compuestos Fuente de carbono: Prácticamente todos los cultivos son heterótrofos (comparativamente unos pocos son autótrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%, es el azúcar más utilizado. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa. También myo-inositol (100 Mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos. Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los macro y micronutrientes esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general se destacan las concentraciones relativamente altas de nitrógeno y potasio. El nitrógeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato. También se pueden utilizar urea, glutamina y caseína hidrolizada. Es fundamental que el hierro sea incorporado conjuntamente con un agente quelante (Na 2 EDTA), lo que lo hace disponible en un amplio rango de ph. Sustancias vitamínicas: De todas las que comúnmente se incorporan a los medios, pareciera que la tiamina es la única realmente imprescindible para el buen crecimiento de los cultivos. Sustancias reguladoras del crecimiento: En la mayoría de los casos los medios utilizados para el establecimiento de los cultivos contienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, IBA, NOA, Dicamba, Picloram) y/o citocininas ( BA, CIN, ZEA, 2iP, Thidiazurón). Las giberelinas (especialmente GA 3 ) son requeridas en algunas ocasiones para el cultivo de meristemas o para la elongación de brotes. El ABA, es usado en algunos casos. Agente gelificante (en el caso de medios semisólidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el compuesto más utilizado. También pueden emplearse «Agargel» (0,40-0,60%), «Transfergel» (2-2,60%), «Phytagel» (0,25-0,40%), agarosa (0, %) y «Gelrite» (0,10-0,20%). Otros compuestos: Muchas sustancias, de variada composición química, suelen ser adicionadas a los medios básicos. Además de la glicina, otros aminoácidos se pueden agregar a los medios. Es el caso de L-tirosina, asparagina y cisteína, aunque hay que tener presente que en dosis altas pueden inhibir el Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 39

25 crecimiento de los cultivos. El carbón activado (0,1 a 5%) suele ser incorporado al medio, dado que es probable que absorba metabolitos tóxicos para los cultivos. En algunos medios se incorporan ácidos orgánicos como el málico, el cítrico, el pirúvico y el succínico y es frecuente el empleo de L- glutamina y de caseína hidrolizada. Aún hoy se siguen utilizando ciertas sustancias de composición química indefinida como el agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y puré de banana. También en ocasiones es necesaria la incorporación de agentes antioxidantes (Lcisteína, ácido ascórbico, polivinilpirrolidona) para prevenir el ennegrecimiento tisular causado por la oxidación de polifenoles presentes en los explantes. Este ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos. La preparación de los medios de cultivo puede llevarse a cabo de diferentes maneras, en «lecturas recomendadas» se citan manuales de laboratorio donde se describe detalladamente este punto. Tabla 1: Composición de tres medios básicos usados en el cultivo in vitro de tejidos. 5 Condiciones ambientales para la incubación. La incubación de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperíodo, humedad atmosférica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor), una buena y uniforme circulación de aire en el interior, dotados de un buen sistema de alarma para interrumpir la iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de ºC, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo «luz día» con una irradiancia de entre 50 y 200µmol.m -2.s -1.La humedad atmosférica debe ser elevada (80-90%). 6 Aclimatación de las plantas regeneradas in vitro. Durante el período de incubación, los cultivos son expuestos a condiciones ambientales disímiles al ambiente externo. La atmósfera interna se caracteriza por presentar una considerable variación diurna en la concentración de CO 2, humedad relativa elevada, temperatura constante e intensidad lumínica baja. A su vez, el medio de cultivo compuesto por concentraciones elevadas de azúcares (en aquellos sistemas heteró-trofos y semiautótrofos de micropropagación), sales y reguladores del crecimiento, sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfológicas, anatómicas y fisiológicas que las plantas deberán corregir cuando son transferidas al ambiente externo. Este período de adaptación al nuevo hábitat es llamado fase o etapa de aclimatación. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deberá contemplar el control minucioso de los parámetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratación y, al mismo tiempo, estimular la fotosíntesis con el objeto de generar un rápido crecimiento de los plantines. El retraso en el desarrollo de la cutícula y la escasa funcionalidad del aparato estomático que presentan las hojas de la mayoría 40 MROGINSKI, Luis; SANSBERRO, Pedro; FLASCHLAND, Eduardo

26 de las especies cultivadas in vitro, determinan una alta tasa de transpiración que puede ocasionar la muerte por deshidratación. El control de este proceso fisiológico es de vital importancia durante la aclimatación, teniendo en cuenta que la disminución de la transpiración será gradual y dependerá de la rehabilitación de los estomas, así como también del desarrollo de la cutícula. El equipamiento necesario estará sujeto a la especie, pudiendo utilizarse desde túneles de polietileno para plantas que posean un elevado control de la transpiración (por ej. Malus pumila o Agave tequilana) o bien, a través del empleo de cámaras climatizadas (Fig.1) equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino de la humedad relativa. En algunos casos puede resultar necesaria la aplicación exógena de ABA (hormona involucrada en el control del cierre de los estomas) o bien, el empleo de sustancias antitranspirantes que forman una capa semipermeable en la superficie de la hoja. En este último caso deberán tomarse algunas precauciones debido a que pueden observarse reacciones de fitotoxicidad. Resulta imprescindible evitar la exposición a temperaturas extremas tanto en la fase aérea como en el substrato. Mediante el empleo de extractores y/o acondicionadores de aire combinados con un sistema de niebla, es posible establecer la temperatura de la fase gaseosa entre los 25 y 30 ºC durante la estación estival, mientras que en la época invernal es necesario, a veces, el empleo de mantas térmicas o serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel del substrato, para mantener la temperatura por encima de los ºC. Sin lugar a dudas, la opción más económica es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia (20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado («saram»). No obstante, en aquellas latitudes donde el nivel medio de luz natural es bajo y los días son cortos durante una parte considerable del año, la luz artificial puede ser aplicada como complemento de la luz natural. Las lámparas tubulares fluorescentes del tipo «luz día» son empleadas en horticultura para prolongar el fotoperíodo. Asimismo, las lámparas tubulares de sodio alta presión presentan una distribución espectral de la energía adecuada para estimular fotosíntesis y se emplean para tal fin en una amplia variedad de cultivos. Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la elección del sustrato; siendo el adecuado aquel que permita el normal crecimiento y desarrollo de las raíces. Se puede emplear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mezclas de ellos, teniendo la precaución de realizar una esterilización previa. Es conveniente el agregado de fertilizantes, ya sea a través del sustrato (fertilizantes de liberación controlada) o bien, mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); empleándose proporciones ricas en fósforo (N-P-K: ) y potasio (N-P-K: ) que favorecerán el desarrollo radicular y la rustificación de las plantas. En todo momento deberá realizarse un riguroso control fitosanitario empleándose antibióticos, fungicidas e insecticidas de uso universal. En la Figura 1, se detalla un modelo de cámara de aclimatación diseñada por los autores y empleada por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botánica del Nordeste. Básicamente, está compuesta por una fase aérea construida en aluminio y policarbonato alveolar (9) y un recipiente o batea (11) que contiene gránulos de arcilla expandida a fin de facilitar el drenaje. Mediante el agregado de arena u otro substrato adecuado, esta cámara puede ser utilizada tanto para el enraizamiento ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa de multiplicación, como así también, para el enraizamiento convencional (a «raíz desnuda») de estacas de tallos u hojas. La humedad relativa de la fase aérea es controlada por un sensor (6) ubicado por encima de la tubería de riego (4). El sistema humidificador está compuesto por picos tipo «fog» y es alimentado por una bomba de bajo caudal y alta presión (13). Con el propósito de evitar el goteo que pudiese ocasionar el agua remanente en las cañerías, el sistema consta de una válvula solenoide de descarga y desagüe (7). La fase gaseosa es renovada en forma intermitente mediante el empleo de extractores ubicados en ambos extremos de la cámara (3) los que, conjunta- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 41

27 7 Agradecimientos Los autores agradecen al Ing. Pablo F. Luna por la planificación digital de la cámara de aclimatación. A la Secretaría General de Ciencia y Técnica (UNNE) y al Establecimiento La Cachuera por el aporte financiero recibido para construir la misma. 8 Lecturas Recomendadas GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEORGE Plant Culture Media. Vol. 1 (Formulations and Uses). Exegetics Limited. England. 567 pág. GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEORGE Plant Culture Media. Vol. 2 (Commentary and analysis). Exegetics Limited. England. 420 pág. HURTADO, D.V. y MERINO, M.E Cultivo de Tejidos Vegetales. Ed.Trillas. México. 232 pág. Figura 1: Diseño de una CÁMARA DE ACLIMATACIÓN mente, introducen o extraen aire, generando un movimiento masal. Debido a la latitud geográfica en que se encuentra, la cámara está equipada con un acondicionador de aire (3000 frigorías) para evitar situaciones de estrés térmico en época estival. A su vez, y dado que la mayoría de las especies estudiadas son originarias de climas tropicales y subtropicales, el sistema cuenta con mantas térmicas que son colocadas por debajo de los tubetes, manteniendo la temperatura del substrato durante el invierno. En este último caso se agrega un material aislante entre la leca (10) y la malla de hierro (16) de tal manera de dirigir el calor hacia la fase aérea. PÉREZ PONCE, J.N Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto de Biología de Plantas.Santa Clara. Cuba. 390 pág. POSPOSILOVA, J.; I. TICHA, P. KADLECEK, D. HAISEL, S. PLZAKOVA Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum 42: ROCA, W.M. y L.A. MROGINSKI (segunda edición). Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Cali, Colombia, 970 pág. TORRES, A.C.; L.A. CALDAS y J.A. BUSO Cultura de Tecidos e Transformacao Genética de Plantas. (Vol.1) Embrapa. Brasil.509 pág. TORRES, A.C.; L.A. CALDAS, y J.A. BUSO Cultura de Tecidos e Transformacao Genética de Plantas. (Vol.2) Embrapa. Brasil.355 pág. 42 MROGINSKI, Luis; SANSBERRO, Pedro; FLASCHLAND, Eduardo

28 II.-Capítulo 3 Herramientas básicas de ingeniería genética Gómez, Marisa; Echenique, Viviana 1 Introducción Hasta aproximadamente 1970 el ADN era la molécula de la célula que planteaba más dificultades para su análisis bioquímico. Excesivamente larga y químicamente monótona, la secuencia de nucleótidos del ADN sólo podía ser estudiada por caminos indirectos, tales como la determinación de la secuencia de proteínas, del ARN o por el análisis genético. Actualmente es posible separar regiones determinadas del ADN, obtener cantidades ilimitadas de esos fragmentos y determinar incluso la secuencia de esos nucleótidos. Estos adelantos técnicos forman parte de la tecnología del ADN recombinante, constituida por una mezcla de técnicas, algunas de las cuales son nuevas, pero otras son adaptaciones de procesos naturales de la genética microbiana que han sido estudiados y se conocen en profundidad. 2 Genética microbiana En los procariotas existen mecanismos de intercambio genético que permiten tanto la transferencia de genes como la recombinación. La recombinación genética en procariotas ocurre porque se transfieren fragmentos de ADN homólogos desde un cromosoma donador a una célula receptora por uno de estos tres procesos: Transformación: es un proceso por cual el ADN libre del medio ambiente se incorpora en una célula receptora, trayendo aparejado un cambio genético. Esto ocurre sólo en algunas especies bacterianas. El movimiento de las moléculas de ADN a través de la membrana y dentro del citoplasma de la célula receptora es un proceso activo, que requiere energía. Una célula que es capaz de tomar una molécula de ADN y ser transformada se dice que es competente. Estas células secretan el factor de competencia, que es una pequeña proteína que induce la síntesis de 8 a 10 nuevas proteínas requeridas para la transformación. Transducción: es un proceso por el cual el ADN se transfiere de una célula a otra por medio de un virus (que en el caso de hospedadores bacterianos se denomina fago). Puede ocurrir de dos maneras. En la llamada transducción generalizada, una fracción del ADN celular, que puede proceder de cualquier porción del genoma del hospedador, pasa a formar parte del ADN de la partícula vírica madura, reemplazando al genoma del fago. En la transducción especializada, que ocurre sólo en algunos fagos atemperados (aquellos que se integran en el genoma como parte de su ciclo biológico), el ADN de una región específica del cromosoma del hospedador se integra directamente en el genoma del fago, reemplazando algunos de sus genes. En ambos casos, la partícula vírica transductora es normalmente defectiva como virus, ya que los genes víricos han sido reemplazados. No todos los fagos pueden transducir, ni todas las bacterias son transducibles. Pero el fenómeno está lo suficientemente extendido para suponer que desempeña un importante papel en las transferencias genéticas que se producen en la naturaleza. Conjugación: es un proceso de transferencia genética que requiere contacto de célula a célula y que está mediado por un plásmido. Consiste en la transferencia de una copia de este plásmido al nuevo hospedador. Sin embargo, otros elementos genéticos resultan a veces movilizados durante la conjugación, como pueden ser otros plásmidos o grandes bloques del cromosoma del hospedador. La conjugación requiere una célula donadora, que contiene un tipo particular de plásmido conjugativo, y una célula receptora que carece de él. El contacto se realiza a través del filamento o pelo sexual, que permite el apareamiento específico y que poseen sólo las células donadoras. Constituye un puente de conjugación a través del cual pasa el ADN. 3 La clonación molecular El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante y la clonación molecular han Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 43

29 aportado sofisticados procedimientos que permiten el aislamiento, purificación y replicación de fragmentos específicos de ADN. La finalidad de la clonación molecular es aislar gran cantidad de genes específicos, en forma pura. El procedimiento implica esencialmente dos etapas (Fig 1): Creación del ADN recombinante, que consta de dos pasos: 1) Aislamiento del ADN de partida. Este puede ser ADN genómico, ADN sintetizado a partir del ARNm por transcripción reversa (ADNc por «copia»), ADN amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa o sintetizado in vitro. Si se parte de ADN genómico, generalmente se corta con enzimas de restricción para obtener los fragmentos a clonar. 2) Unión de los fragmentos de ADN a un vector de clonación utilizando una ligasa de ADN. Un vector es una molécula de ADN que vehiculizará al fragmento de interés. Los vectores de clonación están diseñados de forma tal que permiten la recombinación de ADN foráneo en un sitio de restricción del vector, sin afectar su replicación. A fin de seleccionar las células que incorporaron el vector, el mismo lleva genes marcadores (por ejemplo un gen de resistencia a antibióticos). Introducción del ADN en una célula hospedadora donde se replicará (amplificación): éste es realmente el verdadero evento de clonación, en el cual el ADN recombinante es multiplicado para producir varias copias idénticas. Involucra tres pasos: 1) Introducción y mantenimiento del ADN recombinante en un organismo hospedador. La molécula de ADN recombinante se introduce en el organismo hospedador, que puede ser procariota (bacterias) o eucariota (levaduras, células de mamíferos cultivadas). En el caso de la utilización de sistemas bacterianos, la introducción se realiza por los procesos naturales de la genética microbiana (transformación, transducción, conjugación) o modificaciones específicas de los mismos. También se utiliza ampliamente la introducción del ADN mediante electroporación (descargas eléctricas que crean poros en la membrana celular permitiendo la introducción del ADN). 2) Detección y purificación del clon deseado. La transferencia del ADN al hospedador a menudo genera un grupo de clones que portan el vector. A fin de separar las células que incorporaron el plásmido de las que no lo hicieron se inoculan las células en un medio sólido (agarificado) que contiene el antibiótico al cual son resistentes las células que poseen el vector. Sólo éstas sobrevivirán. Luego deberá buscarse específicamente aquellas células que poseen el fragmento de interés. Para ello puede utilizarse la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación molecular con una sonda específica. 3) Crecimiento y amplificación de las células hospedadoras que incorporaron el ADN recombinante deseado para su aislamiento, estudio, etcétera ADN foráneo a insertar Vector plasmídico Molécula de ADN recombinante Introducción en la célula hospedadora Ligación Gen de resistencia a antibiótico Selección de las células que contienen moléculas de ADN recombinante por crecimiento en presencia de antibiótico Figura 1: Pasos básicos en la clonación de un fragmento de ADN. En primer lugar el ADN a clonar y el vector (plásmido) se cortan con la misma enzima de restricción. Luego se ponen en contacto en presencia de una ligasa para obtener una molécula de ADN recombinante que se introduce en bacterias que multiplicarán el plásmido junto con el fragmento de interés (Modificado de Watson y col., 1992). 44 GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana

30 4 Herramientas y procedimientos implicados. Endonucleasas de restricción La habilidad para clonar cualquier gen o secuencia de ADN de interés, depende, en gran medida, de un tipo especial de enzimas denominadas endonucleasas de restricción, que son enzimas que cortan la molécula de ADN en sitios específicos denominados sitios de restricción. Estas enzimas reconocen secuencias específicas de 4 a 8 bases. Las diferentes endonucleasas de restricción son producidas por distintos microorganismos, para los cuales constituyen un mecanismo de defensa contra el ataque de fagos. Cuando el ADN de un fago ingresa en la célula bacteriana, ésta lo degrada gracias a su batería de enzimas de restricción. Para proteger su propio ADN, las bacterias contienen enzimas (metilasas) que se encargan de modificar (metilar) ciertas bases en los sitios que reconocen sus propias enzimas de restricción, de manera que ya no pueden reconocer dichos sitios de clivaje. La metilación ocurre rápidamente después de la replicación, catalizada por metilasas producidas por el microorganismo. Las enzimas de restricción se denominan utilizando la primera letra del género y las dos primeras letras de la especie que la produce, seguidas por un número que indica el orden en que han sido identificadas las enzimas correspondientes a la misma especie (Tabla 1). Una interesante característica de las enzimas de restricción es que comúnmente reconocen secuencias de ADN que son palíndromes (conjunto de caracteres que se lee de igual manera de derecha a izquierda que de izquierda a derecha). Además producen cortes en las dos cadenas. Muchas enzimas de restricción están compuestas de dos unidades idénticas, cada una de las cuales reconoce y corta una de las cadenas. Como las secuencias reconocidas son relativamente cortas y frecuentemente palindrómicas, tales enzimas siempre hacen cortes en ADN bicatenarios y tales cortes no están sujetos a corrección por enzimas de reparación. Gracias a este mecanismo pueden destruir el ADN extraño. Ciertas enzimas como EcoRI producen cortes escalonados que crean colas cortas de cuatro bases de cadena simple en cada extremo del fragmento. Estas colas tienden a asociarse a una cadena complementaria por apareamiento de bases, por eso se denominan extremos cohesivos o pegajosos («sticky ends») (Fig. 2 A). Los extremos cohesivos pueden unirse permanentemente a secuencias complementarias de otro fragmento con colas producidas de la misma manera (corte con la misma enzima), adicionando la enzima ADN ligasa, que cataliza la formación de nuevos puentes fosfodiésteres y las apropiadas condiciones de renaturalización. Esta cohesividad permite unir fragmentos de ADN no homólogos, una característica de relevancia para la creación del ADN recombinante. Existe otro tipo de enzimas de restricción, como HindII, que cortan el ADN en el centro Organismo Designación Secuencia Nota Bacillus subtilis BsuRI 5..GG CC CC GG..5 Escherichia coli EcoRI 5..G AATTC CTTAA G..5 Escherichia coli EcoRII 5.. CCAGG GGTCC..5 Escherichia coli EcoRV 5..GAT ATC CTA TAG..5 Haemophilus HindII 5..GTPy PuAC..3 influenzae 3..CAPu PyTG..5 Genera extremos romos Genera extremos cohesivos No palindrómica Genera extremos romos Pu: cualquier purina Py: cualquier pirimidina Tabla 1: Secuencias reconocidas y sitios de restricción de diferentes endonucleasas de restricción Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 45

31 Figura 2: Mecanismo de corte del ADN por las enzimas de restricción. a. Corte en secuencias palindrómicas originando extremos cohesivos (ej. enzima EcoRI). b. Corte en el centro de la secuencia de reconocimiento de la enzima, originando extremos romos (ej enzima Hind II). c. Incorporación de extremos cohesivos a un fragmento de extremos romos por la transferasa terminal. (Modificado de Watson y col., 1992). de la secuencia de reconocimiento (en el mismo punto, en ambas cadenas) produciendo extremos romos («blunt-ends»), es decir que las bases están apareadas en sus extremos, y por lo tanto no presentan tendencia para unirse con las bases complementarias (Fig. 2 B). Esto puede solucionarse adicionando extremos cohesivos por medio de la transferasa terminal, enzima que permite adicionar colas de «polia» o «polit», que se comportarán como extremos cohesivos (Fig. 2 C). Vectores de clonación Como se mencionara más arriba, un vector es una molécula de ADN que vehiculizará al fragmento de interés y permitirá su amplificación. Los vectores de clonación más utilizados derivan del genoma viral o de plásmidos bacterianos. Un vector de clonación tiene tres componentes esenciales: 1. Un origen de replicación 2. Un gen marcador fácilmente seleccionable 3. Al menos un sitio único de restricción Los vectores de clonación de última generación son muy prácticos y sencillos de manejar. Incluyen un sitio múltiple de clonación o sitio de restricción múltiple («polylinker»), que es un segmento corto de ADN con muchos sitios de restricción diferentes, cada uno de ellos único para el vector (Fig. 3 A). Este sitio suele formar parte del marco abierto de lectura («ORF») de un gen responsable de alguna característica fenotípica, por lo que resulta sencillo confirmar si tras la restricción y ligado se ha insertado efectivamente un fragmento de ADN, ya que la inclusión de este interrumpe la secuencia del vector, lo cual redunda en la pérdida de funcionalidad del gen mediante inactivación por inserción. Los vectores pueden clasificarse de la siguiente manera: A) Plásmidos: son moléculas de ADN circular, de doble cadena, extracromosómicas, presentes en las bacterias, que poseen propiedades muy útiles como vectores de clonación: 46 GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana

32 Figura 3: Vectores de clonación. a. Sitio de restricción múltiple: corto segmento de ADN con varios sitios de restricción, cada uno de ellos único para el vector. b. Plásmido pbr322 con los sitios de restricción de BamHI y PstI dentro de los genes marcadores (genes de resistencia a la tetraciclina y ampicilina, respectivamente). (Modificado de Watson y col., 1992). 1. Pequeño tamaño que permite mayor facilidad de aislamiento y manipulación. 2. Son circulares, lo que hace que el ADN sea más estable durante su aislamiento químico. 3. Su replicación transcurre independientemente del ADN nuclear en la célula bacteriana. 4. Existen múltiples copias en la célula, dependiendo del plásmido y de la especie hospedadora, puede haber de varias a numerosas copias (por ej a copias de pbr322 por célula). 5. La presencia de genes de resistencia a los antibióticos que actúan como marcadores seleccionables facilita la detección y selección de los clones que los contienen. 6. El tamaño de los insertos que se pueden clonar puede ser considerable; sin embargo, si son mayores de 10 kb, el plásmido se hace generalmente inestable. Aunque en el ambiente natural los plásmidos conjugativos generalmente se transfieren por contacto célula a célula, los plásmidos vectores de clonación generalmente han sido modificados a fin de evitar su transferencia por conjugación y así lograr su contención biológica. Sin embargo, en el laboratorio es posible realizar la transferencia a la célula hospedadora por transformación, utilizando choque de calor, o por electroporación. Los primeros plásmidos utilizados como vectores de clonación existían en forma natural. El plásmido pbr322 constituye una generación posterior de vectores construidos in vitro (Fig 3 B). En este plásmido, el sitio de restricción de BamHI está dentro del gen de resistencia a la tetraciclina, y el sitio para PstI está dentro del gen de resistencia a la ampicilina. Si se inserta un trozo de un ADN en uno de estos sitios, la resistencia al antibiótico conferida por el gen que contiene este sitio se pierde (inactivación por inserción). Por tanto, cuando pbr322 es digerido con BamHI y se liga a un ADN, y luego se aíslan los clones transformados, aquellos transformantes que posean resistencia a la tetraciclina y ampicilina no portan ningún ADN clonado. Aquellas células que continúan siendo resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina, contienen el plásmido con el fragmento del ADN clonado. Como la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina pueden determinarse independientemente en placas con agar, resulta fácil aislar bacterias que contengan los clones deseados y eliminar las células que no los contengan. B) Bacteriófagos o fagos: Fago λ: tiene un mapa genético complejo. Se conoce la secuencia completa de sus pares de nucleótidos y la función de sus genes. El tercio central del cromosoma contiene genes que son requeridos para la lisogenia (estado integrado) pero no para el ciclo lítico (ciclo productivo de nuevas partículas virales). Esa parte central (de aproximadamente 15 kb) del cromosoma puede ser cortada con enzimas de restricción y substituida por un fragmento de ADN foráneo (Fig. 4 A). La molécula resultante de ADN recombinante puede ser empaquetada en las cabezas del fago in vitro. Las partículas Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 47

33 del fago pueden inyectar el ADN recombinante en E. coli, que se replica produciendo colonias bacterianas que contienen los fragmentos a clonar. El fago l silvestre no es indicado como vector de clonación porque tiene demasiados sitios para enzimas de restricción. Para obviar esta dificultad se han construído fagos l modificados (Charon), en los cuales los sitios de restricción no deseados han sido alterados de manera tal que la correspondiente enzima no los reconozca. Es un vector de clonación particularmente útil porque: 1. Se conoce bien su estructura, secuencia y funcionamiento 2. Puede insertar mayor cantidad de ADN que la mayoría de los plásmidos (entre 10 y 20 kb) 3. El ADN puede ser eficientemente empaquetado in vitro dentro de las partículas del fago 4. Las partículas del fago son mucho más eficientes en la infección de las células hospedadoras (transfección) que la transformación. Fago M13: es un fago filamentoso que contiene ADN monocatenario y se replica sin matar a su hospedador. Para poder utilizarlo como vector de clonación es necesario disponer de una forma bicatenaria, ya que las enzimas de restricción sólo trabajan sobre ADN de doble cadena. El ADN bicatenario de M13 puede obtenerse de células infectadas, donde se encuentra en forma replicativa bicatenaria. La mayor parte del genoma del tipo silvestre contiene información genética esencial para la replicación. Existe, sin embargo, una pequeña región llamada secuencia intergénica que puede ser utilizada como sitio de clonación. Es posible clonar ADN de longitudes variables (hasta 5kb), sin afectar la viabilidad del fago. El ADN monocatenario de M13 y de sus vectores derivados ha sido extremadamente útil para secuenciar ADN. Tanto en el fago l como en M13 se ha insertado un fragmento funcional de lacz, el gen de E. coli que codifica para la enzima β- galactosidasa (β-gal), que es utilizado como gen marcador. En el inicio de este gen se ha insertado un sitio múltiple de clonación. Por lo tanto, los fragmentos de ADN clonados en el «polylinker» interrumpen el gen lacz y anulan la actividad de la β-galactosidasa. Cuando esta enzima hidroliza un compuesto químico denominado X-gal, se libera un colorante azul relativamente insoluble. El X- gal se incorpora al medio de cultivo en placa de Petri, donde crecerán las células hospedadoras del ADN recombinante. Si el ADN clonado se insertó en el polylinker y desactivó la β-galactosidasa, no se producirá pigmento azul y las células formarán colonias que se verán blancas en la placa de Petri. En caso contrario, las colonias de las células hospedadoras se verán de color azul. Figura 4: Vectores de clonación. a. Utilización del fagoλ. 1. Dos sitios de restricción EcoRI en el ADN del fagoλ. 2. Región central no esencial del fago 3. El ADN foráneo puede reemplazar al segmento no esencial del ADN del fago 4. Unión con ADN ligasa, se eligen las condiciones para que el ADN híbrido tenga la longitud adecuada para ser empaquetada dentro de la partícula del fago y 5. Empaquetamiento del ADN híbrido añadiendo extractos celulares que contengan las partículas de la cabeza y cola para permitir la formación de partículas viables del fago. b. Cromosoma artificial de levadura (YAC). ARS: origen de replicación, CEN: centrómero, TEL: telómeros, URA. gen marcador seleccionable par el desarrollo en medio con uracilo. Modificado de Watson et al., 1992). c. Cromosomas artificiales de bacterias (BAC) (Modificado de Griffith et al., 2000). a C 48 GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana

34 C) Cósmidos: Son vectores híbridos, que combinan las características ventajosas de los plásmidos bacterianos y del fago λ. Cos proviene de sitio cohesivo («cohesive site»), en referencia a las secuencias terminales de simple cadena de 12 bases complementarias en el cromosoma de λ maduro. El sitio cos es reconocido por el sistema de empaquetamiento de ADN de λ, que hace cortes escalonados que originan los extremos cohesivos complementarios en el cromosoma maduro del fago. Poseen la habilidad del plásmido para replicarse autónomamente en las células de E. coli y la capacidad de empaquetamiento in vitro del cromosoma de λ. Contienen el origen de replicación y los genes de resistencia a los antibióticos de su plásmido parental. La principal ventaja de los cósmidos como vectores es su habilidad para insertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb. D) Fásmidos (fagémidos): Son vectores que combinan las características de un fago filamentoso (M13) y un plásmido (pbr323) y contienen tanto el origen de replicación del fago como del plásmido. Normalmente la replicación depende del plásmido, pero cuando una célula que contiene un fásmido se infecta con un fago de tipo silvestre, el origen del fago es responsable de la replicación y se generan copias monocatenarias. Este ADN monocatenario es empaquetado en viriones y puede aislarse fácilmente y ser utilizado para secuenciar. Habitualmente, los fásmidos pueden transportar de forma estable un fragmento de ADN clonado mayor que un vector típico derivado de M13. E) Cromosomas artificiales: Estos vectores se desarrollaron con el objetivo de clonar grandes segmentos de cromosomas eucarióticos. En la preparación de mapas físicos de genomas se utilizan vectores como los cósmidos, los YAC (cromosomas artificiales de levaduras), los BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y los PAC (cromosomas artificiales basados en el fago P1). Los YAC son minicromosomas de levadura creados por ingeniería genética que pueden contener insertos de ADN de 200 a 500 kb (Fig. 4 B) y contienen un origen de replicación y un centrómero de levadura, dos telómeros en los extremos del cromosoma, un marcador seleccionable y un sitio múltiple de clonación. Los BAC se basan en el plásmido F de 7kb de E. coli y pueden llevar insertos de 300 kb, aunque el promedio es de 100 kb (Fig. 4 C). Los PAC son equivalentes. Aunque los BAC y los PAC aceptan fragmentos menores que los YAC tienen algunas ventajas: Figura 5: Método de hibridación de Southern. a. Inclusión del ADN en el gel de agarosa. b. las moléculas de ADN migran a través del gel dependiendo de su tamaño y forma, c. transferencia de las moléculas de ADN del gel a una membrana por capilaridad (S. Solución tampón, M: mecha, A gel de agarosa, N: membrana de nitrocelulosa, P: papel de filtro y peso), d. incorporación de la sonda e hibridación con las moléculas de ADN, f: detección por autorradiografía, contacto de la membrana con el filme autorradiográfico, g: revelado de la autorradiografía, observación de las bandas hibridadas. (Modificado de Micklos et al., 1990). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 49

35 1. Son menos complejos y por lo tanto más fáciles de construir. Pueden amplificarse en bacterias y manipularse con la tecnología básica de los plásmidos bacterianos. 2. Contienen menor cantidad de insertos híbridos (insertos compuestos por dos o más fragmentos no contiguos en el genoma) que los YAC. Estos insertos híbridos pueden entorpecer los intentos de ordenar los clones Por estos motivos los BAC han reemplazado a los YAC como vectores en la construcción de mapas físicos de cromosomas enteros. Estos vectores simplifican mucho el proceso de secuenciación, ya que aún organismos simples como el nemátodo Caenorhabditis elegans poseen enormes cantidades de ADN (100 Mb). En este caso se necesitarían cósmidos para contener el genoma completo (el inserto promedio de un cósmido es de 40 kb). Los YAC pueden aceptar 1Mb, por lo cual el proceso se simplifica. 5 Análisis molecular de ADN, ARN y proteínas: hibridación. La hibridación es la construcción artificial de un ácido nucleico bicatenario por apareamiento (emparejamiento) de bases complementarias de dos ácidos nucleicos monocatenarios. Para que exista la formación de híbridos estables debe haber un alto grado de complementaridad. Se define formalmente como sonda («probe») a un fragmento determinado de ARN o ADN marcado química o radiactivamente, utilizado para localizar determinadas secuencias de ácidos nucleicos mediante hibridación. Análisis de ADN por hibridaciones Southern Blot La electroforesis en gel es una poderosa herramienta para separar macromoléculas de diferentes tamaños y cargas. Las moléculas de ADN tienen esencialmente una carga constante por unidad de masa, por lo tanto se pueden separar en geles de agarosa o acrilamida, casi completamente, sobre la base de su tamaño o conformación. Los geles de agarosa o acrilamida actúan como tamices moleculares, retardando el pasaje de las moléculas más grandes en relación con las más pequeñas. Los geles de agarosa actúan como mejores tamices para las moléculas más grandes, mientras que los de acrilamida separan mejor las moléculas pequeñas. Los procedimientos utilizados, para separar ácidos nucleicos y proteínas tienen el mismo principio, pero involucran algunas diferencias de técnicas debidas a las características particulares de cada clase de moléculas. En 1975 E. M. Southern, publicó un nuevo procedimiento que permitió a los investigadores ubicar los genes y otras secuencias de ADN sobre fragmentos de restricción separados por electroforesis en gel. La principal característica de esta técnica es la transferencia de las moléculas de ADN que han sido separadas por electroforesis en gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. Esta transferencia se denomina Southern Blot, en honor al científico que desarrolló la técnica (Fig. 5). Para realizarla, el ADN es desnaturalizado (abierto en sus dos cadenas), sea antes o durante la transferencia, ubicando el gel en una solución alcalina. Una vez completada la transferencia, el ADN es inmovilizado sobre la membrana por exposición a elevada temperatura o a radiación UV. Una sonda de ADN conteniendo la secuencia de interés es entonces incubada con el ADN inmovilizado. La sonda sólo va a hibridar con moléculas de ADN que contienen la secuencia de nucleótidos complementaria a su secuencia. El excedente de sonda no hibridada se elimina mediante repetidos lavados de la membrana. Las sondas pueden marcarse por diferentes métodos: con elementos radioactivos, por métodos químicos que producen color o luminiscencia, etc. Luego de la hibridación, la membrana se somete a diferentes procedimientos para poner en evidencia la sonda, de acuerdo al método con el que haya sido marcada. Análisis de ARN por transferencia e hibridación: Northern Blot De manera similar al tratamiento realizado con las moléculas de ADN, las moléculas de ARN también pueden ser separadas por electroforesis en geles de agarosa, transferidas a membranas y analizadas. La transferencia de ARN se denomina Northern blot, en reconocimiento al hecho de que el procedimiento es la imagen de espejo de la técnica Southern blot. Ambos procedimientos son esencialmen- 50 GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana

36 Figura 6: Reacción en cadena de la polimerasa. a) Los tres pasos de un ciclo de PCR. En primer lugar se eleva la temperatura de la reacción para separar las hebras de ADN (1) y a continuación la temperatura baja nuevamente, lo que permite que los cebadores o primers se peguen a las regiones adecuadas de la hebra de ADN (2), y entonces se ensamblan, actuando como límites de la región de la molécula que va a ser duplicada. Para terminar, se eleva la temperatura nuevamente y la Taq polimerasa comienza a copiar (3), y sobre la plantilla crece una hebra nueva complementaria (4). Después de varios ciclos se obtienen múltiples copias del fragmento en cuestión. b) La PCR es una reacción donde el número de copias del gen de interés crece exponencialmente. c) Verificación de un producto de PCR sobre un gel de agarosa. En primer calle se observa un producto de aproximadamente 1850 pares de bases (bp) de longitud, en la calles 2 y 4 fragmentos de 800 bp, en la calle 3 falló la amplificación y en la calle 5 se han formado tres bandas debido a que el primer ha encontrado complementariedad en más de un sitio en el genoma. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 51

37 te idénticos. Sin embargo, las moléculas de ARN son muy sensibles a la degradación por ARNasas. Por lo tanto, se debe tener mucha precaución para evitar la contaminación de los materiales con estas enzimas. Además, la mayoría de las moléculas de ARN contienen estructuras secundarias (producidas por apareamiento complementario intracadenas), por lo tanto deben mantenerse desnaturalizadas durante la electroforesis para poder separarlas sobre la base de su tamaño. La desnaturalización se provoca incorporando formaldehído u otro químico desnaturalizante a la solución tampón («buffer») utilizada en la electroforesis. Después de la transferencia a la membrana apropiada, las moléculas de ARN pueden hibridar con sondas de ADN o ARN. Análisis de proteínas por transferencia e inmunodetección o Western Blot La electroforesis en gel de poliacrilamida es una herramienta muy importante para la separación y caracterización de proteínas. Debido a que muchas de las proteínas están compuestas por dos o más subunidades, los polipéptidos individuales son separados por electroforesis en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS), que desnaturaliza las proteínas. Los polipéptidos separados por electroforesis también pueden ser transferidos del gel a una membrana de nitrocelulosa y pueden ser detectados utilizando anticuerpos específicos. Esta transferencia de proteínas se denomina Western blotting y se realiza utilizando una corriente eléctrica para trasladar las proteínas del gel a la superficie de la membrana. Después de la transferencia, la proteína de interés es identificada colocando la membrana con las proteínas inmovilizadas en una solución que contiene un anticuerpo contra esa proteína. El anticuerpo está conjugado (marcado) ya sea con isótopos radioactivos, que permiten la detección por autorradiografía, o con enzimas que producen un producto visible cuando se adiciona el sustrato correspondiente. 6 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR es una tecnología poderosa que involucra la síntesis enzimática in vitro de millones de copias de un segmento específico de ADN. La reacción se basa en la hibridación y extensión de un par de oligonucleótidos, sintetizados artificialmente, utilizados como iniciadores o cebadores (primers) que delimitan una secuencia de ADN de doble cadena que se desea amplificar. Un ciclo de PCR comprende tres etapas (Fig. 6): desnaturalización de la doble cadena, unión de una secuencia de ADN (primer) a la hebra simple y replicación del ADN a partir del primer. La doble cadena de ADN se desnaturaliza por elevación de la temperatura a 92-95º C. Luego la temperatura se baja rápidamente a 35-60ºC, dependiendo del tamaño y secuencia del oligonucléotido utilizado, permitiendo la hibridación ADN-ADN de cada primer con las secuencias complementarias que flanquean la región objetivo. Luego, se eleva la temperatura a 72º C para que la Taq polimerasa (una ADN polimerasa termoresistente aislada de Thermus aquaticus, bacteria que vive en fuentes termales) realice la replicación a partir de cada extremo 3 de los primers. Este ciclo es repetido por algunas decenas de veces y, como el producto de cada polimerización sirve como molde para el siguiente, cada ciclo duplica la cantidad de producto del anterior. El resultado de la reacción es un fragmento de ADN de doble cadena, cuyos extremos corresponden a los extremos 5 de los primers y su tamaño a la distancia entre los mismos. A pesar de que se forman moléculas más largas a partir del molde original en cada ciclo, se acumulan solo a una tasa lineal y no contribuyen significativamente a la masa final de secuencia blanco. Después de apenas 20 ciclos se logra más de un millón de veces la cantidad inicial de la secuencia de interés. Esta escala de amplificación permite, por lo tanto, iniciar el proceso con cantidades mínimas de ADN (del orden de pico o nanogramos) y terminar la reacción con grandes cantidades de una secuencia de interés. La versatilidad de esta reacción es enorme y la combinación de la PCR y la secuenciación constituye una poderosa herramienta para el análisis de genes. La tecnología de PCR es de suma utilidad para amplificar ADN a partir de fragmentos clonados en distintos vectores. Solo se nece- 52 GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana

38 sita un par de iniciadores complementarios a los sitios del vector que flanquean el fragmento para amplificar cualquier fragmento independientemente de su secuencia. Puede amplificarse ADN de material embebido en parafina por varios años, de material momificado, de restos fósiles, etc. Se utiliza para detectar enfermedades genéticas, determinar el sexo en embriones humanos, para clonar genes, para mutagénesis in vitro y para mapeo y secuenciación de genomas, entre otras aplicaciones. RT-PCR La reacción de PCR en unión con la transcripción reversa (RT-PCR) puede ser utilizada para el estudio de ARNm casi a nivel de una célula individual. Esta técnica puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un transcripto, para estimar el nivel de su expresión y para el clonado de ADNc sin la necesidad de construir una genoteca. Consiste en la síntesis de una cadena de ADN a partir de ARNm por medio de la transcriptasa reversa (enzima extraída de virus tumorales cuyo material genético es ARN), que utiliza ARN como molde para sintetizar una hebra de ADN. La cadena complementaria se sintetiza por PCR. Subsecuentes ciclos de PCR nos permiten tener cantidades apropiadas del ADNc para diversas manipulaciones genéticas. PCR cuantitativa La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar el nivel de amplificación de una secuencia de interés, con el objeto de estimar la cantidad de esa secuencia en la muestra original. Para llevar a cabo esta detección existen varios métodos pero casi todos basados en la utilización de otro fragmento de ADN (sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que se quiere amplificar. Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra molécula que inhibe esta fluorescencia («quencher»), de tal forma que sólo cuando la sonda es desplazada de su sitio por acción de la ADN polimerasa la molécula fluorescente se libera de la acción del «quencher» y emite fluorescencia al ser iluminada con un láser. La fluorescencia detectada durante cada ciclo de la PCR será proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando. En general para que sea válida esta técnica requiere realizar en paralelo una curva patrón en las mismas condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se está amplificando. Existen varios tipos de PCR cuantitativa. La más moderna y sofisticada es la llamada PCR en tiempo real. PCR en tiempo real La PCR en tiempo real es una técnica que ha ganado mucha importancia en los últimos años debido a que ofrece la posibilidad de cuantificar el número de copias de un transgen incorporadas en un genoma. Como se explicara más arriba, se basa en la detección de un informador fluorescente cuya señal aumenta en proporción directa con la cantidad de producto de PCR en la reacción. Se emplea un ciclador térmico que tiene acoplado un sistema de detección capaz de captar y cuantificar la señal emitida por el informador al final de cada ciclo. Se pueden utilizar diferentes reactivos fluorescentes como agentes intercalantes (SYBR green ) que se unen a la doble cadena de ADN dando un incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad del producto de PCR. También se pueden emplear sondas que tienen unidas un fotocromo informador y un fotocromo «quencher» (TaqMan ). Cuando ambos fotocromos están unidos a la sonda, el informador no emite señal, pero cuando ésta hibrida con la secuencia de interés, durante la reacción de PCR, la enzima Taq polimerasa, mediante su actividad de exonucleasa, cliva al fotocromo informador, liberándolo del resto de la sonda y permitiendo la emisión de una señal fluorescente. Se monitorea esta señal que se va acumulando en los sucesivos ciclos de PCR. De este modo, es posible estimar la cantidad de la secuencia original expresada en número de copias por genoma o en unidad de masa. En la Parte IX, Capítulo 4, se detalla más este punto y se aplica esta técnica para la detección de organismos genéticamente modificados (OGM). 7 Genotecas Una genoteca («gene library») es una colección de fragmentos de ADN clonados que representan en su conjunto el ADN to- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 53

39 tal de un organismo de interés o bien el ADNc, que representa el conjunto de genes que se están expresando en un órgano o tejido determinado o bajo una situación particular o momento de crecimiento o desarrollo. En el primer caso hablamos de una genoteca genómica, donde se encuentran todas las secuencias que se expresan y no se expresan en el organismo y en el segundo de una genoteca de ADNc, donde se encuentran sólo las secuencias expresadas. Estas genotecas carecen de un catálogo a través del cual se pueda saber cuál es el clon que contiene una secuencia de interés. Por ello es necesario realizar un relevamiento de todas las colonias utilizando una sonda con la secuencia de ácido nucleico que tenga que sea complementaria a la secuencia o gen buscados. Parte de esta secuencia puede ser conocida o puede deducirse de la secuencia de aminoácidos de la proteína purificada. Alternativamente, puede buscarse la proteína producida por un gen clonado usando anticuerpos contra la proteína o a través de un análisis funcional. Una de las principales dificultades en el clonado de ADN genómico es que algunas secuencias están representadas una sola vez en el genoma y es difícil hallarlas. Para obviar esta dificultad puede clonarse directamente el ADNc, ya que el número de copias del ARNm en el tejido es más elevado. El problema se plantea cuando no se sabe en qué circunstancias o en qué tejido se expresa un gen en particular. Pero existen varias formas de determinarlo. Actualmente es posible clonar un ADNc a partir de mensajeros poco abundantes en la célula, con concentraciones de 1 a 2 moléculas por célula. Genotecas de ADNc El primer paso en la construcción de una genoteca de ADNc consiste en el aislamiento del ARN del cual es posible separar el ARNm tomando ventaja de la característica cola de poliadeninas que posee en su extremo 3. Para ello se empaqueta en una columna de celulosa a la cual se unen oligonucleótidos compuestos sólo por desoxitimina oligo(dt), a través de la cual pasa el ARN quedando el mensajero unido a la timina a través de la cola de polia. Este es luego eluido de la columna utilizando una solución tampón adecuada. Estas colas de polia también son utilizadas en el próximo paso de clonado. La reacción consiste en poner en contacto el ARNm aislado con oligo(dt) de 12 a 20 desoxitiminas que actúan como cebadores o primers para la transcriptasa reversa. El producto de la reacción es un híbrido ARN-ADN. El problema que tiene esta técnica es que si el ADNc es muy largo, al comenzar en el extremo 3, muchas veces no se llega al extremo 5. Para salvar esta dificultad existe otra técnica donde se utilizan primers al azar. Estos constan de 6 a 10 nucleótidos de longitud y están confeccionados de manera de representar muchas secuencias diferentes, por lo que la reacción comienza a partir de muchos sitios diferentes, no sólo del extremo 3. Por cualquiera de los dos métodos se obtiene un híbrido ARN-ADN, a partir del cual se obtienen moléculas de ADN de doble cadena que puede clonarse en el vector apropiado. El primer método desarrollado para obtener la segunda cadena tomaba ventaja de una «vuelta» o «giro» que da la hebra recién sintetizada, como un efecto de cambio de rumbo de la transcriptasa reversa al llegar al final de la cadena de ARN. Este artefacto provee un cebador adecuado para la síntesis de la segunda cadena de ADN y puede eliminarse una vez obtenida la segunda cadena, con una nucleasa S1, perdiéndose parte de la secuencia correspondiente al extremo 5 del mensajero. Existe una segunda técnica, que presenta dos ventajas sobre la anterior. Una es que genera moléculas de ADNc más largas y la segunda es que contiene prácticamente toda la secuencia correspondiente al extremo 5. Se basa en la utilización de la enzima RNasaH, que reconoce moléculas híbridas ARN-ADN y digiere la cadena de ARN dejando trozos pequeños que permanecen unidos a la primera cadena del ADNc y sirven como primers para la ADN polimerasa I, que usa el ADNc original como molde para sintetizar la hebra complementaria de ADN. Sólo queda un pequeño segmento de ARN en el extremo 5. La segunda cadena de ADN tiene algunos sectores no unidos que son sellados por una ligasa de ADN. Estas moléculas de ADNc de doble cadena están listas ahora para ser insertadas en 54 GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana

40 un vector, que puede ser un plásmido o un derivado del fago l. Para ello se utiliza la transferasa terminal, que adiciona colas de polia o polit, o se agregan adaptadores, que son sitios artificiales de reconocimiento de alguna enzima de restricción que se unen a los extremos de la secuencia. Se trata de oligonucleótidos artificiales (8-12 bp) que se unen al fragmento utilizando una ligasa de ADN y son cortados con la enzima de restricción apropiada (Fig. 7 a). Ambos procedimientos sirven para generar extremos cohesivos a fin de unir el fragmento al vector, que posee extremos cohesivos cortados por la misma enzima. Los plásmidos son introducidos en bacterias por transformación (choque térmico o electrofusión), y se seleccionan por la característica del gen marcador del plásmido. Si se trata de fagos, los vectores son empaquetados in vitro para formar partículas víricas, que introducirán su ADN en el hospedador apropiado por infección de un césped de bacterias crecido sobre la superficie de una placa de agar (Fig. 7 a). Si bien los vectores plasmídicos son más fáciles de manipular, las genotecas construidas en los fagos po- Figura 7: Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. a) Para ello se le deben adicionar hebras de cadena simple complementarias a los sitios de restricción del ADN del fago. El ADN del fago se prepara cortando con una enzima de restricción, en este caso EcoRI, y se purifican los dos brazos del fago. Mientras tanto se adicionan al ADNc los adaptadores que llevan sitios EcoRI. Para ello se utiliza una ligasa. Previamente, el ADN se trata con una metilasa, que metila los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción, a fin de protegerlo de la acción de la enzima. Los adaptadores se cortan con la enizma de manera de generar extremos cohesivos que puedan acoplarse con el ADN del fago, cortado con la misma enzima. Se genera así una serie de moléculas recombinantes dispuestas en tandem, flanquedas por los sitios cos. Este ADN recombinante se empaqueta formando partículas infecciosas del fago, que se utilizarán para infectar un césped de bacterias. Esto se visualizará como placas o calvas. Cada placa surge de una molécula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. b) Una vez construída la genoteca puede localizarse un gen en la misma por hibridación con una sonda marcada apropiadamente (Modificado de Watson et al., 1992). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 55

41 seen fragmentos de mayor tamaño. Como resultado del cultivo en placa (plaqueo) de la genoteca, se obtienen cientos de miles a un millón de placas de fagos (zonas claras o de lisis resultado de la producción de particulas víricas) o, en el caso de vectores plasmídicos, colonias bacterianas, cada una conteniendo un fragmento clonado, distribuidas sobre la placa de agar. A fin de realizar la búsqueda de un gen particular («screening»), la genoteca es replicada en membranas de nylon o nitrocelulosa, de manera tal que el patrón de placas en la caja original se vea exactamente reproducido en la membrana de nylon o filtro (Fig. 7 B). Búsqueda del gen clonado: Elección de la sonda La búsqueda se lleva a cabo por hibridación con una sonda de ácido nucleico, lo cual requiere un conocimiento previo de la secuencia de interés. En algunos casos, donde parte del gen ha sido clonado, este se utiliza para buscar las partes faltantes. Si se usa una sonda donde la homología es completa, el «screening» puede realizarse en condiciones de alta rigurosidad (es decir, con lavados más fuertes, temperatura elevada y concentración salina baja, que tienden a despegar lo que se ha unido inespecíficamente). Si la sonda no es completamente homóloga el «screening» deberá realizarse a menores temperaturas y utilizando concentraciones salinas más elevadas en los lavados. Si no se tiene conocimiento previo de la secuencia puede construirse una sonda a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Cuando se utiliza esta estrategia, el tamaño mínimo de la sonda debe ser de 15 a 16 nucleótidos (que permite encontrar secuencias únicas en genotecas de ADNc eucarióticos. Generalmente se utilizan sondas de 17 a 20 nucleótidos (correspondientes a 6 aminoácidos contiguos). Otra consideración a tener en cuenta cuando se construye la sonda es que existe más de un codón o triplete para definir la mayoría de los aminoácidos (es lo que se conoce como la «degeneración» del código genético), por lo que un aminoácido puede estar especificado por hasta 6 codones diferentes. Por ello, estas sondas oligonucleotídicas están constituidas por una mezcla de todas las combinaciones posibles. Una de ellas corresponderá a la secuencia correcta del gen buscado. El problema de esta estrategia es el elevado número de falsos positivos que pueden dar las secuencias adicionales. Una variante consiste en usar un menor número de oligonucleótidos o uno solo pero de mayor longitud (35-75 nucleótidos), eligiendo una región de la proteína que contenga el menor número posible de codones degenerados, utilizando el conocimiento de los codones más probables para la especie en estudio. Existen otras técnicas para localizar genes en las genotecas de ADNc, como hibridación diferencial, si se trata de genes expresados en diferentes tejidos o la utilización de sondas de regiones conservadas en familias de proteínas para encontrar genes relacionados o bien la utilización de vectores de expresión. Genotecas Genómicas Un genoteca genómica puede obtenerse de cualquier tejido, ya que todas las células de un organismo tienen la misma constitución genética. Como se mencionara previamente, se encuentran en ella no sólo secuencias expresadas y no expresadas sino también las correspondientes secuencias regulatorias. Pueden utilizarse fagos como vectores, pero sucede que muchos de los genomas eucariotas son muy grandes, por ejemplo el de mamíferos contiene 3x10 9 pb de ADN. Si el promedio típico de inserto es de pb, se necesitarán unos fagos para contener el genoma completo. Para asegurar que todas las secuencias estén representadas al menos una vez, los cálculos estadísticos dicen que deberán analizarse aproximadamente de 1 a 2 millones de fagos. Muchos genes eucarióticos tienen más de 1000 kb, por lo que deben ser clonados como un conjunto de fragmentos parcialmente superpuestos. Para esto pueden utilizarse cósmidos, que pueden contener unas 45 kb. Para hacer una genoteca con estos vectores el ADN se corta con enzimas de restricción de manera de dejar fragmentos de tamaño apropiado. El cósmido se empaqueta in vitro en fagos que se usan para infectar E. coli. Una vez dentro de la célula el cósmido se replica y puede recuperarse de la célula como un plásmido. 56 GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana

42 Cuando se trata de genomas muy grandes, como es el caso del humano o de varias especies vegetales y animales la utilización de cósmidos resulta ineficiente. Por ello en estos casos se utilizan los YAC y BAC. A) Genotecas genómicas en cromosomas artificiales La capacidad de clonar fragmentos de más de 100 kb es crucial para la genómica estructural, funcional y comparativa de organismos complejos. El primer sistema de clonado de grandes fragmentos de ADN fue informado en 1987 por Burke y colaboradores. Este sistema estaba basado en YAC, que permitían clonar y mantener fragmentos de más de 1000 kb en levaduras. Debido a esta ventaja el sistema fue rápidamente adoptado para los proyectos de genómica. Sin embargo, tienen algunos problemas que limitan su utilización, como el alto nivel de quimerismo o insertos híbridos (artefacto que resulta de la unión de fragmentos no contiguos en el genoma original en un mismo clon), la inestabilidad de los insertos y la dificultad de purificar los insertos clonados. Para minimizar estos problemas se desarrollaron sistemas alternativos que utilizan bacterias en lugar de levaduras: los BAC y los PAC, que son vectores de clonación de copia simple. Cuando se los utiliza para transformar plantas se los llama BIBAC. BAC y PAC pueden contener establemente fragmentos mayores de 300 kb en E. coli. Para preparar una genoteca genómica, el ADN se corta con enzimas de restricción o, para evitar la presencia de fragmentos demasiado largos o cortos, se fragmenta al azar. Un paso crítico en el proceso es el aislamiento de moléculas intactas de ADN de elevado peso molecular, esencialmente ADN cromosómico. Para ello las células se embeben en bloques de agarosa de baja temperatura de gelificación y se tratan con en-zimas y otros Figura 8: Búsqueda de imágenes en una genoteca genómica. Utilización de la reacción en cadena de la polimerasa para buscar un gen específico en una genoteca de BACs. Las 180 placas de cultivo, de 96 pocillos, contienen un genoma vegetal completo. Estas placas se replican, de a 4, en filtros o membranas. Todos los clones de un mismo filtro son juntados y varios de estos conjuntos de clones son agrupados para preparar agrupaciones de conjuntos. El ADN de estos conjuntos se aisla y se amplifica por PCR utilizando primers específicos para el gen de interés. Como control positivo se utiliza un ADN vegetal, también amplificado por PCR. La reacción se analiza sobre un gel de agarosa. Un resultado positivo indica la presencia del gen en el ADN genómico del vegetal y también en uno de los clones. En este caso en el conjunto que contenía los filtros 1-3. Cuando se chequean los conjuntos individuales se encuentra que el clon positivo pertenece al filtro 1. El producto de PCR se hibrida luego con este filtro y esto nos dará la posición exacta en la placa de 96 pocillos donde se encuentra el gen de interés (Modificado de Watson et al., 1992). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 57

43 reactivos para separar el ADN de las proteínas celulares y del RNA. La función del bloque de agarosa es proteger a las grandes moléculas, que, embebidas en esta matriz, se someten a la digestión con enzimas de restricción que realicen cortes poco frecuentes («rare cutters»). La preparación de ADN de alta calidad en plantas es más complicada que la correspondiente para el caso de animales debido a la presencia de la pared celular, que dificulta el embebido en agarosa de bajo punto de gelificación. Para obviar esta dificultad se aíslan los núcleos y se trabaja con ellos directamente. Si se desea separar estos fragmentos por electroforesis, los bloques de agarosa conteniendo el DNA digerido pueden ser directamente embebidos en la matriz del gel que se correrá. B) Separación de grandes trozos de ADN: electroforesis de campo pulsátil Las técnicas estándares de separación de ADN en geles de agarosa no son adecuadas para moléculas mayores de 10 kb. Esta limitación ha sido subsanada con una técnica llamada electroforesis de campo pulsátil, por la cual el campo eléctrico que conduce a las grandes moléculas de ADN a través del gel cambia periódicamente de orientación. De esta manera pueden separarse moléculas tan grandes como los cromosomas de levaduras (200 a 3000 kb) (ver VII.-1). La separación de las moléculas de este tamaño depende de su relativa facilidad o dificultad para reorientarse en respuesta a direcciones cambiantes de un campo eléctrico. Esta técnica puede utilizarse para hacer mapas físicos a gran escala. C) Preparación de una genoteca de BAC El procedimiento consiste en 4 pasos, preparación del vector, aislamiento y digestión del ADN y selección de los fragmentos por tamaño, transformación de las bacterias y ensamblado de la genoteca El vector debe estar bien purificado, digerido y defosforilado (cuando se corta con una sola enzima, se eliminan los fosfatos terminales, para evitar la recircularización). La digestión del ADN es crítica para obtener fragmentos adecuados para clonar. Los fragmentos son seleccionados por electroforesis de campo pulsátil y se separan de la matriz de agarosa por digestión de la misma con agarasa o gelasa, o por elución del ADN desde el gel. Esto permite construir genotecas con fragmentos de tamaños similares, de aproximadamente 150 kb. Estas genotecas de grandes insertos son consideradas recursos de largo plazo para investigación genómica y deben ser mantenidas continuamente, especialmente cuando son utilizadas para proyectos de secuenciado y mapeo a gran escala. En general, cuando se va a construir una genoteca debe elegirse cuidadosamente el genotipo de la especie utilizada como fuente de ADN, el tipo de inserto, etc. ya que la misma puede utilizarse para variados propósitos. Si en lugar de una genoteca de BAC se hace una de BIBAC, se tiene la ventaja adicional de poder usar directamente los fragmentos para transformar plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens En la Fig. 8 se esquematiza la búsqueda de un gen en una genoteca de BAC. Más detalles acerca del ensamblado de los distintos fragmentos clonados pueden encontrarse en el capítulo correspondiente a genómica. Genotecas de cromosomas específicos o de segmentos de cromosomas Cuando se busca un gen que se sabe está ubicado en un cromosoma específico simplifica mucho el trabajo hacer una genoteca de ese cromosoma solamente. Se trata de una técnica que permite separar cromosomas metafásicos teñidos con un colorante fluorescente (Hoechst 33258) (para regiones ricas en AT) y cromomicina A (para regiones ricas en GC) y tratados de manera que el ADN no se desnaturalice. Los cromosomas teñidos fluorescerán cuando se expongan a luz UV (de longitudes de onda de 361 y 363 nm) (Hoechst 33258) o 458 nm (cromomicina A). Las cantidades y proporciones de colorantes varían para cada cromosoma y una computadora reconoce el patrón fluorescente típico de cada cromosoma. Algunos cromosomas son muy similares, por lo que no pueden ser separados. Se necesita un millón de cromosomas para hacer una genoteca. Equipos automáticos pueden hacer este trabajo en unas pocas horas. También puede microdisectarse un cromosoma, tomando un segmento del mismo que tenga la región de interés. En principio se utilizó esta técnica para cromosomas 58 GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana

44 grandes, fácilmente distinguibles por microscopía de contraste de fase. Actualmente, la combinación con PCR posibilita la aplicación de la técnica a cualquier cromosoma. Estos son teñidos con Giemsatripsina y las bandas deseadas son cortadas con agujas de vidrio ultrafinas y clonadas. Primers posicionados en el vector permiten amplificar secuencias desconocidas. El ADN amplificado se clona en un vector apropiado y la localización cromosó-mica de cada clon se determina utilizando hibridación in situ (ver III.5) 8 Secuenciación Una vez que se ha obtenido el clon con el fragmento de interés, el paso siguiente es secuenciarlo. La determinación de la secuencia puede realizarse por el método químico de Maxam y Gilbert o por el método enzimático de Sanger. El primero consiste en la utilización de un compuesto que destruye selectivamente una o dos de las 4 bases que constituyen el ADN. Se realizan 4 reacciones de síntesis de ADN, marcando un extremo de las moléculas, dependiendo de la base a destruir (G, A+G, T+C, C). De esta forma, se generan fragmentos de distinto tamaño en función de la distancia de la base destruida al extremo marcado radiactivamente del fragmento a secuenciar. Los productos de las 4 reacciones se corren lado a lado en un gel de poliacrilamida y la secuencia del fragmento se determina a través del patrón de bandas, después de efectuada una autorradiografía para revelarlas. El método de Sanger, se basa en el mismo principio y consiste en preparar 2,3 didesoxinucleótidos (ddntp) de cada una de las 4 bases. Estas moléculas pueden ser incorporadas al ADN por el ADN polimerasa de E.coli porque tienen un 5 trifosfato normal, pero no pueden formar un enlace fosfodiéster con el nucleótido siguiente, por lo que el crecimiento de la cadena se detiene. En la mezcla de la reacción se incluye la cadena a secuenciar, una proporción controlada de uno de los 4 ddntp con su desoxinucleótido normal y los otros 3 dntp. Cuando se agrega polimerasa la reacción comienza a partir del primero hasta que se introduce en la cadena un ddntp, con lo cual su crecimiento cesa. Con una proporción correcta ddntp:dntp, se generan una serie de fragmentos de distinta longitud, dependiendo de la distancia de la última base incorporada al extremo marcado del ADN. Estos fragmentos son separados en un gel de poliacrilamida, donde, previa autorradiografía, se determina el patrón de bandas, que refleja la secuencia del ADN. Al principio, la posición de cada banda revelada en la película radiográfica se anotaba manualmente, luego, los digitalizadores de imágenes posibilitaron la lectura directa de la película. Existen actualmente secuenciadores automáticos que realizan la electroforesis en gel y determinan automá-ticamente la secuencia utilizando un sistema de detección con láser. Messing desarrolló una serie de vectores de clonado basados en el fago filamentoso M13, muy útiles para el secuenciado enzimático. La ventaja es que sólo una de las cadenas del vector es empaquetada en las cabezas del fago (ver Vectores de clonación). Este ADN de simple cadena es ideal para utilizar con el método de Sanger. Clonando el inserto en M13, en las dos orientaciones posibles, se obtiene una o la otra hebra del ADN a secuenciar. Para ello se utiliza un primer que se posiciona en un lugar adyacente a la región de policlonado de M13, que se llama «primer universal», ya que se puede utilizar para secuenciar cualquier clon recombinante. Actualmente se utilizan fásmidos (ver Vectores de clonación). La adición de un «fago ayudante» («helper phage») a las células que lo contienen, hace que el ADN del mismo, de simple cadena, sea replicado, empaquetado y extraído de la célula. Al ser de menor tamaño (aprox bp) que M13 permite la inserción de fragmentos de ADN más largos. Los proyectos de secuenciación genómica han requerido métodos de secuenciado más veloces y económicos. Para ello se ha desarrollado una técnica llamada Multiplex, que permite manejar mayor cantidad de muestras en menor tiempo. Se utilizan 20 vectores plasmídicos que permiten construir 20 genotecas diferentes a partir del mismo ADN. Cada vector lleva dos secuencias únicas que flanquean al sitio de clonado, que pueden ser usadas como eti- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 59

45 quetas («tags») para el ADN clonado y estarán presentes sobre cada fragmento a ser secuenciado. Se toma un clon de cada una de las genotecas plaqueadas (20 colonias) y se mezclan. Se hace crecer el cultivo, se aísla el ADN y se secuencian los plásmidos utilizando el método Maxam y Gilbert. Los productos de 12 conjuntos de reacciones de secuenciación se corren en un gel y se transfieren a una membrana de nylon. El filtro se hibrida secuencialmente (es decir, se despega una sonda para luego hibridar con las siguiente y así sucesivamente), utilizando como sonda la etiqueta de cada uno de los 20 vectores. En cada caso se van leyendo las secuencias correspondientes a cada uno de los distintos vectores. De esta manera, una sola reacción produce datos de 20 clones a la vez. Actualmente existen equipos robotizados que pueden llevar a cabo dos de las reacciones más limitantes en el proceso de secuenciado: la detección de las bandas de ADN y la traducción de un patrón de bandas en uno de secuencia. Estos equipos utilizan nucleótidos marcados con fluorocromos. Se utilizan 4 colorantes diferentes, que al ser exitados por láser emiten luz de diferente longitud de onda. Los colorantes pueden utilizarse para marcar el primer universal de secuenciación de M13 o cada uno de los 4 terminadores de cadena didesoxi. En este caso, cada mezcla de reacción con un terminador diferente se marca con un colorante diferente. Cuando la reacción es completada, los productos de las 4 reacciones se mezclan y se corren en una sola calle de un gel, en un secuenciador automático. A medida que los fragmentos pasan a través del láser, sus marcas fluorescentes se excitan y emiten luz que se detecta mediante un fotomultiplicador. Después de ser procesada por una computadora, la secuencia es mostrada como una serie de picos o cromatograma, donde cada uno de los 4 colores representa a un nucleótido diferente (rojo: timina, verde: adenina, negro: guanina y azul: citosina). 9 Lecturas Recomendadas FÜTTERER, J.; GISEL, A; IGLESIAS, V.; KLOTI, A.; KOST, B.; MITTELSTEN SCHEID, O.; NEUHAUS, G.; NEUHAUS-URL, G.; SCHROTT, M.; SHILLITO, R.; SPANGENBERG, G.; WANG, Z.Y Standard Molecular Techniques for the Analysis of Transgenic Plants. En Gene Transfer to Plants. Potrykus, Y.; Spangenberg, G. (eds.). Springer Lab Manual. GRIFFITHS, A.; MILLER, J.; SUZUKI, D.; LEWONTIN, R.; GELBART, W An introduction to the genetic analysis. Séptima Edición. W:H:Freeman, N:York. 860 pp. MICKLOS, D. ; FREYER, G DNA Science. Cold Sprong Harbor Lab. Press. Carolina Biol. Supply Comp pp. MADIGAN, M.; MARTINKO, J.; PARKER, J. BROCK (Octava Edición). Biología de los Microorganismos. Prentice Hall. NEWTON, C.; GRAHAM, A (Second Edition). PCR. Springer. N. York. SAMBROOK, J.; SMITCH, E.F.; MANIATIS, T (Second Edition). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratomy Press. Cold spring Harbor. SOUTHERN, E.M Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J.Mol. Biol. 98: WATSON, J. D.; GILMAN, M.; WITKOWSKI, J.; ZOLLER, M (Second Edition). Recombinant DNA. Scientific American Books. N. York. 60 GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana

46 II.- Capítulo 4 Marcadores Moleculares Picca, Aurora; Helguera, Marcelo; Salomón, Nelly; Carrera, Alicia 1 Introducción Desde sus comienzos, el objetivo del mejoramiento vegetal ha sido seleccionar genotipos superiores a partir del reconocimiento de fenotipos superiores. El grado de éxito en este proceso depende de i) el control genético de la característica, es decir el número de genes que la codifican y controlan (herencia monogénica o poligénica) y las relaciones interalélicas (dominancia o aditividad), ii) el grado de influencia ambiental que se mide normalmente a través del parámetro de heredabilidad. Una serie de técnicas moleculares de gran desarrollo en los últimos veinte años permiten conocer la información genética que los organismos portan. Funcionan como señaladores de diferentes regiones del genoma y se los conoce en forma genérica como marcadores moleculares. Son ampliamente utilizados en genética humana, vegetal, animal y microbiana. Permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos, modifiquen éstas o no su fenotipo. En relación a los vegetales son de utilidad en estudios evolutivos y de genética poblacional, manejo de bancos de germoplasma, identificación, protección legal de germoplasma, mapeo, selección asistida por marcadores y clonado de genes. Para que un carácter sea considerado un marcador genético debe mostrar una variación experimentalmente detectable entre los individuos de la población y un modo de herencia predecible según las leyes de Mendel. Esta variación puede ser considerada a diferentes niveles biológicos, desde cambios fenotípicos heredables significativos hasta la variación de un solo nucleótido. Un marcador ideal debe ser: altamente polimórfico o variable dentro y entre especies, de herencia mendeliana no epistática (sin interacción entre genes), insensible a los efectos ambientales, codominante, de rápida identificación y simple análisis y de posible detección en los estadios tempranos del desarrollo de la planta. En los análisis genómicos, se han utilizado varios tipos de marcadores genéticos: morfológicos, isoenzimas, proteínas y marcadores basados en ADN. 2 Marcadores morfológicos Son características fenotípicas de fácil identificación visual tales como forma, color, tamaño o altura. Muchos de ellos se convierten en importantes «descriptores», a la hora de inscribir nuevas variedades. Por ejemplo, alrededor de 50 caracteres de plántula, tallo, hoja, espiga, espiguilla y cariopse se utilizan para inscribir e identificar variedades de trigo en la Secretaría de Agricultura Ganadería Pesca y Alimentación. Este tipo de marcadores contribuyó significativamente al desarrollo teórico del ligamiento genético y a la construcción de las primeras versiones de mapas genéticos. Un gran número de marcadores morfológicos ha sido mapeado en tomate y maíz. En girasol, los primeros híbridos se obtuvieron utilizando el «color de hipocótile» como marcador ligado al gen ms de androesterilidad; de este modo las plantas verdes que eran androestériles se utilizaban como líneas maternas y las plantas con antocianas que eran fértiles se eliminaban del lote de producción al comienzo de su desarrollo. Las principales limitaciones de los marcadores morfológicos se encuentran en: i) número reducido de marcadores disponibles en cada población, ii) bajo nivel de polimorfismo, iii) pueden producir alteraciones fenotípicas que dificultan el desarrollo de la planta, iv) varios se hallan bajo control poligénico, v) dominancia, vi) muchos de ellos se expresan en estadío de planta adulta, lo cual prolonga los tiempos de evaluación en los programas de mejoramiento. No obstante, los marcadores morfológicos permanecen como caracteres útiles en la identificación de materiales dado que representan un conjunto de genes que pueden ser evaluados con métodos sencillos y a bajo costo. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 61

47 3 Isoenzimas Se definen como diferentes formas moleculares de una enzima, que poseen una actividad catalítica común, es decir actúan sobre el mismo sustrato. Ciertos cambios en el ADN que codifica estas enzimas (mutaciones) pueden resultar en cambios en la composición de aminoácidos, originando proteínas con la misma actividad biológica pero con diferente carga neta y por tanto con diferentes velocidades de migración en un campo eléctrico. Estas diferencias determinan patrones característicos de migración electroforética de las formas iso-enzimáticas. Varios factores determinan el patrón de bandas o zimograma: 1) Número de genes que las codifican. La presencia de varios genes codificando para una misma enzima ha sido atribuida a procesos de duplicación génica y subsecuente divergencia a través de mutaciones diferentes en cada caso. 2) Estados alélicos. El proceso más simple de generación de nuevas formas enzimáticas es la mutación de un gen estructural; las variantes alélicas se denominan aloenzimas. Estos marcadores muestran codominancia 3) Estructura cuaternaria de los productos proteicos. La enzima funcional puede estar compuesta por un número variable de sub-unidades. En las formas más simples o monoméricas los individuos homocigotas presentan una banda y los heterocigotas simplemente la suma de ambas. Cuando la estructura cuaternaria se vuelve más compleja, encontramos enzimas activas compuestas por dímeros, tetrámeros, etc.. En este caso el individuo heterocigota presenta bandas adicionales no presentes en los homocigotas, que se generan por la combinación de subunidades codificadas por los distintos alelos o loci. (Fig. 1). 4) Compartimentalización subcelular. Se encuentran formas enzimáticas localizadas en citoplasma, cloroplasto o mitocondria, codificadas todas por genes nucleares pero con diferentes velocidades de migración. Las isoenzimas se obtienen por homogenización del tejido (semilla, raíz, hoja) Figura 1: Locus isoenzimático Pgd-3 en girasol. Variantes alélicas a y b. Genotipos parentales P1, P2 homocigotas y F1 heterocigota en soluciones «buffer» y se analizan mediante electroforesis en un soporte sólido, generalmente almidón. El gel puede ser cortado en capas horizontales y cada una se destina a una solución de revelado específica que consta de un sustrato, un colorante y cofactores, disueltos en un buffer apropiado. La preparación del gel es relativamente simple y el equipamiento es de bajo costo. Las enzimas se clasifican de acuerdo a su función y se representan con una sigla de tres letras. Por ejemplo: dehidrogenasas (alcohol dehidrogenasa ADH, glutamato dehidrogenasa GDH), oxidasas (peroxidasas PRX), hidrolasas (fosfatasas ácidas ACP, esterasas EST), isomerasas (fosfoglucoisomerasa PGI) y transferasas (fosfoglucomutasas PGM). Los loci en general se representan con las tres letras señaladas en tipo cursiva y se agrega un número para designar al locus y una letra para el alelo, de acuerdo a distancias decrecientes de migración. Por ejemplo: Adh-1a, Adh-1b, Adh-2a, Adh-2b, Adh-2c. Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar variabilidad y estructura genética, sistemática y biología evolutiva así como en descripción de germoplasma e identificación de variedades. Su aplicación en la construcción de mapas se ha visto limitada por el número de marcadores isoenzimáticos disponibles, en general menor a 50 y por su reducido polimorfismo, 2-4 alelos. Por otro lado, las formas enzimáticas extraídas de hoja o raíz (no así las de semilla) presentan variaciones en relación a las condiciones ambientales de crecimiento y a la edad del tejido, lo cual afecta la reproducibilidad de los zimogramas. No obstante, estos loci representan importantes marcas de referencia para relacionar mapas obtenidos a partir de 62 PICCA, Aurora; HELGUERA, Marcelo; SALOMÓN, Nelly; CARRERA, Alicia

48 distintos marcadores de ADN. 4 Proteínas de reserva Figura 2: Fraccionamiento de Gluteninas en variedades de trigo por SDS-PAGE para su correlación con variables de calidad industrial. El endosperma de los cereales es el principal componente de la semilla ya que representa aproximadamente el 80-90% de su peso seco. Almidón y proteínas son las dos macromoléculas más importantes. El contenido de proteína varía según la especie y el manejo de cultivo a campo. Los valores más altos se dan en trigo y avena (10-17%) y los más bajos en maíz y arroz (6%). La concentración de proteínas en los cereales es apreciablemente menor que en las leguminosas ya que en éstas los órganos de reserva o cotiledones son capaces de almacenar hasta un 40% de su peso seco en proteínas. Las proteínas del endosperma fueron estudiadas ya a comienzos del siglo pasado por Osborne, quién dio las bases para las clasificaciones actuales. La misma se basa en la solubilidad relativa en diferentes solventes: albúminas solubles en agua, globulinas en solución salina, prolaminas en alcohol y glutelinas en ácidos o álcalis. Para el grupo de las prolaminas se ha asignado un nombre específico para cada uno de los cereales. De esta manera en maíz se la denomina zeína, en cebada hordeína, en avena avenina y en trigo gliadina. En el caso específico de trigo a las glutelinas se las conoce con el nombre de gluteninas. En la mayoría de los cereales las prolaminas y glutelinas están codificadas por varios genes relacionados conformando familias. Durante la evolución de estos genes se han detectado duplicaciones, translocaciones, inserciones de elementos móviles entre otros re-arreglos cromosómicos. Estos cambios genéticos han generado un alto nivel de polimorfismo proteico entre especies, así como entre variedades de la misma especie. Además, el análisis genético de cruzamientos ha demostrado que la variación en el patrón de proteínas es debida a la existencia de variantes alélicas en cada locus. Las glutelinas se analizan en geles discontinuos de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio, en medio básico (SDS-PAGE) utilizando diferentes tamaños de poros (tamiz molecular) (Fig. 2). El fraccionamiento de las prolaminas se realiza en electroforesis ácida (A-PAGE), en geles continuos, utilizando el principio de diferencias en la carga eléctrica. La visualización se realiza en ambos casos mediante tinción con Coomassie Brilliant Blue R250. En trigo pan, Triticum aestivum, los genes estructurales para las dos principales proteínas, gluteninas y gliadinas, están confinados al conjunto de los cromosomas homeólogos (cromosomas parcialmente homólogos pertenecientes a los tres genomas) 1 y 6. Los genes para las subunidades de gluteninas de alto peso molecular (GAPM) están ubicados en el brazo largo de los cromosomas 1A,1B y 1D, cercanos al centrómero. Las gluteninas de bajo peso molecular (GBPM) son codificadas por genes ubicados en los brazos cortos de ese mismo grupo de cromosomas, distantes del centrómero. El patrón electroforético de las gliadinas muestra cuatro grupos proteicos denominadas a, b, g y w gliadinas. Las fracciones g y w se encuentran codificadas por genes del cromosoma 1 de los tres genomas, próximos al grupo de genes correspondientes a GAPM. Los genes de las fracciones a y b se ubican en el brazo corto de los cromosomas 6A, 6B y 6D. La localización cromosómica de los genes de proteínas en trigo se ha establecido principalmente utilizando materiales aneuploides tales como nulisómicos o tetrasómicos de la variedad Chinese Spring. La posición relativa del locus sobre el cromosoma fue determinada por cruzamientos entre líneas con contenidos contrastantes de proteína y determinando la frecuencia de recombinación en la progenie. La posición cromosómica de estas proteínas ha sido estable a lo largo de la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 63

49 evolución y han sido usadas como marcadores para el estudio de la homeología cromosómica de la Tribu Triticeae. 5 ADN y marcadores moleculares Un marcador de ADN es simplemente un punto de referencia en un cromosoma, que puede o no corresponder a un gen. Diversas técnicas de biología molecular se encuentran disponibles para detectar variabilidad en la secuencia de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), las enzimas de restricción, la separación electroforética de los fragmentos de ADN, las sondas marcadas y las hibridizaciones son algunas de las técnicas que permiten obtener un número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares y cubrir la totalidad del genoma de un organismo (para más detalles ver II.- 3) Los marcadores moleculares pueden ser clasificados en tres grupos: A) Marcadores basados en la hibridación del ADN: los más utilizados en plantas son los RFLP «restriction fragment length polymorphisms» o polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción de ADN. Este tipo de estudio involucra la detección de un segmento específico (marcador molecular) en el ADN de estudio por hibridación con un fragmento marcado radiactivamente de secuencia complementaria al marcador (sonda). En el proceso, el ADN en estudio es digerido por medio de una enzima de restricción. Este tipo de enzimas corta el ADN en una secuencia determinada o sitio de restricción. La variabilidad genética presente en el marcador molecular se observa como diferencias en la secuencia del ADN genómico debidas a duplicaciones, deleciones, inserciones, etc. que modifican la distancia entre pares de sitios de restricción y generan fragmentos polimórficos (de diferentes tamaños). Los fragmentos clivados por la enzima de restricción se separan por su tamaño mediante electroforesis y se transfieren a una membrana donde son hibridados con la sonda. En el proceso, la sonda hibrida solamente con fragmentos de ADN inmovilizados en la membrana que presenten la secuencia complementaria a la misma. Para visualizar los polimorfismos se expone la membrana a una placa radiográfica La ventaja de los RFLPs radica en que son altamente reproducibles, codominantes y multialélicos. A su vez cuentan con la desventaja de ser muy laboriosos, difíciles de automatizar, requieren de infraestructura adecuada para mantener las sondas, trabajar con radiactivos, lo que los hace relativamente caros. Los minisatélites o VNTR «variable number of tandem repeats» son repeticiones en tandem de secuencias del genoma que contienen de 9 a 100 pares de bases. El número de repeticiones es variable pero en general es menor a Existen dos formas de detectar los VNTR ya sea por hibridación o por técnicas de PCR. El ADN genómico es digerido con enzimas de restricción que reconocen los sitios de restricción que flanquean las repeticiones en tandem, separado electroforéticamente e inmovilizado en una membrana. Cuando la enzima de restricción corta las secuencias adyacentes a un locus hipervariable, la longitud de los fragmentos de restricción producidos en diferentes individuos varía con el número de repeticiones de minisatélites. Estos fragmentos con diferentes longitudes son detectados utilizando sondas diseñadas a partir de las secuencias de ADN que flanquean las repeticiones o a partir de las repeticiones mismas. Estos fragmentos pueden ser considerados como un tipo específico de RFLP. La diferencia básica entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada. En la técnica de VNRT las sondas están constituidas por secuencias homólogas a las secuencias repetidas de los minisatélites, por lo tanto todos los locus hipervariables son detectados simultáneamente, mientras que en RFLP, las sondas son homólogas a secuencias únicas del genoma, detectando así uno o pocos loci cada vez. De esta manera, en el autoradiograma al contrario del patrón simple de bandas obtenido por RFLP (una banda para genotipos homocigotas o dos bandas para genotipos heterocigotas), para minisatélites se obtiene un perfil complejo de bandas múltiples. Una ventaja de los VNRT, es que además de explorar el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción en cada locus hipervariable, utilizan también el polimorfismo en el número y distribución de estos loci a lo largo del genoma, posibilitando así 64 PICCA, Aurora; HELGUERA, Marcelo; SALOMÓN, Nelly; CARRERA, Alicia

50 la visualización simultánea de diversas regiones del mismo. Las limitaciones para esta técnica, son las mismas descriptas oportunamente para RFLP. Los minisatélites también pueden ser detectados mediante la amplificación por PCR de los segmentos conteniendo diferente número de repeticiones, utilizando «primers» o cebadores, que flanqueen dichos segmentos. B) Marcadores basados en la amplificación del ADN: mediante la reacción de PCR «polymerase chain reaction» o reacción en cadena de la polimerasa de ADN. Esta técnica se basa en la síntesis enzimática de millones de copias de un segmento específico de ADN en presencia de una polimerasa de ADN termoestable. Para ello se utilizan dos oligonucleótidos llamados «cebadores» o «primers». El segmento de ADN a amplificar esta compuesto por dos hebras (a y b), la secuencia de uno de los oligonucleótidos hibrida en uno de los extremos del segmento y es complementaria a la hebra a, el segundo oligonucleótido hibrida en el otro extremo del segmento y es complementario a la hebra b. Para que exista amplificación del fragmento es imprescindible que ambos oligonucleótidos hibriden en secuencias complementarias presentes en las hebras del ADN en estudio. La presencia de mutaciones en el sitio de hibridación de cualquiera de los oligonucleótidos impide la amplificación del fragmento. La necesidad de disponer de información previa acerca de la secuencia del ADN a amplificar para diseñar oligonucleótidos, limitó inicialmente el desarrollo de marcadores basados en la reacción de PCR en plantas. La primera solución a este problema vino de la mano de los RAPDs «random amplified polymorphic DNAs» o fragmentos polimórficos de ADN amplificados aleatoriamente. Esta técnica se basa en la utilización de un único oligonucleótido de 10bp que hibrida al azar con el ADN en estudio. Para que se genere un fragmento RAPD es necesario que las dos hebras del ADN en estudio presenten sitios de hibridación con el oligonucleótido en orientaciones opuestas suficientemente cercanas (menos de 3000bp) como para permitir la amplificación. La secuencia del oligonucleótido es aleatoria al igual que los sitios de hibridación, por lo que la secuencia amplificada es desconocida. El polimorfismo que se observa entre distintos individuos consiste en la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificado (Fig. 3). DAF «DNA amplification fingerprinting» y AP-PCR «arbitrary primer PCR» son técnicas similares a RAPDs. DAF involucra el uso de primers arbitrarios de longitud tan corta como 5 pares de bases. Esto reduce la especificidad del apareamiento con el ADN molde y resulta en un perfil más complejo de bandas. La visualización se lleva a cabo por medio de geles de poliacrilamida teñidos con plata. AP-PCR utiliza primers ligeramente más largos que la técnica anterior (aprox. 20 pares de bases). Los productos de amplificación son marcados radiactivamente y también pueden ser resueltos por electroforésis en geles de poliacrilamida La ventaja de estas técnicas consiste en Figura 3: RAPDs en DNA genómico de trigo candeal. Genotipos parentales K y D y progenie F7. que son rápidas y sencillas, de bajo costo de implementación, automatizables y no radioactivas. La desventaja, además de su baja reproducibilidad, es que es un marcador dominante (al observar un fragmento es imposible determinar si el mismo se originó de una o dos copias de la secuencia amplificada). La disminución en los costos de secuen- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 65

51 ciación y PCR, junto a la creciente información sobre genomas animales y vegetales han permitido el desarrollo de marcadores basados en PCR con diferentes características, entre ellos los más frecuentemente utilizados en plantas son: SSR «simple sequence repeats» o microsatélites y AFLPs «amplified fragment length polymorphisms». Los microsatélites (SSR), son regiones genómicas hipervariables constituidas por repeticiones en tandem de unos pocos pares de bases (1 a 4) flanqueadas por secuencias de copia única. La base genética del polimorfismo detectado en microsatélites se basa en la variabilidad del número de repeticiones en tandem y consecuentemente del tamaño del microsatélite amplificado en individuos de una especie. El microsatélite amplificado por PCR es sometido a electroforesis en geles de alta resolución que permiten detectar diferencias de 2, 3 o 4 nucleótidos que corresponden al mínimo polimorfismo de longitud en un microsatélite. Por el alto polimorfismo que presentan por locus (multialelismo) se los considera los marcadores ideales para el mejoramiento en especies autógamas como el trigo. Estos marcadores son codominantes, genoma-específicos y altamente polimórficos en comparación con los RFLPs y RAPDs. Su implementación en un laboratorio requiere de mayor infraestructura y presupuesto que los RAPDs. C) Marcadores mixtos: AFLP (polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados de ADN) puede considerarse como una combinación de RFLP y RAPDs. Esta técnica consiste en esencia de cuatro etapas: 1) el ADN genómico es cortado con enzimas de restricción (generalmente una de corte raro y otra de corte frecuente). 2) adaptadores de ADN de doble cadena se adhieren en forma específica a los extremos de los fragmentos obtenidos en el paso anterior, generando así el molde para la amplificación del ADN. 3) una fracción de los fragmentos obtenidos es amplificada selectivamente por la acción de primers específicos que fueron diseñados para reconocer la secuencia de los adaptadores ligados en el segundo paso, el sitio de la enzima de restricción, más una a tres bases selectivas al azar agregadas en el extremo 3. El uso de bases selectivas al azar permite la amplificación de sólo un grupo de fragmentos de restricción (aquellos en que coincide la secuencia del adaptador + sitio de restricción + bases selectivas). 4) análisis de la subpoblación de fragmentos amplificados mediante su desnaturalización por electroforesis en geles de alta resolución (poliacrilamida) y visualización por autoradiografía o por tinción con nitrato de plata (Fig. 4). Su implementación en laboratorio requiere de una infraestructura y presupuesto similar a los microsatélites. Estos marcadores presentan un alto poder de detección de la variabilidad genética, ya que se explora simultáneamente el polimorfismo de ausencia/presencia de sitios de restricción (como los RFLP) y la ocurrencia o no de amplificación a partir de secuencias arbitrarias (como los RAPDs). La base del polimorfismo es la ausencia o presencia de fragmentos amplificados de un tamaño determinado y al igual que en los RAPDs, no es posible distinguir individuos heterocigotas por lo que se trata de un marcador dominante. Es un marcador mucho más robusto Figura 4: AFLPs en trigo candeal. Cinco combinaciones de primers para las enzimas de restricción Pst I y Mse I en las variedades K y D. 66 PICCA, Aurora; HELGUERA, Marcelo; SALOMÓN, Nelly; CARRERA, Alicia

52 que los RAPDs, ya que en la amplificación se utilizan oligonucleótidos más largos, que aumentan significativamente la especificidad de la reacción sin perder las ventajas de la amplificación de secuencias al azar (no requiere información previa de secuencia de ADN). Otra ventaja de los AFLPs es el número de fragmentos (marcadores) resueltos por electroforesis que oscila entre contra los 4 10 de RAPDs. Para una utilización más eficiente en programas de mejoramiento de marcadores RFLPs, RAPDs y AFLPs existe la posibilidad de transformarlos en marcadores PCR alelo-específicos, que son económicos, robustos y de sencilla implementación en cualquier laboratorio. Existen distintas estrategias para la conversión de marcadores RFLP, RAPDs y AFLPs en marcadores PCR alelo-específicos, en general ligados a un caracter de interés agronómico. Se conocen como STS «sequencetagged sites». En estos casos se aisla el fragmento de ADN polimórfico del gel, se clona, se secuencia y se diseñan oligonucleótidos específicos de alrededor de 20 pb, para ser utilizados como cebadores. Cuando se parte de un fragmento RAPD, el marcador derivado mediante este proceso es conocido como SCAR «región amplificada de secuencia caracterizada». El paso siguiente es detectar el alelo de valor agronómico superior, por ejemplo un alelo asociado a la resistencia a un patógeno y el marcador entonces se hace evidente con una simple reacción de PCR. El problema que enfrentan estas estrategias suele ser el bajo nivel de polimorfismo entre variedades de una especie (trigo, soja, etc), lo que disminuye las posibilidades de encontrar mutaciones útiles para desarrollar estos marcadores. De todos modos, existen antecedentes exitosos de desarrollo de marcadores de PCR alelo-específicos en trigo para locus altamente polimórficos como pueden ser alelos de gluteninas. Los ESTs «expressed sequence tags» son similares a los STSs y sirven para los mismos propósitos pero derivan de clones de cdna (ARNm transcripto a ADN utilizando la enzima transcriptasa reversa). La ventaja de los ESTs, al ser derivados de ARNm maduro es que generalmente se ven libres de intrones y de ADN repetitivo. Esto implica que los ESTs representan genes funcionales y son por lo tanto más útiles como marcadores moleculares que las secuencias anónimas. En una variante conocida como CAPs «cleavage amplified polymorphic sequence», los productos de amplificación de secuencias específicas se digieren con una enzima de restricción. Este método permite identificar individuos heterocigotas, por lo que se comporta como marcador codominante. La información para la secuencia de los primers utilizados en CAPs puede provenir de un banco de genes o de clones genómicos o de cdna. Recientemente mediante CAPS ha sido posible seleccionar plantas de trigo hexaploide portadoras del alelo 2NS, proviente de una translocación de Triticum ventricosum que contiene genes de resistencia a roya Lr37, Sr38, Yr 17 (Fig. 5). Figura 5: CAPS en trigo. Calle 1 planta control (sin amplificación). Calles 2, 3, 6 y 7 plantas homocigotas para el alelo 2AS (275 pb = ). Calles 4 y 5 homocigotas 2NS (285 pb). Calles 8 y 9 plantas heterocigotas 2AS/2NS. Existen técnicas de alta resolución que permiten detectar mutaciones a nivel de un solo nucleótido conocidas como SNPs «single nucleotide polymorphisms». Entre ellas, los SSCPs «single-strand conformational polymorphism» tienen la capacidad de detectar cambios de un solo nucleótido en fragmentos de más de 1000 pares de bases. La técnica de SSCPs se basa en la movilidad de las cadenas simples del ADN en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes, movilidad que depende tanto de su tamaño como de su secuencia. Las cadenas simples de ADN tienen tendencia a formar apareamientos Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 67

53 intramoleculares de bases que resultan en una conformación dependiente de la secuencia y con una movilidad específica en geles de acrilamida. Por lo tanto cambios en la secuencia del ADN, aunque sea de un solo par de bases, causan modificaciones en la conformación y consecuentemente en la movilidad electroforética. Los SSCPs pueden detectarse clivando el ADN con enzimas de restricción, separando los distintos fragmentos según su conformación por corrida en un gel. Posteriormente se realiza una hibridación de Southern a partir del gel con fragmentos específicos como sondas para la hibridación. Otra metodología para obtener SSCPs consiste en la amplificación de un fragmento específico por PCR y posterior corrida electroforética en geles de alta resolución. De la descripción realizada, se desprende que los marcadores varían ampliamente en el grado de complejidad del método, el modo de herencia, el nivel de polimorfismo y en los factores costo y tiempo, de gran importancia cuando los objetivos del estudio incluyen el análisis de un número elevado de individuos. La tabla 1 resume algunos aspectos importantes a considerar a la hora de elegir el tipo de marcador a utilizar. Tabla 1: Comparación entre algunos sistemas de marcadores moleculares. 6 Lecturas recomendadas BUSHUK W.; ZILLMAN, R.R Wheat Cultivar Identification by Gliadins Electrophoregram I: Apparatus, methods and nomenclature. Canadian Journal of Plant Science, 58: pp CARRERA, A.; POVERENE, M.; RODRÍGUEZ, R Isozyme variability in Helianthus argophyllus. Its application in crosses with cultivated sunflower. Helia 19 (25): pp DIEFFENBACH, CW.; DVEKSLER, GS PCR primer: A laboratory manual. CSHL press. 714 pp. DUBCOVSKY PCR assays for the Lr37-Yr17-Sr38 cluster of rust resistance genes and their use to develop isogenic hard red spring wheat lines. Crop Science, en prensa. FERREIRA, M.; GRATTAPAGLIA, D Introduçao ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 2 ed. EMBRAPA-CENARGEN. 220 pp. GUPTA, PK.; VARSHNEY, RK.; SHARMA, PC.; RAMESH, B Molecular markers and their applications in wheat breeding. Pl. Breed. 118: pp HELGUERA, M.; ECHENIQUE, V Biotechnology in wheat breeding. Aceptado para publicar en Advances In Plant Physiology, vol 7. NG., P.K.; BUSHUK, W Glutenin of Marquis Wheat as a Reference for Estimating Molecular Weights of Glutenin Subunits by Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacryilamide Gel Electrophoresis. Cereal Chemistry. 64(4): pp SALOMÓN, N., MIRANDA, R.; POVERENE, M Variación de la calidad panadera en trigos de diferentes orígenes a través de la escala Glu-1. IV Congreso Nacional de Trigo y II Simposio Nacional de Cereales de Siembra Otoño- Invernal. Mar del Plata. pp. I-21. SALOMÓN, N., CARRERA, A.; MIRANDA, R.; POVERENE, M Estudio de los descriptores de trigo en Argentina. Publicado en Estrategias metodológicas utilizadas en el mejoramiento de trigo: Un enfoque multidisciplinario. Colonia, Uruguay. pp SOLTIS, D.; SOLTIS, P. (Eds.) Isozymes in Plant Biology. Advances in Plant Sciences Series. Vol. 4. Portland, Oregon. 268 p. 68 PICCA, Aurora; HELGUERA, Marcelo; SALOMÓN, Nelly; CARRERA, Alicia

54 II.-Capítulo 5 Citogenética Poggio, Lidia; Naranjo, Carlos A. 1 Introducción Los estudios citogenéticos han permitido realizar valiosos aportes al conocimiento de los mecanismos de aislamiento reproductivo y modos de especiación en plantas. La especiación híbrida es muy común en el reino vegetal, en especial la especiación por poliploidía. En estos casos la citogenética, a través del análisis genómico, ha contribuido a la resolución del origen y evolución de distintos grupos taxonómicos. Mutaciones cromosómicas que alteran la morfología de los cromosomas jugarían un papel importante en la determinación de los mecanismos de aislamiento reproductivo y distintos modos de especiación. Aun sin alterar la morfología de los cromosomas, existen ejemplos en los que mutaciones génicas que afectan el apareamiento han sido determinantes en la evolución de distintos grupos. La citogenética brinda valiosos aportes para la resolución de problemas taxonómicos, evolutivos y aplicados. Esta disciplina tiene grandes ventajas pero también limitaciones y sus aportes deben ser complementados con estudios provenientes de otros campos. Sin embargo es importante señalar que trabajar en biología o genética de eucariontes, usando técnicas clásicas o moleculares, pero desconociendo las características y el comportamiento de sus cromosomas puede llevar a errores en la interpretación de causa y efecto de muchos fenómenos. En esta contribución se explicará brevemente la información que la citogenética puede brindar, con el análisis del cariotipo, análisis meiótico en híbridos y poliploides, estudio de la variación intra e interespecifica en el tamaño del genoma y con la citogenética molecular (hibridación in situ, FISH, GISH), exponiendo como ejemplos, algunos aportes realizados por nuestro grupo de trabajo. 2 Análisis del cariotipo Las características estructurales y cuantitativas de los cromosomas (cariotipo) son importantes en investigaciones básicas (taxonómicas y evolutivas) y aplicadas. Los taxónomos y evolucionistas están familiarizados con el hecho de que los cromosomas son parte de un sistema dinámico que está moldeando el proceso de evolución. Esta variación se expresa en características fácilmente analizables como el número, forma y tamaño de los cromosomas y no está relacionada con complejidad genética u organísmica. Es importante analizar también, la cantidad y localización de heterocromatina (ADN repetitivo no codificante) mediante distintas técnicas de bandeo, y caracterizar citoquímicamente distintos tipos de heterocromatina utilizando fluorocromos, y en algunos casos, identificar ADN satélite y relacionarlo con bandas heterocromáticas. Además, deben localizarse las regiones organizadoras del nucleolo (NOR). Es frecuente y normal la existencia de variación cariotípica interespecífica. Por otro lado, aunque menos frecuente, también puede existir variabilidad cariotípica intraespecífica manifestada como polimorfismos o politipismos cromosómicos. Varios parámetros del cariotipo pueden ser alterados por rearreglos estructurales. En algunos casos puede variar el número cromosómico y la simetría del cariotipo. Un ejemplo de este caso lo constituyen las fusiones céntricas entre cromosomas con centrómero subterminal produciendo cromosomas metacéntricos de mayor tamaño, con o sin eliminación de regiones centroméricas. El fragmento con centrómero puede persistir como un cromosoma supernumerario o cromosoma B. En otros casos no se encuentra variación en el número cromosómico ya que en muchos géneros el número y, a veces, la morfología cromosómica es constante entre las distintas especies que lo componen. En Bulnesia (Zygophylaceae) siete de las nueve especies que lo componen son diploides (2n=26). Sin embargo existen diferencias importantes interespecíficas en cuanto a la morfología cromosómica, simetría del cariotipo y tamaño del genoma. El cariotipo de B. retama es el más asimétrico ya que Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 69

55 FIGURA 1. A-E = Bandeo C. A, C, E = metafases mitóticas. B, D = interfases. A, B = Zea luxurians. C, D = Zea mays ssp. mays. E = Bulnesia retama, las flechas señalan el único par de cromosomas metacéntricos eucromáticos.- F = Metafase I. Eulophia paiveana ssp. borealis, n = 42; las flechas muestran ejemplos de asociación secundaria de bivalentes.- G, H = Zea luxurians x Z. diploperennis, n = 10; G = Metafase I, 8 bivalentes y 4 univalentes, la flecha señala un bivalente heteromorfo; H = Anafase I, 2 puentes (flechas) y 2 fragmentos (cabeza de flecha).- I, J = Zea mays ssp mays, diacinesis. n = 10; I = dos grupos de 5 bivalentes y un cromosoma B; J = Asincronía meiótica, 5 bivalentes en Metafase I y 10 cromosomas en Anafase I.- K = Zea luxurians x Z. perennis, 2n=30; metafase I, 5 trivalentes, 5 bivalentes y 5 univalentes. A-D y F-K poseen el mismo aumento. Las barras representan 10 micrones. Ver explicación extensa de las figuras en: Poggio et al., 1986a y b, 1999; Tito et al., posee un cariotipo bimodal por adición de heterocromatina en 24 de los 26 cromosomas del complemento. El número cromosómico también puede variar por poliploidía. Nuevos números básicos que no tengan relación directa con los ancestrales pueden surgir si ocurren nuevas reestructuraciones o hibridación entre poliploides con distintos números básicos. Variaciones en el cariotipo pueden ocurrir sin cambios notorios en el exofenotipo. Sin embargo rearreglos en condición heterocigota pueden ocasionar disturbios en el apareamiento meiótico e iniciar aislamiento reproductivo. Si se dan las condiciones adecuadas para la fijación de estos rearreglos pueden iniciarse eventos especiogénicos que involucren rearreglos cromosómicos. Estos procesos pueden conducir, en algunos casos, a la existencia de especies crípticas o hermanas, con pocas diferencias a nivel bioquímico o morfológico pero con diferencias cromosómicas que las mantendrían aisladas reproductivamente. Un análisis más preciso de la variación cariotípica puede obtenerse empleando técnicas de bandeo que revelan marcadores cromosómicos (secuencias de ADN altamente repetidas ricas en AT o GC, regiones organizadoras del nucleolo, etc.). El bandeo C es el que se utiliza de rutina y revela heterocromatina constitutiva compuesta por secuencias cortas repetidas en tandem. La heterocromatina constitutiva es un componente aditivo del genoma y presenta, en muchos grupos, variación intra e interespecífica. Aunque no contiene genes activos podría tener importancia en eventos regulatorios, en el desarrollo y en la organi- 70 POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

56 zación tridimensional de los cromosomas en el núcleo. Bennett (1983, 1988) crea el término «cariotipo natural» para referirse al ordenamiento de los cromosomas de acuerdo a la posición real que los mismos ocupan en el núcleo interfásico. Se han postulado varios modelos que explican la organización supracromosómica en los núcleos eucariontes estableciendo que si bien ésta no es universal, es indudable que la información genética no está contenida caoticamen-te en el núcleo sino que está ordenada de acuerdo a patrones que actualmente no conocemos. 3 Análisis meiótico en híbridos y poliploides Una especie diploide con reproducción sexual para ser fértil debe poseer un comportamiento meiótico normal, o sea que debe poseer buen apareamiento entre cromosomas homólogos y consecuentemente formación de bivalentes. Ello determina que exista buena segregación y formación de gametos balanceados y fértiles. En general el grado de apareamiento meiótico es una medida de la homología que existe entre los cromosomas. Esto es cierto cuando son normales los genes que regulan fisiológicamente todas las etapas y procesos de la división meiótica. Estos principios han permitido realizar rápidas evaluaciones de la homología genómica entre dos entidades por medio del estudio meiótico de su híbrido F1, cuando éstos han sido posibles de obtener artificialmente o se los ha encontrado en poblaciones naturales. Si el híbrido analizado es fértil y posee formación de bivalentes se puede concluir que hay afinidad (homología) entre los genomas parentales. El grado de irregularidades meióticas es una estimación de diferencias génicas y estructurales de las entidades en estudio. Configuraciones meióticas anormales como univalentes, bivalentes heteromórficos o multivalentes en Profase-Metafase I y, en estadíos posteriores (puentes, fragmentos, cromosomas con cromátidas desiguales, husos multipolares, etc.,), pueden deberse a heterocigosis para distintos tipo de rearreglos estructurales. Si el híbrido es estéril habrá que analizar si el aislamiento reproductivo postcigótico obedece a causas génicas o cromosómicas. La formación de univalentes podría significar falta de homología entre los cromosomas de los progenitores y, en estos casos, el poliploide artificial debería poseer meiosis regular y fertilidad elevada. Sin embargo podría ocurrir que aunque las especies parentales tuvieran una elevada homología en cuanto a las secuencias de ADN, los híbridos fueran estériles, con formación de univalentes en su meiosis. Esto último podría deberse a la acción de genes que interfieren con el proceso normal de apareamiento (formación del complejo sinaptonémico, ocurrencia y/o posición de sobrecruzamientos) o alteran la disposición espacial de los genomas en el núcleo provocando asinapsis. En algunos casos la formación de univalentes en los híbridos se debería a divergencia cuantitativa en el número de copias de secuencias de ADN altamente repetidas. Este mecanismo disminuye el valor adaptativo del heterocigota por provocar disturbios en la alineación estructural de los cromosomas. Otro caso frecuente en la naturaleza es la existencia de híbridos diploides con formación regular de bivalentes y desarrollo normal de los estados II de la meiosis, pero elevada esterilidad. Este fenómeno es muy común en híbridos entre distintas especies de Amaranthus, Prosopis y Bromus entre otros. Stebbins (1971) ha denominado a este fenómeno «hibridez estructural críptica» y ocurriría cuando las especies progenitoras se diferencian en pequeños rearreglos estructurales. En estos casos se pueden formar bivalentes pero se segregan combinaciones génicas inviables a las gametas. El comportamiento meiótico puede también verse alterado por interacciones particulares «núcleo - citoplasmáticas». En los híbridos el citoplasma puede ejercer una acción diferencial sobre la condensación cromosómica de los genomas parentales o en el ritmo de contracción cromosómica durante la meiosis (alociclia genómica). Cuatro líneas aloplásmicas fueron obtenidas por el Ing. Agr. L. Mazoti utilizando maíz (Zea mays ssp mays) como progenitor masculino recurrente durante al menos 10 retrocruzas so- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 71

57 bre teosinte como progenitor femenino. Estas líneas presentaron comportamiento meiótico regular con formación de bivalentes. Todas las líneas aloplásmicas presentaron características citológicas en común. Una de estas características es que, en mas del 50 % de las células analizadas en Diplotene - Metafase I, los 10 bivalentes se distribuyeron en dos grupos de cinco bivalentes cada uno. Si bien este comportamiento meiótico fue descripto en híbridos y en razas nativas de maíz, en las líneas aloplásmicas se observa con mayor claridad y frecuencia. Otra característica observada en las líneas aloplásmicas es que, en aproximadamente 20-40% de los meiocitos en Profase I, Metafase I y Anafase I, los dos grupos de 5 II presentan una leve asincronía en su comportamiento meiótico (es decir que, por ejemplo, un grupo de 5 II inicia la Anafase I mientras que el resto de los bivalentes permanecen en Metafase I). La drástica separación en dos grupos de 5 II en la mayoría de las células sugiere que la interacción «citoplasma de teosinte-nucleo de maíz «influencia la distribución espacial de los cromosomas en el núcleo. La presencia de dos grupos de 5 II y la asincronía de los mismos en líneas aloplásmicas de maíz sugiere que el citoplasma de teosinte promueve la separación y asincronía de dos genomas diferentes con 10 cromosomas cada uno (x=5). Evidencias citogenéticas de la naturaleza poliploide del maíz y especies afines se discutirán con mayor detalle en la próxima sección. Citogenética de poliploides. El estudio meiótico de poliploides e híbridos entre taxones con distinto nivel de ploidía aporta mayor información que el realizado en híbridos diploides puesto que se puede analizar la afinidad relativa de distintos genomas en el mismo fondo genético. En estos casos la formación de multivalentes es decisiva para establecer las relaciones entre genomas. En el género Larrea el híbrido estéril entre la especie diploide L. divaricata (2n=26) y L. cuneifolia (2n=52) hemos encontrado, en MI, 13 II y 13 I en un gran porcentaje de las células analizadas, indicando que L. divaricata o una especie muy afín sería un progenitor de L. cuneifolia. El análisis de las asociaciones meióticas en especies e híbridos del género Zea nos reveló la naturaleza alotetraploide del maíz y especies relacionadas con 2n=20 cromosomas. En híbridos con 2n=30 cromosomas (Z. diploperennis x Z. perennis y Z. mays ssp mays x Z. perennis) la configuración meiótica más frecuente fue 5 III + 5 II + 5I. Zea perennis, con 2n=40 cromosomas presentó, con frecuencia elevada, 5 IV + 10 II. Estas configuraciones sólo pueden ser claramente explicadas proponiendo dos genomas (A y B) de 5 cromosomas cada uno, siendo AmAm BmBm y ApAp A pa p Bp 1 Bp 1 Bp 2 Bp 2 las fórmulas genómicas postuladas para maíz y Zea perennis, respectivamente. Nuestro grupo de trabajo ha encontrado, en especies e híbridos con 2n=20 cromosomas, formación frecuente de dos grupos de 5 II cada uno en MI. Este «doble huso» observado sería una evidencia de la existencia de genomas ancestrales con 10 cromosomas cada uno. Además, en alrededor del 50 % de las células observadas en algunas líneas de maíz e híbridos interespecíficos se observó «asociación secundaria» de bivalentes, sugiriendo la existencia de homeología entre los genomas ancestrales A y B postulados. Tratamientos premeióticos con soluciones diluidas de colchicina (0,5 x 10-4 ) en el género Helianthus indujeron apareamiento homeólogo y formación de multivalentes en especies que, aunque tienen origen poliploide, poseían meiosis regular con formación de bivalentes. Los resultados obtenidos sugirieron que estos tratamientos pueden inducir apareamiento intergenómico. Este tratamiento produce el mismo efecto que alelos mutantes de genes que controlan el apareamiento, permitiendo recombinación entre genomas que normalmente no recombinarían. Hemos realizado tratamientos con soluciones diluidas de colchicina en maíz y Z. perennis con la finalidad de detectar recombinación entre los genomas A y B postulados anteriormente. El maíz tratado mostró en Diplotene-MI de 1 a 5 IV mientras que el maíz testigo sólo formó bivalentes. Estos resultados sugirieron que en maíz existen genomas homeólogos (Am y Bm) con 5 cromosomas cada uno. El tratamiento en Zea perennis dió como resultado un incremento en la frecuencia de IV señalando también manifestación de homeología dentro de los genomas A y B. El tratamiento con colchicina 72 POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

58 de los híbridos con 2n=30 cromosomas, Z. diploperennis x Z. perennis y Z. perennis x Z. mays ssp mays dieron resultados diferentes. En Z. diploperennis x Z. perennis el tratamiento con colchicina provocó un aumento en la frecuencia de trivalentes, no observándose nunca IV ó VI. En cambio el híbrido Z. perennis x Z. mays ssp. mays tratado con colchicina, no sólo mostró un aumento en el porcentaje de III sino que el 43% de las células analizadas en Diacinesis -MI mostraron IV y VI. Estos resultados permitieron concluir que si se comparan los genomas Am-Bm Ad-Bd y Ap-Bp, sólo son homeólogos los genomas Am y Bm. El análisis conjunto de los datos obtenidos en nuestro laboratorio no sólo confirma la naturaleza alopoliploide del maíz y especies afines con 2n=20 cromosomas, sino que sugiere que en estas especies existen genes (semejantes al Ph descripto en trigo) que impiden el apareamiento entre genomas homeólogos. En Amaranthus la configuración cromosómica de 8 II + 17 I observada en el híbrido A. hybridus (2n=32) x A. spinosus (2n=34), conjuntamente con la asociación secundaria de bivalentes observada en especies e híbridos con meiosis regular apoyaron la hipótesis de que las especies actuales de Amaranthus con 2n=32 cromosomas son poliploides con x=8. EL número n=16 sería un número básico derivado y n=17 habría surgido por trisomía primaria. Se han dado varios ejemplos en los cuales el análisis meiótico ha permitido dilucidar el origen y postular modos de especiación en varios grupos. Como ya se ha discutido, el apareamiento puede estar bajo control genético (por ejemplo genes tipo Ph) y a menudo estos genes pueden constituir un sistema mucho mas simple que los que controlan caracteres diagnósticos de especies y géneros. El establecimiento de sistemas taxonómicos basados en relaciones genómicas deben en lo posible estar apoyados por estudios citogenéticos completos (cariotipo, bandeo C y fluorescente, contenido de ADN, etc.), morfológicos, bioquímicos y moleculares. Además de la utilidad en estudios taxonómicos y evolutivos el conocimiento de la meiosis es de importancia fundamental en estudios aplicados. En la producción de híbridos o poliploides de importancia agronómica se debe lograr un máximo de fertilidad y esto está relacionado con el comportamiento cromosómico. Aunque no siempre la esterilidad es de origen cromosómico, éste es un parámetro que debe ser controlado. 4 Variación intra e interespecifica en el tamaño del genoma: evolución y significado adaptativo Durante el proceso evolutivo ocurren cambios cuantitativos y cualitativos en el contenido de ADN total. En Angiospermas el tamaño del genoma es muy variable entre grupos, oscilando entre 0,2 pg en Arabidopsis thaliana a 127,4 pg en Fritillaria assyriaca no estando esta variación relacionada necesariamente con nivel de ploidia. El contenido de ADN (valor C) se evalúa mediante microdensitometría o citometría de flujo. Si se descarta la variación en el nivel de ploidía, las principales causas de variación (intra o interespecífica) del contenido de ADN serian: aneuploidía, polimorfismo numérico para cromosomas accesorios o supernumerarios, reordenamientos cromosómicos con perdida o duplicación de material genético y variación en el número de copias de secuencias no codificantes. La variación del tamaño del genoma se encuentra, a grandes rasgos, relacionada con diferencias en la complejidad organísmica pues los virus tienen genomas mas pequeños que las bacterias y éstas a su vez menores que el de eucariotas. Sin embargo en organismos superiores se encontró que el aumento en el valor C no estaba relacionado con complejidad organísmica, ni era explicable por la existencia de mayor número de genes funcionales (el contenido de ADN de un alga unicelular, por ejemplo, puede ser igual al de una angiosperma leñosa). Esta paradoja o enigma del valor C (C: contenido de ADN del genoma haploide no replicado) fue explicada, en parte, cuando se demostró que en Angiospermas la variación del tamaño del genoma involucra cambios en la cantidad y proporción de secuencias de ADN repetidas. Los estudios moleculares han reve- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 73

59 lando gran complejidad dentro de los genomas existiendo, además del ADN codificante, secuencias repetidas que no codifican tales como ADN satélite, minisatélites, microsatélites, y elementos transponibles. En general, la relación «ADN génico, no génico» disminuye con el aumento del tamaño del genoma y en angiospermas con elevado contenido de ADN las secuencias repetidas pueden representar hasta el 90% del ADN total. Estos resultados explican la naturaleza de la variación pero plantean interrogantes acerca del significado evolutivo de esta arquitectura repetida del genoma: cuál es el origen, función y/o significado de esta variación? cuál es el papel del ADN repetido, típicamente no codificante?, qué relación poseen estos cambios con la fluidez y plasticidad del genoma en plantas? y cual es la dirección, distribución y extensión de estos cambios en distintos grupos vegetales?. Un enfoque para comprender el significado del tamaño del genoma fue analizar las relaciones que existían entre el contenido de ADN y características celulares, organísmicas y geográficas. En varios grupos de plantas se vio que las variaciones en el contenido de ADN total están correlacionadas positivamente con: volumen o longitud cromosómicas, área y volumen celular, porcentaje de heterocromatina, longitud del complejo sinaptonémico, duración del ciclo mitótico, duración de la meiosis, tiempo mínimo de generación, factores fenológicos, latitud y altitud. Bennett (1987) crea el término «nucleotipo» para referirse a los aspectos del ADN nuclear que afectan al fenotipo independientemente del ADN codificante. En la literatura existen muchos datos que sugieren que el tamaño del genoma posee significado adaptativo y que los parámetros nucleotípicos juegan un papel importante en la evolución, diversificación y adaptación a distintos ambientes, limitando el rango de expresión fenotípica que puede ser alcanzado por acción génica. Por otro lado, varios autores opinan que las secuencias de ADN no génico que pueden variar en el genoma no poseen significado adaptativo constituyendo ADN «egoísta, parásito o ignorante». Otros investigadores señalan que no puede descartarse la existencia de mecanismos moleculares que generen ADN repetido no codificante que, en forma oportunista, actúe como mutágeno y /o agente regulador. En algunos organismos se ha demostrado que la transposición de elementos móviles retrovirales pueden alterar la dinámica del genoma provocando una inestabilidad que se puede traducir en una súbita explosión de variabilidad. Se conocen procesos de escisióninserción de elementos móviles produciendo por ejemplo, plantas variegadas. Estos procesos pueden, además, producir reestructuraciones cromosómicas alterando el orden y posición de los genes. Estos cambios rápidos pueden ser potentes mecanismos evolutivos ya que concomitantemente con el aislamiento reproductivo que implica la diferencia en rearreglos estructurales, los mismos pueden involucrar efectos de posición que, en algunos casos, poseen valor adaptativo. Todos estos procesos tienen, además relevancia en aspectos aplicados más inmediatos ya que un cambio en la posición de un gen puede cambiar la expresión o la función bioquímica del mismo. Se ha demostrado que el genoma de las plantas es inestable y responde al estrés provocado por alteraciones genómicas, ambientales, cromosómicas o citoplasmáticas. Estos factores físicos, bioquímicos o genéticos inducen mecanismos de inestabilidad insercional o modifican el numero de copias de secuencias de ADN no codificante. La hibridación, en la naturaleza o en prácticas de mejoramiento, ha sido, en algunos casos, un factor que desencadena mecanismos de aumento de ADN repetido. Otros experimentos han mostrado que la interacción entre el genoma y el medio resulta en una rápida generación de variación. En lino, por ejemplo, se encontraron diferencias en el número de copias de ADN repetido entre líneas que crecían en medios con diferentes nutrientes. En líneas aloplasmicas de maíz hemos encontrado que el citoplasma de teosinte provocaba activación de elementos transponibles concomitantemente con aumento de secuencias de ADN repetido correspondientes a las zonas heterocromáticas. El análisis del contenido de ADN ha permitido evaluar rápidamente fenómenos de aneuploidía y poliploidía generados por estrés durante prácticas de cultivo de tejidos. 74 POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

60 La variabilidad intraespecífica en el contenido de ADN fue informada y probada en varios grupos taxonómicos. El maíz y especies silvestres relacionadas constituyen un ejemplo de variación intraespecífica donde está bien demostrada la variación en el contenido de ADN debida a variación en porcentaje de heterocromatina (ADN repetido) y en el número de cromosomas supernumerarios. En veintiuna razas nativas de maíz del noroeste argentino ubicadas a lo largo de un gradiente altitudinal encontramos una correlación lineal negativa significativa entre el contenido de ADN de los cromosomas normales (A) y la altitud de cultivo, esto significa que el contenido de ADN de los cromosomas del maíz es menor en lugares de cultivo elevado, sugiriendo que las diferencias no pueden ser al azar y obedecen a procesos selectivos. Es interesante señalar que esta disminución del contenido de ADN de los cromosomas A se correlaciona con un aumento en la frecuencia de cromosomas accesorios no codificantes (B). Aunque se desconocen las causas de este cline discordante entre dos tipos de ADN supernumerario no codificante (ADN repetido- cromosomas B), su repetibilidad en distintos ambientes sugiere que existen fuerzas selectivas involucradas en su mantenimiento. La presencia de cromosomas accesorios (heterocromáticos, no codificantes sin funciones vitales para el organismo), en razas nativas de plantas cultivadas tales como maíz y centeno, es una de las incógnitas actuales de la biología evolutiva y aun no se comprende el papel que pueden jugar los mismos en futuros planes de mejoramiento. El particular modo de herencia de estos cromosomas accesorios (con mecanismos de impulso que hacen que se hereden con mayor frecuencia que la esperada por herencia mendeliana) abre un nuevo campo de investigación en lo que se refiere a su utilidad como portadores de genes útiles en programas de mejora. En resumen, la evolución del genoma eucariota ha involucrado casos de amplificación, divergencia, reamplificación y deleción de secuencias de ADN repetido. Estos procesos han llevado a grandes diferencias en el tamaño del genoma, quedando aun muchas cuestiones por resolver en lo que se refiere a los mecanismos moleculares involucrados, la frecuencia con que ocurren estos eventos y la relación de los mismos con factores ambientales, genéticos ó fisiológicos. Resolver estas cuestiones permitirá comprender el papel de la variación del tamaño del genoma en la evolución y analizar la relevancia de la variación del contenido de ADN con relación a características de importancia agronómica. 5 Citogenética molecular: resolución de problemas básicos y aplicados El hallazgo de técnicas para identificar genomas y cromosomas en preparaciones de rutina ha representado un gran progreso en la citogenética vegetal, ya que disponer de marcadores cromosómicos permite estudiar la organización del genoma y la arquitectura nuclear. Las técnicas de bandeo (C, fluorescente) permiten revelar zonas de ADN altamente repetido (heterocromatina constitutiva), pero no diferencian la composición molecular del ADN. En ausencia de bandas marcadoras no es posible identificar cromosomas con morfología similar. Además en especies alógamas suele existir polimorfismo para número y posición de zonas heterocromáticas, lo que dificulta la caracterización cromosómica y la detección de regiones introgresadas. Un notable ejemplo de polimorfismo y politipismo para bandas heterocromáticas lo constituye el estudio de líneas y razas nativas de maíz. Los marcadores moleculares combinados con la citogenética resultaron ser de gran utilidad para entender la organización cromosómica y la distribución física de las secuencias repetidas. El gran potencial de las técnicas de hibridación in situ resulta de combinar información acerca de la morfología nuclear o cromosómica con la información molecular de la estructura de las secuencias. Aunque estas técnicas se conocen desde 1969 utilizando marcación radioactiva, en plantas se comenzó a aplicar a fines de la década del 80 debido a la gran disponibilidad de secuencias clonadas para utilizar como sonda. Además, la posibilidad de utilizar ADN genómico total como sonda ( GISH) y modernos sistemas de marcación y detección no radioactivos han impulsado el uso de esta técnica en forma rutinaria, complementando los resultados obtenidos por metodologías más clásicas. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 75

61 Mediante la aplicación de estas técnicas se obtienen datos que podrán ser utilizados en estudios de sistemática, filogenia, biodiversidad, evolución, mejoramiento y biotecnología. La hibridación in situ (ISH) de sondas de ácidos nucleicos en preparaciones cromosómicas involucra cuatro pasos fundamentales que son: 1) Obtener una sonda marcando secuencias de ADN; 2) reacción de hibridación entre la sonda y el ADN blanco (cromosomas), ambos desnaturalizados previamente. Las secuencias complementarias de la sonda y del ADN de los cromosomas hibridarán, en relación a su homología, en un «sitio citológico»; 3) remoción de la sonda que no se unió o que se hibridó en forma inespecífica; 4) Detección de la hibridación y visualización de la hibridación a través de fluorocromos. Una de las aplicaciones de esta técnica (FISH o «fluorescent in situ hybridization») es la obtención de un mapa físico, funcional y estructural del genoma utilizando secuencias de distinto origen como sondas. El análisis de la organización física de secuencias repetidas, genes, secuencias clonadas (BACs, ESTs, ver II_3), rdna, transgenes, retrovirus, etc., permite identificar cromosomas, analizar la arquitectura nuclear del genoma y verificar hipótesis acerca de la relación entre posición y función de determinadas secuencias. Otras aplicaciones de esta técnica consisten en determinar la distribución y posición de material cromosómico extraespecífico, la existencia de apareamiento y recombinación intergenó-mica, la existencia de segregación preferencial (responsables de herencia no mendeliana de algunos tipos cromosómicos), la presencia y tipo de rearreglos cromosómicos y analizar la segregación de determinados cromo-somas en estudios evolutivos y planes de mejora. Estos son relevantes para comprender la relación entre estos fenómenos y variaciones en la expresión génica. La hibridación in situ utilizando ADN genómico total como sonda (GISH o Genomic ISH) revela homologías específicas del ADN, principalmente en lo que respecta a secuencias repetidas y ha permitido realizar aportes relevantes en estudios evolutivos, biosistemáticos y en mejoramiento vegetal. Esta técnica ha facilitado, por ejemplo, el reconocimiento de especies parentales en híbridos y poliploides, analizar afinidades genómicas interespecíficas, detectar reestructuraciones cromosómicas, corroborar que en el núcleo existen dominios espaciales de genomas o secuencias particulares, detectar la existencia de apareamiento intergenómico y recombinación. Además, permite analizar la organización nuclear y desarrollo cromosómico en especies e híbridos; detectar la presencia de cromosomas o segmentos cromosómicos introgresantes en planes de mejoramiento; analizar afinidades genómicas interespecíficas en cuanto a variación en secuencias de ADN repetitivo disperso y determinar la naturaleza del apareamiento meiótico en generaciones segregantes de híbridos y poliploides. Es importante señalar que las relaciones obtenidas mediante GISH no son afectadas por genes que producen disturbios en el apareamiento meiótico (asinapsis, desinapsis, apareamiento homeólogo o heterólogo). Como ya fue mencionado, el ADN repetido es el mayor componente del genoma en la mayoría de los eucariontes. En maíz, por ejemplo, el genoma está dominado por elementos repetidos, siendo la mayoría de éstos del tipo disperso (como, por ejemplo, retroelementos), los que ocuparían el 33-62% del genoma. En el género Zea, por ejemplo, existen variaciones intra e interespecíficas en el tamaño del genoma. Su valor (2C) en especies con 2n = 20 oscila, en líneas y razas argentinas de maíz, entre 4,9 y 6,9 pg (5700 Mpb) y es de 9,2 pg (8878 Mpb) en Z. luxurians. Estas variaciones, tanto intercomo intraespecíficas se deberían principalmente a diferencias en la heterocromatina, reveladas por bandeo C y DAPI, que corresponderían a secuencias repetidas «en tandem». Sin embargo, tanto este tipo de ADN repetido «en tandem», como así también el «disperso» correspondiente a los retrotransposones, pudieron haber experimentado amplificaciones y diversificaciones durante la evolución de las especies del género Zea. La técnica GISH es, en la actualidad, la herramienta adecuada para revelar tales amplificaciones y divergencias. Esta técnica puede discriminar en forma directa aquellos genomas que presentan secuencias tan divergentes que no existe hibridación cruza- 76 POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

62 FIGURA 2. A-B, FISH: Zea luxurians (2n=20, A = las zonas amarillas brillantes muestran hibridación con la sonda «Knobs» de maíz marcada don digoxigenina y revelada con FITC; B = contratinción con DAPI, las zonas intensamente hibridadas en A coinciden con las zonas DAPI (+) de B.- C y D = Zea mays ssp. parviglumis, núcleo interfásico; la mayoría de las zonas DAPI (+) observadas en D muestran fuerte señal de hibridación en C; se utilizó sonda «Knob» de maíz marcada con dioxigenina y revelada con FITC. E = Zea mays ssp. mays (2n= cromosomas B), hibridación con sonda rdna pta71 de trigo, marcada con biotina y revelada con Cy3, se señalan (puntas de flechas) los organizadores nucleolares en cromosomas y núcleo interfásico. F = Prometafase I meiótica de la F1 Zea mays ssp. mays x Zea perennis (2n=30); se observan III, II y I; la señal de hibridación se encuentra en un trivalente (señalado con flecha), se utilizó como sonda rdna (pta71) como fue indicado en E. G-I = célula de Tricepiro; G = hibridada con sonda de ADN genómico total de centeno marcado con dioxigenina y revelada con FITC (GISH), se observan 14 cromosomas con fuerte señal de hibridación indicando que Tricepiro posee 14 cromosomas de centeno. H = igual célula rehibridada con la sonda psc119.2 marcada con biotina y que da fuerte señal con Cy3 (en rojo), permitió reconocer los genomas de trigo presentes en Tricepiro. I = contratinción con DAPI. La barra representa 10 micrones, todas con igual aumento. Ver explicación extensa de las figuras en: Ferrari et al., 2001, 2004; Poggio, et al.,1999a,b y Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 77

63 da entre ellas. El uso de ADN genómico total como sonda especie-específica tiene algunas ventajas sobre sondas clonadas pues el ADN genómico total incluye un rango muy amplio de secuencias múltiple copia y es por lo tanto improbable que exista sólo un lugar afín a la sonda. Esto es una ventaja cuando se necesita una amplia especificidad, ya que una sonda clonada sería homóloga de algunos pocos cromosomas o segmentos de cromosomas. En los casos en que la divergencia sea leve, puede modificarse el nivel de exigencia en la hibridación y utilizar DNA no marcado como bloqueante. Esta modificación consiste en agregar a la mezcla de hibridación ADN no marcado en alta concentración. Este bloqueo no sólo aumenta la diferenciación entre la especie que se usa como sonda y la que se usa como bloqueante, sino que reduce la hibridación cruzada con otras especies, ya que muchas plantas de la misma familia comparten muchas secuencias. Para diferenciar especies y cuando la resolución es importante se requiere bloqueo y estricto control de exigencia. Estudios de hibridación in situ (FISH, GISH) mostraron que el cereal sintético Tricepiro (2n=6x=42) está compuesto por 28 cromosomas de trigo, 14 de centeno y pequeñas zonas de introgresión de Thynopyrum. Mediante el uso de sondas repetidas particulares se logró identificar la totalidad de los cromosomas de Tricepiro. Experimentos con GISH han demostrado que Bromus setifolius (2n=28), es uno de los progenitores de B. pictus (2n=70), gramínea patagónica de potencial importancia forrajera. En el genero Zea la técnica GISH nos ha permitido: analizar la afinidad genómica entre subespecies de la sección Zea, y entre maíz, teosinte y géneros relacionados. Mediante GISH hemos demostrado que existen zonas de alta homología entre Tripsacum dactyloides (una de las especies que pudieron haber estado involucradas en el origen del maíz) y Zea mays spp. mays. Estas zonas coinciden con regiones controladoras de la apomixis y secuencias neocentroméricas. Estos resultados apoyan hipótesis planteadas previamente sobre la existencia de zonas de homología entre ambas especies que favorecerían el intercambio genético y la transferencia de genes de importancia para el mejoramiento del maíz. Estudios realizados en especies de la sección Luxuriantes permitió determinar, mediante técnicas de FISH, que Zea luxurians presentaría secuencias teloméricas de ADN altamente repetitivo. El análisis de estas secuencias marcadoras en meiosis nos permitió resolver la constitución cromosómica de las complejas configuraciones meióticas que se observan en híbridos intra e interseccionales. Estos resultados permitieron corroborar las fórmulas genómicas planteadas para las distintas especies, avalando la hipótesis propuesta sobre el origen poliploide del maíz y especies afines. Las mismas técnicas, aplicadas en razas de maíz que presentan polimorfismo numérico para cromosomas B, permitieron postular hipótesis acerca del origen de los mismos. 6 Lecturas recomendada APPELS R., MORRIS R., BIKRAM S. & CEDRIC M Chromosome Biology. Kluger Academic Publish. London BENNETT M. D Nucleotype basic of spatial ordening of chromosomes in eukaryotes and the implications of the order for genome evolution and phenotypic variation. In Genome Evolution, Academic Press, London, pp BENNETT M. D The spatial distribution of chromosomes, Kew Chrom. Conf. II. George Allen & Unwin. P. Brandham & M. D. Bennett (eds.). pp BENNETT M. D The genome, the natural karyotype and biosystematics. In: Plant biosistematics (Grant, W.F., ed.). Academic Press, New York, pp BENNETT, M. D The development and use of genomic in situ hibridization (GISH) as a new tool in plant biosystematics. In: Kew Chromosome Conference IV (Brandham, P.E. and Bennett, M.D. eds.). Royal Botanic Gardens, Kew, pp CUADRADO, A. & JOUVE, N Fluorescent in situ hybridization and C-banding analysis of highly repetitive DNA sequence in the heterochromatin of rye (Secale montanum Guss.) and wheat incorporating S.montanum chromosome segments. Genome 38: FELDMAN, M. & AVIVI, L Genetic control of bivalent pairing in common wheat. The mode of Ph 1 action. In: Kew Chromosome Conference III (Brandham, P.E. ed.). Royal Botanic Gardens, Kew, pp FERRARI, M.R., GREIZERSTEIN, H.E., PACAPELO, A., NARANJO, C.A. & L. POGGIO Identificación cromosómica de Tricepiro, mediante técnicas de bandeo e hibridación in situ (GISH). XXX Congreso Argentino 78 POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

64 de Genética y IV Jornadas Argentino-Uruguayas de Genética, Mar del Plata, de Septiembre de 2001, pág. 80. FERRARI, M.R., GREIZERSTEIN, H.E., PACAPELO, A., NARANJO, C.A., CUADRADO, A., JOUVE, N. & L. POGGIO The genomic composition of Tricepiro, a synthetic forage crop. Genome (Canadá), en prensa. FUTUYMA, D.J Evolutionary biology. (Third Edition). Sinauer Associates Inc. GRANT, V Plant Speciation. Columbia Univ. Press. New York. 435 pp. GRANT, V The Evolutionary Process. W.H. Freeeman and Co. San Francisco, 499 pag. GREIZERSTEIN, E. & POGGIO L Meiotic studies of sponta neus hybrids of Amaranthus: genome analysis. Plant Breeding (Alemania) 114: GRIPYA & T. TSUCHIYA (eds) Chromosome engineering in plants: genetics, breeding, evolution. Part A. Elsvier. HARRISON, G. R Hybrid zones and the Evolutionary Process. Oxford University Press. New York. JACKSON, R.C. & MURRAY, B.G Colchicine-induced quadrivalent formation in Helianthus: evidence of ancient polyploidy. Theor. Appl. Genet. 64: KING, MAX Species Evolution. The role of chromosome change.cambridge Univ. Press LACADENA J. R Citogenetica. Editorial Complutense. 991 pags. LEWIN B GENES VII. Oxford University Press, NY. NARANJO, C. A., MOLINA, M. C. & POGGIO, L Evidencias de un número básico X=5 en el género Zea y su importancia en estudios del origen del maíz. Acad Nac Cs Ex Fis Nat, Buenos Aires, Monografía 5: NARANJO, C. A., POGGIO, L., MOLINA, M. & BERNATENÉ, E Increase in multivalent frequency in F1 hybrids of Zea diploperennis x Z. perennis by colchicine treatment. Hereditas 120: PAGE & HOLMES Molecular Evolution. Blackwell Science. POGGIO, L., CONFALONIERI, V., COMAS, C., CUADRADO, A., JOUVE, N. & NARANJO, C. A. 1999a. Genomic «in situ» hybridization (GISH) of Tripsacum dactyloides and Zea mays ssp. mays with B-chromosomes. Genome 42: the genus Zea: analysis of repetitive sequences used as cytological FISH and GISH markers. Genetics and Molecular Biology (Brasil) 23,4, POGGIO, L., NARANJO, C. A. & JONES, K The chromosomes of Orchids IX. Eulophia. Kew Bulletin 41: POGGIO, L., ROSATO, M. & NARANJO, C. A Meiotic behavior in alloplasmic lines of Zea mays ssp. mays. Genome 40: POGGIO, L., ROSATO, M., CHIAVARINO, A. M. & NARANJO, C. A Genome size and environmental correlations in maize (Zea mays ssp. mays). Annals of Botany (UK) 82 Suppl.A: POGGIO L., ROSATO. M., MAZOTI L. B. & NARANJO, C. A Variable meiotic behaviour among plants of an alloplasmic line of maize. Cytologia (Japón) 62: , POGGIO, L.., WULFF, A.F. & HUNZIKER, J.H. 1986b. Chromosome size, nuclear volume and DNA content in Bulnesia (Zygophyllaceae). Darwiniana 27: SHARMA, A.K. & SHARMA, A. (eds.) Chomosome Painting. Principles, Strategies and Scope. Kluwer Academic Publishers, 179 pp. (Reprinted from Methods in Cell Science 23: (1-3), 2001). SOLTIS D. E., SOLTIS P. S. & DOYLE J Molecular Systematics of Plants II. DNA Sequencing. Kluwer Academic Publishers. 574pp. STEBBINS, G.L Chromosomal Evolution in Higher Plants. Addison Wesley Publ. Reading. Massachusetts. 216 pags. SUMNER, A.T Chromosome banding. London Unwin Hyman.434 pp. SWANSON, C.P., T. MERZ & W.J. YOUNG Cytogenetics. Englewood Cliffs., New Jersey. Prentice Hall, Inc. SYBENGA, J Meiotic Configurations. Springer Verlag. 251 pp TITO, C.M., POGGIO, L. & NARANJO, C.A Cytogenetic studies in the genus Zea. 3. DNA content and heterochromatin in species and hybrids. Theor. Appl. Genet. 83: POGGIO, L., CONFALONIERI, V., COMAS, C., GONZALEZ, G. & NARANJO, C. A. 1999b. Genomic affinities of Zea luxurians, Z. diploperennis and Z. perennis: meiotic behaviour of their F1 hybrids and genomic «in situ» hybridization (GISH). Genome 42: POGGIO, L., CONFALONIERI, V., COMAS, C., GONZALEZ, G. & NARANJO, C. A Evolutionary relationships in Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 79

65 PARTE III Métodos para generar variabilidad Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 81

66 82 CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana

67 III.-Capítulo 1 Variación somaclonal Cardone, Susana; Olmos, Sofía; Echenique, Viviana 1 Introducción El comportamiento celular normal es el resultado de una compleja cascada de programas genéticos que son sensibles a la disrupción por estreses bióticos y abióticos. El cultivo in vitro per se puede ser muy estresante para las células vegetales e involucra procesos mutagénicos durante el establecimiento del explanto, la inducción de callo, la formación de embriones y la regeneración de plantas. Por esta vía es posible obtener variación, de origen nuclear y/o citoplasmática, que podría ser utilizada para el mejoramiento vegetal. Este proceso, denominado variación somaclonal por Larkin y Scowcroft (1981), involucra cambios en las plantas regeneradas que son transmitidos a la progenie. Asimismo cabe citar la ocurrencia in vitro de interacciones no específicas que no generan variación estable y transmisible, pero que conducen a cambios en la expresión génica. Dichos cambios, denominados «epigenéticos», son también considerados por algunos autores como variación somaclonal mientras que otros sólo incluyen en la misma los cambios estables. Los mecanismos por los cuales ocurre la variación somaclonal no han sido completamente dilucidados, pero entre sus causas se mencionan alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinación somática e intercambio de cromátidas hermanas, rearreglos génicos somáticos, elementos genéticos transponibles, amplificación y/o metilación del ADN y cambios en el ADN de las organelas. Por ello, aunque los caracteres morfológicos (como por ejemplo el hábito de crecimiento, la morfología floral, etc.) son fáciles de evaluar, muchos aspectos de la variación suceden sin manifestarse en cambios morfológicos evidentes. Una diferencia estructural en un producto génico puede no alterar su actividad biológica lo suficiente como para producir un fenotipo modificado. Por ello, la variación debe analizarse a varios niveles. Esta variación depende del genotipo, de la fuente de explanto, del tiempo en que el material ha estado sometido al cultivo in vitro, de las condiciones y composición del medio de cultivo y de la vía de regeneración, donde la embriogénesis somática generaría menores alteraciones que la organogénesis. Los cambios producidos son generalmente indeseables, pero la aparición ocasional de caracteres no encontrados en las poblaciones naturales y que representan una ventaja desde el punto de vista agronómico permite utilizar este fenómeno en programas de mejora vegetal. Se ha utilizado en algunos casos para conferir caracteres deseables a cultivares de importancia económica, entre los que se incluyen resistencia a enfermedades, tolerancia a suelos ácidos y a salinidad. El desarrollo de nuevos cultivares por esta técnica involucra un balance entre la cantidad de variación inducida y el mantenimiento de los caracteres agronómicos del cultivar. Como ejemplo puede citarse el caso de somaclones de pasto bermuda, Cynodon dactylon, donde se encontró resistencia a la oruga militar en un cultivar que reunía otras buenas características, dando origen al cultivar Brazos-R3. Si bien desde el punto de vista práctico no resulta una técnica muy eficiente en todos los casos, debido a que no es posible predecir ni dirigir el tipo de variación y se hace menester trabajar con grandes poblaciones de plantas, es necesaria la compresión del mecanismo para evitarlo en casos donde se quiere fidelidad genética, como en la micropropagación, la conservación de germoplasma y la transformación de plantas. También, en algunos casos, puede representar una fuente rápida y fácilmente accesible de variación para ser utilizada en programas de mejoramiento, especialmente para especies con sistemas genéticos limitados y/o de base genética estrecha, como en el caso de la apomixis, donde la variabilidad dentro de las poblaciones naturales o cultivadas es limitada. Los primeros casos de variación somaclonal fueron registrados en plantas de reproducción agámica como la caña de azúcar y la papa, pero el fenómeno ha sido ob- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 83

68 servado en monocotiledóneas como trigo, maíz, avena, arroz, pasto miel (Paspalum dilatatum) y pasto llorón (Eragrostis curvula) y en dicotiledóneas como tabaco, tomate, zanahoria y col, entre muchas otras especies. 2 Factores relacionados con la aparición de variación somaclonal La aparición de la variación somaclonal depende de varios factores, entre los que se han citado: el genotipo, el tipo de explanto, la vía de regeneración, la composición del medio de cultivo utilizado, los reguladores de crecimiento y la duración del período de cultivo. Genotipo. En general se asume que la frecuencia de cambios dependerá de variaciones preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen entre el genotipo y el proceso de cultivo. En arroz, ciertas variedades estables muestran niveles de variación que oscilan entre el 0 y el 1%, mientras que en otras, consideradas inestables, oscilan entre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especie ornamental, la variación somaclonal es genotipo dependiente y se la utiliza como una herramienta para la obtención de variedades. El nivel de ploidía es otro factor a tener en cuenta. Por ejemplo en raigrás (Lolium multiflorum) y en papa se observó que las variedades diploides muestran estabilidad, mientras que las tetraploides tienden a generar aneuploidías durante el cultivo de tejidos. La explicación más razonable es que los poliploides, con más de dos juegos completos de cromosomas, están «tamponados», y por lo tanto toleran la ganancia o pérdida de cromosomas, pudiendo así cumplir con los requisitos impuestos por la regeneración. En los diploides, la pérdida o la alteración de cromosomas que llevan genes vitales impedirá la regeneración de las plantas, llegando con éxito a esta etapa sólo aquellos explantos que tengan su complemento cromosómico completo. Existen evidencias de una mayor inestabilidad en híbridos interespecíficos cultivados in vitro, si se los compara con las especies parentales. Como ejemplo puede citarse el caso de los híbridos obtenidos de la cruza de Hordeum vulgare x Hordeum jubatum, donde el cultivo in vitro generó entre un 5% y un 10% de regenerantes haploides que contenían sólo el genoma de Hordeum vulgare. Por esta causa ciertos cruzamientos interespecíficos suelen utilizarse como metodología para la obtención de haploides. Explanto. La variación también puede ser una consecuencia de quimerismo en el explanto original. Las quimeras son mosaicos genéticos. Esto significa que dentro de una misma planta existen células con diferente constitución genética, lo cual se debe a una serie de cambios producidos durante el desarrollo en el ADN nuclear de ciertos tipos celulares. Si estos tejidos se utilizan como explantos y sus células son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes líneas celulares podrían entonces dar origen a plantas genéticamente diferentes. Por lo tanto, la utilización de explantos con tejidos quiméricos preexistentes puede resultar en una fuente extra de variación. Sin embargo, la recuperación de quimeras a partir de explantos no quiméricos es un fenómeno frecuente que puede ocurrir a partir de procesos organogénicos. La utilización de explantos con tejidos organizados como esquejes radicales o caulinares sería una buena opción si es necesario mantener estabilidad genética durante el cultivo in vitro. Sin embargo, diferentes genotipos reaccionan de manera distinta, aún con explantos «seguros». Parecería que el cultivo de meristemas aislados sería la mejor opción para minimizar el riesgo de variación somaclonal. Sin embargo, esto no debería tomarse como regla. Utilizando técnicas moleculares fue posible detectar la ocurrencia de variación en plantas de frutilla y paraíso obtenidas a partir de meristemas. El cultivo de protoplastos parecería inducir, en ocasiones, inestabilidad genética, como fue observado en papa y Nicotiana. Esto, en ocasiones, ha sido asociado a los mayores tiempos en cultivo involucrados en la regeneración de plantas a partir de explantos tan pequeños. La vía de regeneración también tiene un rol importante en la ocurrencia de alteraciones en plantas obtenidas in vitro. En especies de los géneros Pennisetum, Panicum, y Lolium la variación observada en cultivos embriogénicos es relativamente menor que 84 CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana

69 la que aparece en cultivos organogénicos. Esto probablemente se debe a la gran presión de selección impuesta en la formación de los embriones, mayor que la requerida en la formación de vástagos. Se postula que el gran número de genes requeridos para la iniciación y maduración de embriones cigóticos y somáticos impediría la acumulación de mutaciones deletéreas. Sin embargo, se observaron variantes en plantas de café, apio y caña de azúcar regeneradas a través de embriogénesis somática. En estos casos se observó que algunos fenotipos anormales de embriones somáticos se asemejan a los mutantes del desarrollo embrionario obtenidos en Arabidopsis y maíz. La mayor parte de la variación obtenida in vitro parece provenir de la fase de callo. La iniciación de un callo puede ser análoga a la respuesta de las plantas a heridas, que se sabe que activan elementos transponibles y estimulan la inducción de enzimas y productos específicos que se inducen también en situaciones de estrés. Cuando comienza la división celular a partir de tejidos diferenciados, que dará origen a un callo, se incrementa el riesgo de inestabilidad cromosómica. La variación que ocurre en los números cromosómicos en la primera fase de la inducción del callo sería el resultado de fragmentación nuclear seguida por mitosis de los fragmentos nucleares, combinada con la mitosis normal de los núcleos intactos (núcleos euploides). La naturaleza del callo también puede afectar el nivel de variación obtenida. Un callo verdadero es una masa de células desdiferenciadas que proliferan desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variación. En varias monocotiledóneas, el callo representa, a menudo, una masa de órganos suprimidos o proembriones más que un tejido completamente desorganizado. Este tipo de callo mantiene un alto grado de estabilidad genética, como se ha observado en espárrago. En un estudio realizado en Cymbopogon se observó que muchas de las plantas regeneradas a partir de callos de semilla fueron anormales, mientras que las obtenidas por callos de inflorescencias fueron muy semejantes a las plantas de las cuales provenían los explantos. En ocasiones también fue posible observar variación en plantas obtenidas por regeneración directa, es decir, sin que medie un proceso previo de desdiferenciación celular y formación de callo. Medio de cultivo. El estado físico del medio de cultivo también influye en el nivel de variación obtenida. Un mismo explanto puede tener diferente comportamiento si se lo cultiva en medio sólido o en medio líquido. Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotípica o puede incrementar el número de plantas albinas. Los reguladores de crecimiento, principalmente el 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) han sido señalados como inductores de inestabilidad. Ejercen profundos efectos sobre la respiración celular, el consumo de azúcares y en el control de la división celular. Por ello se especula acerca de su rol indirecto en la inducción de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in vitro. Si bien el modo de acción herbicida del 2,4-D no es totalmente comprendido, aparentemente involucra un incremento sustancial en la transcripción que puede alterar la estructura de la cromatina, siendo utilizado en gramíneas como inductor de aneuploidías. Lo que algunos autores sugieren es que el 2,4-D induce desdiferenciación y este proceso sería el generador de los cambios. La fragmentación nuclear amitótica citada anteriormente observada en algunas plantas regeneradas también se reconoce como causa de aneuploidía. Este fenómeno es causado por una relación especial auxina:citocinina. El 2,4-D, el AIA (ácido indolacético) y el ANA (ácido naftalenacético) han sido señalados como los responsables de los incrementos en la metilación de la citosina que tiene lugar durante el cultivo in vitro. Los sectores en el ADN, donde la citosina se encuentra metilada en posición 5 son considerados puntos calientes de mutación, ya que la desaminación de una 5-metil citocina resulta en un cambio de la base de citocina a timina. Las auxinas naturales y sintéticas tienen una elevada correlación con el porcentaje de 5- metil citocina, las citocininas no tienen efecto en este sentido. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 85

70 Estudios tendientes a analizar los efectos de los reguladores de crecimiento sobre la regeneración de plantas a partir de protoplastos, realizados en papa, indicaron que la variación en el tipo y concentración de reguladores de crecimiento en los estadios iniciales de cultivo no generaría variación genética. Sin embargo, si el cambio en la composición de los reguladores ocurre en el estadio que va desde el crecimiento del callo a la iniciación de los vástagos, se generan elevados niveles de variación genética. Estos datos sugieren que la fase de callo sería un período sensible en el cual la manipulación hormonal afecta la estabilidad de las plantas regeneradas, de manera que las hormonas inducirían la inestabilidad genética sin ser, necesariamente, el origen de la misma. Otro factor a considerar es la deficiencia de oxígeno que se genera durante el curso del cultivo. La tensión de oxígeno de las células en la superficie del callo es diferente a la de aquellas células que se encuentran situadas profundamente en la masa del mismo. La anaerobiosis resultaría en la producción de etanol, el cual podría comportarse como un mutágeno. También existen especies de plantas que producen compuestos mutagénicos durante el cultivo. Un efecto similar podría tener la acumulación de metabolitos producidos por las propias células durante el proceso. Se ha mencionado que las condiciones de cultivo in vitro podrían afectar los niveles de resistencia celular al efecto de los metabolitos que normalmente se encuentran presentes en los tejidos en bajas concentraciones. La edad del cultivo es otro factor que afecta el nivel de variación, aumentando la proporción de variantes en cultivos envejecidos y también en plantas obtenidas a través de varios subcultivos. Esto se ha observado en ajo, maíz, avena, tabaco, triticale y raigrás triploide. La variación puede minimizarse realizando subcultivos frecuentes de explantos no envejecidos. El número óptimo de subcultivos podría estimarse empíricamente luego de realizar pruebas de fidelidad genética en las plantas regeneradas a través de subcultivos subsecuentes. Una observación común es que en los períodos prolongados de cultivo hay una pérdida de totipotencia y que esto sucedería debido a la acumulación de mutaciones y a la alteración de los genes que son responsables de la regeneración. Sin embargo, un estudio realizado por nuestro grupo de trabajo en la UNS, en colaboración con el IBONE, demostró que las variaciones se producen al azar en los diferentes subcultivos, no habiendo una relación lineal entre el número de subcultivos y la cantidad de variación obtenida en plantas micropropagadas de paraíso gigante. La variación en este caso se detectó mediante la ténica de RAPD a lo largo de de 10 subcultivos (Olmos y col., 2002). La deficiencia o exceso de minerales también podría afectar la estabilidad genética in vitro. Se ha observado que las deficiencias o excesos de azufre, fósforo, nitrógeno, calcio y magnesio pueden resultar en cambios genómicos. En la variedad de lino «Stortmont Cyrrus» se detectaron cambios genéticos estables y heredables inducidos por una alta fertilización del suelo con fósforo o con nitrógeno. Varias líneas estables obtenidas, fundamentalmente una llamada «L» y otra llamada «S», denominadas genotrofos, se caracterizaron por poseer diferentes contenidos de ADN nuclear, de ADN repetitivo y diferencias a nivel del ADN ribosomal. 3 Cambios genómicos producidos durante el cultivo de tejidos Las plantas poseen una amplia capacidad de acomodarse a las situaciones cambiantes de su entorno, pero en algún momento esa capacidad de amortiguación se vuelve deficiente y los organismos caen en un estado de crecimiento subóptimo que podría inducir a mecanismos generadores de cambios genómicos. Las bases metabólicas de la interacción entre el estrés y estos cambios son desconocidas. Sin embargo, en la literatura se menciona la posibilidad de ocurrencia de alteraciones a nivel del ADN a consecuencia de diferentes estreses ambientales, dependiendo de la intensidad del estrés y del estado de diferenciación de las células en el momento de experimentarlo. Estos cambios ocurren probablemente debido a un mecanismo de respuesta al estrés que comprende la pérdida del control del ciclo celular. En el caso de un callo, la desdiferenciación que se produce durante la inducción del mis- 86 CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana

71 mo provoca en las células una serie de procesos metabólicos que resultan en reordenamientos genómicos que podrían dar lugar a fenotipos alterados. Entre las alteraciones genéticas registradas durante el cultivo in vitro pueden citarse mutaciones génicas, cambios cromosómicos que involucren la estructura o el número de los cromosomas y activación de elementos genéticos transponibles. También existen anomalías, como el intercambio entre cromátidas hermanas o el «crossing over» somático, que pueden alterar su frecuencia de aparición en plantas regeneradas respecto de plantas que no pasaron por cultivo in vitro. Varias hipótesis han intentado explicar y relacionar la serie de eventos que tienen lugar durante el cultivo in vitro, como por ejemplo las perturbaciones del ciclo celular, las aberraciones estructurales y numéricas, los cambios en la metilación y las mutaciones génicas. Kaeppler y Phillips (1993) han propuesto una base molecular común para todos estos eventos mutagénicos. Tal mecanismo podría afectar la expresión génica y la estructura de la cromatina. Un posible mecanismo involucra alteración en los patrones de metilación. Esta hipótesis establece que el estrés inducido por el proceso de cultivo in vitro, al involucrar efectos hormonales y desbalance en el conjunto de nucleótidos, provoca alteraciones en los patrones de metilación del ADN. Estas alteraciones podrían afectar la expresión de genes específicos, incluyendo elementos transponibles y/ o podrían afectar la estructura de la cromatina de una manera más global, involucrando, por lo tanto, a un gran número de genes. Los cambios en la metilación del ADN podrían estar relacionados con la replicación tardía de la heterocromatina, que, en definitiva resulta en eventos de ruptura cromosómica. El mecanismo por el cual se producen los cambios en metilación no ha sido totalmente dilucidado. Kaeppler y Phillips (1993) indican que plantas bajo estrés severo de nutrientes o de agua no presentan estos cambios de metilación encontrados en los regenerantes de cultivo in vitro. Esto podría indicar que la variación en metilación no es una respuesta general a todos los estreses. El cultivo de tejidos podría representar, por lo tanto, un tipo muy particular de estrés que podría inducir una respuesta única y un perfil particular de mutación. Un posible efector de esta variación en la metilación sería la alta concentración de reguladores de crecimiento utilizada para inducir a las células a crecer en cultivo. El 2,4-D provoca cambios en la estructura de la cromatina en ápices de raíz de echalote y también en cultivos de células humanas. Las auxinas podrían ejercer el mismo efecto durante el cultivo de tejidos vegetales. Se cree, además, que los cambios en los modelos de metilación causados por el cultivo de tejidos no serían aleatorios. En este sentido, en raigrás se ha propuesto la existencia de puntos calientes de inestabilidad en el ADN genómico. Los puntos de ruptura de muchas de las alteraciones estructurales presentes en las plantas regeneradas se hallan en zonas heterocromáticas, de manera que parecería que la variación somaclonal no es al azar y que habría loci específicos que tendrían mayor tendencia a la mutación. Los cambios estructurales que no están asociados a cambios en el dosaje génico o a cambios en la regulación suelen pasar desapercibidos fenotípicamente, pero pueden causar infertilidad. Por otra parte ocurren también cambios genómicos que involucran alteraciones en el número de cromosomas, como aneuploidías y poliploidías. La poliploidía es el más común de estos fenómenos y estaría relacionada con fallas en la mitosis, mientras que la aneuploidía puede surgir por segregación desigual en la mitosis o por fragmentación nuclear, seguida de mitosis. A veces estos cambios en el número cromosómico pueden afectar el fenotipo a través de dosajes génicos alterados. En papa, por ejemplo, se observaron fenotipos aberrantes por aneuploidía o por duplicación cromosómica; sin embargo, no todos los regenerantes aneuploides o poliploides pudieron detectarse a nivel fenotípico. Los cambios pueden ocurrir también en el genoma de los plástidos y las mitocondrias. Como ejemplo puede mencionarse la restauración parcial de la fertilidad en plantas de sorgo androestériles obteni- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 87

72 das in vitro. También puede citarse el caso del cultivo in vitro de plantas androestériles de maíz con citoplasma «T» (susceptibles a Helminthosporium maydis), que condujo a la reversión de la androesterilidad y de la susceptibilidad. Estos cambios se corresponderían con mutaciones en el ADN mitocondrial. Otro caso de variación debida al cultivo in vitro es el albinismo, problema que se presenta frecuentemente en el cultivo de anteras en las Gramíneas. El análisis de los genomas de cloroplastos de plantas albinas de trigo obtenidas a partir del cultivo de anteras reveló la presencia de deleciones y rearreglos. Si bien parecería que los tejidos somáticos son menos sensibles a la variación, también se ha observado albinismo en plantas regeneradas a partir de los mismos. Como puede apreciarse a través de los casos mencionados, son varios los mecanismos que conducen a la variación somaclonal. Como se mencionara anteriormente existen, además, variaciones epigenéticas, que no son estables y que son el resultado de cambios en los patrones de metilación del ADN y de amplificaciones génicas, provocados por las condiciones microambientales del cultivo de tejidos. Características tales como el acostumbramiento a la citocinina y la resistencia a heladas pueden citarse como ejemplos de este tipo de variación. La comprensión de los mecanismos por los cuales ocurre la variación somaclonal ayudaría a comprender y definir los procesos celulares de respuesta al estrés y permitiría definir cómo los mismos actúan en los procesos de evolución (Kaeppler et al., 2000). 4 Niveles de detección de la variación somaclonal Es evidente que los mecanismos que operan para inducir variación son numerosos y diversos, y probablemente actúan simultáneamente, conduciendo a cambios en caracteres cuali y cuantitativos. Detectar y analizar los distintos niveles de modificaciones genómicas generadas por cultivo in vitro reviste interés desde un punto de vista práctico, ya que las mismas podrían ser potentes fuentes de material para seleccionar caracteres de interés y, desde un punto de vista teórico, ya que posibilitarían realizar estudios básicos acerca de la variación y el posible control de la misma. La ocurrencia de variación somaclonal puede detectarse con marcadores fenotípicos, bioquímicos y moleculares. La correlación de dichos marcadores con caracteres agronómicos es un requisito relevante para su implementación en los programas de mejoramiento. Se citan a continuación algunos ejemplos de la utilización de marcadores de varios tipos en la evaluación de la variación somaclonal.. La utilización de marcadores morfológicos para detectar variantes somaclonales ha sido exitosa y citada en varios trabajos de investigación. El examen visual y la utilización de un analizador de imágenes posibilitaron la diferenciación entre fenotipos normales y aberrantes de plantas regeneradas de Pelargonium x hortorum Río. Plantas de (maní) presentaron variaciones epigenéticas en altura, tamaño de hojas, número y peso de semillas. El cultivo in vitro de yemas de ananá dio como resultado plantas que exhibían cambios estables en el tamaño de frutos, tasa de proliferación de vástagos y color y textura de las hojas; el cultivo de tejidos de violeta africana, variedad «Crimson Frost», resultó en un 67% de variación en el color de las flores de las plantas regeneradas. A nivel fisiológico, se detectaron y seleccionaron variaciones en cultivo de células y tejidos por presentar resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, sales, diferencias de crecimiento en condiciones de phs variables, entre otros, tanto para cereales como para plantas frutales. La mayoría de estos estudios se basaron en la implementación de una alta presión de selección durante la etapa de regeneración celular mediante la adición de agentes selectivos en el medio de establecimiento y regeneración, tales como inóculos, toxinas, herbicidas, condiciones de ph extremas o concentraciones salinas elevadas. El estudio del cariotipo permite detectar cambios en el número y estructura de los cromosomas. De esta manera podrían detectarse translocaciones, inversiones, deleciones y duplicaciones. Los cambios cariotípicos constituyen una fuente importante de variación que muchas veces es subestimada cuando se realizan recuentos cromosómicos. Por esto 88 CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana

73 mismo existen otras técnicas que estiman cambios cariotípicos con mayor eficiencia, como por ejemplo el bandeo cromosómico. Esta técnica fue aplicada a suspensiones celulares de Brachycome dichromosomatica (2n = 4), donde permitió detectar rearreglos importantes en individuos donde el número cromosómico permaneció estable. La hibridación in situ es otra de las técnicas que podría aportar información útil para detectar cambios genéticos estructurales. Entre los marcadores bioquímicos utilizados para analizar progenies de plantas regeneradas pueden mencionarse las isoenzimas, que permitieron detectar entre un 24 a 35% de variación en plantas de Populus tremuloides regeneradas a través de callos. Esta variación fue detectada mediante electroforesis en geles de almidón utilizando los sistemas isocitrato deshidrogenasa (IDH) shiquimato deshidrogenasa (SKDH), malato deshidrogenasa (MDH), fosfogluco- isomerasa (PGI) y 6-fosfogluconato - deshidrogenasa (6-PGD). Los patrones electroforéticos permitieron caracterizar a las plantas fenotípicamente normales y anormales. Sin embargo, las plantas albinas obtenidas en este estudio no presentaron polimorfismos en los loci estudiados. En otros casos el análisis isoenzimático no permitió detectar variación. El estudio de líneas de callos derivadas de embriones cigóticos y de embriones somáticos de abeto (Picea glauca x engelmannii) utilizando 15 sistemas isoenzimáticos no evidenció la presencia de variación somaclonal en 25 loci analizados. Los patrones isoenzimáticos de líneas isogénicas de Trifolium pratense L. que diferían en su capacidad de regeneración, resultaron idénticos para los sistemas de peroxidasas, glutamato deshidrogenasas, alcohol deshidrogenasas y esterasas. Las isoenzimas, por lo tanto, pueden proveer información útil acerca de la variación generada in vitro. Sin embargo, se están analizando los productos de genes expresados, cuya regulación puede estar en cierta medida afectada por factores ambientales o fisiológicos. Por otro lado, sólo se transcribe y traduce una pequeña proporción del genoma. Por ello, los métodos de análisis a nivel molecular pueden proporcionar mucha información, ya que las secuencias de ADN son esencialmente las mismas en todas las células vivas de la planta, independientemente del estado fisiológico o de desarrollo de las mismas. Los marcadores moleculares presentan varias ventajas a la hora de detectar inestabilidad genética debido a su amplia cobertura del genoma y a que no son influenciados por el ambiente ni por los estados fenológicos de las plantas. Utilizando RAPD pudo detectarse la existencia de polimorfismos en plantas de Triticum tauschii obtenidas mediante callogénesis. Los RAPD para diagnosticar fidelidad genética en plantas regeneradas por cultivo in vitro han sido utilizados en Pinus mariana (Mill), Festuca pratensis Huds., Picea abies, Quercus suber L.y Panax notoginseng. En Phalaenopsis se ha encontrado correspondencia entre variaciones morfológicas y moleculares, pudiéndose discriminar plantas normales de variantes morfológicas mediante la combinación de perfiles RAPD generados por 38 cebadores. En otros casos no ha sido posible realizar esta asociación, probablemente debido a la necesidad del empleo de un mayor número de cebadores. En Pelargonium x hortorum «Río» el empleo de un conjunto de 13 cebadores permitieron la detección de polimorfismos en solamente el 50% de las plantas con fenotipos aberrantes. En Mentha arvensis se obtuvieron perfiles RAPD polimórficos con 12 cebadores en las 6 plantas fenotípicamente diferentes obtenidas por micropropagación. En otro estudio se observó que no todas las plantas de Musa de fenotipo anormal (enanas) obtenidas presentaban el mismo patrón de bandas. En este mismo género, la técnica permitió detectar polimorfismos en plantas micropropagadas de fenotipo normal. Esto indicaría que la variación molecular no siempre se expresa a nivel fenotípico y viceversa. Existen otros ejemplos que corroborarían esta afirmación, tal es el caso de la palmera datilera (Elaeis guineensis Jacq.), donde no se detectaron polimorfismos en plantas regeneradas que habían presentado fenotipos florales anormales o el de plántulas micropropagadas de Populus deltoides, donde a través de la utilización de microsatélites se detectaron polimorfismos en plantas Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 89

74 fenotípicamente normales. Otros marcadores moleculares utilizados con éxito para la evaluación de variación somaclonal, como los AFLP, permitieron detectar en banana la existencia de diferencias a nivel molecular entre plantas regeneradas de fenotipo normal y aberrantes. A veces, para detectar un cambio es necesario realizar pruebas específicas. Por ejemplo, se evaluaron somaclones de Cynodon dactylon en laboratorio, invernáculo y a campo para resistencia a la oruga militar. Un somaclon, el Brazos-R3 (Croughan y col., 1994), tenía un rendimiento a campo equivalente al del cultivar madre, pero además era resistente a dicho insecto. Esto fue debido a que producía menores niveles de un estimulante para la alimentación del insecto. Es decir que mantenía los caracteres agronómicos positivos del cultivar parental, pero tenía un cambio en la producción de un metabolito secundario que confería resistencia a la oruga. 5 La variación somaclonal y su aplicación en el mejoramiento genético de las plantas La base del mejoramiento genético es la optimización de interacciones génicas. Para lograr combinaciones génicas óptimas o superiores se requiere de diversidad genética. Esta diversidad, que se encuentra normalmente en las poblaciones de individuos, puede provenir de cruzamientos sexuales, mutaciones inducidas (físicas o químicas o producidas por ADN-T o por elementos transponibles o retrotrasposones), hibridación somática y transformación genética. La variación somaclonal proveería una fuente adicional de variabilidad genética, utilizable en programas convencionales de mejoramiento. Algunas de las ventajas que presenta la variación somaclonal pueden resumirse de la siguiente manera: Es relativamente poco costoso generarla: requiere de un laboratorio de rutina y facilidades de campo. Constituye una forma rápida de generar variabilidad genética, particularmente para cultivos con base genética estrecha y que son difíciles de mejorar a través de técnicas tradicionales. Es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien adaptados. Puede utilizarse para mejorar especies de propagación sexual y vegetativa. Las tasas de mutación son relativamente altas si se comparan con las tasas de mutaciones espontáneas. La variación somaclonal ocurre con una frecuencia de 1 mutación cada 100 plantas regeneradas, en contraste con la tasa esperada de mutación espontánea de mutaciones por par de nucleótidos por generación. El conocimiento de las condiciones que generan inestabilidad genética durante el cultivo in vitro permitiría utilizar el fenómeno como estrategia de mejoramiento y permitiría eludirlo en aquellos casos en que se requiera estabilidad genética, como en la micropropagación, la conservación de germoplasma y la transformación genética. El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan mutágenos químicos o físicos, ya que, en el caso de la variación somaclonal, la mayoría de los cambios deletéreos producidos son eliminados por el filtro que representa la regeneración de plantas. Entre las desventajas cabe mencionar: En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa de laboratorio o invernáculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia práctica. La escasa regeneración de plantas en cultivos de largo término. Generalmente en estos casos existe pérdida de la capacidad morfogénica. La regeneración está limitada a genotipos específicos que pueden no ser de mucho interés para los mejoradores. Algunos somaclones son inestables (originados por variación epigenética). Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploidía, esterilidad, etc. Desde el punto de vista productivo y comercial, una variante somaclonal debería cumplir los siguientes requerimientos: 90 CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana

75 Involucrar caracteres agronómicamente útiles. El nivel de expresión del carácter debe superar al de sus progenitores. El carácter mejorado debe estar combinado con todos los otros caracteres agronómicos de la variedad que son importantes para el cultivo. La variación debe ser heredable (o bien estable) en las generaciones subsiguientes. En general, los mejoradores buscan en los somaclones caracteres de importancia práctica. La estrategia es utilizar cultivares altamente adaptados para modificar unos pocos caracteres, ya que resulta más sencillo mejorar selectivamente una variedad corriente que crear una nueva. etapa de multiplicación de semillas, que permitirá realizar pruebas agronómicas en diferentes ambientes, al menos en dos años distintos, para evaluar los efectos del componente ambiental en la expresión del carácter. El programa finaliza con la etapa de multiplicación de semillas para el lanzamiento de la variedad nueva al mercado. Una modificación para la producción de nuevas variedades está basada en el empleo de variantes gametoclonales (Fig. 1). Si se utilizan células haploides como fuente de tejido, las variantes obtenidas se denominan variantes gametoclonales. Los gametoclones 5.1 Estrategias para la selección de variantes útiles Las estrategias que se han utilizado para obtener variación somaclonal comprenden: a) La obtención de plantas por cultivo de células o tejidos, que luego son analizadas para el carácter deseado. La Figura 1 resume los pasos a seguir para la obtención de un cultivar por variación somaclonal. Para este fin se cultiva la mejor variedad disponible y se seleccionan, entre las plantas regeneradas, aquellas que expresen el carácter de interés. Estas plantas (generación R 0 ) se emplean para generar progenies sexuales (en el caso de plantas con este tipo de reproducción), sobre las cuales se vuelve a realizar la selección para el carácter agronómico buscado, tratando de mantener a la vez todas las características favorables de la variedad. En plantas autógamas, como trigo, arroz y cebada, se considera aceptable la evaluación de la estabilidad del carácter hasta la generación R 4. A partir de este momento pueden realizarse cruzamientos de las plantas R 4 selectas con las líneas parentales a fin de determinar, mediante el análisis de segregación, la base genética del carácter mejorado. Posteriormente viene la Figura 1: Estrategia para la producción comercial de variantes somaclonales (izquierda) y gametoclonales (derecha) en arroz. se refieren a regenerantes haploides duplicados, derivados del cultivo de anteras. Esta metodología tendría la ventaja de permitir recuperar caracteres recombinantes además de los que pudieran surgir in vitro. Las plantas haploides obtenidas son duplicadas mediante la exposición al alcaloide colchicina. Las evaluaciones a campo se realizan en forma conjunta a medida que los nuevos materiales van siendo multiplicados, de manera de aumentar las replicas bajo diferentes condiciones ambientales. b) La selección a nivel celular, selección in vitro, que se hace con el objetivo de obtener resistencia a estreses bióticos o Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 91

76 abióticos y se utiliza generalmente para caracteres tales como resistencia a toxinas fúngicas, herbicidas, concentraciones salinas elevadas y temperaturas extremas. Mediante esta estrategia pueden cultivarse explantos de distintos genotipos y observarse el comportamiento de los callos frente al agente selectivo, en condiciones de laboratorio. Una vez seleccionados los genotipos resistentes se procede a la regeneración de las plantas, que son analizadas para ver si expresan la resistencia a campo y luego son introducidas en el programa de mejoramiento. La selección efectuada sobre cultivos celulares in vitro puede llevarse a cabo mediante dos modalidades: - Selección directa en un solo paso, donde el agente de selección es utilizado en con- Figura 2: Selección in vitro de plantas de arroz tolerantes a altas concentraciones de aluminio centraciones dobles o triples de la MIC (concentración mínima que produce un 100 % de inhibición). - Selección en varios pasos, donde la concentración del agente selectivo es gradualmente incrementada en cultivos sucesivos y frecuentes. El primero es un método simple y efectivo, ya que las células sensibles al agente morirían, permitiéndo el crecimiento de las tolerantes. Sin embargo, elevados niveles de estrés serían deletéreos a nivel celular, eliminando materiales que tal vez, con un mayor nivel de diferenciación tisular hubiesen sido capaces de regenerar plantas tolerantes. La elección de un método u otro dependerá de un monitoreo preliminar que proporciona una indicación acerca de la reacción del tejido vegetal a las concentraciones letales y subletales del agente selectivo. En la Figura 2 se representan las etapas de la selección in vitro. En el ejemplo diferentes líneas de arroz son evaluadas para tolerancia al aluminio. La inducción y la proliferación de callo en el medio de cultivo al que se ha adicionado aluminio es indicadora de la tolerancia del genotipo al metal en cuestión. Una vez que se han regenerado las plantas se requieren posteriores evaluaciones a campo, en suelos con concentraciones elevadas de aluminio, a fin de corroborar la tolerancia evidenciada in vitro por los materiales. A continuación se citan ejemplos donde se combinó la selección in vitro con la subsiguiente regeneración de plantas: - Producción in vitro de plantas de arroz resistentes a concentraciones tóxicas de aluminio. Se obtuvieron plantas resistentes utilizando distintas concentraciones de aluminio en el medio de cultivo. Por otro lado, se observó la aparición de plantas resistentes a partir de callos de variedades susceptibles mantenidos en medio de cultivo desprovisto de aluminio. Estos estudios indicarían que 92 CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana

77 el cultivo in vitro per se puede originar modificaciones útiles en el genoma de arroz. - Obtención de resistencia a Fusarium oxysporum en clavel. El cultivo de segmentos internodales de dos cultivares de clavel susceptibles a Fusarium oxysporum f.sp. dianthi permitió, luego de dos ciclos de selección, la obtención de callos resistentes que se utilizaron para regenerar plantas. El 32% de las plantas regeneradas a partir estos callos evidenció considerable resistencia al patógeno en experimentos de campo. La búsqueda de variantes a nivel celular permitiría verificar y seleccionar fenotipos adecuados entre millones de células, con una inversión menor en tiempo, espacio y dinero y ha sido extensamente utilizada en diferentes cultivos. Sin embargo, no existe total garantía de que la resistencia manifestada in vitro se expresará a nivel de la planta entera. Hay diferentes explicaciones para este fenómeno, como por ejemplo que la resistencia o tolerancia observada se deba a cambios epigenéticos, a la naturaleza quimérica del material, al uso de toxinas no específicas (en el caso de resistencia a enfermedades), a la complejidad del carácter a ser seleccionado (como por ejemplo la resistencia a salinidad o sequía) o a la falla de las células para expresar el carácter cuando se diferencian. En ambos casos (a y b) la obtención de resistencia sólo será posible si ésta existe en la población original (entonces el cultivo serviría sólo para recuperar los genotipos útiles) o bien si surge por variación somaclonal durante el proceso de cultivo. 6 Variantes somaclonales liberadas comercialmente La variación somaclonal fue utilizada para la producción de variedades comerciales con caracteres agronómicos superiores en diferentes especies. A continuación se enumera, para cada especie, el carácter agronómico seleccionado y el centro de investigación responsable de dicho logro: en geranio, aquitectura florar (Purdue Univ., USA); en batata: calidad de raíces y arquitectura de la canopia (North Carolina Research Service, USA); en caña de azúcar: resistencia a estrés y a enfermedades (Sugarcane Research Centre, Fiji); en maíz: contenido de triptófano (Molecular Genetic, USA); en tomate y apio: contenido de materia seca y rendimiento, respectivamente (DNA Plant technology of New Jersey, USA); en arroz: resistencia a enfermedades (Plantech Research Institute, Japan y Univ. Agricultural Sciences, Hungary); en mostaza: rendimiento (ICAR, India). Las primeras observaciones de variación en caracteres morfológicos fueron realizadas en arroz y otras especies a partir de Diez años más tarde se informó en detalle la variación obtenida en la progenie de plantas de arroz cultivadas in vitro y autopolinizadas. También se encontraron alteraciones en la altura de la planta, la longitud del tallo y otras características en alfalfa. En arroz, la variación somaclonal resultó en el mejoramiento de varios caracteres cuantitativos, incluyendo parámetros morfológicos, caracteres agronómicos y tolerancia a estreses bióticos y abióticos. Pueden mencionarse además otros ejemplos de variación somaclonal en cultivos agrícolas de interés, como por ejemplo caña de azúcar, donde se obtuvieron somaclones provenientes del cultivar Pindar resistentes a una virosis transmitida por áfidos. Paralelamente, también por variación somaclonal, se seleccionó el cultivar Ono, que presenta resistencia al downy mildew, causado por Sclerospora sacchari. En papa, el cultivo de protoplastos obtenidos de suspensiones celulares cromosómicamente variables produjo gran cantidad de variantes somaclonales del cultivar «Russet Burbano», que presentaron resistencia a Phytophthora infestans, a Alternaria solana y a la colonización por áfidos que transmitían el virus Y de la papa (PVY) y el virus del enrrollamiento de la hoja (PLRV). Se encontró también tolerancia a glifosato en somaclones de cebada regenerados en medios conteniendo el herbicida. En sorgo se encontró variación somaclonal estable para altura, número de macollos, mayor producción de granos y mayor número de semillas y tolerancia a suelos ácidos y a sequía. La incidencia de variación somaclonal en banana se encuentra extensamente documentada. En el caso de cultivares comerciales de banana Cavendish en Taiwán se obtu- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 93

78 vo resistencia a la Raza 4 de Fusarium oxysporum f. sp. Cubense. Estos cultivares no habían podido ser mejorados por métodos tradicionales. No obstante, para lograr una variedad con rendimiento equiparable a las variedades no resistentes se necesitaron varios ciclos de micropropagación adicionales, que permitieron combinar ambas características en un somaclon. Otros ejemplos donde se han obtenido cultivares por variación somaclonal son tabaco (tolerante a aluminio y resistente a herbicida), trigo (resistente a Helminthosporium sativum) y alfalfa (resistente a Fusarium oxysporum). Se han detectado también caracteres interesantes modificados por esta técnica para su explotación comercial en ornamentales, como por ejemplo variación en el color de las flores en gerbera, clavel y crisantemo. En gramíneas forrajeras puede citarse variación cromosómica en Festuca arundinacea y pasto llorón (Eragrostis curvula), albinismo en Lolium perenne y Festuca pratense, cambios en la morfología de planta, forma y tamaño de hoja y espiga, desarrollo floral, vigor, y supervivencia en somaclones de Lolium y Festuca arundinacea, variación isoenzimática en Festuca arundinacea; disturbios reproductivos y resistencia al moteado de hoja en pasto bermuda (Cynodon dactylon). En el laboratorio de Genética del Dpto. Figura 3: Obtención de variantes somaclonales de pasto llorón, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees a partir del cultivo de inflorescencias A) Formación de callos, B) Masa de callo a partir de la cual comienza a evidenciarse morfogénesis. C) Estudio histológico de los mismos callos mostrando células embriogénicas y D) embriones somáticos. E) En el mismo callo se observaron embriones bipolares y también F) organogénesis. G) Plántula completa en el momento de salir del tubo de ensayo. H) Las plantas llevadas al campo fueron fértiles (I). J) Cromosomas en el ápice radical de la planta donadora de explanto, 2n=4x=40 apomíctica. K) Cromosomas de una regenerante primaria (R 0 ) obtenida a partir de la anterior 2n=2x=20, sexual L) Isoenzimas de peroxidasas de las descendientes de la planta R 0, mostrando variación, lo cual indica la presencia de sexualidad. M) Idem anterior, pero malato deshidrogenasas. 94 CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana

79 de Agronomía de la UNS se llevó a cabo un proyecto para obtener somaclones de pasto llorón (Fig.3). Se trabajó con varios cultivares de esta gramínea apomíctica y luego de la evaluación de gran número de plantas se seleccionaron los siguientes materiales: - Una planta diploide sexual, obtenida a partir de un cultivar tetraploide apomíctico. Dicho material está en proceso de registración, y está siendo utilizado en estudios de apomixis. - Dos plantas hexaploides apomícticas a partir de un cultivar tetraploide apomíctico. Dichas plantas dieron origen a dos nuevos cultivares de Eragrostis curvula, muy promisorios por sus características forrajeras, que están en proceso de registro. La variación in vitro en trigo y en otros cereales como cebada es altamente dependiente del genotipo. En plantas regeneradas de triticale y trigo se informaron variaciones a nivel del ADN mitocondrial y de proteínas de la semilla, como las gliadinas. A nivel fenotípico, se han informado cambios estables en longitud de la espiga, número de granos por espiga, peso de 100 granos, densidad y biomasa de la espiga, mayor contenido de proteína en grano sin reducción del rendimiento, aristas, altura de la planta, fertilidad, número de macollos, color del grano, tiempo de espigazón, dureza, sensibilidad al ácido abcísico, color de las glumas, entre otros caracteres morfológicos. Las mutaciones observadas han sido de dominantes a recesivas y viceversa. El único antecedente en nuestro país de búsqueda de variación somaclonal en trigo es un estudio acerca de la estabilidad in vitro de tres cultivares de trigo con elevados niveles de inestabilidad cariotípica espontánea. Se evaluaron caracteres tales como estructura cromosómica, patrón de gliadinas, color del grano y de las glumas, tipo de aristas, niveles de clorofila y morfología de la planta, detectándose sólo una translocación no descripta previamente y un patrón diferente de gliadinas como consecuencia del cultivo in vitro, sugiriendo que esta técnica no es efectiva para inducir variación que pueda ser utilizada en programas de mejoramiento (Franzone y col., 1996). 7 Lecturas recomendadas BREGITZER, P.; HALBERT, S.; LEMAUX, P Somaclonal variation in the progeny of transgenic barley. Theor. Appl. Genet. 96: CASSELS, A.C.; CROKE, J.T.; DOYLE, B.M Evaluation of Image Analysis, Flow Cytometry, and RAPD Analysis for the Assessment of Somaclonal Variation and Induced Mutation in Tissue Culture-Derived Pelargonium Plants. Angew. Bot. 71: CROUGHAN, S.; S. QUISENBERRY; M. EICHHORN; JR., P. COLYER AND T. BROWN Registration of Brazos- R3 bermudagrass germplasm. Crop Science. 34: 542. D AMATO, F Nuclear changes in cultured plant cells. Caryologia. 44 (3-4) : DUNCAN, R Tissue Culture-Induced variation and crop improvement. Advances in Agronomy 58: EASTMAN, P.; WEBSTER, F.; PITEL, J.; ROBERTS, D Evaluation of somaclonal variation during somatic embryogenesis of interior spruce (Picea glauca engelmannii complex) using culture morphology and isozyme analysis. Plant Cell Reports 10: EVANS, D.; SHARP, W Single gene mutations in tomato plants regenerated from tissue culture. Science. 221: FRANZONE P, SUAREZ Y, SOLARI R, FAVRET A, RÍOS R, DÍAZ PALEO A Somaclonal variation in three Argentinean varieties of Triticum aestivum with different karyotypic instability. Plant Breed. 115: GALLEGO, F.; MARTÍNEZ, I.; CELESTINO, C., TORIBIO, M Testing somaclonal variation using RAPDs in Quercus suber L. somatic embryos. Int. J. Plant Sci. 158 (5): GEIER, T Chromosome, variability in callus produced plants. In Genetics and Breeding of Ornamental Species Harding & Mol. eds. KAEPPLER, S. M. & PHILLIPS, R. L In Vitro Cell Dev. Biol. 29: KAEPPLER S, KAEPPLER H, and Y. RHEE Epigenetic aspects of somaclonal variation in plants. Plant Molecular Biology. 43: KRIKORIAN, A Estabilidad genotípica en células, tejidos y plantas derivados del cultivo in vitro. En Cultivos de tejidos en la Agricultura. CIAT. Roca W. y Mroginsky L. Eds. LARKIN, P.; SCOWCROFT. W Somaclonal variation - a novel source of variability from cells cultures from plant improvement. Theor. Appl. Genet. 60, LINACERO R.; FREITAS ALVES E.; VASQUEZ A Hot spots of DNA instability revealed through the study of Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 95

80 somaclonal variation in rye. Theor Appl Genet. 100: MOLINA, M.; GARCÍA, M Analysis of genetic variability in long-term callus cultures and regenerated plants of maize. Cytologia. 63: OLMOS, S.; G. LAVIA, M. DIRENZO, L. MROGINSKI and V. ECHENIQUE Genetic analysis of variation in micropropagated plants of Melia azedarach L. In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant. 38: PESCHKE V.M.; PHILLIPS, R.L Genetic implications of somaclonal variation in plants. Adv. Genet. 30: Scandalios & Wright eds. PHILLIPS, R.L.; KAEPPLER, S.M.; PESCHKE, V.M Do we understand somaclonal variation? En: Progress in plant cellular and molecular biology. Nijkamp, H.J.J.; Van Der Plas, L.H.W.; Van Aartrijk, J. (eds.). Amsterdam: Kuwer Academic Publishers. pp ROUT, G.; PALAI, S.; SAMANTARAY, A.; PATRA, A.; DAS, P Chromosome variation and cytophotometric investigation of callus culture of the tea plant, Camellia sinensis. Cytobios 93: UMBECK, P.; B. GENGENBACH Reversion of male sterile T cytoplasm maize to male fertility in tissue culture. Crop. Science. 23: PHILLIPS, R.L.; KAEPPLER, S.M.; OLHOFF, P Genetic instability of plant tissue cultures: Breakdown of normal controls. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana

81 III.-Capítulo 2 Hibridación somática Polci, Pablo; Friedrich, Pablo 1 Introducción La mejora genética de las plantas cultivadas en procura de incrementar la producción viene siendo practicada por el ser humano desde hace miles de años, seguramente desde el inicio mismo de la agricultura. Para ello, el hombre ha empleado los cruzamientos con el fin de incrementar la variabilidad genética, paso inicial en el proceso de mejoramiento. De esta manera la hibridación entre especies diferentes permitió aumentar de modo significativo la productividad de diversos cultivos, como por ejemplo los cereales. Sin embargo, en otros cultivos esta estrategia no resultó exitosa a causa de esterilidad sexual o incompatibilidad genética. La hibridación somática, es decir, la obtención de plantas híbridas a partir de la fusión de células o de protoplastos derivados de células somáticas, surgió hace unos 30 años como una herramienta muy promisoria para sortear problemas de incompatibilidad precigótica. Esta técnica, si bien presenta algunas limitaciones, como una elevada esterilidad o imposibilidad de regenerar plantas en algunos casos, demostró ser útil en la mejora genética de plantas, principalmente por permitir la introgresión limitada de genes de especies silvestres en los cultivos. Se utiliza, por ejemplo, cuando se quiere transferir resistencia a enfermedades o tolerancia a estreses. También permite la obtención de citoplasmas híbridos (cíbridos). La hibridación asimétrica y cibridización sirve como puente para la transferencia de genes individuales La técnica de fusión de protoplastos se desarrolló en la década de , a partir de la observación de que ciertos virus pueden inducir la fusión de células animales. Sin embargo, recién en la década de tuvo un mayor auge debido a la aparición de métodos químicos y eléctricos más apropiados para la fusión de células vegetales. La pared presente en estas células representa una barrera que normalmente impide la fusión entre ellas. Por ello, la obtención de plantas híbridas somáticas requiere del previo aislamiento de protoplastos mediante la digestión enzimática de las paredes celulares, para luego proceder a la fusión de protoplastos de distintos tipos parentales (distintos genotipos) y posterior regeneración de plantas a partir de los productos de fusión. La hibridación somática en plantas comenzó a desarrollarse a principios de 1970 con la aplicación de métodos químicos de fusión, y se extendió en los 80 con el empleo de métodos de electrofusión. Es relevante destacar que, a los fines del mejoramiento genético, el sistema de protoplastos no sólo se emplea para la obtención de híbridos somáticos, sino que también constituye un material apropiado para la incorporación de ADN exógeno. Asimismo, la fusión de protoplastos tiene un uso mucho más amplio que el estrictamente de interés agronómico; en tal sentido, es de gran utilidad en estudios de biología celular así como para otras aplicaciones biotecnológicas, por ejemplo, la producción de anticuerpos monoclonales. 2 Hibridación somática vs. hibridación sexual Con relación a su potencialidad para producir híbridos, existen diferencias importantes entre la fusión de protoplastos somáticos y el cruzamiento sexual: La hibridación sexual entre organismos de diferentes especies está limitada por barreras de incompatibilidad. En algunos casos estas barreras son precigóticas, es decir, no permiten que se produzca la fecundación. Tal limitación no existe en la fusión de protoplastos, dado que este proceso es noespecífico, permitiendo la fusión de células de orígenes muy diversos, incluso de organismos muy distanciados filogenéticamente (por ejemplo, células animales y vegetales). Ello no significa que pueda regenerarse un organismo viable y fértil a partir de cualquier tipo de combinación entre células. De hecho, la búsqueda de híbridos de interés agronómico ha demostrado que el principal aporte de esta metodología es la introgresión, en los cultivos, de genes provenientes de plantas silvestres emparentadas. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 97

82 La hibridación sexual ocurre normalmente por fusión de células haploides (n + n), mientras que en la hibridación somática se fusionan dos protoplastos con sus genomas completos (2n + 2n) o con uno de ellos conteniendo sólo parte de su genoma. Otra diferencia está dada por la herencia de los genes extranucleares, esto es, plastídicos y mitocondriales. Mientras que en la reproducción sexual el genoma citoplasmático es aportado casi exclusivamente por la gameta femenina, en la hibridación somática se combinan organelas de ambos progenitores, produciendo nuevas combinaciones de genes citoplasmáticos. 3 Hibridación somática vs. transformación genética La preponderancia que han tomado las técnicas de transformación genética ha relegado a la hibridación somática a un papel de menor significación como herramienta biotecnológica aplicada al mejoramiento de los cultivos. Comparando ambas metodologías, podemos destacar las siguientes diferencias: En la transformación genética se incorporan uno o pocos genes exógenos en una planta, mientras que en la hibridación somática el número de genes introducidos es mayor dado que se transfieren cromosomas de una especie a otra o se combinan dos genomas completos. La hibridación somática permite transferir caracteres sin necesidad de contar con un conocimiento detallado de los mecanismos moleculares que determinan la expresión de dichos caracteres. Por el contrario, la transformación genética requiere la previa identificación y aislamiento de los genes que determinan la expresión del carácter de interés. Caracteres tales como productividad, tolerancia a ciertos tipos de estrés, resistencia horizontal a enfermedades y otros son poligénicos, por lo que su transferencia es factible por hibridación somática pero no por transformación genética. Sin embargo, en la actualidad, con las nuevas herramientas aportadas por la genómica se está avanzando en el conocimiento de todos los genes involucrados en diversas vías metabólicas. Estos podrían ser transferidos en conjunto vía transgénesis. 4 Tipos de híbridos somáticos Cuando se realiza la fusión de protoplastos se obtienen células con el aporte de cromosomas de dos o más núcleos (Fig.1.) Si los protoplastos involucrados en la fusión proceden de distintos tipos parentales se originan «heterocariones», y si proceden del mismo tipo parental se originan «homocariones». Cuando en el heterocarión ocurre la fusión de los núcleos (cariogamia), se forma una «célula híbrida». A partir de una célula híbrida, que contiene dos genomas completos, se puede regenerar una planta que, según cual haya sido el destino del material genético nuclear durante las divisiones celulares que siguen a la fusión, puede ser de tres tipos: 1. Híbrido simétrico, que tiene el genoma nuclear completo de cada tipo parental. 2. Híbrido asimétrico, que tiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales y sólo una parte del genoma nuclear del otro parental. Fig. 1. Destino del material genético nuclear y extranuclear en la fusión de protoplastos. 98 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo

83 3. Cíbrido, que contiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales, reteniendo sólo material genético extranuclear del otro parental. Es usual que en el proceso de regeneración de plantas híbridas ocurra una eliminación gradual de cromosomas de uno de los tipos parentales, produciéndose de este modo híbridos asimétricos o cíbridos. La práctica de la hibridación somática en plantas demostró que, en general, los híbridos asimétricos y cíbridos son más valiosos que los simétricos producidos entre plantas alejadas filogenéticamente. Por esta razón se han desarrollado métodos para inducir la hibridación asimétrica o cibridación, alterando el genoma de uno de los protoplastos parentales. En este caso se dice que se transfiere parte del genoma de un protoplasto donante a uno receptor. Por lo tanto, teniendo en cuenta el material de partida empleado para la fusión, pueden producirse tres tipos de células híbridas: 1. Células híbridas simétricas, por fusión de dos protoplastos con sus genomas completos. 2. Célula híbrida asimétrica, por fusión de un protoplasto conteniendo su genoma completo con otro conteniendo su núcleo inviable o sólo una parte de su genoma nuclear. Los protoplastos donantes son irradiados con rayos X o Gamma, lo que provoca la fragmentación de los cromosomas. Una vez producida la fusión, dichos fragmentos tienden a eliminarse en las sucesivas mitosis, pero algunos de ellos pueden integrarse con el genoma del receptor produciendo un híbrido asimétrico. El tratamiento de irradiación parece no tener efectos deletéreos o mutagénicos sobre los genomas de organelas, probablemente debido a que cada célula posee varias copias de ellas. También puede producirse una célula híbrida asimétrica fusionando protoplastos receptores con microprotoplastos, conteniendo uno o pocos cromosomas. Los microprotoplastos se obtienen induciendo la formación de micronúcleos por tratamientos con agentes antimicrotúbulos. 3. Cíbridos, por fusión de un protoplasto conteniendo su genoma nuclear completo con un protoplasto enucleado o con su núcleo inviable. Los protoplastos enucleados o citoplastos pueden obtenerse centrifugando los mismos a alta velocidad en un gradiente de densidad isosmótico. Asimismo, el método de irradiación con rayos X o Gamma puede generar cíbridos en casos en que se produzca la eliminación total de los fragmentos cromosómicos. Los protoplastos que poseen su genoma nuclear completo (receptores), pueden ser tratados previamente con inhibidores metabólicos. En este caso sólo pueden sobrevivir, por complementación metabólica, los heterocariones conteniendo el núcleo del receptor y el citoplasma del donante enucleado. La segregación de los plástidos y mitocondrias de los dos tipos parentales también constituye una fuente importante de variabilidad en la regeneración de plantas híbridas. Es frecuente que ocurran recombinaciones de los genomas mitocondriales de ambos tipos parentales, pero ello es poco común entre plástidos. Dado que las organelas segregan independientemente unas de otras, la regla es que al cabo de pocas divisiones mitóticas las células formadas contengan plástidos provenientes de uno u otro tipo parental. Así, una célula híbrida origina una colonia de células que exhiben diferentes combinaciones de genes citoplasmáticos, pero con una mayor frecuencia de células que poseen mitocondrias recombinantes y plástidos de uno u otro tipo parental. El destino que sufre el material genético nuclear y extranuclear durante las divisiones celulares determina que, a partir de una población de células híbridas similares, se puedan regenerar plantas con diferentes combinaciones de genes nucleares, plastídicos y mitocondriales. La Figura 2 muestra un esquema de las etapas involucradas en la hibridación somática, las cuales son tratadas a continuación. 5 Aislamiento de protoplastos El desarrollo de métodos enzimáticos de aislamiento a partir de 1960 brindó la posibilidad de obtener grandes cantidades de protoplastos vegetales. Ello tuvo gran influen- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 99

84 Figura 2: Materiales y procesos involucrados en la hibridación somática. cia en diferentes áreas de la biología y la biotecnología de plantas, dada la utilidad de los protoplastos como sistema experimental para estudios fisiológicos, bioquímicos y moleculares, así como para su aplicación al mejoramiento genético. Los protocolos de aislamiento emplean enzimas fúngicas con actividad celulasa y pectinasa, siendo necesario en algunos casos el agregado de hemicelulasas. Las celulasas y hemicelulasas degradan la pared celular, en tanto que las pectinasas digieren la matriz de pectina que mantiene adheridas a las células. El uso de enzimas disponibles comercialmente posibilitó el aislamiento de protoplastos de prácticamente cualquier tejido vegetal, siempre que el mismo no esté lignificado. Se ha podido aislar protoplastos de una gran cantidad de especies vegetales y regenerar plantas a partir de los mismos, permitiendo el uso de este sistema para la propagación clonal y la modificación genética de plantas. El número de protoplastos aislados, su viabilidad y la pureza de la suspensión obtenida dependen de varios factores, debiendo establecerse en forma empírica las condiciones óptimas para un sistema determinado. Las etapas del aislamiento y los factores a considerar en cada una de ellas se describen a continuación: 1. Selección del material de partida. Influye en el resultado del aislamiento así como en el proceso de regeneración posterior. Generalmente se emplean hojas y células en cultivo líquido o sólido. Cuando se emplean hojas, la edad y las condiciones de cultivo de la planta afectan el rendimiento. Se obtienen mejores resultados con hojas jóvenes totalmente expandidas que con hojas viejas. (Fig. 3A.). Para facilitar el contacto de las enzimas con las células, las hojas suelen cortarse en trozos pequeños, muy finos en el caso de las monocotiledóneas. Algunas veces se extrae la epidermis inferior antes de colocar la hoja en la solución enzimática, como sucede con las dicotiledoneas. Cuando se emplean células en suspensión, se obtienen mejores resultados si se encuentran en la fase exponencial de crecimiento. 2. Tratamiento enzimático. La concentración de la enzima y el tiempo de incubación requeridos para lograr la liberación de los protoplastos dependen del producto comercial utilizado. El ph generalmente se ajusta en un rango de 4,7 a 6, y la temperatura entre 25 y 30º C. La duración del tratamiento enzimático y la relación volumen de solución/ cantidad de tejido influyen en el rendimiento. Durante el aislamiento se produce la lisis de algunas células, que liberan enzimas hidrolíticas y compuestos oxidantes que pueden dañar los protoplastos, por lo que se suelen agregar inhibidores de proteasas y antioxidantes tales como el Polivinilpirrolidona-10. El agregado de un estabilizador osmótico a la solución enzimática es esencial para evitar la ruptura de los protoplastos a medida que son liberados, siendo más estables si la solución es ligeramente hipertónica. Para ello se utilizan solutos osmóticamente activos, comúnmente manitol o sorbitol, en concentraciones que varían entre 0,3 a 0,8 100 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo

85 6 Métodos de fusión 6.1 Métodos químicos Figura 3: Aislamiento de protoplastos de tabaco. A. Eliminación de las nervaduras centrales y seccionado de la hoja en trozos pequeños. B. Digestión enzimática de las paredes celulares. C. Centrifugación y obtención de protoplastos libres de restos de tejidos vegetales. M según el tipo de protoplasto. La solución enzimática es por lo general suplementada con sales, comúnmente CaCl 2, que incrementan la estabilidad de la membrana (Fig. 3B). 3. Limpieza y purificación de los protoplastos. Una vez lograda la liberación de los protoplastos, se procede a la remoción de las enzimas y de los restos de tejido y de células rotas. La suspensión se pasa por un filtro de nylon o metálico con un diámetro de poro ( mm) que permita el paso de los protoplastos y retenga los restos de tejido y grupos de células no digeridas. Posteriormente, se efectúan 3 ó 4 lavados centrifugando la suspensión por 5 minutos a baja velocidad ( g). Finalmente, los protoplastos sedimentados se resuspenden en una solución salina que contenga un estabilizador osmótico. De este modo se eliminan las enzimas y restos celulares. Para lograr una mayor pureza de la suspensión es conveniente centrifugarla en un gradiente de densidad (Fig. 3C). Para el recuento de protoplastos se emplea un hemocitómetro. La viabilidad se determina generalmente empleando colorantes que son incorporados (rojo neutro, diacetato de fluoresceína) o excluidos (azul de Vean) por las células viables; también pueden evaluarse la actividad fotosintética (emisión de fluorescencia) y la respiratoria (consumo de O 2 ). Los primeros casos informados de fusión controlada y reproducible de protoplastos vegetales y de regeneración de híbridos somáticos se produjeron a principios de la década de 1970, empleando nitrato de sodio como agente fusógeno. La frecuencia de formación de heterocariones en tales casos era muy baja. Posteriormente, se lograron mejores resultados fusionando protoplastos de células del mesófilo de Nicotiana en un medio conteniendo alta concentración de Ca ++ (50 mm) y ph elevado (10,5). Sin embargo, el fusógeno que alcanzó mayor aceptación es el polietilenglicol (PEG) debido a que, en comparación con los otros agentes químicos, produce mayor proporción de heterocariones y, para muchos tipos celulares, resulta menos tóxico. Además, el tratamiento con PEG genera una mayor proporción de heterocariones binucleados, con menor ocurrencia de fusiones entre más de dos protoplastos. El procedimiento de fusión con PEG más ampliamente utilizada es, en lo esencial, una combinación del método original del PEG y el de CA ++ y ph elevados. Los protoplastos de dos tipos parentales se mezclan en una solución conteniendo 15 a 45 % de PEG (peso molecular de 1500 a 6000), durante 15 a 30 minutos. La temperatura de incubación óptima para inducir la fusión es de 35 a 37º C pero, en la práctica, suele ajustarse a 24º C. La densidad de protoplastos adecuada para la formación de heterocariones es de 4 a 5 % (volumen de protoplastos/volumen de suspensión). La remoción del PEG se lleva a cabo en forma gradual, siendo esto fundamental para asegurar una elevada frecuencia de heterocariones. Para ello, la suspensión se somete a sucesivos lavados con una solución alcalina (ph 9-11) de CaCl mm, disminuyendo progresivamente la concentración de PEG con cada lavado. En la fusión de los protoplastos ocurren, en forma sucesiva, los siguientes eventos: (1) las membranas plasmáticas de protoplastos adyacentes entran en íntimo contacto, (2) se producen alteraciones en sitios localizados Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 101

86 de las mismas, formándose puentes citoplasmáticos entre protoplastos vecinos, y (3) las interconexiones citoplasmáticas se expanden, provocando la fusión. La carga negativa neta de la superficie de las membranas produce la repulsión entre ellas; el tratamiento con Ca ++ y ph elevados neutraliza las cargas superficiales, favoreciendo el contacto entre protoplastos. El PEG actuaría como un puente molecular causando alteraciones en las membranas plasmáticas que promueven la adhesión y formación de puentes citoplasmáticos entre protoplastos vecinos, produciéndose finalmente la fusión. 6.2 Electrofusión En 1973 se descubrió que pulsos de elevado potencial eléctrico en un rango muy estrecho de intensidad y duración conducen a un incremento reversible, experimentalmente controlable, de la permeabilidad de la membrana celular. Este efecto se denominó ruptura eléctrica reversible para enfatizar la habilidad de la membrana para reparar tales perturbaciones. El voltaje mínimo para un protoplasto (umbral) con el cual se produce la formación de poros disminuye a mayor duración del pulso eléctrico. Este fenómeno de ruptura reversible también es aplicado en la técnica de electroporación, con la que se pueden introducir en las células construcciones de ADN y otras moléculas de alto peso molecular. El método de electrofusión en esencia involucra dos pasos: 1. Los protoplastos, colocados en un medio de baja conductividad entre dos electrodos, se ponen en contacto al aplicar corriente alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz) en un campo eléctrico no uniforme. Las cargas se separan dentro de las células formando un dipolo y generando, por lo tanto, un potencial de membrana. La fuerza del campo a ambos lados de una célula es diferente (campo no uniforme), dando origen a una fuerza neta que la empuja a una región de mayor intensidad de campo (hacia uno de los electrodos). Este proceso se denomina dielectroforesis. La polaridad de la célula incrementa el campo local no uniforme, atrayendo a las células vecinas. Luego, los protoplastos se aproximan unos a otros y forman cadenas paralelas a las líneas de campo aplicadas (Fig. 4A). La fuerza ejercida sobre la célula bajo condiciones dielectroforéticas depende (1) de la intensidad de campo eléctrico, (2) del gradiente del campo, (3) del volumen del protoplasto y (4) de la diferencia entre las constantes dieléctricas de la célula y su ambiente (así como la correspondiente diferencia entre sus conductividades). 2. El segundo paso consiste en la aplicación de uno o más pulsos cortos de corriente directa de 15 a 100 µseg., con una intensidad de campo elevada (1 a 3 Kv/cm), suficiente para causar la ruptura reversible de la membrana. Para que esto ocurra es necesario que el voltaje crítico de membrana sea alcanzado en cuestión de nanosegundos a microsegundos. Ocurre entonces la fusión de las dos células cuyas membranas están en estrecho contacto (1 a 2 nanómetros de distancia). El proceso de resellado es principalmente atribuido a las moléculas lipídicas debido a que su coeficiente de difusión es dos órdenes de magnitud mayor que el de las proteínas. Durante este proceso pueden formarse puentes lipídicos entre las membranas de las dos células. En otras palabras, las membranas no se vuelven a sellar separadamente en la zona de contacto. Los puentes formados de esta manera, con continuidad citoplasmática entre las dos células, conducen a un radio de curvatura muy pequeño y a altas tensiones superficiales. Como consecuencia se forma una nueva célula esférica, ya que el proceso es favorecido energéticamente (Fig. 3B y C). La ruptura es reversible si el número y el tamaño de los poros son pequeños en relación con el total de la superficie de la membrana. Fuerzas de campo supra críticas, así como también largos períodos de exposición, rompen áreas mayores de membrana y pueden producir la destrucción total de la célula La frecuencia de fusión depende de varios factores: El genotipo. La procedencia de los protoplastos dentro del mismo genotipo. Diferentes poblaciones de protoplastos exhiben frecuen- 102 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo

87 Figura 4: Electrofusión de protoplastos de mesófilo de pasto llorón. A. Dielectroforesis de células. Las diferencias en intensidad de campo eléctrico hacen que las células se muevan hacia la zona cercana al electrodo. B. Aplicación de pulsos cortos de corriente directa, que inducen la formación de poros en la membrana, generando puentes entre las membranas de las células adyacentes. C. Los puentes con continuidad citoplasmática poseen un radio de curvatura muy pequeño. Las altas tensiones superficiales generadas en ese sector conducen a la formación de una nueva célula esférica. cias de fusión diferentes, aun cuando provengan del mismo genotipo. En general, los protoplastos obtenidos a partir de hojas se fusionan más fácilmente que los provenientes de raíz o de cultivos celulares. El tamaño de los protoplastos. Los más grandes se fusionan más fácilmente. La densidad de los protoplastos. El número, la duración y la fuerza de los pulsos de corriente directa. La duración del pulso eléctrico es de 15 a 50 µseg. El tiempo requerido para la fusión que sigue a la aplicación de un pulso varía desde pocos segundos a varios minutos. Esto probablemente esté relacionado a la diferencia de fluidez de la membrana en los distintos tipos celulares y a las propiedades del citoesqueleto dentro de la célula. El medio de fusión. Un factor de limitación en la agregación dielectroforética de las células es la conductividad eléctrica del medio; si ésta es muy alta, hay mucho flujo de corriente en la solución y se producen calentamientos y turbulencias que impiden la formación de cadenas. El potencial osmótico del medio de fusión. La inclusión de iones en el medio puede incrementar el porcentaje de fusión. Sin embargo, existe la limitación de que la dielectroforesis debe realizarse en un medio de baja conductividad; el medio de fusión usualmente consiste en manitol (cuya concentración se ajusta según los protoplastos empleados) y CaCl 2 1 mm. Valores bajos de presión osmótica en el medio de suspensión de los protoplastos pueden favorecer el proceso de fusión. La longitud de las cadenas de protoplastos formadas durante la dielectroforesis, que además depende de factores como la densidad de protoplastos, fuerza del campo eléctrico y tiempo durante el cual es aplicado. Cadenas más largas darán mayor frecuencia de fusión que las cadenas cortas. Pulsos de corriente más largos y de mayor voltaje producen un aumento de los eventos de fusión múltiple; obviamente, pulsos muy largos y voltajes muy elevados pueden matar a los protoplastos. La composición y propiedades de la membrana plasmática pueden ser afectadas por la actividad metabólica de los protoplastos y por el tipo de enzimas empleadas en el proceso de aislamiento, influyendo en consecuencia en el proceso de fusión. Las condiciones experimentales deben ajustarse de modo de obtener la mayor frecuencia de fusión posible (número de protoplastos fusionados sobre el total de protoplastos), intentando maximizar la proporción de heterocariones (productos de la fusión de protoplastos diferentes) formados por sobre la de homocariones (productos de la fusión de protoplastos del mismo tipo parental), y minimizando la ocurrencia de eventos de fusión múltiple (fusión de más de dos protoplastos). La proporción de cada uno de los dos tipos de protoplastos en la suspensión puede fijarse a fin de incrementar la formación de heterocariones por sobre la de homocariones. El tipo de protoplasto con mayor tendencia a fusionar se mezcla con el de menor tendencia a fusionar en una relación de 1:5 a 1:10. Así, durante la formación de cadenas, los protoplastos más fusionables estarán mayoritariamente en contacto con los menos fusionables, y éstos a su vez esta- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 103

88 rán ligados entre ellos mismos. Seleccionando las condiciones duración y voltaje de los pulsos que promuevan sólo la fusión de los protoplastos más fusionables, los productos serán mayormente heterocariones. Sin embargo, aun cuando las condiciones de fusión puedan fijarse de modo de incrementar la frecuencia de fusión y la proporción de heterocariones formados, la fusión de protoplastos a gran escala (macrofusión), tanto por métodos químicos como eléctricos, resultará en una mezcla de protoplastos parentales, homocariones y heterocariones. Esto conlleva la necesidad de emplear métodos de selección de los híbridos somáticos obtenidos. Una técnica alternativa que ofrece la ventaja de no requerir una posterior selección de heterocariones, aunque demanda mayor manipulación, es la microfusión o electrofusión de pares de protoplastos. Esta técnica se basa en los mismos principios que la electrofusión a gran escala pero está diseñada para inducir la fusión en pares seleccionados de protoplastos. Este sistema emplea microelectrodos de platino fijados a un soporte montado debajo del condensador de un microscopio invertido. Los pares de protoplastos seleccionados se colocan en microgotas de medio de fusión sobre un soporte, recubiertas por aceite mineral. En cada evento de fusión, los microelectrodos se posicionan a cada lado de una microgota conteniendo un par de protoplastos, y se aplican los pulsos eléctricos. Después de la fusión, los heterocariones resultantes son transferidos a gotas con medio de cultivo para la posterior regeneración de plantas híbridas. La tasa de fusión es de aproximadamente 30 pares de protoplastos fusionados y transferidos a medio de cultivo por hora, pudiendo alcanzarse frecuencias de fusión cercanas al 50 %. Ventajas de la electrofusión: 1. El proceso entero puede ser seguido bajo microscopio por lo que los híbridos pueden ser fácilmente identificados y transferidos a un medio nutritivo o selectivo. 2. Puede preseleccionarse el número de células a ser fusionadas. Las formaciones de dos células son favorecidas por bajas densidades en la acanaladura entre los electrodos. Para obtener productos de multifusión deben emplearse elevadas densidades. 3. El proceso de fusión es sincrónico, ya que el pulso provoca la fusión de todas las células expuestas al campo. 4. Se obtienen elevadas plasmogamia ( %) y cariogamia. 5. La viabilidad de las células fusionadas es muy buena. 6. Este método ofrece ventajas sobre otros como el del PEG, que: -requiere condiciones no fisiológicas -las frecuencias de formación de heterocariones binucleados son bajas y variables -resultan tóxicos para diversos tipos celulares- el fusógeno debe ser removido antes del cultivo de los protoplastos y tiene bajo rendimiento de células fusionadas. 7 Selección de heterocariones La fusión de protoplastos a gran escala produce una mezcla de tipos parentales y productos de fusión. Si no se efectúa una previa selección de las células híbridas, la regeneración de plantas y la posterior identificación de los híbridos demandará mucho trabajo y recursos. Dicha selección es particularmente necesaria cuando se emplean métodos químicos, que producen una baja proporción (<10%) de células híbridas. Por el contrario, los métodos eléctricos no requieren necesariamente del posterior proceso de selección dado que normalmente producen frecuencias de fusión muy elevadas o porque, en el caso de la microfusión, no se generan mezclas heterogéneas de protoplastos debido a que se fusionan dos células por vez. Cualquiera que sea el caso, la condición de híbrido debe verificarse en la planta regenerada mediante diferentes análisis que se explican más adelante. La selección de células híbridas puede llevarse a cabo empleando los siguientes métodos: Selección sobre la base de caracteres morfofisiológicos. En ciertos casos es posible diferenciar los callos híbridos de los parentales. Por ejemplo, en algunos cruzamientos, los callos híbridos poseen un color intermedio al de los parentales. Cuando se produce un cruzamiento entre un parental con capacidad para regene- 104 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo

89 rar planta con uno recalcitrante, los híbridos somáticos normalmente regeneran plantas, ya que este carácter se comporta como dominante. Si los protoplastos del genotipo respondedor son tratados con inhibidores metabólicos irreversibles (iodoacetamida, dietilpirocarbamato, etc.) no sobrevivirán, y solamente podrán regenerarse los híbridos. Selección por complementación. La selección se produce porque el medio de cultivo resulta restrictivo para el crecimiento de los parentales, pero no para el de los híbridos. La complementación puede lograrse por las siguientes vías: a) Empleando dos parentales con defectos metabólicos o genéticos no alélicos. Si dichos caracteres son recesivos, la fusión produce una célula híbrida en la que los defectos se anulan por complementación. Por ejemplo, la fusión de dos variedades albinas no alélicas (nucleares) de tabaco, permitió obtener plantas verdes. AAbb (albina) x aabb (albina) AAaaBBbb (verde) Asimismo, a partir de dos líneas mutantes no alélicas de tabaco deficientes en nitrato reductasa, se obtuvieron colonias capaces de crecer en un medio conteniendo nitrato como única fuente de nitrógeno. b) Fusionando parentales que expresan caracteres dominantes tales como resistencia a antibióticos o herbicidas. Para ello se emplea una línea resistente a cierta droga, y otra resistente a una segunda droga, efectuándose la selección de las células híbridas en un medio conteniendo ambas drogas a concentraciones que resultan letales para las líneas parentales. c) Una línea que presente una mutación autotrófica (por ejemplo: albinismo, deficiencia a nitrato reductasa) y un carácter dominante (por ejemplo, resistencia a antibióticos o herbicidas) es de gran utilidad para la selección. Los híbridos producidos por el cruzamiento de estos parentales con cualquier genotipo silvestre pueden ser seleccionados en medio mínimo suplementado con el antibiótico o herbicida, que no permite el crecimiento de los parentales. Selección por aislamiento de los heterocariones o células híbridas. Es el sistema más confiable y de más amplio espectro de aplicación. El aislamiento puede realizarse de dos maneras: a) Selección mecánica directa utilizando técnicas de micromanipulación con micropipeta. Puede realizarse cuando los protoplastos parentales presentan rasgos que los distinguen al microscopio, permitiendo reconocer las células híbridas. Por ejemplo, al fusionar protoplastos del mesófilo (verdes) con protoplastos de suspensiones celulares (incoloros). También pueden colorearse las células de ambos progenitores con diferentes colorantes vitales, como el rojo neutro y azul brillante de cresilo. b) Citometría de flujo. Los protoplastos parentales se marcan con diferentes colorantes fluorescentes; por ejemplo, rodamina (rojo) y fluoresceína (verde amarillento). El aislamiento de los heterocariones marcados con ambos colorantes se realiza utilizando un citómetro de flujo (FACS, fluorescenceactivated cell sorter), que es preciso y muy rápido. El equipo posee fotocélulas que detectan fluorescencia, pudiendo separar los protoplastos marcados con un solo fluorocromo (parentales) de aquéllos doblemente marcados (híbridos). 8 Cultivo de protoplastos La habilidad para regenerar plantas a partir de células y tejidos en cultivo es un componente esencial en la biotecnología para la manipulación genética y el mejoramiento vegetal. Esto resulta relativamente fácil para las dicotiledóneas herbáceas, pero ha sido bastante difícil para las monocotiledóneas, particularmente las gramíneas. Los protoplastos se cultivan en cajas de Petri en medio líquido o semisólido, rico en compuestos orgánicos e inorgánicos, suplementado con reguladores del crecimiento, y en presencia de un estabilizador osmótico. Suelen ser cultivados en cajas de Petri con medio agarificado, donde se mezcla la solución de protoplastos con un medio de cultivo líquido a 40º C conteniendo 1,2% de agar, perferen-temente agarosa (Fig. 5AyB). Los protoplastos quedan, así, atrapados en el medio semisólido y, luego de varios días, se ven las colonias formadas (Fig. 5C). Sin em- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 105

90 Figura 5: Cultivo de protoplastos de tabaco. A. Protoplastos de mesófilo. B y D. Cultivo de los protoplastos en perlas de agarosa suspendidas en medio líquido. C. Detalle de la formación de callo a partir de protoplastos. E. Callo en medio de regeneración. F. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. G. Planta regenerada. bargo, el medio líquido da mejores resultados por varias razones: (a) los protoplastos de varias especies sólo pueden dividirse en medio líquido, (b) la presión osmótica del medio puede ser fácilmente reducida a los pocos días en cultivo, (c) la densidad celular puede ser modificada agregando medio de cultivo o las células con especial interés pueden ser aisladas y cultivadas a alta densidad, (d) la degradación de algunos componentes del medio por la población de protoplastos puede producir algunas sustancias citotóxicas, cuya concentración alrededor de las células será menor en el medio líquido. Una técnica muy eficiente que combina medio sólido y líquido es la de cultivo en perlas de agarosa, donde los bloquecitos con los protoplastos inmovi-lizados en agarosa son cortados en cuatro mitades y colocados en medio líquido, donde se cultivan en continua agitación. Los protoplastos regeneran la pared celular luego de uno a cuatro días en cultivo. La presencia de pared es esencial para lograr una división regular. Luego de dos a tres semanas, producto de mitosis sucesivas, se forman microcolonias derivadas cada una de una célula, que dos semanas después se pueden ver a simple vista. Estos callos son transferidos a un medio de cultivo y a condiciones apropiadas para regenerar plantas (Fig. 5). Los principales factores a tener en cuenta para el cultivo de protoplastos son: Los requerimientos nutricionales: se han utilizado en muchos casos los mismos medios de cultivo que se utilizan en el cultivo de células y tejidos, pero en general son enriquecidos con vitaminas, azúcares, aminoácidos, reguladores de crecimiento y también con aditivos inespecíficos como leche de coco, hidrolizado de caseína, extracto de levadura, etcétera. El potencial osmótico del medio de cultivo: los protoplastos requieren de protección osmótica antes de regenerar la pared celular. Normalmente se ajusta con el agregado al medio de cultivo de manitol o sorbitol. La densidad celular: la densidad inicial de protoplastos varía de protoplastos/ml de medio de cultivo. Los cultivos con altas densidades producirán, a partir de cada protoplasto, colonias que deberán separarse tempranamente para evitar quimeras. Si deseamos colonias bien separadas para asegurar que provengan de un solo protoplasto, la densidad inicial debe ser baja, de protoplastos/ml. Hay protoplastos de varias especies y tipos que no logran dividirse a bajas densidades de cultivo. Para estos casos se desarrolló la técnica de cultivo con células nodrizas o alimentadoras. Esta técnica consiste en exponer una suspensión de 10 6 protoplastos/ml a rayos X a dosis que inhiben la división celular, pero que quedan metabólicamente activas. Estas células se plaquean en un medio agarificado, y luego se colocan por sobre éstas los protoplastos sin irradiar, de los cuales se formarán las colonias. También suele utilizarse papel de filtro para separarlas de las células nodrizas. Otra técnica utilizada es el cultivo en microgota, donde se puede cultivar hasta un solo protoplasto. Cada microgota contiene entre 0,25-25 µl de medio de cultivo, logrando densidades de 2 4 x 10 3 proto-plastos/ml. Con ayuda de un micromani-pulador se coloca la célula y se la cubre con aceite mineral para evitar la deshidratación del medio. Los tratamientos físicos: tratamientos de choque eléctrico y térmico estimulan la división de los protoplastos. Las condiciones de cultivo: en general los protoplastos son sensibles a la luz, por lo cual durante el cultivo se los mantiene en oscuridad o bajo luz muy tenue. El origen de los protoplastos: el 106 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo

91 estado fisiológico del tejido del cual provienen y la calidad de los protoplastos son muy importantes para obtener una elevada eficiencia en la respuesta al cultivo. 9 Identificación de las plantas híbridas La condición de híbrido debe verificarse en la planta regenerada aun cuando se haya efectuado algún tipo de selección para el cultivo de las células híbridas. A tal fin es conveniente efectuar diferentes evaluaciones, lo que permite una mejor caracterización del híbrido. Comúnmente se llevan a cabo los siguientes estudios: 1. Morfológicos. Los híbridos somáticos pueden presentar rasgos morfológicos característicos. Los mismos pueden ser intermedios a los de los parentales, la suma de ellos, u otros completamente nuevos. 2. Citológicos. El análisis del complemento cromosómico permite revelar si el híbrido posee el total de cromosomas de cada parental, si se han fusionado más de dos protoplastos, el grado de aneuploidía y posibles translocaciones intergenómicas. Mediante hibridación in situ empleando sondas de ADN repetitivo específico de especie puede evaluarse con más profundidad la contribución de los genomas parentales y reestructuraciones cromosómicas en el híbrido. 3. Isoenzimáticos. El patrón de bandas isoenzimáticas del híbrido debe mostrar bandas de ambos parentales, pudiendo haber otras bandas que resultan de nuevas combinaciones de las subunidades enzimáticas. Habitualmente se analizan los patrones de glucosa-6-fosfato deshidrogenasas, fosfoglucoisomerasas, glutamato oxalacetato transaminasas, esterasas, peroxidasas y fosfatasas ácidas. Las isoenzimas son extremadamente variables entre tejidos vegetales, por lo que para el análisis se deben emplear los mismos tejidos u órganos, y en el mismo estadío fenológico. 4. En el ámbito del ADN. La demostración de la presencia de ADN de ambos parentales es la prueba más directa de la hibridación. El análisis de ADN es independiente del tejido empleado y de la edad de la planta. Puede llevarse a cabo por RFLP (polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción), RAPD (polimorfismos en el ADN amplificado al azar) o Southern blot, empleando sondas de ADN repetitivo específico de especie o de genes de ARN ribosomal. 10 Logros y tendencias de la hibridación somática La hibridación somática ha permitido producir híbridos que no se habían podido obtener por cruzamientos sexuales, incrementando así el flujo de genes en los cultivos. La tabla 1 muestra algunos ejemplos de híbridos somáticos que presentan algunas ventajas agronómicas. En sus inicios, algunos esperaban que la hibridación somática permitiera producir nuevas especies que expresaran las características deseadas de ambos progenitores. Por ejemplo, por hibridación entre tomate y papa, se buscó producir plantas que desarrollaran tomates en la parte aérea y tubérculos en la raíz (pomato). La experiencia mostró que difícilmente puedan lograrse estos híbridos espectaculares, debiéndose más bien dirigir la técnica hacia la introgresión de pocos genes silvestres en las especies cultivadas mediante hibridación asimétrica o cibridación, manteniendo las características generales del cultivo. Uno de los factores que dificulta la obtención de híbridos simétricos es la progresiva pérdida de cromosomas de uno de los parentales, que normalmente ocurre durante la regeneración. Si bien la fusión de protoplastos permite sortear las barreras precigóticas, siguen existiendo barreras genómicas que resultan en la eliminación espontánea de cromosomas durante las divisiones celulares. El mecanismo que determina la eliminación de cromosomas no está bien comprendido, pero generalmente se retienen los cromosomas del parental que tiene el ciclo celular más corto. Uno de los factores que puede producir incompatibilidad genómica es el estado de diferenciación de los tipos celulares involucrados en la fusión. Por ejemplo, cuando se fusionan células en fase de crecimiento activo con células del mesófilo, que no se dividen, generalmente se pierden los cromosomas de estas últimas. Los híbridos somáticos o sexuales entre especies silvestres y cultivadas contienen Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 107

92 Tabla 1: Ejemplos de híbridos somáticos que exhiben algún carácter de interés agronómico muchas características no deseadas de la primera, además de aquéllas deseadas. El retrocruzamiento con la especie cultivada es requerido para remover los genes no deseados del parental silvestre, pero ello no siempre es posible debido a que los híbridos suelen ser estériles. La hibridación asimétrica y la cibridación tienen la ventaja de incorporar sólo uno o pocos caracteres provenientes del parental silvestre en la especie cultivada, y producir plantas con mayor fertilidad. Algunos caracteres deseables están codificados por el genoma extranuclear, tales como la androesterilidad citoplasmática y ciertos tipos de resistencia a enfermedades y a herbicidas. Para estos casos es de particular utilidad la cibridación, dado que es un método simple para transferir estos genes. 11 Algunos ejemplos oryzicola, Triticum monococcum (+) Pennisetum americanum, Festuca arundinacea (+) Lolium multiflorum. El primer caso de regeneración de plantas maduras de híbridos intergenéricos (simétricos y asimétricos) en gramíneas fue el Festulolium. A pesar de los esfuerzos realizados, la aplicación de esta estrategia no ha conducido a la obtención de nuevos híbridos de especies importantes, fundamentalmente debido a problemas de baja o nula fertilidad. Los métodos actuales de transferencia de genes aislados han desplazado el interés en la hibridación somática. Sin embargo son una excelente herramienta para estudiar las interacciones núcleo-citoplasmáticas entre genomas. 12 Lecturas recomendadas BHOJWANI, S.S.; RAZDAN, M.K Protoplast isolation and culture. Somatic hybridization and cybridization. En: Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Capitulos 12 y 13. S.S. Bhojwani y M.K. Razdan (eds.) Elsevier, Amsterdam. pp LINDSEY Y JONES, Biología celular de la ingeniería genética. En: Biotecnología vegetal agrícola, Capítulo 6. Editorial ACRIBIA, S.A., Zaragoza. pp MATSUMOTO, K Híbridos somáticos. Biotecnología Ciencia & Desenvolvimiento, 20,mayo / junio: pp ZIMMERMANN, U Electrofusion of cells: principles and industrial potential. Trends in Biotechnology, 1,5: pp Se han obtenido híbridos intergenéricos de Panicum maximum (+) Pennisetum americanum (Ozias-Atkins et al., 1986), Saccharum officinalis (+) Pennisteum americanum, Oriza sativa (+) Echinochloa 108 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo

93 III.-Capítulo 3 Transformación genética Díaz, Marina L.; Zappacosta, Diego C.; Franzone, Pascual M.; Ríos, Raúl D. 1 Introducción El mejoramiento genético vegetal se originó hace aproximadamente años, cuando el hombre se hizo agricultor y comenzó la domesticación de las plantas. En el siglo XX, con la incorporación de los cruzamientos sexuales, el conocimiento de la biología floral de las especies, los avances de la genética y de la estadística experimental, entre otros, se desarrollaron los métodos de mejoramiento actualmente utilizados. El mejoramiento genético se basa en la existencia de variabilidad genética para los caracteres que se desea mejorar y la reproducción sexual para la incorporación de los mismos. Este hecho hace que el aprovechamiento de la variabilidad esté restringido por barreras de cruzabilidad. El reciente desarrollo de métodos no sexuales para transferir genes, como la transformación genética, permite superar esta limitación, abriendo nuevas perspectivas en el mejoramiento de las plantas. La ingeniería genética o transformación genética, técnica conocida como del ADN recombinante, permite introducir en plantas genes provenientes no sólo de otras especies vegetales muy alejadas desde el punto de vista evolutivo sino incluso de hongos, virus, bacterias y animales. Conviene destacar que la transformación de plantas es una tecnología que aporta variabilidad genética conocida sin alterar el fondo genético. Este último aspecto es de gran importancia ya que la creación de cultivares es un proceso acumulativo; es decir que se desea incorporar características favorables sin perder las mejoras logradas anteriormente. El germoplasma transgénico es posteriormente incorporado al proceso de mejoramiento, el cual dependerá de la especie y del tipo de cultivar a obtener. En 1983 se informaron los primeros experimentos de expresión de un transgen (gen introducido) en células vegetales y al año siguiente se obtuvieron las primeras plantas transgénicas (tabaco y petunia). Desde entonces se ha extendido la aplicación de esta tecnología a unas 120 especies. Las plantas transgénicas obtenidas hasta la fecha se desarrollaron por diversos métodos, los que han sido modificados para cada especie en particular, aumentándose de esta forma la eficacia de los mismos. Entre sus aplicaciones se encuentran la obtención de plantas con resistencia a virus, insectos, hongos y bacterias, tolerancia a herbicidas y a estreses abióticos y modificación de la calidad nutritiva de los cultivos entre otras. Asimismo, a través del uso de transgenes es posible modificar la expresión de genes presentes en el genoma de la planta. La transformación genética también constituye una herramienta útil para estudios básicos que permiten conocer y/o profundizar acerca de la estructura y función de genes específicos, aspecto particularmente relevante en la era genómica (ver VII.-1). 2 Requerimientos para la obtención de plantas transgénicas Para todas las técnicas de transformación desarrolladas hasta el momento es necesario disponer del transgen (secuencias regulatorias y codificante clonadas en un vector de transformación) y de una metodología eficiente para la transferencia al genoma vegetal. Una vez introducido el gen de interés en la célula, se induce el desarrollo de plantas mediante distintas técnicas de cultivo de tejidos. Se procede luego al análisis molecular de las plantas regeneradas in vitro para identificar aquellas que porten y expresen el o los transgenes en los niveles deseados. Finalmente, a través de experimentos de campo y laboratorio se estudia el comportamiento de los individuos transgénicos y su descendencia. Por lo tanto, los elementos básicos que se requieren en trabajos de transformación genética en plantas son: 1. Un sistema de cultivo de tejidos que permita regenerar plantas completas y fértiles. 2. Vectores apropiados, que permitan el Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 109

94 clonado del gen de interés y/o su transferencia al tejido blanco de transformación. 3. Un protocolo de transformación (sistema de transferencia de genes y de selección del material transformado). 4. Herramientas de análisis para detectar la presencia del transgen y los productos del mismo en la planta. Antes de iniciar la descripción de los ítem anteriores, resulta importante destacar que para lograr una planta transgénica deben ocurrir tres procesos en la misma célula: a) El transgen debe ser transferido al interior de la célula, b) El transgen debe integrarse al ADN celular y c) Se debe regenerar una planta completa a partir de la célula transgénica en la que se verificaron los procesos a y b. Dado que las células tienen diferente competencia o capacidad de respuesta para cada uno de estos procesos, la puesta a punto de un protocolo de transformación eficiente requiere maximizar la cantidad de células competentes para todos ellos de manera simultánea. 2.1 Cultivo de tejidos vegetales Los métodos de transformación más utilizados actualmente se basan en la obtención de células transgénicas y posterior recuperación de plantas completas y fértiles a partir de las mismas a través del cultivo y selección in vitro. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia expresada por las células vegetales (ver II.-1). En la mayoría de las especies se observa una importante influencia del genotipo en la respuesta al cultivo in vitro. Por ello, cuando se usa esta tecnología con fines de mejoramiento genético es muy importante conocer la respuesta morfogenética de distintos genotipos con adaptación local. En el cultivo in vitro, un prolongado período de subcultivos puede inducir la aparición de variación somaclonal no deseable, ya que es conveniente introducir sólo las modificaciones que se desean y en forma controlada (ver III.-1). 2.2 Construcción del vector Para introducir un transgen es necesario que el mismo sea incorporado previamente en un vector (por ejemplo un plásmido). Para ello se digiere el ADN extraído de un organismo, cualquiera que sea su origen, con enzimas de restricción. Estas endonucleasas tienen la capacidad de reconocer en el ADN secuencias específicas compuestas por pocos nucleótidos y posteriormente producir cortes en las mismas. Los fragmentos de restricción así obtenidos pueden ser ligados enzimáticamente a vectores de clonado, obteniéndose, de este modo, clones de ADN recombinante (ver II.-3) Figura 1: Estructura molecular del transgen Un transgen está compuesto por una secuencia codificante (región comprendida entre los codones de iniciación y terminación de la traducción) y por secuencias regulatorias que determinan el tejido, el momento del desarrollo y el nivel de expresión del transgen en la planta. La adecuada expresión de los transgenes es un aspecto importante en la obtención del fenotipo deseado en la planta transgénica. Muchas veces los genes utilizados provienen de bacterias y usualmente no pueden expresarse eficientemente en células eucariotas. Por ello, para optimizar la expresión del transgen es necesario reemplazar las secuencias regulatorias bacterianas por otras aptas para su expresión en células vegetales. En este contexto, la secuencia más importante es el promotor, sitio del ADN al cual se une la enzima ARN-polimerasa para iniciar el proceso de transcripción (Fig. 1). Cabe destacar que la expresión génica es controlada por las secuencias regulatorias y no depende de la secuencia codificante. Por lo tanto, una secuencia codificante aislada de un gen A, puesta bajo el control de un promotor aislado de un gen B, se expresará de acuerdo con el patrón de expresión de dicho promotor. Asimismo, en la elección del pro- 110 DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.

95 Tabla 1: Promotores usados en transformación genética de plantas cias de otros promotores. Al momento de elegir el promotor debe tenerse en cuenta también la planta a transformar ya que algunos de ellos son menos activos en monocotiledóneas, como el 35S; por otra parte el de ubiquitina 1 (ubi1) de maíz es uno de los más efectivos en gramíneas. Además, es necesario que el transgen disponga de una región no traducida en el extremo 3 del mismo, que incluya la señal de corte y poliadenilación (terminador), necesaria para el correcto procesamiento del transcripto correspondiente. Por otra parte el nivel y patrón de expresión del gen también puede estar afectado por la posición del mismo en el genoma de la planta transformada (efecto de posición). Esto puede deberse a la presencia de otras secuencias regulatorias cercanas, a la estructura de la cromatina, al patrón de metilación, etc. La cantidad de proteína producida por el transgen comúnmente varía más de 100 veces entre individuos transformantes obtenidos en el mismo experimento. La solución para evitar los «efectos de posición» es dirigir la secuencia de interés a sitios específicos del genoma vegetal, elegidos por su patrón de expresión adecuado y estable. Esto se puede lograr usando sistemas de recombinación heteróloga sitio-específicos o mediante reemplazo génico por recombinación homóloga. 2.3 Métodos de transformación La pared celular impide la entrada del ADN en la célula, constituyendo un obstáculo que todos los métodos de transformación genética tienen que superar de algún modo. Estos métodos pueden dividirse en: Promotores Constitutivos Específicos de tejido Inducibles nos (nopalina sintetasa de Agrobacterium) 35 S (virus del mosaico del coliflor) Ubi (ubiquitina de maíz) Act 1 (actina de arroz) TA 29 (tapete de la antera de tabaco) faseolina (cotiledones de poroto) TobRB 7 (raíz de tabaco) patatina (tubérculo de papa) glutenina (endosperma de trigo) subunidad pequeña de Rubisco inducible por luz alcohol deshidrogenasa-1 inducible por anaerobiosis proteína de shock térmico inducible por calor a) Transformación mediada por Agrobacterium, vector biológico que participa del proceso de transferencia. b) Métodos de transformación genética directa, también llamados físicos, mediante los cuales, por distintos mecanismos, se introduce el ADN en la célula. motor a utilizar en la construcción del transgen, hay que considerar la especie vegetal a transformar, ya que su nivel y patrón de expresión pueden variar al ser utilizados en especies distintas a la de origen del mismo. Dentro de los promotores se distinguen aquellos constitutivos, que permiten la expresión del gen en toda la planta en forma continua, los inducibles que responden a factores ambientales y finalmente los específicos de tejido que permitirán la transcripción en determinados órganos y tejidos (Tabla 1). Los promotores pueden ser modificados con el fin de aumentar la expresión de los genes que regulan, pueden truncarse, adicionárseles un intrón o unírseles secuen Transformación mediada por Agrobacterium Las especies del género Agrobacterium son bacterias Gram-negativas aeróbicas obligadas que viven en el suelo. Ellas son capaces de desarrollar un crecimiento saprofítico o parasítico. El género comprende cuatro especies fitopatogénicas, dos de ellas ampliamente estudiadas (A. tumefaciens y A. rhizogenes). Ambas especies son capaces de infectar una amplia variedad de especies de dicotiledóneas y tienen como blanco de infección a las heridas, atacando células individuales y provocando su proliferación. A. tumefaciens causa tumores, enfermedad que se conoce como «agalla de la corona» y A. rhizogenes induce la proliferación de raíces dando lugar a la enfermedad denominada «raíz en cabellera». La capacidad patogénica de estas bacterias esta asociada a la presencia de megaplásmidos ( kilo pares de bases o Kb) llamados Ti (por Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 111

96 «tumor-inducing» o inductor de tumores) o Ri (por «root-inducing» o inductor de raíces), presentes en algunas de las agrobacterias. Se demostró que durante la patogénesis un fragmento de estos plásmidos llamado Figura 2: Estructura del T-DNA T-DNA (por «transfer-dna»), es transferido a la célula están involucrados genes cromosómicos (chv vegetal, donde se integra al ADN A, chv B, chv E, cel, psc A y att), se produce cromosómico de la planta y cuya expresión el procesado y la transferencia del T-DNA, causa proliferación de células de la planta a mediados por los genes vir (por virulencia) través de la síntesis y alteración de la respuesta a hormonas vegetales. El T-DNA contiene tos fenólicos, como la acetosiringona, produ- que son inducidos por azúcares y compues- genes que se expresan eficientemente en la cidos por células vegetales heridas. Se conoce con mucho detalle la etapa de la célula vegetal infectada y producen síntesis de hormonas vegetales (llamados oncogenes patogénesis que ocurre en la bacteria (ver porque son los responsables de la proliferación anormal del tejido) y genes que provolencia (de alrededor de 30 Kb) está organiza- revisión de Gelvin, 2000). La región de virucan la síntesis de opinas (fuente de carbono da en operones esenciales para la transferencia del T-DNA (vir A, vir B, vir D, vir G) o y nitrógeno para la bacteria). A. tumefaciens es el caso más estudiado que permiten incrementar la eficiencia de la y utilizado en la transformación de plantas. transformación (vir C, vir E). El ingreso de El T-DNA está delimitado por dos repeticiones directas imperfectas de 25 pares de bará avanzar en el conocimiento de la Agrobacterium en la era genómica permitises (bp) que lo flanquean, llamadas bordes interacción de esta bacteria con las plantas. derecho e izquierdo (Fig. 2). Estos bordes son El desarrollo de la patogénesis de plantas por Agrobacterium representa una situa- los únicos elementos en cis necesarios para dirigir el procesamiento del T-DNA. Cualquier ción única en la naturaleza: la transferencia fragmento de ADN ubicado entre estos bordes puede ser transferido a la célula vegetal. ganismo procariota a un organismo eucariota de un elemento genético (T-DNA) de un or- Contrariamente a lo que sucede con otros superior, con su subsiguiente integración y tipos de secuencias móviles de ADN, el T-DNA expresión en el genoma hospedador. Este no codifica los productos que median su mecanismo de ingeniería genética natural es transferencia. El T-DNA es una región relativamente grande (ca. 20 Kb) que contiene de interés a las plantas, para lo cual, los aprovechado para la transferencia de genes genes con secuencias regulatorias (promotores y señales de poliadenilación) típicamente reemplazados por un marcador seleccionable oncogenes y genes de síntesis de opinas, son eucarióticas. y el gen a transferir (Fig. 2). El método llamado «del explante» (Horsch y col., 1984) con- Desde la década de se sabe que los tumores de la agalla de la corona se desarrollan si hay A. tumefaciens patogénicas en tumefaciens, dejar la bacteria en contacto siste en inocular un explante con A. presencia de heridas. Un aspecto destacable con el explante durante un cierto tiempo, en de esta bacteria es que usa la respuesta de la él se produce la transferencia del T-DNA que planta a las heridas (cicatrización y defensa) contiene un gen marcador seleccionable y el como quimioatractivo y activador del proceso de patogénesis. Luego de la adhesión de se transfieren los explantes a un medio de o los transgenes de interés. Posteriormente la bacteria a la célula vegetal, etapa en la que cultivo que contiene un antibiótico que ac- 112 DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.

97 túa como bacteriostático y el agente selectivo correspondiente al gen marcador seleccionable utilizado. Una vez completado el protocolo de cultivo y selección in vitro se recuperan las plantas transgénicas (Fig. 3). Análisis por hibridación del T-DNA en plantas transgénicas y su progenie han demostrado que el T-DNA se incorpora al ADN cromosómico y se hereda en forma estable. Los plásmidos Ti sin oncogenes se denominan «desarmados», son de gran tamaño y resulta difícil introducir genes en su T-DNA usando técnicas habituales de ADN recombinante. Por esta razón se han desarrollado dos sistemas de vectores para introducir genes en Agrobacterium: los vectores cointegrados, que deben formar estructuras cointegradas para replicarse en A. tumefaciens y los vectores binarios, que son capaces de replicarse en forma autónoma en esta bacteria. En los vectores cointegrados, la inserción del ADN que contiene los transgenes dentro del T-DNA de un plásmido Ti desarmado se logra por recombinación homóloga. Sobre la base de la capacidad de los genes de virulencia de actuar en trans, movilizando el T-DNA presente en otro plásmido, se construyen vectores denominados binarios que contienen un T-DNA no oncogénico en un plásmido pequeño, con un origen de replicación de amplio espectro de hospedantes, características que permiten su fácil manipulación genética usando E. coli como huésped. La introducción de este plásmido a una cepa de Agrobacterium que contenga un plásmido llamado «helper» de virulencia (con la región vir intacta y sin T- DNA) la hace apta para la transferencia del T-DNA a las células vegetales. Si bien ambos tipos de vectores son herramientas eficientes para la transformación, se aprecia una notable preferencia por el uso de vectores binarios. La integración del T-DNA en el ADN cromosómico de la planta se produce al azar, por recombinación ilegítima, preferencialmente en regiones con actividad transcripcional y con la participación de proteínas de la bacteria y de la planta. Este sistema de transformación permite transferir fragmentos de ADN de hasta 150 Kb. Para ello se utilizan vectores especiales que tienen características tanto de cromosomas artificiales de bacterias (BACs) como de vectores binarios. El uso de estos vectores permite clonar fragmentos de ADN de gran tamaño y posteriormente transferirlos al genoma vegetal vía A. tumefaciens. Esta tecnología es de gran utilidad para el clonado posicional de genes. Más de 600 especies vegetales son hospedantes naturales de A. tumefaciens. Estas pertenecen en su mayoría a dicotiledóneas y gimnospermas y más raramente a monocotiledóneas. Para muchas de ellas se han puesto a punto protocolos de transformación genética basados en este vector. El interés en el desarrollo de este tipo de tecnología hizo que se expandiera el rango de hospedantes de A. tumefaciens a especies que no son susceptibles en condiciones naturales a este patógeno. Esto fue posible debido al amplio conocimiento que se tiene de esta patogénesis. Así, se ha puesto énfasis en la utilización de A. tumefaciens como vector de transformación en gramíneas y se han desarrollado protocolos en varias especies de este grupo (arroz, maíz, cebada, trigo y gramíneas forrajeras). Cabe notar que su aplicación es actualmente una rutina en arroz y maíz. La transformación con A. rhizogenes tiene fundamentalmente dos aplicaciones: la producción de raíces con alta tasa de crecimiento capaces de sintetizar metabolitos secundarios como productos farmacéuticos, aditivos alimentarios y cosméticos, y por otra parte representa una valiosa herramienta para la estimulación de la rizogénesis en especies recalcitrantes, por ejemplo, leñosas. La puesta a punto de un protocolo eficiente y reproducible de transformación mediada por Agrobacterium es un proceso complejo en el que además de tener muy buen conocimiento de la respuesta al cultivo in vitro de la especie a transformar, hay que considerar aspectos tales como el genotipo vegetal, la cepa bacteriana, el tejido blanco de transformación, la inducción de los genes de virulencia y el control del estrés durante todo el proceso Transformación directa o por métodos físicos La primer metodología de transformación genética de plantas desarrollada fue la de A. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 113

98 Figura 3: Comparación de técnicas de transformación directa e indirecta tumefaciens. Inicialmente esta tecnología no resultó de utilidad para abordar la transformación de especies de gran importancia económica como los cereales, debido a que no son hospedantes naturales de esta bacteria. Este hecho condujo al desarrollo de los métodos físicos de transformación. En ellos el transgen es introducido en la célula vegetal mediante distintas técnicas que se detallan a continuación. - Transformación de protoplastos La introducción y expresión de ADN foráneo en protoplastos fue el primer método de transferencia directa claramente demostrado en plantas y esto se debió a que se disponía, para algunas especies, de procedimientos eficientes para la regeneración a partir de protoplastos. Se basa en el hecho de que la pared celular es la principal barrera para la introducción de ADN en las células vegetales por lo que ésta es temporariamente removida. Los protoplastos pueden ser aislados en forma mecánica o por un proceso enzimático que digiere la pared. Así se obtiene una suspensión conteniendo millones de células individuales lo que favorece la transformación de células aisladas. Los protoplastos pueden ser transformados utilizando polietilenglicol (PEG), electroporación, microinyección o liposomas. La transformación de protoplastos mediada por PEG es el método más comúnmente usado. Tanto el PEG como la electroporación producen poros en la membrana plasmática por alteración de la polaridad de la misma y por ellos penetra el ADN foráneo. En el último caso se someten los protoplastos a un campo eléctrico. Ambas técnicas permiten el tratamiento de un gran número de protoplastos al mismo tiempo. La microinyección es un método difícil y laborioso que consiste en la introducción de ADN dentro de protoplastos individuales mediante el uso de capilares de inyección y micro-manipulador y aunque con esta metodología es necesario manipular las células individualmente, es posible lograr un alto grado de integración del ADN foráneo. Cabe notar que el cultivo de protoplastos es la metodología más sofisticada de cultivo in vitro de plantas por lo cual representa gran complejidad experimental y no está disponible más que para algunas especies y dentro de ellas particularmente en genotipos modelo. Por ello se desarrollaron metodologías alternativas de transformación directa como la electroporación de tejidos, el uso de fibras 114 DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.

99 de carburo de silicio para facilitar la entrada del ADN en las células en cultivo y el bombardeo con microproyectiles o micropartículas. - Bombardeo de micropartículas Es un proceso por el cual micropartículas cubiertas con ADN son aceleradas por un gas comprimido e introducidas en células vegetales. Esta técnica se ha ido perfeccionando y actualmente es la más difundida entre los métodos de transformación directa. Inicialmente, la fuerza impulsora de las partículas estaba dada por pólvora, pero luego fue reemplazada por el sistema de helio comprimido que brinda una mejor regulación de la fuerza, distribución de microproyectiles y mayor reproducibilidad entre bombardeos. Se utilizan microproyectiles de oro o tungsteno (químicamente inertes) cuyos tamaños van desde 0,5 a 3 mm, que al ser disparados a grandes velocidades pueden atravesar pared y membranas de la célula vegetal bombardeada sin causarle daños letales (Klein y col., 1987). Para el bombardeo se puede emplear cualquier tipo de explante vegetal, desde células o protoplastos hasta plántulas completas, pasando por tejidos organizados en embriones y meristemas. El explante es generalmente sometido a un tratamiento osmótico pre y posbom-bardeo, que produce plasmó-lisis celular, evitando que el impacto y la penetración de las partículas dañen las células (Fig. 3). Los vectores plasmídicos que se usan en este tipo de procedimiento sólo requieren un origen de replicación que permita un alto número de copias de los mismos en E. coli, aspecto que facilita en la práctica la preparación del ADN necesario en grandes cantidades para la transformación genética por este método. Esta técnica, sin embargo, tiene manifiestas limitaciones. Algunas especies oponen una resistencia natural a la penetración de las partículas, dada por cutículas endurecidas, paredes celulares lignificadas o superficies vellosas. Sin embargo, la principal limitación del método continúa siendo la baja relación entre el total de células sometidas al bombardeo y el número de células que logran incorporar de manera permanente la información genética transferida. A pesar de la desventaja que representa el bajo número de transformantes producido por un solo episodio de bombardeo, la versatilidad de la aceleración de partículas para introducir transgenes ha superado muchas de las barreras asociadas a otros métodos de transformación, como son el rango de huéspedes de Agrobacterium y las dificultades inherentes al cultivo y regeneración de protoplastos. Tabla 2: Comparación entre métodos de transformación del genoma nuclear Agrobacterium Método biolístico Especies a transformar - dicotiledóneas y algunas - sin limitaciones monocotiledóneas Eficiencia de transformación - alta - baja Tipo de integración en el genoma vegetal - aleatoria en regiones con transcripción - bajo número de copias independientes - precisa - aleatoria - multicopia en tandem - imprecisa Construcción de vectores - compleja - simple Dependencia del genotipo vegetal - mayor - menor La biolística ha demostrado ser la mejor opción para la producción de plantas transgénicas de soja, sorgo, papaya, espárrago, caña de azúcar y trigo Transformación directa vs. indirecta Con el transcurso de las investigaciones se ha logrado optimizar los protocolos de transformación para muchas especies vegetales; igualmente, en la actualidad, ambas vías de transformación presentan ventajas y desventajas que las hacen más o menos convenientes para los distintos fines. En la Tabla 2 se presenta una comparación entre la transformación del genoma nuclear mediada por A. tumefaciens y el método biolístico como representante de los métodos de transformación directa. Uno de los procesos necesarios para obtener plantas transgénicas es la integración del transgen al ADN cromosómico. Con relación a este proceso existen diferencias entre ambos métodos. A. tumefaciens posee un mecanismo natural muy eficiente para transferir, al núcleo celular, el T-DNA que contiene el transgen y producir una integración aleatoria en regiones cromosómicas con actividad transcripcional. Generalmente, los Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 115

100 patrones de inserción de transgenes son más sencillos en comparación a los producidos por el método biolístico. Así, el número de copias que se incorpora es bajo y cuando hay más de una copia, suelen distribuirse en loci independientes, lo que facilita la posterior eliminación de las copias no deseadas por segregación. Por otra parte, el mecanismo involucrado hace que se transfiera un segmento de ADN definido: el T-DNA, acompañado de proteínas que lo protejen de la acción de nucleasas. Por el contrario, en el método biolístico el ADN transferido no está asociado a proteínas, por lo que al ser parcialmente degradado, sólo parte del mismo llega al núcleo donde se produce, con baja eficiencia, la integración al azar en el ADN cromosómico. En este método es común que se produzcan inserciones de varias copias del transgen en un mismo sitio del genoma con distinto grado de reordenamiento de la secuencia del transgen. Este último aspecto es considerado como una desventaja ya que tanto desde el punto de vista de la percepción pública como el de la optimización de la expresión de los transgenes, es deseable disponer de inserciones simples y bien definidas molecularmente. Esto es particularmente relevante cuando se tiene por objetivo el desarrollo de productos comerciales. Así, el fenómeno de silenciamiento de transgenes (pérdida de su expresión), observado en algunos casos, puede resultar de la presencia de varias copias del transgen. Por otra parte, cuando se utiliza el método biolístico, el segmento de ADN plasmídico que se integra al ADN cromosómico no está definido, como en el caso de T-DNA, sino que es de longitud variable. La construcción de vectores es mucho más sencilla en el caso del método biolístico. Este aspecto puede resultar importante en el contexto del desarrollo de proyectos de investigación, en los cuales muchas veces se requiere utilizar un número considerable de vectores diferentes. Es conveniente destacar que en ambos métodos la integración del transgen en el genoma se produce al azar. Como consecuencia de ello, diferentes plantas transgénicas provenientes de un mismo experimento, presentan inserciones en distintos sitios del genoma receptor. Así, la expresión fenotípica de un transgen será diferente en distintas plantas que contienen el mismo transgen, por lo cual, para clarificar la situación se considera a cada una de ellas como eventos de transformación distintos. La aplicación de cualquiera de estos métodos de transformación al mejoramiento vegetal depende, en gran medida, de la disponibilidad de genotipos con muy buena respuesta al cultivo in vitro. Finalmente, cabe mencionar que en el caso de A. tumefaciens, debido a que se trata de una interacción biológica entre una planta y una bacteria, la dependencia del genotipo es mucho más acentuada, ya que influyen también en la eficiencia de transformación, tanto el genotipo de la planta como el de la bacteria Genes de selección e informadores En el proceso de obtención de plantas transgénicas, los genes marcadores seleccionables (Tabla 3), generalmente de origen bacteriano, cumplen un rol de relevancia, sea para poner a punto un protocolo de transformación o como acompañantes de genes de interés que se desean introducir. El gen marcador seleccionable otorga a las células transgénicas que lo expresan una importante ventaja, con respecto a las células no transgénicas, al permitirles crecer en un medio de cultivo que contiene el agente selectivo correspondiente. Entonces, si el gen marcador codifica para una proteína que confiere resistencia a agentes fitotóxicos como antibióticos o herbicidas, las células que lo expresen podrán crecer y desarrollarse en medio de cultivo que contenga dichos agentes selectivos mientras que las células no transgénicas no lo harán (selección negativa). En otros casos, la ventaja estará dada por la posibilidad de utilizar diferencialmente un sustrato. Así, el gen man A de E. coli permite a las células vegetales que lo expresan utilizar la manosa como fuente de carbono, lo cual no es posible para las células no transgénicas (selección positiva). Es necesario tener en cuenta que algunas especies pueden poseer una resistencia natural a los agentes selectivos antes mencionados, por lo que es importante evaluar este aspecto cuando se elige el gen de selección a utilizar, así como 116 DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.

101 Tabla 3: Genes marcadores utilizados comúnmente en transformación de plantas Marcadores 2.4 Técnicas de detección del transgen y sus productos Seleccionables (Agente selectivo) npt II (kanamicina, paromomicina, G418) hph (higromicina) pat o bar (phosphinotricina, bialaphos) CP 4 (glifosato) man A (manosa 6 fosfato) el agente selectivo y las concentraciones del mismo. En la puesta a punto de las metodologías de transferencia de genes son asimismo de gran utilidad los genes marcadores visualizables o informadores que posibilitan la observación directa de las células que los expresan (Tabla 3). Estos genes codifican para proteínas que no están presentes en las células vegetales y producen un fenotipo característico de fácil y rápida observación. Así, el gen gus A proveniente de E. coli codifica para la enzima ß-glucuronidasa. Esta proteína puede ser detectada cualitativamente por tinción histoquímica, en presencia de un sustrato específico, por la producción de un precipitado azul-índigo de fácil visualización. Este marcador también puede ser detectado cuantitativamente usando técnicas fluorométricas. Como ejemplo de la aplicación de estos métodos de detección podemos mencionar el estudio de la expresión de un promotor en una especie vegetal. Para ello se puede construir un vector con la secuencia codificante de gus A y con una secuencia de terminación de transcripción, y estudiar en plantas transgénicas el patrón de expresión espacio-temporal del promotor (en qué tipo de células y cuándo se expresa) por tinción histoquímica y su nivel de expresión por fluorometría. Recientemente, el gen de la proteína fluorescente verde, gfp («green fluorescent protein»), aislado de una medusa, se ha convertido en un gen marcador visualizable in vivo muy utilizado. Cuando se ilumina con luz ultravioleta o luz azul, tejidos que contienen células que expresan este gen, se observa un brillo verde fluorescente. Al ser éste un ensayo no destructivo, es decir que permite conservar vivo el material en estudio, representa una herramienta de utilidad para visualizar diferentes etapas del proceso de transformación. Luego de la selección in vitro, las plantas regeneradas deben ser analizadas por métodos moleculares para identificar aquellas que porten y expresen los transgenes en los niveles deseados. Para ello se emplean técnicas como: - Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con el uso de «primers» homólogos a la secuencia del transgen se puede determinar la presencia del mismo. Esta técnica permite hacer un «screening» rápido de las plantas regeneradas, aunque tiene algunas limitaciones, un resultado positivo indica solamente que en la muestra existe una secuencia que amplifica con los «primers» utilizados pero no indica si el transgen se encuentra incorporado al genoma de la planta. Para maximizar la robustez de esta prueba es necesario utilizar temperaturas de annealing o apareamiento de primers altas (más de 60 C) y «primers» relativamente largos (más de 20 nucleótidos). Una variación de esta técnica, PCR en tiempo real, resulta de utilidad para evaluar el número de copias del transgen incorporadas al genoma de la célula vegetal. Visualizables (Fenotipos asociados) gus A (color azul índigo) luciferasa (luminiscencia) gfp (fluorescencia verde) - Hibridación southern o «Southern blotting»: es una de las herramientas moleculares más poderosas para caracterizar las plantas transgénicas. Además de indicar la presencia o no de la secuencia de interés, da información acerca de la integración de la misma en el genoma de la célula huésped (número de copias integradas y número de loci en los cuales se produjo la integración). En la Fig. 4 se representa el análisis de un caso hipotético de transformación mediante Agrobacterium, aunque éste es aplicable también a plantas obtenidas por métodos directos. El esquema 4-a representa parte del vector que contiene el gen de interés y el gen marcador. Si se utiliza como sonda el T-DNA completo y la digestión del ADN genómico se realiza con enzimas de restricción que no cortan dentro del T-DNA, el número de bandas del patrón representa el número de si- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 117

102 Hind III Eco RI Sal I Sal I Hind III BI Gen Marcador Gen de Interés BD 2kb 3kb b) c) d) Sitio de corte: Ausente dentro del Uno interno (Eco RI) Un sitio (EcoRI) entre T -DNA el marcador y el transgen Sonda: T-DNA (frag.hind III) T-DNA (frag.hind III) Gen marcador Frag: tamaño >5kb >2kb >2kb e) f) Sitio de corte: Un sitio (Eco RI) entre el marcador y el transgen Dos sitios (Sal I) dentro del transgen Sonda: Transgen Fragmento (Sal I) del transgen Frag: tamaño >3kb 1kb cantidad Igual que en d) Uno Figura 4: Patrones de Hidridación de Southern (Modificado de Bhat y Srinivasan, 2002) tios de inserción. El tamaño de las bandas será mayor que el T-DNA ya que se están utilizando enzimas que cortan por fuera de éste. Plantas transgénicas obtenidas en forma independiente tendrán patrones de hibridación diferentes (4-b). Por otra parte, si la enzima tiene un sitio de corte único dentro del T-DNA, utilizando la sonda antes mencionada, ésta dará dos señales de hibridación para cada sitio de inserción independiente del T- DNA (4-c). La aparición de un número impar de bandas indica que en un mismo sitio se insertaron múltiples copias, ocurrieron rearreglos o se produjo el truncado del T- DNA. Si se digiere la muestra con una enzima de restricción que posee un sitio único de corte entre el gen marcador y el gen de interés y utilizando como sonda el gen marca- 118 DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.

103 dor, se obtendrá una sola banda por cada inserción independiente (4-d). Si la membrana se hibrida con el gen de interés (4-e) aparecerá un patrón que tendrá el mismo número de bandas que el anterior. La ausencia de una banda es indicativo de la inserción de una copia truncada de uno de los genes por lo que se pierde el sitio de corte. La aparición de una banda del tamaño del T-DNA puede indicar la presencia de repeticiones en tandem. Para estimar el número de copias del transgen en un locus transgénico, se deben utilizar enzimas de restricción con sitios flanqueantes del transgen y como sonda, el transgen. Se observará una sola banda del tamaño del transgen; sin embargo, la intensidad de la señal variará entre las distintas plantas analizadas de acuerdo con el número de copias del mismo (4-f). Para realizar la comparación es necesario utilizar simultáneamente estándares conteniendo un número conocido de copias del transgen. Esta determinación no es del todo precisa ya que existe mucha variabilidad en los resultados debido a diferencias en la digestión de las muestras y a la degradación que sufre el ADN. En lo que respecta a la cuantificación, esta técnica ha sido reemplazada en gran medida, en los últimos años, por la PCR en tiempo real o «real time PCR», antes mencionada, dado que esta última resulta menos costosa en reactivos y tiempo y requiere menos cantidad de material vegetal para realizar el análisis. - Análisis de ARN: Las técnicas de RT- PCR (transcripción reversa seguida de PCR) con la hidridación de ARN o «Northern blotting» pueden resultar valiosas herramientas para detectar los transcriptos de interés presentes en la muestra. La RT-PCR presenta algunas ventajas frente al Northern blotting: se requiere poca cantidad de material, posee una alta sensibilidad y la muestra es de fácil preparación. Por otra parte, la hibridación del ARN utiliza como sonda el transgen, ofrece información sobre el tamaño del transcripto y permite su cuantificación. - ELISA y «Western blotting»: aquellas plantas que poseen la secuencia de interés y la expresan como transcripto, pueden ser analizadas con estas técnicas inmunológicas a fin de determinar la presencia de la proteína codificada por el transgen. La actividad de la proteína debe ser medida, sea por ensayos bioquímicos o por bioensayos, a fin de interpretar correctamente el fenotipo de la planta obtenida. Además, es conveniente confirmar la estabilidad meiótica de los transgenes estudiando su transmisión sexual a la generación siguiente. Estas técnicas se encuentran descriptas detalladamente en la sección II.3 y su aplicación para el análisis de plantas transgénicas en Register (1997) y en Bhat y Srinivasan (2002). Finalmente, el comportamiento de los individuos transgénicos se estudia en laboratorio, invernáculo y campo. Cabe aclarar que para realizar experimentos de invernáculo y de campo es necesario contar con autorización de la Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA) (ver IX.-3). 3 Aporte de la transformación genética a la variabilidad genética Como ya se mencionó, la transformación genética permite introducir variabilidad genética novedosa en las diferentes especies vegetales. Analizando con más detalle este concepto podemos considerar que este aporte puede ser realizado de diferentes maneras. Así, este puede consistir en: a) La expresión de secuencias codificantes no existentes en la especie (ejemplo: proteínas insecticidas de origen bacteriano). b)la expresión de nuevas formas alélicas de genes que ya están presentes en el genoma (ejemplo: tolerancia al glifosato en soja). c) La expresión de secuencias codificantes presentes en el genoma pero bajo el control de nuevas secuencias regulatorias que modifican su nivel o patrón de expresión (ejemplo: proteínas relacionadas a la patogénesis). d)la inhibición de la expresión de genes residentes en el genoma. Para lograr la inhibición de la expresión génica se pueden usar diferentes técnicas: cosupresión, antisentido y la denominada interferencia del ARN. Todas ellas se basan en un proceso denominado silenciamiento génico post-transcripcional. Este involucra la degradación del ARN mensajero producido Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 119

104 por un gen determinado. La cosupresión consiste en la obtención de plantas transgénicas que expresan un transgen homólogo del gen residente que se desea silenciar. La técnica del ARN antisentido involucra la síntesis de moléculas de ARN que son complementarias al ARNm producido por la transcripción del gen que se quiere silenciar. El transgen consta de la secuencia codificante del gen cuya expresión se desea alterar pero con la orientación invertida, cuando esta secuencia se transcribe genera ARN que hibrida con el ARNm formando una hebra doble que bloquea la traducción. Como resultado de este mecanismo las células transformadas producirán poco o ningún producto proteico. Esta técnica ha sido utilizada para obtener variedad de tomates (FlavrSavrä) la que mantiene su firmeza durante mas tiempo luego de la cosecha debido a que la enzima responsable de la rotura de la pared celular, la polygalacturonidasa, se expresa en un 10% del nivel normal. La interferencia del ARN es parte de un mecanismo regulatorio natural de la expresión génica que es actualmente muy estudiado y es la metodología más eficiente, y por ello la más utilizada, para silenciar genes en plantas. La técnica se basa en la construcción de transgenes cuyo producto final es un ARN. Este contiene parte de la secuencia transcripta del gen a silenciar en forma de repetición invertida. Como consecuencia de esta estructura, cuando este tipo de transgen se transcribe en la planta se genera un ARN de doble cadena que dispara el mecanismo de degradación dependiente de la secuencia antes mencionado (Agrawal et al., 2003). El uso de una secuencia espaciadora entre las repeticiones confiere a las construcciones mayor estabilidad durante las manipulaciones en bacterias. Este tipo de construcciones se denominan ARN «hairpin». Además, se observó que el uso de un intrón como secuencia espaciadora, produce un silenciamiento más eficiente en la planta. Esta metodología es una herramienta muy valiosa para los proyectos de genómica funcional para poner en evidencia la función de genes clonados mediante su inactivación. Otra posibilidad es utilizarla para la obtención de plantas transgénicas mejoradas mediante la inactivación de genes endógenos cuya expresión es indeseada (Kusaba, 2004). Una interesante aplicación de interés agronómico de esta tecnología fue la obtención de plantas transgénicas de café que no contienen cafeína. 4 Obtención de plantas transplastómicas Las células vegetales contienen tres genomas: el nuclear, el plastídico y el mitocondrial. Los métodos presentados en las secciones precedentes tienen como blanco de transformación al genoma nuclear. Sin embargo, en los últimos años la obtención de plantas transplastómicas ha recibido notable atención (Maliga, 2002). Así, el genoma de los plástidos (plastoma) se ha convertido en un blanco atractivo para la ingeniería genética ya que esta tecnología ofrece una serie de ventajas sobre la transformación del genoma nuclear: 1. Se pueden obtener altos niveles de expresión de los transgenes y elevados niveles de acumulación de las proteínas codificadas por ellos (hasta el 47% de las proteínas solubles totales). Cabe notar que el nivel de acumulación observado a partir de transgenes nucleares es generalmente inferior al 1%. 2. Es posible expresar un transgen operón con varias secuencias codificantes bajo el control de un mismo promotor. 3. No se observa efecto de posición debido a que la integración del transgen está dirigida a un sitio particular del plastoma. Esto hace que no sea necesario obtener una gran población de transformantes, a diferencia de lo que actualmente ocurre con las plantas transgénicas nucleares. 4. No se observa silenciamiento de transgenes. 5. Para las especies que tienen transmisión materna de los plástidos (la mayoría). Se minimiza la dispersión de los transgenes por el polen debido a la ausencia de transmisión de los plástidos por el mismo. 6. A pesar de la naturaleza eminentemente procariota del sistema genético de los plástidos, se ha demostrado que estas organelas pueden procesar proteínas eucariotas permitiendo su correcto plegamiento y la formación de puentes disulfuro gracias a la presencia de proteínas 120 DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.

105 chaperonas y sistemas enzimáticos endógenos. Los protocolos existentes para la obtención de plantas transplastómicas se basan en la transferencia de genes por el método biolístico, un eficiente proceso de cultivo y selección in vitro, y la utilización de vectores con secuencias homólogas al genoma del cloroplasto. A diferencia de lo que ocurre en la transformación del genoma nuclear, la integración dirigida de los transgenes en el plastoma se realiza mediante recombinación homóloga. Para lograr esto, los vectores contienen los transgenes de interés flanqueados por secuencias con alta homología al ADN plastídico. La homología entre el ADN del vector y del ADN del cloroplasto determina la potencialidad del plásmido para ser utilizado en la transformación genética del plastoma. En este contexto, la existencia de secuencias altamente conservadas en el plastoma de varias especies es explotada para el diseño de vectores universales, potencialmente útiles en la transformación de los cloroplastos de numerosas especies. La expresión exclusivamente plastídica de los transgenes queda asegurada a través de la utilización de promotores específicos del cloroplasto, cuya transcripción tiene características típicamente procarióticas. 5 Importancia y aplicaciones de las plantas transgénicas Las primeras plantas transgénicas experimentales fueron obtenidas a mediados de los años 80. La disponibilidad de esta tecnología permitió importantes avances en el área del conocimiento de la biología vegetal. Por otra parte, se constituyó en una herramienta disponible para el mejoramiento genético vegetal (ver aspectos para esta aplicación en Birch, 1997) y el gran esfuerzo realizado en este sentido tuvo como consecuencia la llegada al mercado, a partir de 1995, de los primeros cultivares transgénicos. Es destacable la rápida adopción que tuvieron estos productos. Así en el 2002 se cultivaron en el mundo 58,7 millones de hectáreas con plantas transgénicas. El 99% de este área global se cultivó en 4 países (USA, Argentina, Canadá y China) mientras que el 1% restante se distribuyó en 12 países. Esta superficie estuvo ocupada prácticamente por 4 cultivos: soja (62%), maíz (21%), algodón (12%) y canola (5%). Los caracteres modificados que presentaron estos cultivos fueron resistencia a herbicidas (75%), resistencia a insectos (17%) o una combinación de ambos (8%). En la Argentina los eventos con autorización de comercialización son los siguientes: soja (tolerancia a glifosato), maíz (resistencia a lepidópteros, tolerancia a glufosinato de amonio) y algodón (resistencia a lepidópteros, tolerancia a glifosato). La CONABIA (ver en la página de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos, República Argentina; ha autorizado desde el año 1991, 520 solicitudes para liberaciones a campo, en distintas especies y con diferentes eventos de transformación. Los cultivos transgénicos actuales corresponden a lo que se denomina «la primera generación» que tiene por objetivo el aumento de la productividad de los cultivos, la reducción en el uso de agroquímicos, la conservación de la tierra arable, el agua y la energía, la reducción de la contaminación del ambiente y los beneficios para la salud humana derivados de estos aspectos. Se considera que la segunda generación de cultivos transgénicos tendrá más beneficios directos para los consumidores. Estos comprenden el mejoramiento de la calidad nutricional (proteínas, aceite, vitaminas y minerales), la eliminación de alergenos, la fitoremediación (es decir la recuperación de ambientes contaminados mediante el uso de plantas) y la utilización de plantas como bioreactores para la expresión de proteínas recombinantes con fines tales como la producción de vacunas comestibles, anticuerpos y otras proteínas de uso terapéutico o industrial. Esta aplicación se conoce como «molecular farming» (producción de moléculas en la granja) y presenta numerosas ventajas para la producción en gran escala de estas proteínas en particular en lo que respecta a costos, practicidad y seguridad. Sin embargo aún quedan algunos aspectos que limitan su potencial como biorreactores como son la calidad y homogeneidad del producto final. En los últimos 10 años, se han desarrollado varios sistemas de expresión basados en plantas y en la ac- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 121

106 tualidad se producen más de 100 proteínas recombinantes en diferentes especies vegetales, generándose un estrecho vínculo entre la agricultura y muchas ramas de la industria. Un ejemplo destacable es el arroz dorado, llamado así por la pigmentación amarilla que tienen sus granos debido a que acumula altos niveles de provitamina A en el endosperma. La tercera generación de cultivos transgénicos se basará en la información producida por los proyectos genómicos y tendrá por objeto aspectos tales como la modificación de la arquitectura de la planta, la manipulación de la floración, el mejoramiento de la eficiencia fotosintética, la manipulación de la heterosis y la apomixis, etc. 6 Perspectivas La continuidad en el desarrollo de tecnología de transferencia de genes en plantas es importante tanto para ampliar el rango de especies a transformar como el de genotipos dentro de cada especie. En los últimos años se nota un creciente interés en el control del nivel de expresión de transgenes así como de su regulación espacial y temporal. La expresión de los genes nucleares eucarióticos está controlada en varios niveles que involucran la transcripción propiamente dicha, el procesamiento, transporte y estabilidad de los transcriptos y su traducibilidad, así como la estabilidad, modificación y compartimentalización del producto proteico final. Por otra parte, es necesario aprovechar la experiencia acumulada en cuanto a la expresión de transgenes, de modo de diseñar protocolos de transferencia que minimicen las posibilidades de silenciamiento génico. En este contexto, está recibiendo notable atención el estudio de la recombinación homóloga como mecanismo para la transformación del genoma nuclear (ver revisión de Hanin y Paszkowski, 2003). Del análisis comparativo de métodos presentado cabe destacar dos aspectos actualmente en desarrollo. Por un lado, continúa el interés en extender el uso de la transformación mediada por A. tumefaciens a especies que no son hospedantes naturales de la bacteria. Por otro lado, como fuera anteriormente mencionado, los métodos de transformación genética actualmente en uso requieren de genotipos con una excelente respuesta al cultivo in vitro, lo cual resulta en una clara limitación cuando se desea aplicar esta tecnología a los materiales usados por los mejoradores, los que generalmente no poseen esta característica. Por ello, se está tratando de reducir y si es posible evitar la fase de cultivo in vitro durante el proceso de transformación, lo que permitirá ampliar el rango de genotipos a los cuales se podrá aplicar esta moderna tecnología. Así, se desarrolló un método eficiente y reproducible de transformación in planta para Arabidopsis thaliana. Este consiste en infiltrar con vacío plantas adultas de esta especie, con una suspensión de A. tumefaciens de modo que los tejidos y órganos reproductivos sean invadidos por la bacteria. Posteriormente se propuso una simplificación de este método que consiste en reemplazar el tratamiento de vacío y sumergir la inflorescencia en una suspensión bacteriana que incluye un surfactante. Las plantas transgénicas que se obtienen por autofecundación de las plantas así transformadas, son hemicigotas y se demostró que esta metodología produce la transformación de la gameta femenina. El logro de determinados objetivos como puede ser el redireccionamiento de una ruta metabólica o la modificación de un carácter complejo de interés agronómico como por ejemplo la resistencia durable a enfermedades fúngicas, requiere de la integración de múltiples transgenes y de la expresión coordinada de los mismos en la planta transgénica. Este tema está recibiendo notable atención (ver revisión de François y col., 2002). Los métodos de transformación que hemos descripto se basan en la utilización de genes marcadores seleccionables. Sin embargo, hay razones por las cuales la presencia del marcador no es deseable en plantas transgénicas que se liberan al ambiente. Hay un manifiesto rechazo por parte del público con respecto a la utilización de genes de resistencia antibióticos y en determinadas situaciones, el uso de genes de resistencia a herbicidas puede ser inconveniente. Por otra parte, desde un punto de vista experimental puede ser necesario transformar una misma planta varias veces con distintos trans- 122 DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.

107 genes y con la metodología convencional no hay más que un número limitado de genes marcadores disponibles. Por ello se consideran estrategias alternativas para la obtención de plantas transgénicas libres de marcadores (Puchta, 2003). La estrategia que ha recibido más esfuerzo hasta ahora, plantea la remoción vía cruzamiento sexual del marcador seleccionable luego de haber obtenido la planta transgénica. Una posibilidad para ello es cotransformar, esto implica que el transgen de interés y el marcador seleccionable estén presentes en vectores distintos y que posteriormente se separen los genes por segregación luego de la reproducción sexual. Sin embargo, esta puede ser una alternativa poco atractiva en circunstancias particulares como cuando no se dispone de un protocolo eficiente de cotransfor-mación o cuando no se desea reproducir sexualmente la planta transgénica. Otra opción dentro de esta línea es la utilización del sistema de recombinación sitio-específica de origen viral Cre/lox. Más recientemente se ha propuesto como estrategia alternativa el desarrollo de métodos de transformación que no usen marcadores seleccionables. La idea subyacente es incrementar la frecuencia de transformación a través del uso de genes que promuevan la regeneración. Finalmente, las plantas transgénicas actualmente cultivadas comercialmente, en su mayoría resistentes a herbicidas nos permiten ganar experiencia y acumular el conocimiento necesario para desarrollar nuevas y mejores generaciones de productos. 7 Lecturas recomendadas AGRAWAL, N.; DASARADHI, V.; MOHAMMED, A.; MALHOTRA, P.; BHATNAGAR, R. y MUKHERJEE, S «RNA Interference: Biology, Mechanism, and Applications». Microbiology and Molecular Biology Reviews Dec. 2003, p BIRCH R «Plant transformation: Problems and strategies for practical applications». Annu. Rev.Plant Physiol. Plant Mol.Biol. 48: FRANÇOIS, I.; BROEKAERT, W.; CAMMUE, B «Different approaches for multi-transgene-stacking in plants». Plant Science 63: GELVIN S «Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration». Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51: HANIN, M.; PASZKOWSKI, J «Plant genome modification by homologous recombination». Current Opinion in Plant Biology 6: HORSCH, R.; FRALEY, R.; ROGERS, S.; SANDERS, P.; LLOYD, A.; HOFFMAN, N «Inheritance of functional foreign genes in plants». Science 223: KLEIN, T.; WOLF, E.; WU, R.; SANFORD, J »High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells». Nature 327: KUSABA, M «RNA interference in crop plants» Current Opinion in Biotechnology 15: 1-5. MALIGA, P «Engineering the plastid genome of higher plants». Current Opinion in Plant Biology 5: PUCHTA, H «Marker-free transgenic plants». Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74: REGISTER J Approaches to evaluating the transgenic status of transformed plants. TiBTech, 15: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 123

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109 III.-Capítulo 4 Polinización y fertilización in vitro. Picca, Aurora; Cardone, Susana 1 Introducción Muchas plantas con flores producen menos frutos maduros que flores, y los frutos, a su vez, generan menos semillas que el número de óvulos disponibles para la fecundación. Considerando que la producción de polen no es el factor limitante, existen diferentes razones que explican esta situación. En ocasiones, a pesar de la ocurrencia de la polinización, la fecundación no puede llevarse a cabo. Otras veces, la fecundación ocurre normalmente pero el embrión aborta en forma precoz. En cualquiera de estas circunstancias, las técnicas de cultivo in vitro y manipulación de células aisladas son apropiadas para lograr el proceso completo de desarrollo del embrión y del endosperma y la obtención de semillas normales. En este capítulo se utilizarán indistintamente los términos «fecundación» y «fertilización» como sinónimos, refiriéndose a la unión de las gametas masculina y femenina para originar un nuevo individuo. La técnica de fertilización o polinización ovular in vitro fue desarrollada por Kanta et al. en 1962, quienes demostraron que en algunas especies de papaveráceas los granos de polen tenían la capacidad de germinar in vitro directamente sobre los óvulos en cultivo. En estas condiciones el tubo polínico alcanzaba el saco embrionario para concretar la fertilización, con la consiguiente formación de semilla normal en el mismo medio de cultivo. Esta técnica desarrollada en Papaver somniferum, ha sido luego empleada en varias especies de plantas como Dianthus caryophyllus, Nicotiana tabacum, N. rustica, Argemone mexicana, Eschechlozia californica, Petunia violacea, Antirrhinum majus y Dicranostigma franchetianum. Bajo el nombre de «polinización in vitro» se suele englobar a varias técnicas que si bien poseen puntos en común, difieren en otros. Entre ellas se pueden citar la «polinización in vitro de óvulos», la «polinización placental in vitro» y la «polinización estigmática in vitro». En todos los casos la gameta femenina es fecundada por células espermáticas liberadas por el tubo polínico, en forma «casi» idéntica a la vía natural. El término «fertilización in vitro» se utiliza para aquellos casos donde la fusión de las gametas aisladas se logra por distintos métodos como electrofusión, alta concentración de calcio o elevado ph. A veces la fertilización ocurre normalmente, pero el embrión no puede alcanzar la madurez debido a una ruptura del equilibrio entre el mismo y el endosperma o por anomalías en el desarrollo embrionario que impiden una nutrición normal. Esto es lo que se conoce como barreras posfertilización o poscigóticas, que pueden contrarrestarse con el rescate de los embriones y su posterior crecimiento en un medio nutritivo adecuado. 2 Fertilización in vitro Durante años, los científicos utilizaron técnicas de fertilización in vitro de gametas aisladas tanto en animales como en plantas inferiores. Sin embargo, estos métodos no pudieron ser aplicados a las plantas superiores hasta comienzos de la década de los noventa. Esto se debió a que la fertilización in vitro de las gametas aisladas de plantas superiores es un proceso muy diferente al que ocurre in vivo, y también lo es de los sistemas animales y de las plantas inferiores, donde las gametas son de vida libre. El hecho más notable de la fertilización in vivo de las angiospermas es el de la «doble fecundación», que es un proceso muy complejo en comparación con lo que acontece en todos los demás seres vivos. Esto ocurre en el saco embrionario, que se halla profusamente cubierto por el tejido materno. Los núcleos espermáticos se encuentran dentro de los granos de polen o tubos polínicos. Durante la fertilización, el tubo polínico llega hasta el aparato ovular, desorganizándose entonces el núcleo vegetativo. Las dos células espermáticas contenidas en el tubo, se vuelcan en una de las sinérgidas, la misma se desorganiza y uno de los núcleos espermáticos se fusiona con la oósfera para dar el cigoto, que luego producirá el embrión. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 125

110 Saco embrionario Saco embrionario Oósfera en fusión con uno de los gametos Tubo polínico El otro núcleo masculino se reunirá con dos núcleos femeninos secundarios para dar la célula madre del endosperma triploide (Fig. 1). Para que la fertilización tenga lugar in vitro no sólo deben aislarse las gametas femeninas y masculinas sino que deben ser inducidas a fusionarse en ausencia de las células asociadas. Las técnicas de micromanipulación desarrolladas durante los años 80 permitieron el aislamiento y la fusión in vitro de gametas femeninas y masculinas de angiospermas. La combinación de estas técnicas con métodos de cultivo de células únicas posibilitaron la fertilización in vitro. Se pudo concretar de esta manera el desarrollo de cigotos y de endospermas en forma individual in vitro, lo cual demuestra que cigotos y endosperma son capaces de autoorganizarse en cultivo, independientemente del tejido materno. Tanto los cigotos obtenidos in vitro como los que son aislados después de la polinización in vivo desarrollan embriones normales y posteriormente plantas fértiles en cultivo. En 1989 se fusionaron por primera vez gametas aisladas de maíz in vitro (Zea mays). Llevó tres años más regenerar plantas híbridas fértiles, vía embriogénesis cigótica, a partir de esos cigotos cultivados individualmente. Actualmente puede reproducirse in vitro el ciclo completo de vida de una planta superior, comenzando con la electrofusión de Núcleos polares recibiendo al segundo gameto Sinérgida que recibió el extremo del tubo polínico Figura 1: Corte longitudinal de un óvulo mostrando la doble fecundación en angiospermas. la célula espermática con la ovocélula, dando como resultado un cigoto, un embrión y finalmente una planta madura. Estudios posteriores (1998,1999) posibilitaron el desarrollo de endosperma in vitro de maíz a partir de la fusión por pares de células espermáticas y núcleos secundarios aislados. La fusión del núcleo de la célula espermática puede ocurrir con uno de los dos núcleos polares o con los núcleos secundarios y se completa aproximadamente dos horas después de la fusión in vitro de las células. Los estudios in vitro sobre los primeros eventos después de la fusión de las células y núcleos indicaron que las primeras células del endosperma resultante desarrollan un tejido característico capaz de autoorganizarse en forma separada del tejido materno. 2.1 Aislamiento y selección de las gametas Se han desarrollado métodos de aislamiento y selección de gametas para una amplia variedad de especies vegetales entre ellas maíz (Zea mays), trigo (Triticum aestivum), cebada (Hordeum vulgare), raygrass (Lolium perenne) y algunas brasicáceas. Los pasos a seguir son los siguientes: a) Conocer exhaustivamente la morfología floral de la especie a utilizar con el objetivo de ubicar el saco embrionario y sus células constituyentes. b)aislar las gametas masculinas a partir de los granos de polen mediante choque osmótico y/o de ph. c) Aislar el saco embrionario y las gametas femeninas mediante microdisección individual en asociación con maceración enzimática. Este paso es crítico y limitante ya que pueden obtenerse pocas gametas femeninas y el proceso de manipulación es muy delicado. El tratamiento de las espigas no polinizadas con 2,4-D, que induce a la expansión del ova- 126 PICCA, Aurora; CARDONE, Susana

111 Figura 2: Fertilización in vitro mediante electrofusión. rio, facilita el proceso, resultando en ovarios más grandes y óvulos más blandos, incrementando la eficiencia en el aislamiento de las ovocélulas. Fertilización in vitro propiamente dicha. Esta puede ser realizada mediante la microinyección de células espermáticas o núcleos espermáticos aislados en células individuales obtenidas de los sacos embrionarios o por electrofusión (Fig. 2). En este último caso las gametas se ponen en contacto en una cámara de electrofusión por alineación dielectroforética y se fusionan mediante pulsos eléctricos. Los productos de fusión pueden ser entonces cultivados en una solución con células nodrizas y algunos de ellos desarrollarán en proembriones. 2.2 Fusión de las gametas Muchos de estos estudios, algunos de los cuales datan de 1994, fueron realizados en maíz, donde las gametas masculinas se obtienen a partir de granos de polen fresco sometidos a un shock de ph en una solución 0,5 M de manitol. Las ovocélulas y los protoplastos de las células centrales se aislan de óvulos por tratamiento con enzimas celulolíticas y microdisección manual. Las gametas femeninas y masculinas aisladas se colocan de a pares, bajo condiciones de esterilidad, en un medio de fusión simple compuesto por manitol y cloruro de calcio (CaCl 2 ). El uso de microagujas de vidrio permite poner en contacto las gametas femeninas y masculinas a fin de facilitar y dirigir la fusión. La adhesión y posterior fusión de las gametas es rápida (aproximadamente 10 segundos). A los 20 minutos de realizada la fusión, deja de visualizarse el núcleo masculino y 20 horas después es posible visualizar mediante contraste de fases la presencia de dos núcleos, de manera similar a lo que se observa in vivo. En 1995 se logró la fertilización exitosa de trigo a través de la electrofusión de ovocélulas con células espermáticas. En promedio, la frecuencia de fusión suele ser del 30%, pero bajo condiciones óptimas es posible alcanzar frecuencias superiores al 55%. Dos días después de la fusión eléctrica aproximadamente el 60% de los productos de fusión comenzó a dividirse y cerca del 90% de ellos formó estructuras multicelulares y en unos pocos casos microcallos. Pese a que se ha tomado al maíz (Zea mays L) como sistema vegetal modelo en el cual estudiar los procesos de fusión de gametas y posterior embriogénesis, también se han realizado trabajos exitosos de fusión de gametas en trigo (Triticum aestivum L.) obteniendo como resultado estructuras multicelulares y en algunos casos del tipo de microcallos. Los recientes progresos relacionados a los sistemas de fertilización in vitro así como los proyectos de genómica posibilitarán una mejor comprensión de los procesos de reconocimiento gamético, fusión, señales intracelulares, eventos tempranos de activación del huevo y formación del cigoto. 3 Polinización in vitro En muchos casos el polen no puede germinar sobre el estigma de la propia flor aunque éste se halle receptivo. Este hecho puede deberse a barreras genéticas o fisiológicas. Algunas de estas barreras de prefertilización o precigóticas se deben a: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 127

112 a) la incapacidad del polen de germinar en estigmas extraños b) la incapacidad del tubo polínico para alcanzar el óvulo debido a una lenta velocidad de crecimiento o a una excesiva longitud del estilo. En estos casos, el ovario aborta antes de que el tubo polínico alcance la base del estilo o sin que la alcance en absoluto c) el hecho que el tubo polínico se deshaga en el estilo. La polinización in vitro de óvulos con el desarrollo posterior de embriones ha sido exitosa en 14 familias de Angiospermas, resultando más adecuada su aplicación en aquellas especies que poseen ovarios grandes y que contienen muchos óvulos. No obstante, con el tiempo se desarrollaron varias técnicas de polinización in vitro más sofisticadas ampliando con esto las posibilidades de aplicación. Entre estas técnicas se encuentran: - La polinización estigmática, que consiste en cultivar el pistilo in vitro y colocar el polen sobre el estigma. - La polinización placental, donde los óvulos se ponen en contacto con el polen a través de un corte en la parte superior del ovario o quedan directamente expuestos por remoción de la pared del ovario. - La polinización de óvulos aislados que se cultivan directamente sobre el medio de cultivo. - El injerto del estilo, en el cual los granos de polen germinan en un estilo compatible y luego se los une al ovario de la planta madre que se desea fertilizar. Es de esperar que en todos estos casos el polen germine en pocas horas, y que después de la polinización, tenga lugar la fertilización. En la polinización placental in vitro los porcentajes de supervivencia son muy buenos, ya que los óvulos no resultan dañados durante las manipulaciones involucradas en su aislamiento. El cultivo junto con la placenta incrementa, en general, las posibilidades de un rápido desarrollo embrionario. El cultivo de óvulos aislados (separados de su placenta) es un procedimiento mucho más complicado y que ha sido empleado con éxito sólo en pocas especies de plantas. Para que las técnicas sean exitosas es crucial realizar el aislamiento de los óvulos y del polen en el estado fisiológico adecuado, por lo que es indispensable realizar un estudio de la duración de los distintos estadios del desarrollo de ambos. Este estudio consiste en: a) Determinar los tiempos de antesis, dehiscencia de las anteras y polinización. b)precisar el momento en que el estigma esté receptivo c) Especificar el momento adecuado para la polinización. d)establecer el tiempo adecuado para recoger el polen. Experimentalmente se intentó la polinización in vitro de óvulos de varias especies de angiospermas con polen proveniente de varias especies de gimnospermas. El análisis embriológico de los óvulos de Melandrium album, fijados tres días después de la polinización con polen de Pinus wallihiana, reveló la presencia de remanentes de tubos polínicos y embriones de 2-células en los sacos embrionarios. 4 Cultivo de óvulos y embriones in vitro El cultivo de óvulos es un procedimiento muy complejo debido a que la manipulación del material es difícil. El óvulo es una estructura delicada, muy pequeña, altamente hidratada, que puede ser dañada con suma facilidad. Es imprescindible realizar la microcirugía con rapidez para evitar que los tejidos sufran desecación durante el proceso. Pese a las dificultades de la técnica, en algunos cruzamientos interespecíficos como los realizados en papa, algodón y Hevea brasiliensis, se comprobó que el cultivo de óvulos completos es más exitoso para el rescate de embriones que el cultivo de los embriones aislados. El rescate de embriones consiste en aislar los embriones de los óvulos de una planta y cultivarlos en un medio estéril que contenga los nutrientes esenciales que les permita concluir su desarrollo normal y germinar. Esta técnica es relativamente fácil de llevar a cabo en embriones maduros y sus posibilidades de éxito son muy buenas. Las dificultades incrementan cuanto más inmaduro sea el 128 PICCA, Aurora; CARDONE, Susana

113 embrión a rescatar, ya que los requerimientos nutricionales son más específicos en las etapas tempranas de desarrollo del embrión. El cultivo de óvulos y de embriones vegetales se emplea en mejoramiento vegetal cuando se desea: - sortear algunas de las barreras de autoincompatibilidad - rescatar embriones abortivos derivados de la hibridación interespecífica o intergenérica - superar problemas de abscisión precoz del fruto - recuperar embriones de cruzas interespecíficas que conducen a la obtención de haploides - acortar el período de latencia que ocurre en algunas semillas por presentarse inhibidores del desarrollo del embrión, en el endosperma o en la cubierta de la misma. El cultivo de embriones ha ayudado también al mejoramiento genético de especies leñosas que tienen dificultad en la germinación de sus semillas como en Taxus mairei o con escasa producción de semillas como es el caso de Pseudotsuga macrolepis y constituye una herramienta interesante en estudios básicos de biología reproductiva ya que permite analizar la embriogénesis in vitro. 4.1 Factores externos que condicionan el cultivo de óvulos y de embriones Entre los factores externos más importantes que afectan el cultivo de óvulos y de embriones se citan el medio de cultivo, la osmolaridad y los reguladores de crecimiento. El óvulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales, que varían con el estadio de desarrollo del mismo y que es necesario identificar para cada especie en particular. Es importante además obtener un medio de cultivo adecuado para favorecer la germinación de los granos de polen y permitir el desarrollo de los óvulos fertilizados hasta semillas maduras. En general, todos los medios de cultivo para germinación de los granos de polen poseen altas concentraciones de sacarosa y de ácido bórico. Un aspecto fundamental a tener en cuenta en el rescate de embriones es la selección correcta de un medio de cultivo que pueda soportar los cambios progresivos de requerimientos durante las distintas etapas del desarrollo embrionario. Se pueden reconocer dos fases en el desarrollo embrionario con respecto a la nutrición: la fase heterotrófica en la que el embrión es dependiente del endosperma y demás tejidos maternos que lo rodean, y la fase autotrófica, en la cual el embrión es capaz de sintetizar las sustancias requeridas para su crecimiento a partir de sales minerales y azúcares. La etapa crítica de pasaje de una fase a otra varía con las especies. Este cambio de requerimientos nutricionales hace que, cuando crecen in vitro, sea imprescindible la transferencia de los embriones de un medio de cultivo a otro para garantizar un óptimo crecimiento. Entre los medios de cultivo más difundidos podemos citar el de Murashige & Skoog, Monnier, Randolph & Cox, Gamborg, Liu y col., etcétera. El agua de coco y los extractos de endospermas han sido muy útiles, activando el crecimiento y desarrollo de los embriones en el cultivo de óvulos de algunas especies vegetales. No existe demasiada evidencia acerca de la absoluta necesidad de los reguladores de crecimiento para el desarrollo de los embriones extraídos, sean inmaduros o maduros, fuera de su rol en la ruptura de la dormición. La concentración osmótica es un factor importante en el desarrollo de óvulos y embriones, dependiendo del estado de madurez de los mismos. La sacarosa presente en los medios de cultivo no sólo provee la fuente de carbono necesaria para el crecimiento sino que además mantiene la osmolaridad requerida para cada etapa del desarrollo. Está demostrado que una presión osmótica elevada previene la germinación precoz de los embriones inmaduros, evitando así la ocurrencia de malformaciones estructurales. A medida que van creciendo, los embriones necesitan ser transferidos a medios con progresivas disminuciones en los niveles de sacarosa. Los embriones de la mayoría de las especies presentan un buen crecimiento en un rango de temperaturas que va de los 25ºC a los 30ºC. Aunque algunos estudios indican Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 129

114 que la luz no es crítica para el crecimiento de los embriones, se demostró que en el caso de la cebada la luz disminuye las probabilidades de germinación precoz en los embriones inmaduros. 5 Aplicaciones La polinización placental in vitro puede ser empleada para superar las barreras de autoincompatibilidad e incompatibilidad cruzada. Los granos de polen de plantas autoincompatibles son capaces de germinar directamente sobre los óvulos y llevar a cabo el proceso completo de la reproducción sexual. En algunas combinaciones de cruzamientos, la polinización directa de los óvulos permite que se superen las barreras de incompatibilidad precigótica, obteniéndose embriones híbridos y aun plantas híbridas imposibles de obtener mediante técnicas convencionales, como es el caso de Zea mays x Z. mexicana, Nicotiana tabacum x N. amplexicaulis, Melandrium album x Viscaria vulgaris, M. Album x Silene schafta, etc. En aquellos cruzamientos en los que la barrera de incompatibilidad se encuentra a nivel del ovario como en Trifolium repens x T. hybridum, es necesario rescatar los óvulos recién fecundados. La polinización placental in vitro también se emplea como vía para la obtención de plantas resistentes a estreses ambientales, ya que permite seleccionar para la fecundación aquellos granos de polen que tuvieron capacidad de germinar bajo diferentes condiciones de estrés. La polinización in vitro con polen obtenido de plantas de maíz creciendo a temperaturas elevadas condujo a la obtención de plantas tolerantes a estrés por calor. En Brassica rapa, la selección de polen a baja temperatura tuvo un efecto positivo en el crecimiento de la progenie en condiciones de frío, logrando acumular más peso seco que en progenies normales. Se podría entonces seleccionar para la fecundación aquellos granos de polen que hayan sido capaces de germinar bajo condiciones de estreses ambientales, en este caso térmico, acelerando así la obtención de plantas resistentes. Dentro de las aplicaciones del cultivo de embriones está la del rescate de embriones para la producción de plantas haploides, donde se cultivan embriones que se forman por partenogénesis o por eliminación de cromosomas luego de la hibridación interespecífica o intergenérica. Los embriones haploides en algunos casos se distinguen morfológicamente de los normales, de manera que se extraen y se los cultiva in vitro en medios y condiciones de cultivo adecuados (ver IV.-1). Otras veces es necesario esperar a obtener las plantas para determinar el nivel de ploidía. Esta técnica se ha utilizado con éxito en cebada, trigo y tabaco. El cultivo de embriones se utiliza también en el caso de plantas que sufren el aborto de los mismos en estadios tempranos del desarrollo debido a la incompatibilidad con el endosperma, como en la producción artificial del triticale. Precisamente fue en este caso donde la técnica de cultivo de embriones junto con la aplicación de colchicina fueron de fundamental importancia en la transformación del triticale en cultivo comercial, para superar el alto grado de incompatibilidad del cruzamiento inicial y la marcada esterilidad que poseía la F1. El perfeccionamiento de estas dos metodologías fue decisiva para la producción de un gran número de triticales hexaploides y octoploides, cruzando el centeno con trigos duros y harineros, respectivamente, con un alto grado de fertilidad. También se emplea el cultivo de embriones en casos en que el endosperma no se desarrolla normalmente, como sucede en los cruzamientos de cultivares diploides y tetraploides de Citrus, o cuando el mismo se desintegra después de la fecundación, como en Oenothera biennis x O. muricata o O. biennis x O. lamarckiana. Esta técnica también es de utilidad para sortear barreras de dormición o en casos donde la viabilidad de la semilla es baja, como en yuca y otras especies del género Manihot. El cultivo in vitro de embriones es una alternativa para el intercambio de semilla a través de fronteras internacionales. En un proyecto de mapeo de genes con resistencia al virus del mosaico en yuca, desarrollado entre CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, con sede en Colombia) y IITA (Instituto Internacional de Agricultura Tropical, con sede en Nigeria) donde fue necesario trasladar «stocks» de semillas desde 130 PICCA, Aurora; CARDONE, Susana

115 Sudamérica al continente africano, el cultivo de embriones resultó ser un excelente método para transferir germoplasma con mínimos riesgos fitosanitarios. El cultivo de embriones inmaduros también puede ser aplicado como complemento del mejoramiento convencional, entre las estrategias utilizadas para disminuir el tiempo necesario en la obtención de un nuevo cultivar. Por ejemplo en soja se requieren unos diez años para este fin. Si se consiguen realizar varias generaciones por año, en contraestación, se acelera el proceso. El cultivo de embriones inmaduros ahorraría además el tiempo de maduración de la semilla. Cultivo de nucelas. Existen pocos explantos que poseen la capacidad de producir callos embriogénicos. Las inflorescencias y los embriones inmaduros se utilizan para este fin en los pastos y en los cereales, constituyendo excelentes herramientas para la transformación de plantas. En las plantas leñosas los explantos de tejidos maduros pierden la capacidad de regeneración, se ha inducido entonces con éxito la embriogénesis somática a partir de nucelas de óvulos jóvenes. Este es el caso de Citrus sp, Vitis vinifera, Malus domesticus, Psidium guajava y Pyrus serotina. En estas especies también permiten acortar el período de siembra a floración. Otro sistema que puede utilizarse en algunos experimentos básicos es la obtención de un embrión a partir de cigotos transgénicos o micromanipulados. Para ello son importantes la fertilización in vitro de gametas aisladas y el cultivo de los productos de fusión hasta la obtención de una planta. Bajo esas condiciones el embrión no se diferencia de los embriones obtenidos in vivo. En maíz también es posible cultivar los cigotos fertilizados in vivo dentro de sacos embrionarios parcialmente aislados. 5.1 El cultivo de óvulos y embriones y la embriogénesis somática para dilucidar aspectos básicos del desarrollo en plantas Las plantas parecen poseer un programa embriogénico específico preestablecido que puede dispararse en respuesta a condiciones específicas. La embriogénesis cigótica se dispara por la fertilización mientras que la somática lo hace a través del cultivo de tejidos. El estudio de los eventos moleculares que tienen lugar durante la embriogénesis temprana es actualmente uno de los campos principales de la biología vegetal. Los embriones somáticos constituyen una excelente herramienta para estudiar los procesos de desarrollo en plantas, ya que facilitan el acceso a gran cantidad de embriones libres. En su medio natural los embriones cigóticos ofrecen dificultades debido a su pequeño tamaño y al hecho de estar inmersos en el tejido materno. Los embriones vegetales son morfológicamente simples pero molecularmente complejos. A diferencia de lo que ocurre en los embriones animales, donde los patrones de expresión génica se hacen más complejos a medida que progresa el desarrollo, en los embriones vegetales se encontraron unos ARN, número similar al encontrado en órganos más complejos como hojas, raíces, flores, anteras, etc., donde los ARN que son específicos de un estadio determinado constituyen una modesta fracción del total, representando, sin embargo, a un gran número de genes. En algodón, por ejemplo, el 10% de los ARN presentes en embriones en la fase media de maduración son únicos de aquel estadio. Muchos de estos genes específicos de estadio han sido clonados como ADNc, pero en general se trata de genes expresados mayoritariamente, como aquellos de las proteínas de reserva de la semilla. Estos ADNc resultaron ser marcadores útiles de la diferenciación celular, como el gen inhibidor de la tripsina de Kunitz, cuyo ARN se acumula en el polo micropilar del embrión globular (por donde penetra el núcleo espermático al saco embrionario) antes de que sea evidente la diferenciación celular. La expresión de este gen es uno de los primeros indicadores moleculares de polaridad en la transición del embrión globular a uno de simetría bilateral con forma de corazón. Para estudiar el desarrollo en plantas, al igual que en el caso de animales, se ha recurrido al uso de mutantes. El organismo modelo en este caso es Arabidopsis thaliana, que es una planta de genoma pequeño y ci- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 131

116 Preglobular Corazón Globular Torpedo Embrión maduro Figura 3: Estadíos de la embriogénesis de Arabidopsis thaliana. clo de vida muy corto, lo cual la hace apta para estudios genéticos. Se han detectado dos tipos de mutantes, letales embrionarios y con alteraciones en el patrón de desarrollo. Calculando el número de mutantes letales embrionarios que se encontraron, algunos investigadores han concluido que existen unos genes expresándose durante la embriogénesis. En el punto superior de esta compleja vía se encuentran genes reguladores principales («master regulators») y sólo de 40 a 50 genes que afectan el patrón embriogénico. Entre las mutaciones estudiadas se encuentran bio1, que es letal y detiene la embriogénesis en el estadio de corazón temprano. No es un gen regulador principal y sus efectos se ven revertidos en presencia de biotina. Otra mutación es raspberry. Estos mutantes quedan bloqueados en el estado globular y poseen protuberancias en las células externas lo que le da el aspecto de una frutilla. El bloqueo se presenta en un estadio anterior a la formación de órganos, momento en el que ya existe diferenciación celular. En maíz también se han encontrado mutantes letales embrionarios. En algunos se encuentran inhibidos el desarrollo del embrión y el endosperma. En otros, sólo el embrión. Una importante conclusión a la que permitieron arribar estos mutantes es que el embrión de Arabidopsis está constituido por el ensamblaje de dos patrones superpuestos, uno a lo largo del eje apical-basal y el otro a lo largo del eje radial. Ninguno de los mutantes encontrados fueron mutantes tempranos, lo cual sugeriría un control de los primeros estadios del desarrollo embrionario por parte de genes maternos, como sucede en animales. Sin embargo, se han identificado pocos genes maternos que afecten el desarrollo en plantas y el hecho de que se puedan formar los embriones somáticos o que se puedan desarrollar embriones producto de la fertilización in vitro induciría a sospechar que los genes maternos no juegan un rol primordial. Un gen materno encontrado en Arabidopsis es sin1 (short integument 1). Este gen afecta la formación de óvulos, el tiempo de floración y el desarrollo embrionario. No se sabe si realmente se requiere para la embriogénesis o si los defectos observados se deben a las limitaciones impuestas por los defectos en el tejido materno. Los embriones provenientes de madres sin1/sin 1 tienen grandes defectos morfogenéticos. Embriones con ese genotipo en madres normales tienen un desarrollo normal (Fig. 3). Un gen embrionario muy importante es GN/EMB30. No se sabe si es un regulador principal y actúa muy temprano en el desarrollo, durante la primera división celular del cigoto. En los mutantes las dos células resultantes no son diferentes, como ocurre en embriones normales, donde la primera división celular es asimétrica. El sistema mejor estudiado en relación con la embriogénesis somática es el de suspensiones celulares de zanahoria (Daucus carota). En este sistema, la remoción del ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) genera un respuesta embriogénica por la cual los agregados celulares forman embriones que crecen de a millares en un medio líquido. La disponibilidad de gran cantidad de embriones creciendo sincrónicamente en un medio líquido representa un buen sistema para estudiar los eventos genéticos involucrados en el desarrollo embrionario. Los primeros estudios tendientes a identificar patrones de expresión génica relacionados con la embriogénesis somática fueron realizados en Utilizando electroforesis bidimensional se encontra- 132 PICCA, Aurora; CARDONE, Susana

117 ron pocas diferencias entre patrones proteicos de embriones somáticos y células en proliferación, aunque, en virtud de lo expresado anteriormente, se esperaría un patrón más complejo. Habría varias explicaciones para esta inconsistencia. Una es que los productos de genes individuales involucrados en el desarrollo embrionario no fueran muy abundantes como para ser detectados en las genotecas de ADNc. Otra es que la sincronización fuera sólo aparente, particularmente en estadios tardíos y que estas diferencias enmascararan las diferencias entre estadios. Otra es que las constelaciones génicas involucradas en la embriogénesis somática podrían estar ya activadas en las células proliferando en cultivo. Algunos estudios indicarían que muchos de los genes expresados en los embriones somáticos ya estarían haciéndolo en las masas proembriogénicas. Uno de estos genes es el SERK que se expresa en células competentes. Se conoce la secuencia de su ADNc y codificaría para una proteína receptora con repeticiones ricas en leucina del tipo proteína quinasa. La expresión de este gen está correlacionada con la aparición de células competentes en cultivos primarios derivados de explantos de hipocótilos. La expresión continúa en las masas proembriogénicas y persiste hasta el estadio de embrión globular. Se encontró una línea celular (ts11) sensible a la temperatura (letal condicional) que en la temperatura restrictiva detiene su desarrollo en el estadio de corazón. Este efecto es revertido al colocar las células en un medio condicionado proveniente de suspensiones celulares normales. El compuesto responsable de la reversión resultó ser una endoquitinasa acídica. Aparentemente, esta enzima puede hidrolizar un sustrato que se encuentra en las paredes celulares vegetales y liberar un compuesto indispensable para disparar la embriogénesis somática. Tal sustrato no pudo ser identificado pero se encontró un lipoligosacárido de Rhizobium, NodRlv-R (Ac, C18:4), que puede rescatar a estas líneas celulares mutantes a fin de que prosigan los procesos de embriogénesis somática. Hasta el momento no se ha encontrado cuál es la sustancia en células vegetales que produce este efecto. El programa de eventos que tiene lugar durante la embriogénesis somática es muy elaborado como para estar regulado solamente por el 2,4-D. La perturbación causada por la deprivación de este regulador del crecimiento debe disparar una serie de eventos clave que involucran la acción de factores de crecimiento más específicos y fuerzas biofísicas que confieren información posicional y de desarrollo. 6 Lecturas recomendadas BARNABAS, B.; PONYA, Z Test-tube Plants as Tools for Crop Improvement. Hungarian Agriculture Research. 2: 5 9. BHOJWANI, S. S.; RAZDAN, M. K Plant Tissue Culture: Theory and Practice, a Revised Edition. Elsevier. DUMAS, C; MORGENSEN, H. L Gametes and fertilization: Maize as a model system for experimental embryogenesis in flowering plants. Plant Cell. 5: FAURE, J. E.; DIGONNET, C.; DUMAS, C An in Vitro System for Adhesion and Fusion of Maize Gametes. Science. Vol 263, pp FAURE, J. E.; ALDON, D.; ROUGIER, M.; DUMAS, C Emerging data on pollen tube growth and fertilization in flowering plants, Protoplasma, Vol 193, Iss 1-4, pp GUEVARA, C.; OSPINA, J.; MAFLA, G.; V. VERDIER Zygotic embryo culture of Manihot esculenta Crantz : a practical approach for the safe internacional movement of cassava seed stocks. Plnat Genetic Resources Newsletter 115: HOWELL, S Molecular Genetics of Plant Development. Cambridge University Press. KANTA, K.; RANGASWAMY, W. S.; MAHESHWARI, P Test tube fertilization in a flowering plant. Nature 194: KOVACS, M.; BARNABAS, B.; E. KRANZ Electrofused isolated wheat (Triticum aestivum L.) gametes develop into multicellular structures. Plant Cell Rep. 15: KRANZ, E.; DRESSELHAUS, T In vitro fertilization with isolated higher plant gametes. Trends in plant science reviews. Vol. 1, Nro. 3, pp KRANZ, E.; KUMLEHN, J Angiosperm fertilization, embryo and endosperm development in vitro. Plant Science. Vol. 142, Iss 2, pp LITZ, R. E «Cultivo de embriones y óvulos». En Cultivo de tejidos en la Agricultura. Fundamentos y Aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). Roca y Mroginsky editores. pp Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 133

118 MOL, R.; MATTHYS-ROCHON, E.; DUMAS, C Embryogenesis and plant regeneration from maize zygotes by in vitro culture of fertilized embryo sacs. Plant Cell Reports. 14: PONYA, Z.; TIMAR, I.; SZABO, L.; KRISTOF, Z Morphological characterisation of wheat (T. aestivum L.) egg cell protoplast isolated from immature and overaged caryopses. Sex Plant Reprod. 11: ROUGIER, M.; ANTOINE, A. F.; ALDON, D.; DUMAS, C New lights in early steps of in vitro fertilization in plants. Sexual Plant Reproduction. Vol 9, Iss 6, pp ZENKTELER, M In vitro pollination of excised ovaries. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica. Vol. 41, pp PICCA, Aurora; CARDONE, Susana

119 PARTE IV Métodos para acelerar programas de mejoramiento e identificación varietal Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 135

120 136 POLCI, Pablo; CONTI, Verónica; MIRANDA, Rubén

121 IV.-Capítulo 1 Obtención de plantas doblehaploides Polci, Pablo; Conti, Verónica; Miranda, Rubén 1 Introducción Comentarios generales sobre los haploides Para referirnos al término haploide es necesario conocer previamente el origen de dicha denominación, y definir algunos conceptos básicos sobre el tema. Si consideramos haploide al individuo que posee un solo juego de cromosomas de la especie, no estaríamos incluyendo en esta clasificación a aquellos individuos derivados de especies poliploides, cuya constitución genética es igual a la de los gametos normales de dicha especie. Por ejemplo, un autopoliploide AAAA (2n = 4x) daría lugar a individuos «haploides» AA (n = 2x), que por tener dos juegos cromosómicos (AA) no podrían ser incluidos en la definición. Por lo tanto, una solución sería denominar como haploides a los individuos originados a partir de especies diploides, que posean un solo juego de cromosomas (n = x), llamando polihaploides a aquellos individuos con una composición cromosómica igual que la gamética normal de la especie, que tengan dos o más juegos cromosómicos (n > x). Otra posibilidad sería considerar el término haploide en un sentido más amplio, comprendiendo en éste a todos los individuos que posean una constitución cromosómica igual a la de los gametos normales de la especie (n = 2n/2). Llamaríamos de esta manera monoploides y polihaploides a los individuos provenientes de plantas diploides (2n= 2x) y poliploides (2n> 2x) respectivamente. De aquí en adelante, a los fines prácticos y en concordancia con la segunda definición, nos referiremos al término haploide indistintamente del nivel de ploidía de la especie en cuestión, como a aquellos individuos que poseen la mitad del número cromosómico normal contenido en las células somáticas de la especie. Identificación de Haploides Varios procedimientos facilitan la búsqueda de haploides en muestras grandes en número de individuos. Algunos de ellos son: - Morfología: Las plantas haploides son, en general, más pequeñas que las diploides, tanto en sus partes vegetativas como florales. Esto se debe principalmente a la disminución en el tamaño de sus células. Es lógico pensar que el fenotipo más pequeño de las plantas puede ser una primera aproximación en la búsqueda de haploides. Si esta disminución de tamaño fuera notable en las semillas, sería muy fácil realizar una selección mecánica, aunque sucede en pocas especies. - Poliembrionía: La presencia de poliembrionía facilita la detección de embriones haploides; no obstante ello, debe realizarse el control citológico correspondiente. El porcentaje de embriones gemelos observados varía con la especie y el genotipo. - Genes marcadores: Con este fin puede utilizarse cualquier par de alelos cuyos fenotipos dominante y recesivo sean fácilmente distinguibles. En la práctica, conviene utilizar marcadores que posean manifestaciones fenotípicas claras en semilla o en plántula y de esta manera hacer una selección más económica en tiempo y esfuerzo. Para identificar haploides en una variedad que se supone homocigota, se realizan cruzamientos con otra variedad que sea homocigota para el alelo alternativo. La mayor parte de la descendencia será heterocigota (diploide), con fenotipo dominante. Los individuos que aparezcan con el fenotipo recesivo serían haploides, obtenidos por partenogénesis o androgénesis, según sea el fenotipo recesivo materno o paterno, respectivamente. Antecedentes El valor de los haploides es conocido desde 1922, cuando se descubrió la producción espontánea de los mismos. Actualmente son más de cien las especies vegetales capaces de producirlos in vivo. Sin embargo, la frecuencia con la cual se producen es muy baja, con valores que van de 0,001 a 0,01 %. Entre los casos de haploidía espontánea es común la poliembrionía, que, con una gran variación entre los distintos genotipos, ocurre en una amplia gama de especies, géneros y familias. En estos casos es frecuente Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 137

122 la aparición de haploides procedentes de una sinérgida del saco embrionario, puesto que se ha comprobado en muchas especies que las células antípodas degeneran antes de la fecundación. En 1966, Guha y Maheshwari descubrieron que las anteras de Datura innoxia Mill. generaban plantas haploides al ser cultivadas in vitro. Este proceso, confirmado posteriormente por Nitsch y Nitsch (1969) en tabaco, se ha utilizado para producir haploides en numerosas especies. En el caso de Datura innoxia, las frecuencias de inducción son casi del 100% y el rendimiento es de más de mil plántulas o callos por antera en condiciones óptimas (Fig. 1). Figura 1: Obtención de plantas haploides por cultivo de anteras. En estudios de androgénesis in vitro se ha detectado especial facilidad para regenerar haploides a partir de anteras aisladas o de granos de polen en miembros de la familia de las solanáceas También se han encontrado resultados sorprendentes en numerosos géneros de las crucíferas, gramíneas y de las ranunculáceas, aunque resulta común observar diferencias significativas, incluso dentro de un mismo género. No se ha logrado, sin embargo, el mismo éxito en especies arbóreas y arbustivas. 2 Importancia de los haploides y aplicaciones en el mejoramiento vegetal Los métodos tradicionales para el mejoramiento vegetal han sido practicados por cientos de años. Actualmente se ha llegado a una etapa en donde estos métodos son insuficientes para hacer frente a las demandas mundiales de producción. A pesar de que cada año se liberan al mercado numerosas variedades, no persisten demasiado. Los objetivos de mejoramiento a largo plazo no podrán ser alcanzados a menos que se genere mucha variabilidad genética que pueda ser utilizada con estos fines y que existan métodos que acorten el tiempo necesario para la obtención de variedades. El advenimiento de las técnicas biotecnológicas y los avances en biología molecular han permitido el desarrollo de nuevas herramientas de gran utilidad en el mejoramiento vegetal. Entre éstas, la producción de haploides y doblehaploides es una herramienta interesante ya que permite acortar el tiempo requerido para la obtención de nuevas variedades, siendo un buen complemento para los programas de mejoramiento tradicionales. En algunos casos, las poblaciones haploides o doblehaploides (DH) carecen de genotipos heterocigotas y sirven para encontrar genotipos raros, especialmente en el caso de caracteres recesivos, ya que éstos no quedan enmascarados por los alelos dominantes. Estas poblaciones presentan mayor variación genética aditiva y ausencia de varianza genética debida a la dominancia, si se las compara con poblaciones segregantes. Es decir que se eliminan las complejidades del estado heterocigota y se facilita enormemente el análisis genético. De esta manera pueden distinguirse las mutaciones recesivas de forma inmediata, haciendo que el proceso de selección sobre una población de haploides resulte más eficiente (Fig. 2). La producción de haploides es una alternativa biotecnológica de gran importancia y ha resultado exitosa en varios cultivos, entre ellos cebada, arroz y trigo. Un sistema de producción de DH debe cumplir con tres requisitos básicos para su utilización en programas de mejoramiento: - Debe producir líneas DH eficientemente a partir de todos los genotipos. - Los DH obtenidos deben ser normales y estables. Estos deberían representar una muestra al azar del conjunto de gametos parentales. 138 POLCI, Pablo; CONTI, Verónica; MIRANDA, Rubén

123 Autofecundación AB Ab ab ab 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 AB AABB AABb AaBb AaBb 1/4 Ab AABb AAbb AaBb Aabb AAbb X aabb Ab AaBb híbrido intervarietal AB Ab ab ab Genotipos posibles después de un Ciclo de autofecundación de la F1: 1/4 ab AaBB AabB aabb aabb 1/4 ab AaBb Aabb aabb aabb * La probabilidad de ocurrencia de los recuadros internos es de 1/16 (1/4 x 1/4) Generación parental Gametos Generación F Gametos F Cultivo de anteras Entre las aplicaciones más importantes de los doblehaploides en el mejoramiento vegetal podemos citar: Acortamiento de los programas de mejoramiento El desarrollo de nuevos cultivares por los métodos tradicionales actuales comprende tres etapas fundamentales: (a) Generación de variabilidad genética, sea por medio de hibridaciones sexuales intra e interespecífica, por inducción de mutaciones, o por transformación genética. (b) Recuperación de progenies homocigotas a través de generaciones repetidas de autofecundación o retrocruzamiento, seleccionando a favor de los caracteres de interés. (c) Evaluación del comportamiento de los nuevos materiales en ensayos comparativos a campo. Estos pasos son básicos en un programa de mejoramiento, pudiendo existir otras etapas en función del modo reproductivo de la especie. Así, por ejemplo, el tiempo requerido para la obtención de un nuevo cultivar de ab Genotipos posibles después del cultivo de anteras: Plantas haploides AB Ab ab ab Duplicación con colchicina Plantas doblehaploides AABB AAbb aabb aabb 1/4 1/4 1/4 1/4 Figura 2: Ventaja del uso de haploides en el mejoramiento cuando los cultivares parentales difieren, teóricamente, en dos pares de genes. Si el genotipo buscado es, por ejemplo, el doble recesivo aabb, se tiene, por autofecundación convencional, una probabilidad de 1/16 de encontrarlo. Si se induce haploidía, el mismo genotipo tendrá una probabilidad de ocurrencia de ¼ porque no se producirán los genotipos heterocigotas. 1 trigo de ciclo invernal es de aproximadamente diez años, a través del mejoramiento tradicional (Fig. 3). 1 La biotecnología se presenta como una alternativa atractiva no sólo para reducir el tiempo de obtención de los genotipos deseados, sino también para lograr una economía de mano de obra y espacio en el campo experimental. En las plantas autógamas, con los métodos convencionales de mejoramiento, la homocigosis práctica se logra recién luego de seis a ocho generaciones de autofecun-dación, mientras que con una técnica de producción de haploides, seguida de duplicación cromosómica, es posible llegar a homocigosis completa en una generación. En las plantas alógamas, la producción de homocigotas resulta de gran importancia. Al trabajar con especies de polinización cruzada se favorece naturalmente la heterocigosidad, y, de ser posible la autofecundación, la obtención de homocigotas se ve dificultada por la endogamia. En plantas bulbosas, árboles frutales y forestales la homocigosis juega un rol muy importante en el aceleramiento de los programas de mejoramiento. Debido al prolongado tiempo requerido para alcanzar la fase Progenitor A x Progenitor B 6-7 ciclos F 1 Selección Líneas puras (homocigosis práctica: F 7-8 ) Figura 3: Representación esquemática de los pasos requeridos para la obtención de líneas puras en un programa de mejoramiento tradicional. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 139

124 adulta, el proceso de mejoramiento resulta extremadamente largo, aun siendo posible la autopolinización. Generación de poblaciones de mapeo Diversos tipos de poblaciones pueden ser utilizadas para el mapeo genético de plantas. La elección del tipo de población se realiza en función de los objetivos de la investigación y del tiempo y recursos disponibles. Las poblaciones de mapeo con el mayor contenido de información son aquellas obtenidas a partir del cruzamiento entre dos indivíduos homocigotos contrastantes. En las plantas F 1 obtenidas, el desequilibrio de ligamiento es máximo, y las poblaciones derivadas a partir de estas plantas F 1 procuran explorar este desequilibrio. Para especies de autofecundación o que toleran la autofecundación pueden utilizarse poblaciones F 2, F n, RILs (Recombinant Imbreed Lines), derivadas de retrocruzas y doblehaploides. Las poblaciones de doblehaploides representan la variabilidad genética entre los progenitores luego de ocurrida una meiosis (F 1 ), y son especialmente indicadas cuando se realizan estudios con QTL («quantitative trait loci»), ya que al obtenerse genotipos 100 % homocigotas se dispone de poblaciones estables o «inmortales» de mapeo. Esto permite analizar la misma población en diferentes años y localidades, debido a la constante disponibilidad de semilla, obteniéndose estimaciones mas precisas de los parámetros de los caracteres cuantitativos a ser mapeados. Estudio de especies poliploides La inducción de haploides en plantas poliploides facilita el trabajo de investigación y mejoramiento, ya que permite manejar niveles de ploidía menores para los estudios de herencia y la combinación de caracteres de interés. Fusión de protoplastos Al fusionar dos protoplastos haploides se origina uno diploide que puede duplicarse y llevar a la obtención de un híbrido interespecífico o intergenérico, siendo esto una ventaja importante cuando se trabaja en hibridación somática. Variación gametoclonal La androgénesis in vitro provee un excelente sistema para analizar, a nivel esporofítico, la variación debida a recombinación y segregación meiótica. Las variantes gametoclonales expresan el carácter recesivo en la R 0, a diferencia de las somaclonales, que requieren de autofecundación y análisis de progenie. Algunos logros de esta técnica: - Frutos de tomate con mayor contenido de sólidos - Plantas enanas de arroz con granos más largos y con elevados niveles de proteínas de reserva y más macolladoras. - Plantas de Datura innoxia con contenidos más elevados de alcaloides en las hojas. - Plantas de tabaco con mayor resistencia a bajas temperaturas. - Plantas de Brassica napus con mayor contenido de aceite del ácido erúcico en las hojas. Este aceite se usa como lubricante en la industria. Mutagenesis Si se aplica mutagénesis a un sistema de haploides, se obtienen mutantes sólidos, lográndose la homocigosis del mutado rápidamente luego de la duplicación con colchicina. Entre los agentes mutagénicos más frecuentemente utilizados se encuentra la N-metil-N-nitrosurea (20 mm), los rayos γ (0,5 krad) y el etil metil sulfonato. Transformación genética Rige el mismo principio que para mutagénesis. La transformación de haploides permite la obtención del transgen en homocigosis luego de la duplicación con colchicina. Puede realizarse con PEG, microinyección o utilizando Agrobacterium tumefaciens. Producción de plantas homogaméticas Asparagus officinalis es una especie cultivada, dioca, en la cual las plantas femeninas son XX y las masculinas son XY. De esta manera, para obtener una población de plantas deben cruzarse ambos tipos, lo que dará una progenie constituida por 50 % de plantas XX y 50 % de plantas XY. Sin embargo, desde el punto de vista del productor, es deseable la obtención de una población cons- 140 POLCI, Pablo; CONTI, Verónica; MIRANDA, Rubén

125 tituida solamente por plantas XY, que tienen un menor contenido de fibra y son, por lo tanto, preferidas por los consumidores. Plantas haploides Homocigotos, hembra y supermacho Gametos X X XX X Progenitor masculino XY XY Híbrido Formación de gametos Cultivo de anteras Duplicación cromosómica Formación de gametos Para solucionar este problema y obtener 100 % de plantas masculinas se ideó un sistema que consiste en el cultivo de anteras y diploidización de plantas YY, llamadas supermachos. La ventaja de estas plantas es que, al ser cruzadas con plantas XX darán 100 % de plantas XY, como se muestra en el esquema: Con este sistema, en 1990 fue liberada una variedad llamada Andrea (es un híbrido obtenido como se mencionara anteriormente). Andrea es una variedad muy homogénea, de alto rendimiento y de excelente calidad. 3 Obtención de Haploides Como se mencionara anteriormente, las plantas haploides aparecen en muy baja frecuencia en la naturaleza, siendo necesaria la posterior ocurrencia de duplicación cromosómica para la obtención de semillas. Por ello, la producción artificial de haploides resulta siempre más efectiva. Origen de los haploides I. Ginogénesis: desarrollo de un gameto femenino no fecundado. Se logra por: 1) Castración y aislamiento de las flores. Y Y YY Y Por este tratamiento se han obtenido haploides de Triticum monococcum. 2) Polinización retrasada: la castración de las flores y la posterior polinización en el límite de la madurez receptiva del estigma permiten obtener hasta un 30 % de haploides en trigo. 3) Polinización con polen inviable: a) Utilizando polen extraño (típico de cruzamientos interespecíficos), incapaz de fecundar a la especie en cuestión, puede servir de estímulo para inducir haploidía, como sucede en el cruzamiento entre Solanum tuberosum x S. phureja (papa silvestre). El polen de la papa silvestre contiene sólo un núcleo generativo, producto de una gametogénesis anormal, por lo cual la fertilización doble no logra producirse, pero se forman embriones haploides por partenogénesis. b) Utilizando polen previamente irradiado. 4) Cultivo de ovarios: puede ser eficaz para obtener haploides a partir de cruzamientos interespecíficos. II. Androgénesis: desarrollo de un gameto masculino. 1) Cultivo de anteras: se ha inducido haploidía en mono y dicotiledóneas, siendo más fácil en las últimas. Es una técnica simple que, dependiendo del genotipo y de las condiciones de cultivo permite obtener elevados números de plantas en tiempos relativamente cortos. Ha sido más difícil en los cereales; no obstante ello, se obtuvieron haploides de arroz, trigo, cebada con diferentes grados de dificultad. 2) Cultivo de micrósporas: en 1974 Nitsch indujo la regeneración de plantas haploides de Nicotiana terbium y Datura inoxia a partir de cultivos en suspensión de micrósporas, previo choque térmico a baja temperatura de las flores. Este método tiene la ventaja de producir haploides masivamente (más de 7000 plantas por botón floral en tabaco), y de permitir la aplicación de diferentes tratamientos a las micrósporas como transformación o mutagénesis para luego obtener plantas por embriogénesis partiendo de una única célula inicial. Para conseguir diferenciar Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 141

126 plantas a partir de micrósporas es necesario quebrar el mecanismo responsable de la asimetría en la primera mitosis del polen. III. A partir de alguna célula haploide del saco embrionario distinta del gameto femenino (sinérgidas o antípodas). IV. Cruzamientos interespecíficos o intergenéricos con eliminación cromosómica: se produce la fertilización de manera de que se forme un cigoto diploide, que, a lo largo de las sucesivas divisiones mitóticas, va perdiendo el genoma del individuo que aportó el gameto masculino, como sucede en los cruzamientos entre Hordeum vulgare y H. bulbosum. V. Interacción núcleo-citoplasma: utilizando líneas de sustitución y restauración nuclear se encontró que los individuos con citoplasma de Aegilops caudata y núcleo de Triticum aestivum o Triticale mostraban una frecuencia de haploidía del 3,1% y del 52,9% respectivamente. Esto se debe a que ciertas interacciones entre un citoplasma y un núcleo extraño inducen haploidía. VI. Semigamia: el núcleo del gameto masculino penetra en la ovocélula pero sin fusionarse con el núcleo femenino. Ambos núcleos comienzan a dividirse independientemente, produciendo un individuo haploide con tejidos de origen materno y paterno. Métodos más utilizados para la obtención de plantas haploides: Entre los métodos disponibles actualmente para la obtención de doblehaploides, los más utilizados son la hibridación interespecífica e intergenérica y la androgénesis. - Cultivo de Anteras: Consiste en el cultivo de anteras inmaduras en un medio de inducción, donde las micrósporas competentes originarán callos, que serán luego transferidos a un medio apropiado para la regeneración de plantas (Fig. 1). En algunas especies de dicotiledóneas el número de plantas obtenidas por cada cien anteras cultivadas es muy elevado. En cambio en las gramíneas la técnica no ha sido tan exitosa. Sin embargo, los progresos en Figura 4. Producción de callos y plantas a partir del cultivo de anteras de Triticum aestivum. A. Callo blanco y compacto sobre una antera(flecha). B. Detalle del callo señalado en (A). C. Callo transferido a medio de cultivo para regenerar planta. D. Plántula de trigo regenerada a partir de callo, con sistema radicular en formación. E. Planta haploide completa finalizando la etapa de rusticación, creciendo sobre sustrato inerte (Perlita). los métodos de cultivo in vitro durante las últimas décadas han permitido obtener buenos resultados con gramíneas (Fig. 4), aun en aquellas consideradas recalcitrantes. La capacidad de respuesta al cultivo de anteras, denominada capacidad androgénica, puede ser evaluada a través de la producción de callos y de plantas verdes, y su eficiencia es altamente dependiente de: a) El genotipo: es quizás el factor más importante que afecta al cultivo de anteras. En la naturaleza, la haploidía es controlada por el gen hap, llamado gen inhibidor de la haploidía. Existe suficiente evidencia que sugiere que la androgénesis in vitro también está bajo control génico y que este carácter puede ser transferido desde clones con alta respuesta a otros no respondedores. Se ha hallado variabilidad en la respuesta entre especies y aun dentro de ellas. En cebada y trigo los caracteres de inducción de callos y regeneración de plantas son altamente heredables, y ha sido sugerido que ambos caracteres estarían controlados por muchos genes. Por lo tanto, el mejoramiento de la capacidad androgénica no parece difícil, sien- 142 POLCI, Pablo; CONTI, Verónica; MIRANDA, Rubén

127 do la identificación de genotipos con gran capacidad de respuesta un paso indispensable para su incorporación en los bloques de cruzamiento. b) El % de albinismo: La ocurrencia de plantas albinas representa un serio problema para la aplicación del cultivo de anteras en programas de mejoramiento de cereales. La incidencia depende no solo de la especie sino también de la variedad, citándose valores de 50, 70 y 100 % para tres variedades diferentes de arroz (Wang y col., 1978). Bernard (1980) ha sugerido que las altas temperaturas incrementan la diferencia entre la velocidad de replicación del material nuclear y el de las organelas, resultando en un desarrollo retardado o incompleto de los plástidos, lo cual conduciría a la producción de fenotipos albinos. De acuerdo con este autor, el desarrollo de un sistema fotosintético funcional es promovido por el tratamiento con bajas temperaturas, aunque no siempre un pretratamiento con frío reduce incidencia de albinismo. c) Las condiciones de crecimiento de las plantas donantes: la edad y las condiciones ambientales en que crecen las plantas afectan considerablemente la capacidad androgénica de las mismas. Los factores ambientales más críticos son el fotoperíodo, la intensidad de luz, la temperatura, la nutrición y la concentración de CO 2. Estos factores incidirían en la capacidad de producir las divisiones celulares morfogénicas que conducen al desarrollo de embrioides y la regeneración de plantas. Este último paso es crítico dentro de todo el proceso, es altamente dependiente de la calidad del callo y está asociado fuertemente a toda la historia previa del cultivo. En general, se ha informado que la utilización de anteras de las primeras floraciones favorece la respuesta androgénica, mientras que las colectadas al final de la estación muestran una menor respuesta al cultivo, generando una menor cantidad de embrioides. En Brassica napus, el crecimiento de las plantas a bajas temperaturas mejora la producción de embrioides obtenidos a partir de anteras. d) El estado de desarrollo de las microsporas: en la fase gametofítica de las plantas, que comienza luego de la meiosis, las micrósporas sufren inicialmente una división mitótica asimétrica que da origen a dos células de distintos tamaños: la generativa, más pequeña y con un núcleo altamente condensado; y la vegetativa, más grande y con un núcleo difuso. En las gramíneas, el núcleo generativo se divide nuevamente originando dos núcleos espermáticos. Uno generará el endosperma triploide al fusionarse con los dos núcleos polares del saco embrionario, mientras que el segundo fertilizará a la oosfera produciendo el cigoto diploide, que constituirá el primer paso de la nueva fase esporofítica. Los embrioides haploides se originan in vitro a partir de una de las vías que se enuncian a continuación. Cuando la primer división mitótica de la micróspora es asimétrica, los haploides se originan por repetidas divisiones de la célula vegetativa, de la generativa o de ambas. Cuando la primer división mitótica es simétrica, ambas células resultantes contribuyen al desarrollo del haploide. Por lo tanto, una célula gamética masculina puede revertir su desarrollo gametofítico hacia el grano de polen y dar origen directamente a un nuevo individuo. En general, las micrósporas que se encuentran en la primera división mitótica son las que mejor responden. Esto varía levemente con la especie vegetal, pero esta reversión no es posible luego de iniciada la deposición de almidón. El estadío más apropiado para los cereales es el de micróspora uninucleada media y tardía. e) Los pretratamientos: distintos tipos de estrés aplicados durante el estadío adecuado pueden enmascarar el programa gametofítico e inducir la expresión de genes específicos del desarrollo esporofítico. Si bien las bajas temperaturas son consideradas como el mejor pretratamiento, también otros pueden estimular la androgénesis, como el calor, el choque osmótico, la centrifugación de las anteras o hasta una incisión en la parte superior de la inflorescencia donante. También se citan la poda, la pulverización con etrel, la irradiación, la reducción en la presión atmosférica, la anaerobiosis, el tratamiento en una atmósfera saturada de agua y la aplicación de gametocidas. Las bajas temperaturas aplicadas sobre la planta madre, sobre las yemas florales jóvenes o sobre las anteras, generalmente estimulan la embriogénesis. El frío estimula la división mitótica simétrica de las micrósporas. Esto se Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 143

128 debería a una alteración en la orientación del huso que conduciría a una primera mitosis anormal del grano de polen. Por otra parte, se ha mencionado que las bajas temperaturas retardan el envejecimiento de la pared de la antera, lo cual aumentaría la supervivencia y la viabilidad del polen. En general, las temperaturas citadas varían entre 2 y 10 ºC y la duración del tratamiento de 2 a 30 días. Es importante determinar la temperatura adecuada para cada especie vegetal, aun para variedades dentro de la misma especie. En algunas especies, tales como Capsicum annun, avena y algunos genotipos de trigo se ha logrado éxito con un choque con alta temperatura. Temperaturas de 30-35ºC durante los primeros 1 a 4 días del cultivo ayudaron a inducir la androgénesis en varias especies de género Brassica. f) La composición del medio de cultivo: es otro de los factores importantes para el éxito en el cultivo de anteras. No existe una recomendación general y las variaciones dependen de la especie a cultivar. Medios de inducción: dos tipos de estrés, osmótico y nutricional, han sido identificados como causas disparadoras de la inducción de embriogénesis en las micrósporas de mono y dicotiledóneas. En tabaco, el cultivo de las anteras en un medio carente de sacarosa durante los primeros 6 días de la etapa de inducción permitió una máxima respuesta androgénica. Los carbohidratos cumplen dos roles fundamentales en los medios de inducción ya que actúan como osmolito y como nutriente. Los agentes gelificantes representan otro aspecto importante en la evolución de los medios de inducción. Tradicionalmente se utilizó agar como gelificante de los medios de cultivo, debido a su disponibilidad y bajo costo. Pero en 1973 se detectó una mejor respuesta androgénica en tabaco cuando las anteras fueron cultivadas en un medio solidificado con agar y suplementado con carbón activado. En medios líquidos la adición de Ficoll (polímero sintético de sacarosa, inerte, no iónico y de alto peso molecular) incrementa la tensión superficial y la viscosidad del medio. De esta manera, las anteras y callos flotan sobre el medio líquido y se desarrollan en condiciones aeróbicas, permitiendo elevadas tasas de embriogénesis y de producción de plantas verdes. En cuanto a los reguladores de crecimiento, la mayoría de los cereales requiere de la presencia de auxinas y de citocininas en el medio de cultivo y las respuestas parecen depender de los niveles endógenos de tales reguladores. Por ejemplo, para lograr la inducción en trigo es indispensable el uso de 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) en concentraciones de 1,5 a 2 mg/l. Existen otras sustancias que, adicionadas al medio de cultivo, ayudan en la estimulación de la androgénesis, como la glutamina y el inositol. También se citan otros compuestos inespecíficos como extracto de papa, de batata, de mandioca, de trigo germinado y de endospermas de arroz y de maíz. En ocasiones, si el medio se suple con leche de coco, los granos de polen desarrollan directamente en embrioides. Medios de regeneración: la variedad de medios de regeneración citada es menor cuando se la compara con la de los medios de inducción. Los más utilizados son modificaciones derivadas del medio MS, con concentraciones de carbohidratos similares a las utilizadas en los medios de cultivo de tejidos tradicionales (30gr/l de sacarosa), utilizando agar (0,6 %) como gelificante, auxinas menos poderosas, y un balance hormonal a favor de las citocininas. g)las condiciones de incubación: las características ideales de cultivo son específicas para cada especie, y aun para cada genotipo dentro de una misma especie. Estas afectan particularmente la tasa de absorción final de nutrientes y la regeneración de plantas verdes. La duración e intensidad lumínica, la temperatura y la orientación de las anteras sobre el medio de cultivo pueden tener un efecto considerable en algunas especies. Cultivo de Micrósporas: comprende la obtención de individuos haploides a partir de micrósporas aisladas. Las espigas son pretratadas y las micrósporas liberadas son colocadas en un medio de cultivo donde desarrollarán embriones haploides, que serán luego transferidos a un medio de regeneración para originar plántulas (Fig. 5). 144 POLCI, Pablo; CONTI, Verónica; MIRANDA, Rubén

129 Figura 5. El diagrama muestra las diferentes etapas del cultivo de anteras y de micrósporas aisladas. Para el cultivo de anteras, las etapas requeridas a partir de anteras hasta la obtención de las plantas haploides pueden describirse como sigue: a) yema floral previo a la antesis, 1b) anteras, 1c) anteras en cultivo, 1d) y 1e) proliferación de las anteras, 1f) callo haploide, 1g) diferenciación de callo, h) planta haploide. Para el cultivo de micrósporas aisladas: a) yema floral previo a la antesis, 3b) micrósporas aisladas de una antera, 3c) cultivo de micrósporas, 3d) estado multinucleado, 3e) y 3f) embrión en desarrollo. Este sistema es considerado el de mayor potencial para la producción de doblehaploides, debido a que induce a los miles de micrósporas que contiene una flor a dividirse y producir embriones. La ausencia de la pared de la antera podría mejorar la nutrición y eliminar las restricciones físicas para la androgénesis. El cultivo de micrósporas tiene la ventaja de originar embriones de similar tamaño y etapa fisiológica debido a que pueden separarse las micrósporas de tamaños semejantes por centrifugación diferencial. La optimización de los diferentes pasos críticos para el éxito de esta técnica puede llevar a la obtención de una alta cantidad de plantas verdes con menores costos y esfuerzos. Entre los factores determinantes de la eficiencia del método podemos citar: (a) Genotipo: se han citado cultivares de cebada con una alta respuesta al cultivo de micrósporas, en contraste con otros menos respondedores. (b) Albinismo: al igual que en el cultivo de anteras el número de plantas albinas depende del genotipo, y también se ve influido por la densidad de cultivo de las micrósporas. (c) Condiciones de crecimiento de la planta donadora: el mantenimiento de las plantas en condiciones controladas de fotoperíodo y temperatura es esencial y debe ser ajustado en función de la especie. Se han citado resultados en cebada cuando las plantas son cultivadas en ambientes libres de patógenos, con alta humedad relativa (60-80%), fotoperíodo de 16 hs. de luz, y adecuado régimen de fertilización y riego. Cuando las plantas crecen estresadas, sea por riego excesivo, sequía, enfermedades, o la aplicación de algún plaguicida, la respuesta al cultivo de micrósporas es menor. (d) Estadío: Como se citara anteriormente para el cultivo de anteras, es imprescindible el chequeo del estadio correcto para que conserven su capacidad androgé-nica. (e) Pretratamientos: los pretratamientos más utilizados consisten en el uso de frío, estrés osmótico, presencia o ausencia de determinados nutrientes, etc. Se ha demostrado que los nutrientes disponibles durante el pretratamiento constituyen un factor decisivo que determina la calidad de los embriones originados. (f) Densidad de cultivo: La densidad de las micrósporas en cultivo afecta el desarrollo de las mismas y el número que entrarán en división. Existe una concentración mínima para el desarrollo de las micrósporas, y una densidad óptima para una mayor regeneración. Las condiciones más favorables deben ser ajustadas en cada caso y para cada genotipo en particular. (g) Medio de inducción: Se han estudiado diferentes concentraciones de azúcares, distintas fuentes de nitrógeno orgánico, y la adición de diferentes auxinas al medio. En general se sugiere la sustitución de sacarosa por maltosa como fuente de carbohidratos, la disminución de la concentración de nitra- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 145

130 to de amonio, el agregado de glutamina, y el empleo de APA (ácido fenil acético) como auxina para favorecer la inducción (Kasha y col., 2001). (h) Medio de regeneración: la composición del medio de regeneración puede afectar el vigor y supervivencia de las plántulas. Kasha et al. (2001), trabajando con cebada, encontraron en este método una manera eficiente de producción de DH, con una mejor respuesta y una menor dependencia del genotipo que en el caso del cultivo de anteras. A esto se le suma la ventaja de contar con una elevada cantidad de micrósporas haploides en un estado fisiológico uniforme, que constituyen excelentes blancos para la mutagénesis, la selección y la transformación. - Hibridación interespecífica e intergenérica: en este caso los haploides se originan a través de la eliminación del genoma del polinizador. El sistema de hibridación de trigo x Hordeum bulbosum, inicialmente descubierto y empleado con éxito en cebada, ha sido considerado superior al cultivo de anteras por tres razones: (a) La producción de haploides es más fácil. (b) El tiempo requerido para la regeneración de plantas es menor. (c) La eficiencia en la regeneración de plantas parece ser mayor. Figura 6. Producción de haploides de Triticum aestivum por cruzamientos de trigo x maíz (Zea mayz). A. Espigas de trigo cortadas en el campo y castradas en el laboratorio. B. Plantas de maíz (donantes de polen) crecidas en invernáculo. C. Desgrane de espigas para realizar la desinfección de los granos y posterior rescate de embriones. D. Grano con dos embriones haploides (poliembrionía). E. Embriones inmaduros rescatados y creciendo in vitro. F. Planta rusticada. G y H. Plantas con 3-5 macollos con sus raíces sumergidas en solución de colchicina para la duplicación cromosómica. I. Plantas tratadas con colchicina y llevadas a macetas con tierra en cámara de crecimiento. La gran limitante de este sistema lo constituye el hecho de que la mayoría de los cultivares de trigo no pueden cruzarse con H. bulbosum debido a la presencia de los genes de incompatibilidad, Kr1 y Kr2, y al desconocimiento del estado de estos genes en los genotipos de trigo y de H. bulbosum involucrados en los cruzamientos, debido a que los genotipos se seleccionan sobre la base de criterios agronómicos y no a un sistema de compatibilidad de cruzamientos con H. bulbosum. Para sortear estos inconvenientes se ha sugerido como alternativa realizar los cruzamientos, en el caso de trigo, utilizando maíz como polinizador (Fig. 6). Luego de la fertilización del óvulo de trigo por el polen de maíz, durante las primeras mitosis del cigoto, los cromosomas del maíz son eliminados. Esto se debe a una incompatibilidad entre los cinetocoros de estos cromosomas y las fibras de los husos acromáticos que hace que en las primeras anafases los cromosomas de maíz vayan quedando rezagados en el citoplasma, donde finalmente son degradados. El resultado de este proceso es un em- 146 POLCI, Pablo; CONTI, Verónica; MIRANDA, Rubén

131 brión haploide de trigo. Seguidamente, los embriones inmaduros deben ser rescatados en un medio de cultivo apropiado. A través de las cruzas con maíz se han obtenido haploides de trigo de cultivares tanto compatibles como incompatibles con H. bulbosum, lo cual sugiere que el sistema de incompatibilidad no afecta al método de trigo x maíz, por lo que sería menos dependiente del genotipo. 4 Duplicación cromosómica Después de la duplicación cromosómica, ya sea espontánea o inducida, se logra la homocigosis y se restaura la fertilidad. La planta haploide, sin duplicar, es estéril por lo que no podría producir semillas. Entre las técnicas que han sido utilizadas para la duplicación de haploides cabe mencionar: (a) Duplicación espontánea durante la etapa de callo o de rescate de embriones. (b) Regeneración de plantas doblehaploides a partir de callos de médula de plantas haploides de tabaco (Kasperbauer y Collins, 1972). (c) Sustancias químicas: aunque se conocen casos mediante agentes químicos tales como acenafteno, hidrato de cloral, sulfanilamida, etc., la mayor eficacia se ha logrado con la colchicina y el óxido nitroso. La aplicación del óxido nitroso bajo presión (2-6 atmósferas) resulta de especial interés por su fácil penetración en los tejidos y la rápida desaparición de los mismos cuando cesa la presión. Puede utilizarse en flores recién polinizadas. La ventaja que presenta este tratamiento es que, al poder ser aplicado durante la primera división mitótica del óvulo fecundado, se ve reducida la aparición de quimeras. Por otro lado, los residuos de este agente resultan menos tóxicos para la planta que otros que se aplican en forma líquida, aunque la frecuencia de aneuploides puede ser muy elevada. La acción de la colchicina fue descubierta en 1937 y desde entonces ha pasado a ser prácticamente el agente diploidizante más importante Esta droga actúa impidiendo el autoensamblaje de la tubulina, inhibiendo así la formación de los microtúbulos del huso y, en consecuencia, la segregación anafásica de las cromátides. Afecta por lo tanto sólo a las células que se encuentran en división. Puede aplicarse a plántulas, plantas adultas, semillas, micrósporas y anteras. El tratamiento puede realizarse utilizando una solución acuosa donde se sumergen las raíces, dejando fuera la parte aérea. También se puede hacer llegar la solución al interior de la planta utilizando una jeringa con la dosis deseada (microinyección), o por absorción de la solución a través de los tallitos decapitados, sobre los que se vierte. Otra forma de hacerlo es tratar los callos con colchicina antes de trasladarlos al medio de regeneración. Este último método permite la obtención de gran número de doblehaploides, pero presenta la desventaja de que la mayoría de las plantas así obtenidas son mosaicos cromosómicos. Otra alternativa, para micrósporas y anteras, es la adición del agente duplicador directamente en el medio de inducción, antes de la primer mitosis. La diploidización en este momento requiere menos tiempo y esfuerzo y ha sido utilizada en programas de mejoramiento de trigo, maíz, Tritordeum y arroz. El problema de la suplementación del medio de inducción con colchicina es que reduce la embriogénesis en trigo, si bien en Oryza sativa y Brassica la puede incrementar. La duración del tratamiento y la concentración de la solución varían para cada especie. Cualquiera que sea el método con que se duplique la planta, un macollo o sólo una yema floral, lo importante es lograr que las semillas que éstas produzcan sean viables. 5 Consideraciones finales La elección de los progenitores y la selección son etapas decisivas en un programa de mejoramiento que avanzará luego generación tras generación, hacia una homocigosis que permita entrar en las etapas de evaluación. Ganar tiempo en estos casos puede significar una reducción de costos muy importante y una más temprana entrada en el mercado de la nueva variedad. En el caso de una especie autógama como el trigo es posible ganar generaciones haciendo dos cosechas en un año, especialmente en aquellos cultivares de corto ciclo vegetativo. Esto, sin Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 147

132 embargo, dificulta la observación de algunas características agronómicas importantes, que no pueden ser observadas en los genotipos en esas condiciones, atentando contra una selección eficiente. Para los trigos de tipo invernal y facultativos, con ligeros requerimientos de vernalización, esta ganancia de generaciones no es posible o es difícil. La producción de individuos doblehaploides que puedan participar anticipadamente en la etapa de evaluación agronómica se plantea como una solución promisoria a este problema, reduciendo los tiempos y presupuestos. Muchos interrogantes, sin embargo, quedan aún sin resolver, limitando la aplicación extensiva de esta tecnología a algunos modernos programas de mejoramiento vegetal. Algunas preguntas a las que debemos encontrar respuestas son: En que generación segregante se aplica el método de doblehaploides? Cuál es el número de individuos doblehaploides derivados de un cruzamiento, representativo de la variabilidad gamética creada en la cruza, que permita un aprovechamiento integral, comparable al logrado con el método convencional de selección a campo? Cómo superar la escasa cantidad de semilla producida? Es una técnica alternativa, o complementaria del mejoramiento tradicional? La eficiencia en la producción de doblehaploides justifica su alto costo dentro de un plan de mejoramiento? De acuerdo con Mujeb-Kazi (1998), las generaciones segregantes adecuadas para producir doblehaploides son la F2 y F3. Si eligiéramos individuos F3, que ya cuentan con un año de selección a campo durante la F2 - generación que ha mostrado la mayor varianza genética entre los dos padres- estaríamos evitando producir un gran número de plantas doblehaploides que no serán agronómicamente promisorias. No obstante, debemos considerar que serían necesarios varios cientos de individuos DH para que el proceso tenga posibilidades de éxito agronómico. En general, la producción de doblehaploides resulta en un gasto excesivo en comparación a los métodos tradicionales de mejoramiento, por lo cual en la mayoría de los programas sólo genotipos élite son sometidos a este sistema. Si bien el costo de producción de los DH depende directamente del método elegido y la eficiencia lograda, la aplicación de esta metodología al mejoramiento vegetal se vislumbra más bien como una herramienta complementaria al mejoramiento tradicional, y que en ningún modo intentaría reemplazarlo. 6 Lecturas Recomendadas ATANASSOV, A.; ZAGORSKA, P.; BOYADJIEV, P.; DJILIANOV, D In vitro production of haploid plants. World Journal of Microbiology & Biotechnology 11, BERNARD, S In vitro androgenesis in hexaploid triticale: determination of physical conditions increasing embryoid and green plant production. Z. Pflazenzucht 85: BHOJWANI, S.S.; RAZDAN, M.K Haploid Production. En: Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Capitulo 7. S.S. Bhojwani y M.K. Razdan (eds.) Elsevier, Amsterdam. pp KASHA, K.J.; SIMION, E.; ORO, R.; YAO, W.A.; HU, T.C.; CARLSON, A.R An improved in vitro technique for isolated microspore culture of barley. Euphytica 120: KASPERBAUER, M.; COLLINS, G Reconstitution of diploids from leaf tissue of anther derived haploid in tobacco. Crop Sci. 12: LACADENA, J.R Variaciones cromosómicas numericas. En: Genética, Capítulo 15. Lacadena, J.R.(ed.) A.G.E.S.A., Madrid. pp SNAPE, J.; SIMPSON, E.; PARKER, B.; FRIEDT, W.; FOROUGHI-WHER, B Criteria for the selection and use of doubled haploid systems in cereal breeding programmes. En: Genetic manipulation in plant breeding. Proc. Int. Symp. Eucarpia W. Horn, C. Jensen, W. Odenbach, O. Schieder (eds). W. De Gruyter, Berlin. pp WANG, C.; CHU, Z.; SUN, C.; CHI, C.; WU, W Studies on the albino pollen plantlets of rice. En: Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Pekin Press, pp POLCI, Pablo; CONTI, Verónica; MIRANDA, Rubén

133 IV.-Capítulo 2 Aplicaciones de los marcadores moleculares Carrera, Alicia; Tranquilli, Gabriela; Helguera, Marcelo Las herramientas descriptas en II.-4 se utilizan en numerosas áreas relacionadas con el mejoramiento vegetal y el análisis de la biodiversidad. A continuación se describen algunas de esas aplicaciones. Cada uno de estos campos posee una base teórica en ocasiones compleja y muchos de ellos requieren del uso de programas de estadística avanzada. De este modo, el presente capítulo debe ser considerado como una introducción a los temas considerados. 1 Identificación de genotipos Pureza varietal El control de la pureza varietal y la discriminación de variedades protegidas (es decir, registradas) requieren de una adecuada identificación de los materiales. Esta identificación se basa tradicionalmente en el uso de descriptores morfológicos y fisiológicos. En la mayoría de los cultivos, la utilización de recursos genéticos similares en diferentes programas de mejoramiento ha reducido la eficiencia de discriminación por marcadores fenotípicos. Por otro lado, varios de los caracteres usados como descriptores presentan limitaciones en cuanto al número restringido de variantes, influencia ambiental y dependencia del estadio de desarrollo de planta. Como alternativa para resolver estos problemas, los polimorfismos moleculares de proteínas y ADN resultan de utilidad en la determinación de los criterios DUS (distinción, uniformidad y estabilidad). Se utilizan localmente como datos complementarios de los descriptores morfológicos y fisiológicos para el registro de los cultivares, en aquellos casos en que las diferencias entre materiales no son conspicuas. ISTA (International Seed Testing Association) y UPOV (Union Pour La Protection Des Obtenions Vegétales) son entidades internacionales que han desarrollado protocolos para estandarizar los análisis de laboratorio para identificación de cultivares y reglamentar la utilización de diferencias moleculares en el control de la pureza varietal, la discriminación de variedades protegidas y en el otorgamiento de nuevas patentes. Con el objeto de evitar el registro de variedades esencialmente equivalentes, UPOV ha establecido umbrales mínimos de diferencias moleculares sobre la base de distancias genéticas obtenidas a partir de caracteres tradicionales. En la actualidad se dispone de patrones moleculares varietales para una extensa lista de especies. Como ejemplo podemos mencionar al trigo pan (Triticum aestivum L.), para el que se desarrolló una matriz de identificación varietal sobre la base de marcadores microsatélites de ADN, que permite la individualización de variedades argentinas. (Manifesto y col., 1998). A partir de datos moleculares es posible obtener distintos índices de distancia genética y generar esquemas ramificados o dendrogramas, que ponen en evidencia la similitud genética de los materiales (Ver VI.- 1). La pureza varietal es uno de los principales requisitos de la semilla comercial. En la producción de semilla híbrida la heterogeneidad intralote puede originarse por falta de uniformidad en las líneas parentales, polinización cruzada espontánea o mezcla de semillas durante la cosecha o embolsado. Los individuos fuera de tipo pueden identificarse mediante el patrón molecular. Del mismo modo pueden establecerse las relaciones de descendencia entre una serie de líneas parentales y sus híbridos. Se ha observado que aún después de 5-6 generaciones de autofecundación, una línea puede no haber alcanzado completa uniformidad para ciertos marcadores moleculares. Esto puede interpretarse como una porción residual del genoma que permanece segregando. Cuando la evaluación de estos lotes muestra uniformidad morfológica, fisiológica y de caracteres agronómicos, pueden aceptarse ciertos niveles de variación molecular sin expresión fenotípica evidente. El mejorador considerará en cada caso los niveles máximos de variación admisibles. Sin embargo, la ocurrencia de polimorfismos moleculares Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 149

134 intravarietales puede representar una limitante para el uso de marcadores como descriptores complementarios en la inscripción de nuevos cultivares. 2 Uso en bancos de germoplasma Las prácticas de la agricultura moderna han generado una pérdida de diversidad en la mayoría de las especies cultivadas. El reemplazo paulatino de las variedades primitivas por los cultivares híbridos de indudables ventajas económicas ha producido una reducción en el número de genotipos que se cultivan. La erosión genética puede tener graves consecuencias para el cultivo, principalmente en relación a su vulnerabilidad sanitaria. Este proceso puede ser atenuado mediante la creación de bancos de germoplasma, que constituyen un componente vital de los programas de mejora. Las colecciones pueden mantenerse como bancos de semilla, a campo o in vitro. Los recursos genéticos de una especie cultivada comprenden i) cultivares antiguos y de reciente obtención ii) poblaciones locales mantenidas por los productores, «landraces» iii) poblaciones silvestres de la misma especie o formas maleza y iv) especies relacionadas. Los marcadores moleculares permiten caracterizar las accesiones o muestras a ser incluidas en las colecciones, estudiar el proceso de domesticación, establecer relaciones filogenéticas y colaborar en la elección de las estrategias de conservación. El procedimiento consiste básicamente en analizar los materiales mediante marcadores proteicos o de ADN y calcular medidas de diversidad (nivel de polimorfismo, riqueza alélica, presencia de alelos únicos) y de similitud genética. Esta información luego se complementa con datos geográficos (procedencia de las accesiones, distribución), pedigrí y datos históricos de obtención. La información generada por los marcadores resulta de inmediata aplicación en los procesos de acopio (dónde colectar, qué intercambios realizar), conservación (identificación de duplicados en las colecciones, monitoreo de los cambios en la composición genética que puedan ocurrir durante la multiplicación o conservación de los materiales), caracterización (diversidad genética de la colección) y distribución eficiente de los recursos genéticos hacia los usuarios. Veamos algunos ejemplos. En casos como el girasol (Helianthus annuus), el análisis de diversidad molecular ha demostrado que el proceso de domesticación ha reducido considerablemente la base genética de los materiales cultivados con relación a las poblaciones silvestres. Por el contrario, en poroto (Phaseolus vulgaris) y olivo (Olea europea), las formas cultivadas conservan gran parte de la variabilidad presente en las poblaciones de los centros de origen en América y Europa, respectivamente. La comparación entre los materiales silvestres y cultivados de una especie permite además identificar los lugares de origen del cultivo, conocidos como centros de domesticación. Una vez que los recursos genéticos disponibles han sido caracterizados, es posible decidir cuáles serían los cruzamientos que más contribuirían a la expansión de la base genética. Frecuentemente, limitaciones en cuanto a espacio físico y presupuesto, hacen que los centros nacionales e internacionales de recursos genéticos deban restringir el número de entradas a conservar en el banco de germoplasma. La información reunida a partir de datos moleculares y morfológicos puede contribuir a establecer una colección núcleo o representativa de la variabilidad total. Esta colección central debería incluir los caracteres que están presentes en numerosas accesiones o comunes, pero también los denominados componentes raros y aquellos presentes en pocas accesiones de manera bastante frecuente. La mayor parte de los polimorfismos moleculares carecen de expresión fenotípica y son selectivamente neutros, siendo la deriva génica el proceso más importante para el cambio de frecuencia en las poblaciones. Una gran parte de ellos se encuentran en regiones no codificantes del genoma. En contraste, los genes que codifican los rasgos morfológicos poseen un fuerte efecto fenotípico y han estado sometidos a intensas presiones de selección en las distintas etapas del mejoramiento; podrían, por lo tanto, constituir una muestra de genes atípica con respecto a la mayoría de genes de una especie. Estos caracteres representan grupos de genes sometidos a diferentes fuer- 150 CARRERA, Alicia; TRANQUILLI, Gabriela; HELGUERA, Marcelo

135 zas de selección a lo largo del proceso de domesticación. Los marcadores moleculares combinados con datos morfológicos, agronómicos y de origen, conforman una base de datos integral que permite describir la variación genética en colecciones de germoplasma. 3 Mapeo genético Un mapa genético de una especie animal o vegetal muestra la distribución linear de un grupo de genes y marcadores en cada uno de los cromosomas que constituyen el genoma de un organismo. Este mapa esta basado en el concepto clásico de ligamiento: si dos o más genes o marcadores están físicamente cercanos sobre el mismo cromosoma, sus alelos se heredan usualmente juntos a través de la meiosis. Las proporciones en que estos genes segregan en una población se apartan de las esperadas bajo la ley de Mendel de segregación independiente. La mayor parte de los gametos contendrán las mismas combinaciones alélicas que los padres; sólo aquellos meiocitos que experimenten un intercambio entre cromátides no hermanas o crossover generarán gametos con combinaciones alélicas diferentes de las parentales (recombinantes). El fundamento del mapeo genético reside en la relación directa entre la frecuencia de recombinación y la distancia física entre los loci. Es así como determinando la frecuencia de recombinación entre dos genes, uno puede estimar la distancia de mapa entre los mismos, siendo la unidad de mapeo equivalente a una frecuencia de recombinación del 1%. Usualmente esta distancia se expresa en centimorgan (cm). La relación entre frecuencia de recombinación y distancia física es distorsionada por factores tales como la distribución no al azar de los entrecruzamientos, las diferencias entre organismos, la presencia de «hot spots» o sitios de alta frecuencia de recombinación y la evidencia de control genético de la recombinación. No obstante, el uso de la intensidad de ligamiento como estimador de la distancia genética genera un modelo de la disposición linear de genes y marcadores de gran utilidad en múltiples áreas del estudio genómico. Recordemos que el grado de recombinación genética (r), también conocido como fracción de recombinación, es la proporción de gametos recombinantes, n r sobre el total de gametos. r = nr / n Para tres loci, ABC, ligados en ese orden, las fracciones de recombinación entre los tres se relacionan a través de la siguiente expresión: r AC = r AB + r BC 2C r AB r BC donde 2rAB rbc representa la frecuencia esperada de entrecruzamientos dobles y C, el coeficiente de coincidencia, una medida de la independencia con la que ocurren quiasmas (entrecruzamientos) en regiones cercanas. La fracción de recombinación no es aditiva a lo largo del cromosoma y la desviación respecto de la aditividad aumenta con la distancia entre los loci. De este modo se han desarrollado «funciones» de mapa tales como Haldane o Kosambi que tornan aditiva la fracción de recombinación. Función de Haldane : m = - 0.5ln (1-2r), donde m representa unidades de mapa genético. Si un marcador resulta estar genéticamente ligado a un gen que controla un carácter de interés agronómico, la selección de este marcador resulta en la selección indirecta del gen de interés. Este hecho constituye el fundamento del proceso denominado selección asistida por marcadores moleculares, aplicado en el mejoramiento genético vegetal y animal (ver sección correspondiente en este capítulo). La eficiencia del proceso de selección indirecta basado en la cosegregación del marcador y del gen, es una función de distancia, expresada como la probabilidad de recombinación genética entre el marcador y el gen; por lo tanto, cuanto más próximos estén el marcador y el gen en cuestión, más eficiente será la selección. Este análisis puede aplicarse tanto en caracteres cualitativos como cuantitativos. La diferencia entre un carácter cuantitativo y uno cualitativo se basa en la magnificación del Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 151

136 efecto de sustitución de un alelo por otro en un determinado locus (Falconer, 1988). Si el efecto de la sustitución alélica sobre la variación fenotípica total del carácter es pequeño, se considera el carácter como cuantitativo o QTL (quantitative trait loci). Si el efecto de la sustitución de un alelo por otro es grande en relación con la variación fenotípica total, el carácter es cualitativo (genes de herencia simple). En general, la mayoría de los caracteres de importancia económica y/o agronómica, principalmente aquellos relacionados con la productividad, poseen herencia cuantitativa o fenotipos complejos. Para incorporar un carácter de interés agronómico en un mapa genético es necesario cumplir con una serie de premisas: 1- Desarrollar una población segregante para el carácter agronómico en cuestión. 2- Caracterizar la población segregante utilizando marcadores moleculares polimórficos (con diferencias en la secuencia de ADN entre los parentales). Para construir un mapa mínimo es deseable disponer de al menos cuatro marcadores moleculares por cada cromosoma del genoma en estudio. Cuanto mayor sea el número de marcadores incorporados al mapa, mayor será su resolución y la probabilidad de identificar algún marcador ligado al carácter agronómico de interés. 3- Evaluar fenotípicamente el carácter agronómico, sobre los individuos de la población segregante. Este punto es crucial, ya que si la evaluación del carácter en la población de mapeo no es clara, es imposible incorporarlo al mapa genético. 4- Identificar marcadores ligados al carácter agronómico (cosegregación entre fenotipo del carácter y fenotipo del marcador). Para esta instancia, al igual que para la construcción del mapa genético, se pueden utilizar herramientas informáticas específicas tales como los programas Mapmaker, MapmakerQTL, Genemap, etcétera. Cuanto mayor sea la distancia genética entre los parentales que darán origen a la población de mapeo, mayor será la probabilidad de detectar marcadores polimórficos, que es un punto crítico para identificar marcadores ligados al carácter en estudio. En el contexto del mejoramiento vegetal los mapas genéticos posibilitan: La cobertura y análisis de genomas completos La descomposición de caracteres genéticos complejos (QTL) en componentes mendelianos La localización de regiones genómicas que controlan caracteres de importancia agronómica La cuantificación del efecto de estas regiones en la característica estudiada La canalización de esta información en programas de mejoramiento La construcción de un mapa genético genera información básica sobre la estructura y organización de un genoma tal como reordenamientos cromosómicos (inversiones, translocaciones, duplicaciones) e identificación de regiones con alta densidad de genes. Por otro lado un mapa genético constituye el punto de partida para proyectos de clonado posicional de genes (ver sección 6 de este capítulo). 4 Selección asistida por marcadores El advenimiento de nuevas técnicas moleculares ha facilitado el análisis genético de caracteres de interés agronómico y la selección asistida por marcadores moleculares. Un argumento frecuentemente utilizado en contra de la selección asistida por marcadores es que el mejoramiento de caracteres de herencia simple no necesita de marcadores para selección si los fenotipos son fácilmente identificables. Si bien esto es correcto, en estos casos, la utilización de marcadores en un programa de mejoramiento puede aportar una ventaja muy importante basada en su naturaleza molecular y es que la selección se independiza del fenotipo y el ambiente. Estas características permiten identificar rápidamente genotipos únicos en poblaciones segregantes e incorporar varios genes de interés en un fondo genético, proceso también denominado «piramidización» o «apilamiento» de genes. Los ejemplos más claros para ilustrar la utilidad de la selección asistida por marcadores moleculares en la piramidización de genes se observan en los casos en que interacciones 152 CARRERA, Alicia; TRANQUILLI, Gabriela; HELGUERA, Marcelo

137 génicas como la epistasis (efectos de ciertos genes sobre la función de otros) «enmascaran» la presencia de un gen, dificultando su seguimiento mediante el fenotipo. Esta situación se presenta con los genes de resistencia a enfermedades, cuando se desea sumar en un genotipo resistente a una determinada enfermedad otros genes de resistencia al mismo patógeno, como estrategia de resistencia durable. Otro impacto de la selección asistida por marcadores moleculares es el menor tamaño de las progenies mantenidas en un programa. Con la selección asistida, el número de generaciones necesarias para la estabilización de los genotipos es menor, ya que la heredabilidad de los caracteres es próxima a 100%, aumentando la ganancia genética. También es posible incrementar la velocidad de un programa de mejoramiento, ya que al independizarse la selección del ambiente y de la expresión del fenotipo, se logra adelantar el número de generaciones por año. En la Figura 1 se representa un programa de retrocruzas asistida por marcadores moleculares como ejemplo de la utilización de esta herramienta en el mejoramiento vegetal. La utilidad potencial que los marcadores moleculares presentan en el proceso de mejoramiento genético resulta clara. Sin embargo, a pesar de ello, el uso actual de estas herramientas en algunos casos es limitado. Diversos son los factores que determinan esta situación. Por un lado podríamos considerar los de orden técnico y por otro los de índole económico. Dentro de los primeros, además de lo mencionado en párrafos anteriores respecto de la necesidad de contar con el mapa genético, con alta resolución y de una población segregante, debemos tener en cuenta el paso siguiente que es la validación de los marcadores que se identifiquen como promisorios para el seguimiento de caracteres de interés, es decir, la confirmación de determinados marcadores como herramien- Figura 1. Esquema de un programa de retrocruzas, asistido por un marcador específico para el gen de resistencia a roya de la hoja del trigo Lr47. Pavon: variedad donora de la fuente de resistencia. PI Gaucho: variedad susceptible recurrente. BC: generación de retrocruza. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 153

138 ta efectiva de seguimiento o selección de un gen particular. La validación es un aspecto fundamental previo a la implementación de estas herramientas en programas de mejoramiento, y su importancia reside en que la mayoría de los marcadores disponibles hasta el momento derivan de regiones del genoma que, como ya fuera indicado, son neutras y en que la asociación con caracteres de interés está determinada por ligamiento genético en la población evaluada. Dado que ese ligamiento puede no mantenerse en otro germoplasma, es necesario confirmar en los materiales de mejoramiento que el carácter deseado está determinado por gen/es presentes en el locus marcado. Desde este punto de vista, el mejor marcador es aquel que reconoce sitios polimórficos que estando dentro del gen son los determinantes de la variación fenotípica observada. Estos marcadores, también llamados diagnóstico o funcionales, pueden ser usados en forma confiable en poblaciones en los que no se hayan mapeado previamente, sin correr el riesgo de que la información de interés se pierda por recombinación. (Andersen y Lübberstedt, 2003). Como ejemplo podemos mencionar al marcador desarrollado para el gen denominado Pinb-D1. Este gen codifica para una de las proteínas relacionada con textura de grano en trigo y se ha observado que la mutación de una base específica dentro de su secuencia implica el cambio de un aminoácido (de glicina a serina) en la proteína codificada y que esto es suficiente para determinar un mayor grado de dureza de grano. Para este gen, se ha desarrollado un marcador cuyo polimorfismo esta dado por dicha mutación, y esto asegura que su uso sea válido para identificar la presencia de esta característica, sea en poblaciones de mejoramiento como en la caracterización de germoplasma. Sin dudas, la disponibilidad de marcadores diagnóstico aumentará progresivamente a partir de nuevos conocimientos que surjan de los proyectos genómicos emprendidos en diversos cultivos de interés económico. Dentro de los factores de índole económico, la limitante en la adopción de esta tecnología ha sido la relación entre el costo de la misma y el valor comercial de la semilla mejorada. En los programas de mejoramiento de aquellas especies donde el material de cultivo es híbrido, en general se observa mayor uso de selección asistida por marcadores moleculares. Es esperable que esta tendencia se modifique con el tiempo, ya que el permanente avance tecnológico ha permitido simplificar las metodologías a aplicar, por ejemplo, sustituyendo marcadores basados en hibridación (RFLP, por ejemplo) por marcadores basados en amplificación (RAPD, AFLP), reduciendo costos y también aumentando la eficiencia en el proceso de selección. 5 Mapeo comparativo La comparación de mapas de ligamiento entre diferentes especies se denomina mapeo comparativo. Si un grupo de marcadores moleculares mantiene el orden y sus relaciones de ligamiento entre dos especies se dice que son colineares o que muestran sintenia. Los mapas comparativos en vegetales comenzaron a realizarse a partir del desarrollo de los marcadores RFLP y de la posibilidad de obtener hibridación entre las secuencias de ADN utilizadas como sondas con genomas distintos a los utilizados para la obtención de las mismas. Es decir, a partir de los RFLP fue posible identificar sitios comunes en distintas especies que servían como puntos de referencia para la comparación de sus genomas. Es así que los mapas comparativos dieron las primeras evidencias de que el ligamiento de grupos de genes podría haberse conservado a través de largos períodos evolutivos. Estudios en diversos grupos taxonómicos han revelado una estrecha relación entre los genomas de las especies comprendidas dentro de cada grupo. Esto se ha observado, por ejemplo, entre especies pertenecientes a las Solanáceas (tomate, papa, pimiento), entre Arabidopsis y cultivos del género Brassica, y dentro de las gramíneas entre especies pertenecientes a la tribu Triticeas (trigo, cebada, centeno) así como entre especies pertenecientes a distintas subfamilias taxonómicas, tal el caso de arroz, maíz y sorgo. Es importante señalar que los tamaños de los genomas de las especies comparadas, en general, son significativamente diferentes. Sin embargo, a pesar de esa gran variación en el tamaño del genoma, el orden 154 CARRERA, Alicia; TRANQUILLI, Gabriela; HELGUERA, Marcelo

139 linear de los genes se encuentra altamente conservado. La utilidad de los mapas comparativos puede apreciarse desde distintos puntos de vista. Por un lado, aportan información muy valiosa para conocer los cambios producidos en la estructura cromosómica (inversiones, translocaciones, duplicaciones, deleciones) durante el proceso evolutivo que lleva a la diferenciación de especies a partir de un antecesor común, así como también permiten evaluar niveles de ploidía. Por ejemplo, a partir de la comparación de mapas moleculares, ciertas especies consideradas inicialmente diploides han modificado su estatus. Sobre la base de estudios citogenéticos, el maíz posee un comportamiento meiótico que corresponde al de una especie diploide típica. Sin embargo, numerosos loci RFLP de arroz están representados dos veces en el genoma de maíz por lo que actualmente se considera que el maíz desciende de un poliploide ancestral. Por otro lado, los mapas comparativos posibilitan la transferencia de información entre especies con genomas simples y bien caracterizados, tales como Arabidopsis y arroz, a especies con genomas más complejos tales como trigo, cebada y avena. Este ha sido tal vez el objetivo principal para impulsar el desarrollo de estos mapas. Las notables similitudes observadas entre genomas fue la base sobre la que se postuló el uso de especies modelos, como arroz o Arabidopsis, a partir de las cuales estudiar y avanzar en el conocimiento de genomas más complejos. Asimismo, partiendo del supuesto de que los genes que gobiernan aspectos fundamentales de la biología vegetal muy probablemente están conservados entre distintas especies, y el hecho de que la variación en el tamaño de los genomas de especies relacionadas se debe fundamentalmente a variación en la cantidad de ADN no codificante y no a una variación en el número de genes, la idea de llegar a la identificación, clonado y estudio de genes en las especies modelo se vio fortalecida. De este modo la información generada podría hacerse extensiva a una amplia gama de especies, incluyendo las cultivadas, facilitando así el estudio en estos organismos. 6 Clonado posicional El clonado posicional de un gen es un claro ejemplo de la utilización de información genética (disposición espacial de genes), molecular (secuencia nucleotídica de genes) y del funcionamiento (expresión de los genes) de un genoma (conjunto de genes) para identificar al gen responsable de un carácter particular. El primer paso para lograr esto es seleccionar parentales que sean contrastantes para el gen en cuestión; por ejemplo, una variedad de trigo susceptible y otra resistente a la roya de la hoja, para desarrollar una población de mapeo segregante para el gen de resistencia (Stein y col., 2000). Una vez seleccionados los parentales se desarrolla una población segregante para el carácter, la más sencilla es una F2. Posteriormente, se caracteriza esta población utilizando marcadores moleculares (microsatélites, RFLP, AFLP, RAPD) que cubran todo el genoma del organismo en estudio (en este caso trigo). El siguiente paso es determinar el fenotipo de los individuos que constituyen la población de mapeo (en este caso plantas resistentes o susceptibles a roya de la hoja). Una vez obtenida la información fenotípica y molecular de la población de mapeo, con la ayuda de programas específicos de computación (por ejemplo, Mapmaker QTL), se identificarán marcadores ligados genéticamente al carácter en una región específica del genoma. Una vez identificada la región cromosómica portadora del gen responsable del carácter, se satura dicha región con nuevos marcadores moleculares. El objetivo es delimitar el intervalo del genoma al fragmento mínimo posible que contenga al gen de interés. Muchos de estos marcadores pueden obtenerse del mapeo comparativo, identificando las regiones cromosómicas colineares de las especies más estudiadas, por ejemplo en plantas, arroz, Arabidopsis, maíz, sorgo, tabaco, etcétera. Una vez reducido al mínimo el intervalo de genoma portador del gen de interés, el paso siguiente es obtener la secuencia nucleotídica del mismo. Una forma de hacerlo es mediante una caminata cromosómica. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 155

140 La caminata se inicia seleccionando clones de una genoteca de trigo («BAC library», Ver Capítulo II.-3) con los marcadores que flanquean al intervalo portador del gen. Los dos grupos de BAC (uno para cada marcador) son digeridos con enzimas de restricción para identificar en cada grupo fragmentos compartidos y no compartidos. Se estima que, en cada grupo los BAC seleccionados deben tener en común al menos un fragmento de digestión (el fragmento que posee la secuencia del marcador). Los fragmentos no compartidos corresponden a los extremos de estos BAC parcialmente solapados entre sí. Estos extremos se utilizan como nuevos marcadores para extender la caminata cromosómica en ambos sentidos. Este proceso se hace simultáneamente con ambos grupos de BAC hasta que se superpongan y se forme un continuo o «contig» de BAC. Este contig contiene la secuencia del gen en estudio. El paso siguiente consiste en la secuenciación del contig. A partir de esta información, y por análisis de secuencia, se determinan los genes presentes, posibles candidatos del carácter en estudio. La prueba definitiva para establecer el hallazgo del gen en cuestión es la prueba de complementación. Esto consiste en transformar una planta que carece del carácter en estudio (por ejemplo es susceptible a un patógeno) con cada uno de los genes candidatos y determinar cuál de ellos le confiere el carácter (en este caso resistencia al patógeno). En algunos genomas (por ejemplo, arroz), la región cromosómica colinear a trigo puede estar secuenciada, y a partir de esta información se puede tener una primera estimación del número de genes candidatos para la resistencia al patógeno en la región cromosómica homóloga a trigo en arroz. En el caso del trigo pan, que posee un genoma extremadamente grande (16000Mb/ genoma haploide) es crítico obtener un intervalo genómico lo más pequeño posible, ya que si bien posee aproximadamente el mismo número de genes que arroz, su genoma haploide es diez veces mayor, y la diferencia está constituida principalmente por ADN repetitivo no codificante que dificulta el clonado posicional. Como ejemplo, para el clonado posicional del gen Vrn-1 que controla el momento de floración del trigo se utilizó una población de trigo diploide (Triticum monococcum) de 3095 individuos F2, para llegar a delimitar un intervalo de 0.03 cm que contenía dos genes candidatos para Vrn-1 (Yan et al. 2003). Esta región presentó una densidad de genes de uno cada pares de bases, la mitad del valor promedio de fragmentos contenidos en un BAC. 7 Distribución de la variabilidad genética en poblaciones naturales Las especies están constituidas por unidades o demos más o menos aislados denominados poblaciones. Una especie vegetal raramente se extiende en forma continua e ininterrumpida. En general adopta una distribución en parches. El número de individuos en cada población, el modo reproductivo (autogamia-alogamia), las distancias inter-demos, el tipo de polinización (gravedad-anemófila-entomófila), la acción del hombre en la fragmentación del hábitat y el origen histórico (especies nativas-especies introducidas) determinan en conjunto una distribución de la variación genética propia de cada especie. Los programas de conservación utilizan a menudo información acerca de la distribución de la variación genética para establecer prioridades y estrategias de manejo. El estudio de los componentes de la variación dentro y entre poblaciones colaboran en la definición de las unidades a conservar y se convierten en elementos importantes para la toma de decisiones relacionadas con la protección de la biodiversidad. Es deseable que las poblaciones seleccionadas para formar parte de las áreas protegidas, contengan la mayor diversidad genética posible de modo de asegurar el mayor potencial evolutivo. A partir de marcadores codominantes como las isoenzimas pueden ser obtenidos parámetros de diversidad: P: número de loci polimórficos/número total de loci analizados. A: número promedio de alelos por locus He: heterocigocidad esperada promedio (1- Σf i2, fi : frecuencia alélica) Ho: heterocigocidad observada También se calculan coeficientes de endogamia (F) a partir de la heterocigocidad observada y esperada, e índices de simili- 156 CARRERA, Alicia; TRANQUILLI, Gabriela; HELGUERA, Marcelo

141 tud (I) o distancia genética (D) que cuantifican la semejanza o diferencia genética entre poblaciones a partir de las frecuencias alélicas (Ver VI.-1 ). La diversidad genética cuantificada por marcadores moleculares puede mostrar por ejemplo, que en una especie nativa de interés forestal todas las poblaciones presentan altos niveles de variabilidad genética y son bastante similares entre sí. En este caso la decisión de cuáles poblaciones formarán parte del programa de conservación podría basarse en consideraciones exclusivamente prácticas ya que las poblaciones son genéticamente equivalentes. Por el contrario, una especie compuesta de poblaciones con niveles bajos de variabilidad en cada unidad pero con alto grado de diferenciación entre poblaciones, requerirá que los esfuerzos de protección sean dirigidos hacia tantas poblaciones como sea posible, ya que cada una de ellas posee una identidad genética diferente. Poblaciones de especies endémicas, con niveles de diversidad genética extremadamente bajos y un reducido número de individuos, son normalmente ingresadas a la categoría de especies en peligro de extinción. En este punto, es importante recordar que los marcadores moleculares representan variación genética esencialmente neutra, es decir se encuentran sometidos a la acción de fuerzas evolutivas no selectivas tales como deriva o flujo génico. Las decisiones finales de un programa de conservación deberían por lo tanto combinar los datos obtenidos a partir de marcadores moleculares junto con la evaluación de ciertos rasgos morfológicos, fisiológicos o reproductivos, que son críticos en el proceso de adaptación y supervivencia de las poblaciones en su hábitat. El conocimiento de los componentes de variación entre y dentro de las poblaciones naturales puede utilizarse además en situaciones de repoblamiento, es decir, la introducción de individuos en áreas en proceso de declinación. De acuerdo a la información obtenida por la caracterización molecular, es posible seleccionar la ó las poblaciones donadoras sobre la base de la similitud genética con la receptora, de modo de evitar los efectos indeseables de la depresión por exogamia. Las malezas de mayor impacto en la agricultura mundial son en general especies introducidas. En el nuevo territorio, libre de presiones selectivas tales como especies competidoras o patógenos características del ecosistema de origen, la especie introducida es capaces de establecerse y colonizar todos los territorios que reúnan determinadas condiciones ambientales. La caracterización genética de las poblaciones de malezas puede aportar información de utilidad en los programas de control. Mediante diferentes marcadores moleculares puede establecerse si las poblaciones actuales provienen de un solo evento de introducción, con unos pocos individuos iniciales o por el contrario, ocurrieron múltiples eventos de introducción. Además, determinados marcadores informativos pueden establecer con bastante precisión cuál es el lugar de origen de las poblaciones introducidas, y en este caso rastrear «enemigos naturales» que pudieran ser útiles como control biológico de la especie invasora. Del mismo modo puede ser analizada la variabilidad genética de patógenos o parásitos vegetales tales como razas de royas, virus, nematodos, etc. y a partir de esta información diseñar programas de control más eficaces. El tipo de reproducción de una especie vegetal determina en gran parte la distribución de variabilidad genética entre poblaciones. Los mecanismos reproductivos pueden clasificarse en los tres tipos básicos: alogamia, autofecundación y apomixis (ver Capítulo VIII.-3). En realidad existen combinaciones de estos tipos básicos, con porcentajes variables de cada uno de ellos, según las especies, y aun dentro de las poblaciones, con formas obligadas o facultativas. El estudio de marcadores moleculares en diferentes plantas de una población y su progenie ha contribuido a determinar el tipo de reproducción de numerosas especies vegetales. 8 Estimación del flujo génico El flujo génico entre poblaciones vegetales ocurre mediante el movimiento de polen o de semillas. La morfología de semilla y polen, los mecanismos de dispersión, el tipo de polinización, etc., hacen que la contribución de estas dos vías al flujo total varíe de acuerdo a la especie. Los marcadores moleculares Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 157

142 permiten cuantificar cada uno de estos procesos. Si el flujo génico se produce básicamente a través de polen, los marcadores de ADN de organelas, como por ejemplo cloroplastos, no serán transferidos de una población a otra porque este tipo de información es sólo heredada por vía materna. En contraste, si el flujo génico se realiza principalmente a través de semillas, tanto los marcadores de herencia materna como los de herencia biparental o nuclear, serán transmitidos entre poblaciones. Mediante el uso de marcadores altamente polimórficos como los microsatélites es posible determinar cuál ha sido la planta donadora del polen de cada semilla por ejemplo, en especies arbóreas. En este caso, por un lado se obtiene información acerca de la distancia de transporte de polen y además constituye un test de «paternidad». La estimación del flujo génico ha cobrado especial relevancia en los estudios tendientes a evaluar el efecto sobre el ambiente de los materiales genéticamente modificados. Dicho efecto comprende diferentes facetas. Por un lado la posibilidad de que poblaciones silvestres cercanas a las formas cultivadas, adquieran el transgen mediante fecundación cruzada, generando cambios en la dinámica poblacional, competitividad o relación con otro miembros de la comunidad biótica tales como polinizadores, patógenos, etc.. Esta potencial transferencia de genes se torna preocupante cuando se trata de flujo génico hacia poblaciones silvestres catalogadas como malezas. En este escenario los marcadores moleculares de ADN o isoenzimas constituyen herramientas muy útiles. Los individuos de una determinada población pueden ser analizados y comparados con su progenie, producto de una polinización libre. Los alelos que no estaban presentes en la población materna son atribuidos al ingreso externo de polen del cultivo. Evaluando poblaciones a distancias crecientes desde una determinada fuente de polen, el flujo génico puede ser cuantificado, y cuando esta información se complementa con datos de compatibilidad sexual, polinizadores y clima se arriba a una serie de conclusiones que pueden aplicarse al cultivo en gran escala de variedades transgénicas. A modo de ejemplo, con el objeto de establecer el riesgo ambiental de la liberación de girasol genéticamente modificado en la Argentina, se está realizando un estudio que comprende el relevamiento de las especies silvestres del género Helianthus, su distribución y el grado de intercambio genético en las zonas de contacto cultivo-silvestre (Ver IX.- 2). Se trate de variedades transgénicas o no, los procesos de hibridación de formas cultivadas de base genética estrecha con silvestres alteran los niveles de diversidad genética de las poblaciones naturales, produciendo una erosión de los recursos genéticos vegetales, con potencial aplicación en mejora. Nuevamente la estimación del flujo génico y la determinación de la variabilidad genética mediante marcadores pueden contribuir a atenuar los procesos de «homogenización» genética y dar tiempo a la evaluación de las poblaciones naturales en cuanto a rasgos como resistencia a enfermedades o parámetros de calidad. 9 Filogenia La filogenia intenta reconstruir las relaciones jerárquicas de descendencia entre especies o grupos de especies y utiliza esta información como criterio de clasificación biológica. El conocimiento de la filogenia y diversidad genética de los recursos silvestres permite optimizar los procesos de hibridación con los materiales cultivados. Cultivos importantes como trigo, girasol, tomate, poroto, arroz cuentan con numerosas especies y géneros silvestres relacionados, con potencial uso en el mejoramiento genético mediante cruzamientos. Los marcadores RFLP son particularmente útiles dado que están basados en reacciones de hibridización, lo que garantiza la homología de los segmentos que se comparan entre los diferentes taxa. RAPD no requiere un conocimiento previo del genoma en estudio y puede ser aplicado a diferentes especies pero la interpretación de los datos parte de asumir que los productos de amplificación de iguales tamaños son homólogos. El procedimiento consiste básicamente en calcular un índice de distancia genética sobre la base del número de bandas en común y luego realizar un análisis de agrupa- 158 CARRERA, Alicia; TRANQUILLI, Gabriela; HELGUERA, Marcelo

143 miento (UPGMA) o árbol filogenético (Neighbour Joining), que refleje las relaciones entre los taxa. Establecer cuál es el árbol correcto entre todos los posibles es una tarea difícil que en parte es resuelta mediante el uso de métodos estadísticos, como técnicas de re-muestreo, que generan índices de consistencia o confiabilidad para cada árbol. Las relaciones establecidas de este modo se comparan luego con vías filogenéticas propuestas a partir de datos citogenéticos, morfológicos, ecológicos, cruzamientos, etcétera. Los polimorfismos en los fragmentos de restricción de ADN de cloroplasto resultan útiles para establecer relaciones filogenéticas en el ámbito de familias y géneros debido a su tasa de evolución más lenta y a su modo de herencia uniparental. Para los niveles de especie e infraespecíficos es conveniente complementar con marcadores de origen nuclear, entre los cuales las sondas para ARN ribosómico 45S y ADNc son frecuentemente usadas. El mapeo comparativo ha permitido conocer el tipo de reorganización genómica que ha operado durante el proceso de especiación. Cuando se compara el orden de los marcadores moleculares del girasol, Helianthus annuus, y especies relacionadas como H. petiolaris y H. anomalus se observa que las especies poseen zonas colineares y zonas no colineares, originadas estas últimas en cambios estructurales como inversiones y translocaciones. Además se ha comprobado que H. anomalus es una especie resultante de la hibridación entre las dos especies mencionadas, que conserva el mismo número cromosómico de las especies parentales. Mediante marcadores isoenzimáticos es posible dilucidar las especies parentales ancestrales de una especie alopoliploide, como ocurrió con el tabaco y el algodón. Basta con examinar las variantes moleculares de las especies candidatas diploides y compararlas con las de la especie poliploide derivada. El modo de herencia de un locus isoenzimático, es decir, disómico vs. polisómico, permite además caracterizar una especie en cuanto a su origen alo- o autopoliploide, respectivamente. En la evolución del género Citrus ha operado la hibridación natural a través de reproducción sexual pero también están presentes mecanismos apomícticos que constituyen barreras al intercambio de genes. La taxonomía de este grupo resulta particularmente compleja ya que no puede ser aplicado el concepto biológico de especie. Marcadores de ADN han permitido esclarecer las relaciones de este polimórfico grupo que incluye naranjas, limones, limas y mandarinas. Los estudios moleculares más recientes han colocado al tomate, previamente denominado Lycopersicon esculentum, dentro del género Solanum, pasándose a denominar Solanum lycopersicon. Los estudios sobre ADN de cloroplasto y la similitud de los mapas de ligamiento constituyen evidencias de que el tomate y la papa comparten un antecesor común muy reciente. Esta información resulta de gran aplicación en el mejoramiento de estos cultivos así como en la comprensión de la evolución de los genomas. 10 Lecturas recomendadas ANDERSEN, J. R.; LÜBBERSTEDT, T Functional markers in plants. Trends in Plant Science 8: ANGIOLILLO, A.; MENCUCCINI, M.; BALDONI, L Olive genetic diversity assessed using amplified fragment polymorphisms. Theor. Appl. Genet. 98: CARRERA, A.; PIZARRO, G.; POVERENE, M.; FEINGOLD, S.; BERRY, S.; LEÓN, A Variability among inbred lines and RFLP mapping of sunflower isozymes. Genetics and Molecular Biology 25: FALCONER, DS Introduction to quantitative genetics. New York, Longman. GRIFFITH, S.; ANTHONY, J.F.; GELBART, WILLIAM, M.; MILLER, JEFFREY H.; LEWONTIN, RICHARD C Modern Genetic Analysis. New York: W.H: Freeman & Co. (eds.) ISBN bv.fcgi?call=bv.view..showsection&rid=mga GODT M, HAMRICK J Allozyme diversity in the grasses. En: Population biology of grasses. G. P. Cheplick (ed). Cambridge University Press. 399 pp. MANIFESTO M.M., SCHLATTER A.R., HOPP H.E., SUÁREZ E.Y., AND DUBCOVSKY J. Quantitative evaluation of genetic diversity in wheat germplasm using molecular markers. 2001, Crop Science 41: MOORE G Oranges and lemons: clues to the taxonomy of Citrus from molecular markers. Trends in Genetics 17: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 159

144 PATERSON A, TANKSLEY S, SORRELLS M DNA markers in plant improvment. Advances in Agronomy. 46: RIESEBERG, L, SEILER G, Molecular evidence and the origin and development of the domesticated sunflower (Helianthus annuus, Asteraceae). Economic Botany 44: RIESEBERG L, VAN FOSSEN CH, DESROCHERS A Hybrid speciation accompanied by genomic reorganization in wild sunflowers. Nature 375: monococcum L. spans the Lr10 resistance locus in hexaploid wheat (Triticum aestivum L.). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (24): TOHME, J.; GONZALEZ, D.; BEEBE, S.; DUQUE, M AFLP alalysis of gene pools of a wild bean core collection. Crop Sci. 36: YAN, L.; LOUKOIANOV, A.; TRANQUILLI, G.; HELGUERA, M.; FAHIMA, T. and J. DUBCOVSKY Positional cloning of wheat vernalization gene VRN1. Proc. Natl. Acad Sci. USA 100: SOLTIS, E.; SOLTIS, P Contribution of plant molecular systematics to studies of molecular evolution. Plant Molecular Biology 42: STEIN, N.; C. FEUILLET, T. WICKER, E. SCHLAGENHAUF, and B. KELLER Subgenome chromosome walking in wheat: A 450-kb physical contig in Triticum 160 CARRERA, Alicia; TRANQUILLI, Gabriela; HELGUERA, Marcelo

145 PARTE V Métodos de propagación y conservación de germoplasma Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 161

146 162 OLMOS, Sofía; LUCIANI, Gabriela; GALDEANO, Ernestina

147 V.-Capítulo 1 Micropropagación Olmos, Sofía; Luciani, Gabriela; Galdeano, Ernestina 1 Introducción La micropropagación consiste en la propagación de un genotipo a gran escala a través del empleo de técnicas de cultivo de tejidos. El cultivo es así una herramienta muy útil en los programas de mejoramiento, ya que tiene el potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicación ilimitada. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las células vegetales; esto es la capacidad de regenerar una planta completa cuando están sujetas a los estímulos adecuados. Así, las células somáticas de cualquier tejido podrían formar tallos, raíces o embriones somáticos de acuerdo con la competencia que posean y al estímulo que reciban. Esta regeneración ocurre en fases consecutivas: la fase de desdiferenciación, donde las células se vuelven competentes para responder ante cualquier estímulo organogénico o embriogénico; la fase de inducción, donde las células se determinan para formar un órgano o embrión, y la fase de realización, donde se forma el órgano o embrión propiamente dicho. Estas fases están directamente afectadas por el balance hormonal del medio de cultivo, por lo cual la optimización de los protocolos de regeneración debe realizarse teniendo en cuenta los requerimientos intrínsecos de cada genotipo en cada fase del cultivo. Así, en general, puede decirse que el proceso de desdiferenciación generalmente es promovido por una auxina, la fase de inducción por un balance hormonal específico del órgano o embrión a formarse y la fase de realización, por una disminución de la concentración hormonal en el medio de cultivo. 2 Etapas de la micropropagación La regeneración de plantas in vitro presenta cuatro etapas principales: 1) establecimiento del cultivo, 2) desarrollo y multiplicación de vástagos, 3) enraizamiento y 4) aclimatación de las plántulas. Generalmente, las etapas de enraizamiento y aclimatación pueden combinarse en condiciones ex vitro. En algunos casos tiene importancia considerar una etapa previa (Etapa 0), que es la etapa de preparación de los explantos para el establecimiento. Etapa 0: Preparación del material vegetal El empleo de explantos que se encuentran expuestos a bajos niveles de patógenos puede resolver el problema de la contaminación por hongos y bacterias durante el establecimiento del cultivo in vitro. Los factores que influyen sobre la calidad del explanto son: 1) El tipo de órgano que sirve como explanto, 2) la edad ontogénica y fisiológica del mismo, 3) la estación en la cual se colecta el material vegetal, 4) el tamaño y 5) el estado sanitario general de la planta donante. La planta donante debe elegirse sobre la base de una selección masal positiva para las características agronómicas deseables. Una vez seleccionados los individuos, es preciso definir el tipo de explanto a establecer en condiciones in vitro. En general, los órganos jóvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. Se recomienda colectar explantos primarios a campo durante la estación primaveral y estival, cuando existe una brotación activa de las yemas, ya que el empleo de yemas en estado de dormición ocasiona serios problemas de contaminación. A fin de lograr explantos de óptima calidad es conveniente hacer crecer las plantas donantes por un tiempo mínimo en condiciones de invernáculo. De esta forma es posible incidir directamente sobre el estado sanitario y la calidad de los explantos mediante el control de la intensidad lumínica, temperatura y reguladores de crecimiento. Para especies ornamentales tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas donantes en condiciones de alta temperatura (25ºC) y baja humedad relativa (75%), a fin de reducir la proliferación de patógenos. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 163

148 Los procesos morfogénicos de floración, dormición y bulbificación son controlados por el fotoperíodo y la temperatura. Controlando estos factores también es posible obtener plantas donantes y explantos más homogéneos durante todo el año. Pueden aplicarse además pretratamientos con reguladores de crecimiento a las plantas donantes, así como también a los explantos mismos. En especies leñosas suele utilizarse como pretratamiento la inmersión de los explantos primarios en soluciones con citocininas a fin de inducir la brotación de yemas. Etapa 1: Establecimiento del cultivo El objetivo de esta etapa es establecer cultivos viables y axénicos. El éxito está determinado por la edad de la planta donante, la edad fisiológica, el estado de desarrollo y el tamaño del explanto. En esta etapa los principales procesos a controlar son la selección, el aislamiento y la esterilización de los explantos. Los materiales que demuestran tener mayor capacidad regenerativa son los obtenidos de tejidos meristemáticos jóvenes, sean yemas axilares o adventicias, embriones o semillas en plantas herbáceas y aquellos tejidos meristemáticos que determinan el crecimiento en grosor, como el cambium en las plantas leñosas. En este sentido, es importante señalar que el empleo de yemas adventicias (también llamadas yemas formadas de novo) está asociado con una mayor probabilidad de ocurrencia de variantes somaclonales respecto de los sistemas de propagación, basados en la regeneración a partir de yemas axilares o embriones somáticos. La obtención de cultivos axénicos puede lograrse trabajando tanto sobre aspectos preventivos como curativos. Una acción preventiva la constituye el empleo de métodos de verificación de patógenos en los explantos. Esto puede realizarse mediante análisis específicos para las enfermedades del cultivo, tales como DAS-ELISA o PCR, análisis generales para patógenos cultivables como el empleo de medios de cultivo para el crecimiento de bacterias y hongos y métodos específicos para la detección e identificación de patógenos intracelulares como virus, viroides y bacterias. La realización de estos análisis directamente sobre las plantas donantes, previo establecimiento, presenta dos ventajas. En primer lugar, el empleo de tejidos maduros permite visualizar los síntomas más marcados de la enfermedad; en segundo lugar, la carga de patógenos es mayor y por lo tanto la precisión del sistema de detección aumenta. Por otro lado, las plantas enfermas pueden tratarse con técnicas adecuadas para la eliminación de patógenos como la termoterapia, la quimioterapia a través de la aplicación de antibióticos, desinfectantes, antivirales y el cultivo de meristemas. La desinfección superficial incluye varios pasos: el lavado de los explantos con agua corriente, el empleo de etanol al 70% por 1 minuto, seguido de concentraciones variables de hipoclorito de sodio (0,5 a 1,5% de cloro activo) con unas gotas de tensoactivos para favorecer su penetración y actividad. Posteriormente, los explantos deben ser enjuagados al menos tres veces con agua destilada estéril. Algunos patógenos permanecen latentes y se expresan cuando son transferidos a un medio de cultivo nuevo. En general, estos patógenos incluyen los patógenos superficiales del material vegetal, los patógenos endógenos y los patógenos propios del manejo en laboratorio. En la Etapa 1 también pueden observarse infecciones por bacterias y hongos asociados a trips que sobreviven a los tratamientos de esterilización y por patógenos endógenos latentes dentro del sistema vascular, resultado de una esterilización inefectiva de los explantos. Estos patógenos latentes podrían manejarse mediante el empleo de bacteriostáticos o antibióticos en el medio de cultivo. Etapa 2: Multiplicación El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicación sucesivos y poder destinar parte de ellos a la siguiente etapa de producción (enraizamiento, bulbificación, etc.). Es importante señalar que en esta etapa, cualquiera que sea la vía de regeneración empleada, es conveniente evitar la formación de callo para disminuir el riesgo de variación somaclonal. En esta etapa, los medios de cultivo, los reguladores de crecimiento como auxinas, citocininas y ácido giberélico y las 164 OLMOS, Sofía; LUCIANI, Gabriela; GALDEANO, Ernestina

149 condiciones de crecimiento juegan un papel crítico sobre la multiplicación clonal de los explantos. Ambas vías de regeneración, organogénesis y embriogénesis, pueden darse en forma directa o indirecta. Esta última implica la formación de callo. En general, la organogénesis conduce a la producción de vástagos unipolares que enraízan en etapas sucesivas, mientras que por embriogénesis somática se forman embriones bipolares a través de etapas ontogénicas similares a la embriogénesis cigótica. La organogénesis puede darse por inducción de yemas axilares o adventicias. La inducción de yemas axilares comprende la multiplicación de yemas preformadas, usualmente sin formación de callo. La inducción de yemas adventicias comprende la inducción de tejido meristemático localizado mediante un tratamiento con reguladores de crecimiento, conduciendo a la diferenciación del primordio y desarrollo del vástago, esto último generalmente en ausencia del regulador de crecimiento que indujo la organogénesis. La principal desventaja del primer método es que el número de yemas axilares por explanto limita la cantidad de vástagos. Esto se ve compensado, sin embargo, por un aumento en la tasa de multiplicación con los sucesivos subcultivos. La formación de yemas adventicias ofrece mayor potencial para la producción de vástagos, ya que la inducción de vástagos ocurre en sitios distintos al de los meristemas. La embriogénesis somática es una vía más conveniente porque permite saltar las etapas de formación de yemas y enraizamiento regenerando plantas en una forma mucho más rápida y eficiente, disminuyendo además el riesgo de variación somaclonal. A su vez, la disponibilidad de protocolos para la obtención de embriones somáticos es clave para la automatización de la micropropagación y la consecuente reducción de costos para su implementación a escala comercial. Los biorreactores son equipos que contienen aproximadamente 2 litros de medio de cultivo líquido estéril y donde los embriones somáticos pueden regenerar y madurar a partir de suspensiones celulares, sustentados por la circulación permanente de nutrientes y de aire (Fig.1). Hoy en día, el empleo de biorreactores para la micropropagación a gran escala está limitado por dos motivos críticos. Figura 1: Embriogénesis somática en zanahoria. A partir de células del floema se obtienen los embriones somáticos que son un excelente sistema de propagación clonal. Los biorreactores permiten el cultivo a gran escala de los mismos.(gentileza Dr. Miguel Pedro Guerra) En primer lugar, el declinamiento de las líneas celulares (clones) por efecto de la variación somaclonal y segundo, por los altos costos asociados con la conversión de estos embriones somáticos en plántulas. Las condiciones culturales en las cuales crece el explanto son el resultado de la interacción de tres factores: el estado del explanto o material vegetal, determinado en parte por el medio de cultivo, el recipiente de cultivo y el ambiente externo o condiciones de crecimiento del cuarto de cultivo. La capacidad de respuesta de los explantos a un mismo medio de cultivo cambia con el número de subcultivos, el tipo de explanto subcultivado y el método del repique. Por esto mismo, el medio de cultivo debe optimizarse a fin de lograr la mayor tasa de multiplicación vegetativa. Comúnmente se Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 165

150 emplea como medio basal el medio MS completo sugerido por Murashige & Skoog (1962) suplementado con 3% de sacarosa como fuente de carbono. A este medio se le adicionan además reguladores de crecimiento, tanto del tipo de auxinas como de citocininas. La etapa de multiplicación generalmente comprende dos períodos, la fase de inducción y la fase de multiplicación propiamente dicha. La primera implica, generalmente, el empleo de concentraciones elevadas de reguladores de crecimiento (generalmente de auxinas más que citocininas) para favorecer la desdiferenciación. La segunda etapa requiere del empleo de un balance hormonal adecuado para favorecer los procesos de diferenciación y multiplicación celular. En este caso, el sistema es más dependiente de reguladores del tipo de las citocininas. En algunos casos, como ocurre en la formación de embriones somáticos, se requiere de una tercera y cuarta etapa, denominadas de maduración y de germinación respectivamente, cuya duración varía entre 1 a 2 semanas. Para la etapa de maduración se adiciona ABA (ácido abscícico) al medio basal en rangos de 5 a 20 micromolar, seguido del subcultivo a un medio basal conteniendo AG (ácido giberélico) en concentraciones de 0,1-1 micromolar, cuyo fin es lograr la germinación de los embriones obtenidos. Los tipos de auxinas (a) y citocininas (b) y los rangos de concentración más empleados se mencionan a continuación: a) IBA (ácido 3-indolbutírico): 0,1-2 µm; 2,4-D (ácido 2,4- diclorofenoxiacético): 4-35 µm; AIA (ácido 3- indolacético): 0,1-2 µm; ANA (ácido naftalenacético): 1-5 µm; y, picloram: 1-10 µm; b) BA (N6-benciladenina): 1-20 µm; CIN (cinetina): 0,1-1 µm; ZEA (zeatina): 1-10 µm; 2ip (isopentiladenina): 1-5 µm; y, TDZ (tidizuron): 0,01-1 µm. Los tipos de reguladores, sus combinaciones y rangos de concentraciones deben ser optimizados para cada especie, genotipo y etapa de multiplicación determinada. Los cultivos se incuban en luz a 27±2º C con 14 horas de fotoperíodo e intensidad lumínica moderada (100 µmol m -2 s -1 ). La presencia de compuestos fenólicos oxidados se encuentra asociada con tejidos vegetales sometidos a situaciones de estrés, tales como aquel provocado por el daño mecánico producido durante el aislamiento del explanto de la planta madre. Estos compuestos se encuentran en general en las plantas en estado reducido y el ataque de patógenos produciría su oxidación y liberación. Esto inhibiría el crecimiento de los mismos, dañando, indirectamente, a los explantos. Estas sustancias (quinonas, fitoalexinas y protectores de auxinas) son muy lábiles y fácilmente oxidables. Por esto mismo, durante el establecimiento y multiplicación in vitro es necesario emplear estrategias tendientes a disminuir el estrés de las plantas y limitar al mínimo la producción y oxidación de los compuestos fenólicos. Para ello se emplean agentes absorbentes de fenoles en el medio de cultivo, tales como el carbón activado y la polivinilpirrolidona o antioxidantes como el ácido ascórbico, la modificación del potencial redox con agentes reductores, la inactivación de las fenoloxidasas con agentes quelantes o la reducción de su actividad o afinidad por el sustrato utilizando un bajo ph, o bien cultivando in vitro en condiciones de oscuridad. Es recomendable además lograr que la tasa de intercambio gaseoso entre los ambientes del recipiente y externo sea óptima, evitándose la acumulación de CO 2 y de etileno. En este sentido, el sellado del recipiente es importante, el intercambio gaseoso es más limitado con el empleo de una tapa de plástico que con un film de polietileno extensible. La utilización de una tapa perforada con tapón de gomaespuma es altamente recomendable (Fig. 2). Los principales problemas que pueden presentarse durante los sucesivos subcultivos in vitro son la vitrificación y la producción de compuestos fenólicos por los explantos. La vitrificación consiste en un proceso de morfogénesis anormal con cambios anatómicos, morfológicos y fisiológicos que producen hojas de una apariencia vidriosa. Este fenómeno está regulado por dos factores clave que son la humedad relativa y el potencial agua, y afecta a dos procesos fisiológicos fundamentales: la fotosíntesis y la transpiración. Debido a la disfunción metabólica asociada, las plantas se vuelven heterótrofas y transpiran excesivamente debido a un mal funcionamiento estomático y a cambios estructurales en las paredes celulares. La principal consecuencia de la vitrificación es la baja supervivencia de las plántulas obtenida du- 166 OLMOS, Sofía; LUCIANI, Gabriela; GALDEANO, Ernestina

151 Figura 2: Plantas de tabaco creciendo in vitro en un recipiente de vidrio con tapa metálica perforada y tapón de gomaespuma, que evita la acumulación de CO 2, etileno y excesiva humedad en el ambiente de cultivo. rante la aclimatación ex vitro. Por ello, es fundamental conocer el rol de los distintos factores que inciden negativamente sobre el desarrollo morfogénico normal (autótrofo) in vitro. Estos factores son el ambiente de cultivo, los componentes orgánicos e inorgánicos del medio, los reguladores de crecimiento, la luz y la temperatura. Una baja humedad relativa, elevada irradiación, la remoción de la fuente de carbohidratos del medio de cultivo y la defoliación de las plantas para estimular la formación de hojas nuevas estimulan la fotosíntesis y otras actividades metabólicas de las hojas en forma normal. Otras estrategias para lograr un óptimo crecimiento implican el empleo de retardantes del crecimiento para estimular la formación de hojas nuevas después del transplante. O bien, el empleo de altos niveles de CO 2 (antagonista del etileno) para estabilizar la vía de lignificación y prevenir la vitrificación a través de la inhibición de la hiperhidratación, la hipolignificación y la formación de aerénquima. Etapa 3: Enraizamiento y aclimatación En esta etapa se produce la formación de raíces adventicias. En las especies herbáceas es relativamente fácil mientras que en las especies leñosas es complicado por su limitada capacidad rizogénica. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso pueden emplearse varios tipos de sustratos y reguladores de crecimiento (auxinas) para promover la rizogénesis. Los sustratos incluyen: medio solidificado con agar, perlita y/o vermiculita humedecidas con medio nutritivo o agua. En un medio solidificado con agar, los nutrientes se reducen de 1/2 a 1/4 de la composición original, y la sacarosa se reduce a una concentración final de 1-2%. Medios con baja concentración salina, como el WPM (Lloyd & Mccown, 1980) y GD (Gresshoff & Doy, 1972), incrementan el porcentaje de enraizamiento de vástagos axilares en plantas latifoliadas. El empleo de agar presenta ventajas y desventajas sobre la rizogénesis. Por un lado, el enraizamiento de especies forestales en agar se favorecería al producirse una rizogénesis más sincrónica como resultado del contacto íntimo de las estacas con el medio de cultivo. Sin embargo, las raíces producidas por este método son usualmente delgadas y no se forman raíces cabellera. Adicionalmente, el empleo de agar está asociado con la formación de callo en la base de las estacas, que conduce al establecimiento de conexiones vasculares interrumpidas entre raíces y vástagos. Comúnmente, a fin de proceder a su enraizamiento, los vástagos de buen tamaño provenientes de la etapa de multiplicación y provistos de al menos 4-5 yemas, se colocan durante períodos cortos en soluciones con concentraciones elevadas de auxinas. La auxina más utilizada es el IBA (ácido 3- indolbutírico), que puede utilizarse a concentraciones de 1-10 µm durante pocas horas. Alternativamente se pueden emplear niveles más bajos de auxinas (0.1 a 1µM ), pero manteniendo la inducción por un período más prolongado (3 a 7 días). Luego los vástagos se transfieren a un medio de cultivo basal desprovisto de reguladores de crecimiento para permitir el desarrollo de las raíces. Aproximadamente 20 días después del tratamiento de inducción es posible la obtención de una adecuada cantidad de raíces funcionales que permitan continuar hacia la etapa de aclimatación. Es importante acentuar que el uso de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 167

152 auxinas a elevadas concentraciones es contraproducente porque induce la formación de callo en la base de las estacas. Por ello, para cada cultivo es necesario optimizar un protocolo de rizogénesis que minimice la formación de callo y maximice la tasa de rizogénesis y supervivencia de las plantas. El enraizamiento ex vitro permite que el enraizamiento y aclimatación se logren simultáneamente y que raramente se forme callo en la base de las estacas, asegurando así una conexión vascular continua entre el vástago y la raíz. Sin embargo, el estrés asociado a la evapotranspiración acelerada de las plantas durante las etapas iniciales del trasplante puede reducir considerablemente la tasa de supervivencia. Por ello, es conveniente contar con instalaciones de invernadero o cámaras de crecimiento adecuadas para brindar temperatura y humedad relativa moderadas, que permitan lograr la rusticación de las plantas en forma progresiva. Bajo condiciones ex vitro se utilizan diferentes sustratos, mezclas de tierra y arena y/o abonos, los cuales conviene que estén debidamente esterilizados. 3 Propagación de especies leñosas El empleo de clones en programas de reforestación genera al menos un 10 % de incremento en ganancia genética en relación con el empleo de plantas regeneradas por semillas de árboles selectos. Sin embargo, la máxima ganancia genética puede ser obtenida mediante el empleo conjunto de propagación sexual y agámica. La reproducción sexual es importante para la introducción de genes nuevos, prevenir los efectos de la endogamia y el mejoramiento de características controladas por efectos aditivos de genes. La reproducción asexual, por otro lado, permite la multiplicación de individuos o grupos de individuos seleccionados de una población élite, que exhiben una significativa ganancia genética debida a efectos no aditivos de genes. Tradicionalmente, las especies forestales fueron propagadas vegetativamente mediante el enraizamiento de estacas, de braquiblastos en coníferas, así como también por injertos. La propagación por estacas de Cryptomeria japonica (kiri), Populus (álamo) y Salix (sauce) ha sido llevada a cabo durante siglos en Asia y Europa. Sin embargo, para la mayoría de los árboles propagados por estacas se observa una rápida pérdida de capacidad de rizogénesis al aumentar la edad de la planta donante de las estacas. En este sentido, una de las principales ventajas de la micropropagación es la capacidad potencial de desarrollar protocolos de multiplicación optimizados para multiplicar árboles adultos que han demostrado ser fenotípicamente superiores. 3.1 Métodos de Micropropagación Los trabajos pioneros en el cultivo de tejidos cambiales de especies forestales condujeron, en el año 1940, a la formación de yemas adventicias en Ulmus campestris. Durante la década del 40 se publicaron logros adicionales en al producción separada de vástagos y raíces en especies latifoliadas. En 1950 se publicó por primera vez la obtención de organogénesis en coníferas, con la formación de vástagos a partir de callos de Sequoia sempervirens. En la década se obtuvieron las primeras plantas de álamo (Populus tremuloides) y Pinus palustris. En ambos casos la formación de plántulas se logró vía organogénesis. Luego del año 1975 la micropropagación de especies latifoliadas se realizó a través de la regeneración indirecta, pasando por una etapa de callo. Actualmente, la multiplicación in vitro de coníferas y latifoliadas se logra a través de tres vías, 1) brotación de yemas adventicias, 2) producción de yemas adventicias y 3) embriogénesis somática. La brotación de yemas adventicias emplea ápices de vástagos, yemas laterales y microestacas. Es el principal método utilizado para especies latifoliadas. En las coníferas, la elongación de las yemas axilares a partir de braquiblastos de plantas adultas no ha sido muy exitosa. En latifoliadas de clima templado los mejores explantos los constituyen las yemas y vástagos en activo crecimiento más que las yemas en estado de dormición. Los vástagos se colectan en primavera y a principios del verano a fin de obtener material con reducido nivel de contaminación. Alternativamente, las yemas en dormición pueden ser colectadas y brotadas en condiciones ambientales controladas. 168 OLMOS, Sofía; LUCIANI, Gabriela; GALDEANO, Ernestina

153 Para la inducción de vástagos, tanto en gimnospermas como en angiospermas, se requiere el empleo de citocininas. Las más usadas son la N6-benciladenina (BA) y el tidiazurón (TDZ). Los medios basales más usados para angiospermas son el MS (Murashige & Skoog, 1962) o el WPM (Lloyd & Mccown, 1980). Para el caso de gimnospermas, el empleo de medios reducidos en sales minerales y baja cantidad de nitrógeno resulta mucho mejor que el empleo de un medio altamente salino y nitrogenado como el MS. La inducción de yemas adventicias es el método más empleado para gimnospermas y angiospermas. En este caso, las yemas se inducen directamente sobre el explanto en general sin previo pasaje por una etapa de callo. En general, cuanto más joven es el tejido, tanto mayor es la respuesta a los tratamientos que conducen a la organogénesis de novo. Los explantos más frecuentes son embriones cigóticos maduros, seguidos de cotiledones y epicótilos de plántulas. Generalmente se utiliza BA a concentraciones mayores o iguales a 5 ppm como única fuente de inducción o en combinación con otras citocininas. La adición de auxinas puede ser beneficiosa, aunque en coníferas se ha encontrado que promueve la formación de callo y reduce el proceso de organogénesis. En algunos casos, como en Populus spp., la formación de yemas adventicias se logra a partir de un callo originado a partir de tejido cambial. El método llamado multiplicación mediante nódulos meristemáticos es un método también utilizado para pino radiata y álamo. En este caso se obtiene básicamente un tejido meristemático (no un verdadero callo) usando relaciones altas de auxina/citocinina para luego inducir la producción de vástagos. La disponibilidad de protocolos vía embriogénesis somática para especies forestales es aún limitada. En las angiospermas los primeros embriones somáticos se obtuvieron de Santalum album, donde sin embargo no fue posible la obtención de plantas completas. Veinte años después pudieron lograrse plantas completas de abeto (Picea abies), una gimnosperma. En las gimnospermas los mayores éxitos se lograron empleando como explantos embriones cigóticos maduros e inmaduros. En la mayoría de los casos los embriones se originan en forma indirecta a partir de callos embriogénicos o bien, directamente, desde el explanto. En las coníferas puede ocurrir un proceso de poliembrionía, previa formación de callo que conduce a una alta tasa de multiplicación inicial. En general, los medios de cultivo más efectivos para estos fines contienen elevados niveles de sales y suministran nitrógeno tanto como NH 4 + y NO 3-. Las auxinas más comúnmente empleadas en el medio de inducción son el 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y el ANA (ácido naftalenacético), en concentraciones mayores de 2 µm. En algunos casos es necesario además el empleo de alguna citocinina, generalmente en concentraciones mayores a 1 µm si se trata de BA y entre 0,1-1 µm en el caso del TDZ. 3.2 Condiciones de cultivo Los explantos jóvenes de especies leñosas, particularmente angiospermas, a menudo secretan al medio de cultivo polifenoles oxidados, visibles como pigmentos marrones y/o negros. Se observa también que en los explantos de árboles adultos el problema se acentúa. Por ello se recomienda el empleo de explantos primarios juveniles. Los tipos de explantos más utilizados para el establecimiento in vitro son los segmentos nodales de explantos juveniles, las yemas axilares obtenidas por rejuvenecimiento de plantas adultas, y los embriones cigóticos y plántulas obtenidas de semillas de origen sexual. La desinfección de los mismos se logra mediante inmersión en etanol al 70 % (1 a 2 minutos) seguido de una solución de lavandina comercial conteniendo de 0,8 a 2,4 % de hipoclorito de sodio durante 5-30 minutos. En la mayoría de los casos se emplean agentes tensoactivos, tales como Tritón Ò y Tween20 Ò, adicionados en la solución de lavandina. En todos los casos los explantos son lavados finalmente varias veces con agua destilada estéril. Los medios basales más empleados son el MS, formulado por Murashige & Skoog (1962), diluído a la mitad o a un cuarto de su formulación original o el WPM, formulado por Lloyd & McCown (1981). Como medios de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 169

154 blanco y negro Figura 3: Etapas de la micropropagación en plantas de paraíso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos et al., 2002): A) Huerto semillero de paraíso gigante con ejemplares de seis años de edad, provincia de Misiones, Danzer Forestación S.A. Las semillas de los genotipos seleccionados fueron empleadas para generar una población de plantas donantes de explantos. B) Etapa 0, Preparación del material vegetal: plantas de origen sexual de 6 meses de edad crecidas en condiciones de invernadero y utilizadas como donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimiento del cultivo: vástagos desarrollados a partir de meristemas luego de 30 días sobre medio de establecimiento (Medio basal de Murashige y Skoog, 1962 (MS) suplementado con 2,22 µm 6-bencil amino-purina (BAP) + 0,29 µm ácido giberélico (GA3) + 0,25 µm ácido 3-indolbutírico (IBA). D) Etapa de Multiplicación: vástagos luego de 30 días sobre medio de multiplicación (medio MS suplementado con 2,22 µm BAP, estos vástagos fueron empleados como explantos para los subcultivos siguientes o para pasar a la etapa de enraizamiento. E) Explantos provenientes de la etapa de multiplicación con problemas de vitrificación y presencia de callo. En estos casos, el medio de multiplicación para los cultivos subsiguientes fue modificado reduciendo la concentración de BAP a 0,44 µm. F) Vástago enraizado en medio de MS con la concentración salina reducida a la mitad, suplementado con 9,89 µm IBA durante 2 días, seguido por el subcultivo en medio basal durante 30 días hasta estar listo para pasar a la etapa de aclimatación. multiplicación se emplean además el BTM (broadleaved tree medium, Chalupa, 1983) y el medio de Périnet y Lalonde (1983). Los reguladores de crecimiento más utilizados son el ácido naftale-nacético (ANA) y la benciladenina (BA). También han sido efectivas auxinas como el ácido indol-butírico (IBA) y el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y citocininas como la 2- isopentil amino purina (2iP), cinetina (CIN), zeatina (Z) y tidiazurón (TDZ). En general, los cultivos se incuban a 27±2º C con 14 horas de fotoperíodo e intensida- 170 des lumí-nicas moderadas. En la Fig. 3 se muestran las etapas de la micropropagación de plantas de paraíso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos et al., 2002). 3.3 Problemas asociados a la micropropagación de especie leñosas Es mucho más difícil propagar material adulto que juvenil ya que los primeros son recalcitrantes, es decir, difíciles de regenerar. Sin embargo, aún en estos casos es posible OLMOS, Sofía; LUCIANI, Gabriela; GALDEANO, Ernestina

155 extraer ex-plantos de mayor capacidad regenerativa mediante dos formas: 1) seleccionando los tejidos más juveniles dentro de un árbol o 2) induciendo el rejuvenecimiento del árbol donante antes de aislar los explantos. Para seleccionar el material más juvenil en una planta adulta hay que considerar el fenómeno de topófisis. Este es un proceso por el cual el tipo de crecimiento de un nuevo individuo está determinado por la posición que ocupaba en la planta adulta. Esto es ocasionado por efecto del envejecimiento fisiológico e implica que los explantos más reactivos in vitro se encuentran en las yemas de las áreas basales del tronco y raíces. A su vez, el rejuvenecimiento es un proceso de reversión temporaria de las características adultas que permite lograr material vegetal en estado de juvenilidad. En general, a fin de contrarrestar los efectos debidos a la topófisis, se recomienda emplear tejidos juveniles y un tamaño de explanto muy pequeño. La juvenilidad puede lograrse por dos métodos. En primer lugar, mediante el empleo de órganos juveniles separados de plantas adultas, la utilización de estacas enraizadas o bien de brotes epicórmicos. En segundo lugar, mediante el rejuvenecimiento de partes adultas, la iniciación de yemas adventicias y embriones (en este caso se logra un rejuvenecimiento total por el inicio de un nuevo ciclo ontogénico), del injerto de yemas adultas sobre pies juveniles, de tratamientos con reguladores de crecimiento (como citocininas como el BA), por la poda severa (recepado de árboles adultos) y a través del cultivo in vitro de meristemas. Tanto los atributos de supervivencia a campo, como la tasa de crecimiento, el plagiotropismo y la susceptibilidad a enfermedades de las plantas, tienen una correlación directa con la calidad de los vástagos durante el cultivo in vitro. Un problema crucial a resolver en cada sistema de propagación es la calidad diferencial de las raíces de las plantas regeneradas en relación con aquellas obtenidas por semillas. Por ejemplo, las plantas regeneradas de Pinus elliotti suelen tener una raíz principal no ramificada y gruesa. En cambio, las plantas obtenidas a través de semillas tienen raíces más delgadas y de mayor crecimiento lateral que permiten comparativamente un mejor anclaje y una mayor resistencia a los vientos. 4 Propagación de especies herbáceas La micropropagación de especies herbáceas está orientada a proveer material libre de patógenos, propagar material seleccionado por su mayor rendimiento o por su mayor resistencia a enfermedades y estreses ambientales, conservar la diversidad específica en bancos de germoplasma, obtener material para estudios fisiológicos y genéticos y sentar las bases para la aplicación de técnicas de ingeniería genética. Existe una gran variedad de protocolos, desarrollados en función de la especie y de los objetivos de la propagación. Existen protocolos generales para monocotiledóneas como en el caso ciertos cereales (trigo, maíz, cebada, avena, arroz), pasturas (pasto bermuda, festuca alta, raigrás, pasto llorón) y hortícolas (cebolla, ajo, puerro); protocolos generales para dicotiledóneas que incluyen especies hortícolas (tomate, papa, pimiento y zanahoria) y leguminosas forrajeras (alfalfa, maní, trébol blanco) y protocolos para especies modelo como Arabidopsis y tabaco. En todos los casos, las formas de propagación son las mismas. Se emplean vías de regeneración por formación de yemas axilares, yemas adventicias y embriogénesis somática. En los dos primeros casos, el sistema de propagación a través de la organogénesis directa asegura la estabilidad genética de las plantas regeneradas y se emplean cuando el objetivo es la propagación clonal a gran escala. La embriogénesis u organogénesis indirecta, con formación de callo, se emplea en cambio para generar variabilidad en programas de mejoramiento. En el caso de ajo y cebolla, por ejemplo, las etapas de la micropropagación incluyen tanto la multiplicación de yemas axilares por el cultivo de meristemas, la formación directa de yemas adventicias en explantos obtenidos a partir de placas basales o umbelas inmaduras y la formación indirecta de yemas adventicias y/o embriones somáticos obtenidos a partir de callos que provienen de distintos tipos de explantos (meristemas, bro- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 171

156 tes, placa basal ó raíces). En el caso de alfalfa y otras leguminosas como soja y maní, la micropropagación es llevada a cabo por la vía de la embriogénesis somática, donde los embriones se obtienen utilizando tejidos juveniles (embriones, cotiledones y pecíolos) como explantos. En algunos casos como pasto llorón (Eragrostis curvula) es posible la regeneración de plantas mediante embriogénesis, organogénesis y regeneración directa a partir de los explantos. 5 Lecturas Recomendadas CASO, O. H Juvenilidad, rejuvenecimiento y propagación vegetativa de las especies leñosas. Agriscientia 9 (1): CHALUPA, V Micropropagation of conifer and brodleaved forest trees. Communicationes Instituti Forestalis Cechosloveniae 13: DEBERGH PC; PE READ, Micropropagation. En Micropropagation. Debergh PC y Zimmerman RH eds, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands: Agroforestry systems 32. Kluwer Academic Publishers. Netherlands: LLOYD, G.; B. MCCOWN Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kolmia latifolia, by use of shoot tip culture. Combined Proceedings International Plant Propagator Society 30: MURASHIGE, T.; SKOOG, F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: PÉRINET, P.; M. LALONDE In vitro propagation and nodulation of the actinorhizal host plant Alnus glutinosa (L.) Gaertn. Plant Science Letters 29: SCHENK, R.U.; HILDEBRANDT, A.C Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can J Bot 50: THORPE, T.A.; HARRY, I.S.; KUMAR, P.P Application of micropropagation to forestry. En Micropropagation. Debergh PC y Zimmerman RH eds, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands: ZIV M, Vitrification: morphological and physiological disorders of in vitro plants. En Micropropagation. Debergh PC y Zimmerman RH eds, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands: EVANS, D.A.; SHARP, W.R.; BRAVO, J.E Cell culture methods for crop improvement. Handbook of Plant Cell Culture 2: KLOPFENSTEIN, N.B.; KERL, J.G The potential of biotechnology in temperate agroforestry practices. In: 172 OLMOS, Sofía; LUCIANI, Gabriela; GALDEANO, Ernestina

157 V.-Capítulo 2 Semilla sintética Rey, Hebe Y.; Mroginski, Luis A. 1 Concepto Figura 1: a) Partes de una semilla sintética. b, c y d) Obtención de plantas de Arachis pintoi (2n=3x=30) mediante semillas sintéticas (las barras verticales indican 3 mm). Resulta difícil determinar como se originó la idea de producir semillas sintéticas o artificiales. Estas son el resultado de la aplicación en agricultura del fenómeno de embriogénesis somática, descripto por primera vez en 1958 por Jakob Reinert y F.C.Steward y colaboradores. Sin embargo, un gran propulsor de su utilización para la propagación a gran escala de plantas fue Toshio Murashige, quien en un simposio realizado en 1977 en Ghent (Bélgica) presentó formalmente la idea de la producción de las semillas sintéticas, entendiendo como tal a un simple embrión somático encapsulado. Esta semilla se diferencia de la semilla verdadera en que el embrión es somático (producido por el fenómeno conocido como embriogénesis somática) y no cigótico, y que si tiene endosperma y cubierta, éstos son artificiales (Fig.1 a y b). Esta semilla, puesta en condiciones adecuadas, germina (Fig.1 c) y se convierte en una planta (Fig.1 d). Muchos grupos de investigación han contribuido al desarrollo de tales semillas. Entre ellos se deben destacar el grupo liderado por Keith Walker de la Compañía Monsanto, quien a partir de mediados de la década que va de 1970 a 1980 trabajó especialmente con alfalfa. También hay que mencionar la labor de Robert Lawrence de la Union Carbide, quienes comenzaron los trabajos con especies forestales, lechuga y apio. Otros investigadores como Drew, Kitto y Janick realizaron sus trabajos con zanahoria. El aporte del grupo liderado por Keith Redenbaugh de la Plant Genetic Inc. fue muy importante, especialmente por su descubrimiento de que hidrogeles como el alginato de sodio podían utilizarse para producir semillas artificiales que podían germinar en condiciones de invernadero. Existe otro tipo de semilla sintética, diferente del definido más arriba, donde, en lugar de encapsular embriones somáticos se encapsulan yemas. Este tipo de «semillas sintéticas» de una utilización muy restringida no será tratado en este capítulo. 2 Tipos de semillas sintéticas Las semillas sintéticas pueden fabricarse de diferentes maneras (Fig. 2). Básicamente pueden utilizarse embriones hidratados, tal como resultan del proceso de embriogénesis somática, o bien pueden ser desecados. En algunos casos estos embriones están protegidos por cubiertas protectoras. De esta manera se pueden distinguir 5 tipos básicos de semillas sintéticas: 1) Semillas sintéticas con embriones desecados sin cubierta (Tipo 1, Fig. 2). Se Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 173

158 Tabla 1: Ejemplos de semillas sintéticas basadas en la desecación de embriones sin cubierta protectora. Especie % humedad en la semilla % conversión en plantas Apium graveolens Dactylis glomerata Medicago sativa trata de un sistema muy simple donde los embriones son desecados hasta alcanzar porcentajes de humedad del 8 al 20% y no están provistos de ningún tipo de cubierta protectora. En el caso de alfalfa, embriones sometidos a la desecación mostraron porcentajes de conversión en plantas de hasta el 95% (Tabla 1). Es posible mantener la viabilidad de este tipo de embriones por un año, aproximadamente, en condiciones de laboratorio. 2) Semillas sintéticas con embriones somáticos desecados y provistos de cubierta protectora (Tipo 2, Fig. 2). Esta técnica ha sido utilizada en zanahoria y apio, donde los embriones fueron recubiertos con polyoxietileno y luego desecados. Los resultados han mostrado que es factible lograr una buena supervivencia de éstos; sin embargo, la conversión en plantas es realmente baja. 3) Semillas sintéticas con embriones hidratados sin cubierta (Tipo 3, Fig. 2). Es el sistema más simple; consiste en la utilización Desecados Encapsulado Explante Cultivo e inducción de la embriogénesis somática Embriones somáticos Hidratados Gel Viscoso Siembra en el suelo Figura 2: Tipos de semillas sintéticas. Encapsula do de los embriones somáticos tal como resultan del proceso de embriogénesis somática, sin ningún tipo de cubierta protectora. Este sistema ha sido desechado en la práctica por la escasa conversión de embriones en plantas. 4) Semillas sintéticas con embriones somáticos hidratados suspendidos en un gel viscoso («fluid drilling»)(tipo 4, Fig. 2). Inicialmente fue desarrollado en zanahoria y más recientemente en batata; consiste en la inclusión de varios embriones en una especie de tubo que contiene un gel viscoso. 5) Semillas sintéticas con embriones somáticos hidratados y provistos de una cubierta protectora (Tipo 5, Fig. 2). Es el sistema más usado. Por esta razón, de aquí en adelante, cuando se mencione «semilla sintética» se referirá a este tipo. Tiene la ventaja de que los embriones no están sujetos a la desecación, que constituye la principal causa de los bajos valores de conversión en plantas. Si bien se han ensayado numerosas sustancias para encapsular a los embriones somáticos (agar, gelrite, gomas), una de la técnicas más utilizadas consiste en lograr la formación de una cubierta protectora de alginato de calcio, compuesto que no es tóxico para el embrión y permite una rápida encapsulación. El proceso es muy simple y consiste básicamente en sumergir a los embriones somáticos en una solución de alginato de sodio al 2%, pasándolos luego a una solución acomplejante de, por ejemplo, 100 mm de Ca (NO 3 ) 2 (Fig. 3). Con esta técnica se genera una semilla sintética consistente en un embrión somático recubierto con una cubierta seminal y provisto de un endosperma artificial (Fig.1 a y b). Eventualmente estas cápsulas pueden ser recubiertas por sustancias tales como polioxieti-lenglicol, que sirve para mantener una adecuada hidratación de las cápsulas y embriones. Este procedimiento ha posibilitado la obtención de semillas sintéticas de numerosas especies de interés económico, entre las que pueden mencionarse alfalfa, zanahoria, apio y especies forestales como Picea abies, Pinus radiata, Santalum album y Pseudotsuga 174 REY, Hebe Y.; MROGINSKI, Luis A.

159 menziesii. I A B C 3 Producción de semillas sintéticas H G Figura 3: A-D) Inducción de la embriogénesis somática,e) selección de embriones somáticos, F) inmersión de los embriones en alginato de sodio,g) acomplejamiento con nitrato de calcio, H) lavado, I) semilla sintética (i) F E En la Fig.4 se esquematizan 6 aspectos que deben tenerse en cuenta para la producción y manipulación de las semillas sintéticas. En primera instancia es necesario contar con un sistema eficiente de inducción de embriogénesis somática in vitro, es decir, la producción de embriones sin la necesidad de la fusión de gametas. Estos embriones deben ser estructuras bipolares perfectas (con un polo que genere el vástago y el otro la raíz) capaces de convertirse («germinar») en plantas enteras (ver II.-2). Si bien la existencia de embriogénesis somática ha sido informada en centenares de especies de angiospermas y gimnospermas, en muchos casos no es de utilidad para iniciar la producción de semillas sintéticas debido a la baja tasa de producción de embriones aptos para la encapsulación. En los últimos años se han hecho notables avances en el conocimiento de los factores que regulan la embriogénesis somática. Sin embargo, en muchos casos, la base genética de este fenómeno no está completamente dilucidado. En alfalfa es un carácter heredable, codificado por dos genes dominantes de segregación independiente. Una vez inducida la embriogénesis somática, el segundo Inducción de la embriogénesis somática D Producción sincronizada y en gran escala de los embriones somáticos Maduración de los embriones somáticos Encapsulamiento mecanizado Almacenamiento de las semillas sintéticas Siembra en invernadero o a campo Figura 4: Etapas en la producción de las semillas sintéticas. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 175

160 paso consiste en lograr una producción sincronizada, a gran escala, de los embriones. Es fundamental contar con embriones simples, en estado cotiledonar, que no se fusionen entre sí y que no generen embriones secundarios. A fin de seccionarlos se han desarrollado diferentes procedimientos basados en filtros y equipos clasificadores automáticos. Para la producción a gran escala se han diseñado biorreactores y sistemas mecanizados de encapsulamiento adaptados a las particularidades de cada especie. Gran parte de la investigación se halla centrada en lograr una adecuada maduración de los embriones, que es un factor esencial para la obtención de altos valores de conversión en el suelo. En alfalfa se ha demostrado la necesidad del empleo de tratamientos con ácido abscísico, maltosa y de pretratamientos con temperaturas bajas (4ºC). El almacenamiento de las semillas sintéticas es otro aspecto importante a tener en cuenta. Lo ideal sería que las semillas sintéticas tuvieran un comportamiento similar al de la mayoría de las semillas verdaderas y permanecieran viables por mucho tiempo. Los resultados obtenidos con semillas sintéticas de muchas especies muestran que aún hay que trabajar arduamente para que ello ocurra. La criopreservación con nitrógeno líquido (ver V.3) podría resolver este punto. Por último, si bien muchos factores inciden negativamente para que ello ocurra, lo ideal sería que la semilla sintética fuera sembrada directamente en el suelo, rindiendo elevados porcentajes de conversión en plantas. Actualmente, en la mayoría de los casos, las semillas sintéticas son sembradas primeramente en cámaras climatizadas o en invernaderos para luego ser llevadas al campo. 4 Calidad de la semilla sintética Otro aspecto de gran importancia tecnológica es el contar con semillas sintéticas que, además de no generar variantes somaclonales, tengan un alto porcentaje de conversión en plantas cuando éstas son sembradas en el suelo. Este aspecto se ve afectado por varios factores, entre los que figuran el tipo de embrión, la calidad del endosperma sintético, la dureza de la cápsula y la protección contra agentes patógenos. Generalmente, la carencia de embriones de calidad es el factor limitante para la producción de semillas sintéticas. Los mismos deben poder generarse rápidamente, en grandes cantidades, sin fusionarse entre sí ni formar callos. Deben desarrollarse de manera sincronizada y convertirse rápidamente en plantas. Es además altamente deseable que conserven su viabilidad por largo tiempo en condiciones de laboratorio o preservados en refrigeradores comerciales. El endosperma sintético tiene que proteger y nutrir al embrión hasta que germine y pueda crecer autotróficamente. En este punto es preciso recordar que si bien los embriones somáticos son muy similares a los embriones cigóticos, carecen de las sustancias de reserva necesarias para su conversión en plántulas. El endosperma sintético generalmente está compuesto de los mismos medios de cultivo que se usan para inducir la germinación in vitro de los embriones. Estos medios contienen macro y micronutrientes, vitaminas, sacarosa y sustancias reguladoras de crecimiento. La composición de este endosperma lo hace susceptible al ataque de patógenos, por lo que también se incorporan compuestos de acción fungicida y bactericida. Es común el agregado de 1-5 mg/ L de benomyl y de algunos antibióticos como cefotaxina o ampicilina. La dureza de la cápsula puede afectar, por acción mecánica o por dificultar la respiración, la conversión de los embriones en plantas. En general, la dureza debe ser del orden de 0,2 y 2 Kg/cm 2 de presión, y puede obtenerse mediante una adecuada manipulación de la concentración de alginato y de los tiempos de la reacción de acomplejamiento. 5 Ventajas del empleo de semillas sintéticas La mayoría de las plantas de interés económico son propagadas mediante semillas verdaderas. Estas constituyen excelentes propágulos que pueden ser producidos a bajo costo, en forma rápida, y pueden ser sembrados mecánicamente. Además, la mayoría de ellas pueden ser conservadas fácilmente por mucho tiempo. Sin embargo, existen muchas plantas que no se propagan median- 176 REY, Hebe Y.; MROGINSKI, Luis A.

161 te semillas verdaderas y lo hacen a través de sus partes vegetativas, como es el caso, entre otras, de la caña de azúcar, mandioca, ajo, frutilla, papa, batata, varios árboles y plantas ornamentales. Otras especies tienen semillas de baja calidad (muchas coníferas) o presentan dificultades para la germinación (como, por ejemplo, la yerba mate). En otras un alto grado de heterocigosis hace que las poblaciones derivadas de semillas sean muy heterogéneas (té, yerba mate, paraíso), lo que hace muy recomendable su propagación asexual. También es el caso de muchos híbridos y de plantas que no producen semillas verdaderas o bien el caso de ciertas plantas transgénicas. En todas estas situaciones el uso de semillas sintéticas resultaría ventajoso. Las plantas podrán ser clonadas y sembradas en el campo utilizando sembradoras similares a las que hoy se emplean con las semillas verdaderas. Adicionalmente las semillas sintéticas podrán actuar como transportadoras de reguladores de crecimiento, microorganismos y pesticidas que se quieran incorporar durante la siembra. De esta manera, los costos de los transplantes se verán reducidos, las poblaciones serán genéticamente uniformes y podrán ser comercializados ciertos híbridos resultantes de costosas manipulaciones manuales. En la Tabla 2 se señalan algunas especies para las cuales sería necesario contar con un sistema de semilla sintética. La falta de una difusión masiva de esta tecnología en la actualidad obedece a razones técnicas, ya que en muchas especies aún no se ha logrado inducir eficientes sistemas que permitan la generación de grandes cantidades de embriones somáticos de calidad, y económicas. Los cálculos realizados en rela- Tabla 2. Necesidad de contar con semillas sintéticas en algunas plantas leñosas subtropicales de interés para la Argentina y estado actual de su desarrollo. Especie Interés en contar con semillas sintéticas Estado de desarrollo Estado de de la inducción de la desarrollo de la Embriogénesis producción de la Somática semilla sintética Aguaí XXX X --- (Chrysophyllum gonocarpum ) Araucarias XXX XX --- (Araucaria spp.) Algarrobo XXX (Prosopis spp) Cítricos * XX XXX X (Citrus spp.) Eucaliptos* XXX X --- (Eucalyptus spp.) Mango XX X --- (Mangifera indica) Paraíso XXX XX X (Melia azedarach) Pinos* (Pinus spp.) XXX XX X Quebracho XX (Schinopsis balansae) Té XXX XXX --- (Camellia sinensis) Toona (Toona XXX ciliata) Yerba mate (Ilex paraguariensis) XXX X --- Ref.: * depende de la especie --- Nulo, X escaso, XX regular, XXX elevado Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 177

162 ción a alfalfa indican que su costo de producción supera en casi cien veces el costo de producción de la semilla verdadera. Sin embargo, este costo es casi similar o incluso inferior al de la producción de semillas verdaderas para algunos híbridos de alcaucil, geranio y gerbera. 6 Conclusiones Si bien el uso de semilla sintética en la agricultura es aún incipiente y sólo es utilizada en ciertos grupos de árboles forestales, las perspectivas para esta tecnología son altamente promisorias, pudiendo llegar a convertirse, en un futuro cercano, en el principal método de propagación de plantas. Si bien los progresos logrados en los últimos 20 años han sido notables, existe aún la necesidad de realizar estudios básicos sobre embriogénesis somática para luego abordar los aspectos «industriales» de la producción a gran escala de semillas sintéticas, tanto de angiospermas como de gimnospermas. En la Argentina, la mayor demanda proviene del sector de productores de plantas leñosas, donde el desarrollo de esta tecnología es aún incipiente (Tabla 2). Existe, sin embargo, la capacidad técnica y humana para encarar este desafío. 7 Lecturas recomendadas CANTLIFFE, D. J Bioreactor technology in plant cloning, Proceedings of the Fourth International Symposium on In Vitro Culture and Horticultural Breeding. Acta Horticulturae. 560: CARLSON, W. C.; HARTLE J. E Manufactured seeds of woody plants. In S.M. Jain, P K.Gupta,R.J. Newton (eds.) Somatic embryogenesis in woody plants. London, Kluwer Acad. Press. 1 : GRAY, D. J. P., A «Somatic embryogenesis and development of synthetic seed technology.» Critical Reviews in Plant Sciences 10: GUERRA, M. P. T., A.C.; TEIXEIRA, J.B Embriogenese somática e sementes sintéticas. In: A.C.Torres, L.S.Caldas, J.A.Buso (eds.) Cultura de Tecidos e Transformacao Genética de Plantas. CBAB. Embrapa. Brasilia. 2: IBARAKI, Y. K., K Automation of somatic embryo production. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 65: JIMÉNEZ GONZÁLEZ,E.A.; MENDOZA,E.Q In :Pérez Ponce,J.N. (ed.) Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto de Biología de Plantas.Santa Clara. Cuba. pp McKERSIE,B.D.; BROWN D.C.W Somatic embryogenesis and artificial seeds in forage legumes. Seed Science Research 6: MROGINSKI, L. A.; REY, H.; OLMOS, S.; GONZALEZ, V Semillas artificiales para la propagacion de plantas. Paradigmas 1: 5-9. TIMMIS,R Bioprocessing for tree production in the forest industry: Conifer somatic embryogenesis. Biotechnol. Progress 14: REY, Hebe Y.; MROGINSKI, Luis A.

163 V.-Capítulo 3 Conservación de germoplasma in vitro Scocchi, Adriana; Rey, Hebe 1 Introducción Desde sus inicios, el hombre ha dependido básicamente de los vegetales como fuente de energía. Al aumentar rápidamente el tamaño de la población, se han ido implementando técnicas de explotación, en particular agropecuarias, que han contribuido a la destrucción de las poblaciones vegetales pioneras, que fueron el producto de siglos de evolución. Por otro lado, las técnicas modernas de producción de variedades mejoradas, altamente homogéneas, han provocado la reducción de la variabilidad genética de las especies cultivadas, ocasionando una verdadera «erosión genética». Es en este contexto en que se recurre a las fuentes genéticas originales de variabilidad, las que se deben preservar adecuadamente. Cuando se habla de preservación de germoplasma hay que subrayar que el objetivo es conservar, con la mayor integridad posible, la variabilidad genética de las poblaciones seleccionadas. 2 Métodos empleados para la conservación de germoplasma La estrategia a seguir para la conservación de germoplasma depende de la naturaleza del material vegetal, y está definida por la duración de su ciclo de vida, el modo de reproducción y el tamaño de sus individuos. De acuerdo con estas características se han intentado diversas alternativas de conservación, que van desde el tradicional banco de semillas hasta el mantenimiento de áreas de reserva. Sin embargo, en muchos casos el mantenimiento no es posible y en otros resulta sumamente costoso, siendo muy elevados los riesgos de pérdidas por manipulación o desastres naturales. Por ello se ha buscado implantar nuevas estrategias para conservar los recursos genéticos en una forma más eficiente. Los métodos de conservación de germoplasma pueden dividirse en métodos in situ y métodos ex situ. Los primeros se basan en la conservación de las plantas en sus hábitat naturales e incluyen la conservación en parques nacionales y en reservas ecológicas, lo cual requiere de un considerable espacio físico e implica altos costos, asociados a la necesidad de mano de obra especializada, control permanente de enfermedades y malezas, a la par que las plantas están expuestas a las inclemencias del clima y de los incendios. Por otra parte, los métodos de conservación ex situ se basan en el mantenimiento del material biológico en bancos de semillas, bancos de cultivo in vitro, colecciones de plantas (en campo, viveros o jardines botánicos). En general, los bancos de semillas constituyen uno de los métodos más convenientes para la conservación de germoplasma ex situ, porque permiten almacenar una gran variabilidad genética en forma económica y práctica. Para la conservación de semillas el International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI) recomienda su desecación hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18ºC). Este protocolo de conservación es, en general, el más recomendado para la mayoría de las especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la desecación sin que ello implique pérdida de viabilidad. A las semillas que presentan estas características se las denominan «semillas ortodoxas», como por ejemplo las semillas de arroz, trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo, en ciertos casos este método de conservación no es aplicable porque la especie se propaga, en la práctica, vegetativamente, (como la mandioca, papa, caña de azúcar, plátanos y bananos), o bien porque sus semillas pierden rápidamente la viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecación. A estas semillas se las denominan «semillas recalcitrantes». Las semillas de numerosas especies que viven en zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta categoría, como por ejemplo las de coco, cacao, frutales tropicales perennes y diversas palmeras. Otro método de conservación de germoplasma ex situ, es mediante el cultivo in vitro de tejidos. El descubrimiento de la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 179

164 totipotencialidad de las células vegetales y la posibilidad de desarrollar plantas normales y completas a partir de diferentes explantes ha permitido pensar en el establecimiento de bancos de germoplasma utilizando el cultivo de tejidos vegetales. Algunos de los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma fueron realizados en mandioca en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y en papa en el Centro Internacional de la Papa (CIP). En 1980 se reconoció el potencial de los métodos del cultivo in vitro para la conservación de especies de plantas consideradas «difíciles» (este término se refiere a las especies propagadas vegetativamente en forma obligada o que tienen semillas recalcitrantes). En estos casos, la conservación de los genotipos se realiza mediante el mantenimiento de plantas vivas o mediante el cultivo in vitro de ápices caulinares o de nudos. El mantenimiento de los recursos fitogenéticos mediante los métodos de cultivo in vitro se logra generando cambios en el ambiente de cultivo que permiten desacelerar el crecimiento de las células y de los tejidos. El objetivo es aumentar al máximo el período de transferencia del cultivo. Es esta necesidad la que estimuló algunos de los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma de diversas especies. Este método cubre un amplio espectro de técnicas que implican el cultivo, bajo condiciones de asepsia, de órganos o fragmentos de órganos (meristemas, semillas, embriones somáticos, embriones cigóticos, hojas, tallos, raíces, yemas, polen, anteras, callos o protoplastos), en un medio de cultivo artificial definido, bajo condiciones ambientales controladas. Esta técnica ha sido utilizada para mantener colecciones en crecimiento mínimo, para lo cual se requiere: reducir la temperatura, reducir las condiciones de luminosidad, modificar el medio de cultivo, adicionar al mismo inhibidores osmóticos o retardantes del crecimiento, deshidratadores de tejido o modificar la fase gaseosa del recipiente de cultivo. La modificación de uno o más de estos factores es usada para la conservación de numerosas especies, como por ejemplo para la conservación de microestacas de Manihot esculenta; de vástagos de especies de Fragaria, Ipomoea, Rubus, Musa, Saccharum, Zingiber, Ananas, Coffea, Dioscorea y de microtubérculos de Solanum. Estas técnicas de almacenamiento se realizan a mediano plazo, es decir, se basan en reducir el metabolismo celular y con ello reducir el crecimiento y el número de subcultivos durante meses hasta un año, sin que ello afecte la viabilidad de los cultivos. Desde hace varios años en el Laboratorio de Cultivo in vitro del Instituto de Botánica del Nordeste (IBONE), en la Facultad de Ciencias Agrarias de la UNNE, se llevan a cabo experimentos referidos a la conservación de germoplasma de paraíso (Melia azedarach). Utilizando como explantes meristemas de clones selectos de paraíso mantenidos durante 12 meses a tasas de crecimiento reducidas (medios de cultivo subóptimos o empobrecidos y en condiciones de oscuridad) se logró mantener con éxito y regenerar plantas de paraíso que actualmente se encuentran en la etapa de evaluación a campo (Fig. 1). En el IBONE también se realizan experimentos tendientes a optimizar las técnicas de conservación in vitro a largo plazo, que consisten en el almacenamiento a la temperatura del nitrógeno líquido (-196ºC) crioconservación, con lo cual se consigue la supresión del crecimiento hasta llegar a un estado de «suspensión animada». En el mencionado Instituto se ha logrado la crioconservación de meristemas de paraíso mediante la técnica de encapsulación-deshidratación (Fig. 1). El uso de la crioconservación para el almacenamiento de germoplasma ofrecen varias ventajas en relación con las técnicas tradicionales, pues permiten la conservación a largo plazo (años), con bajos costos de mantenimiento, fácil manipulación de las muestras y no dependen del suministro eléctrico. Luego del informe, en 1968, acerca de la crioconservación de células de lino y de los resultados satisfactorios que se obtuvieron con la crioconservación de meristemas de frutilla en el Instituto de Biotecnología de Plantas en Saskatoon, Canadá, en 1985 se iniciaron algunas investigaciones colaborativas entre el CIAT y el IPGRI para desarrollar esta técnica para meristemas de mandioca. A partir de estos estudios numerosos trabajos han dado muestras de la importancia de esta técnica, de sus usos y aplicaciones. 180 SCOCCHI, Adriana; REY, Hebe

165 Figura 1: Estrategias para la conservación de germoplasma de paraíso (Melia azedarach L.), desarrolladas en el Laboratorio de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales. IBONE. Facultad de Ciencias Agrarias. UNNE. La crioconservación consta de seis pasos: Selección del material a crioconservar Cuando se realiza la selección del material a crioconservar se debe tener la absoluta seguridad de que a partir del mismo se obtendrán plantas completas. El explante seleccionado dependerá del objetivo de conservación y está estrechamente relacionado con el tipo de propagación de la especie. Por ejemplo, en el caso de la mandioca, especie que se propaga principalmente por vía asexual (mediante estacas), en el CIAT se conserva su germoplasma in vitro mediante el cultivo de microestacas y también de meristemas, con lo cual paralelamente a la conservación se consigue el saneamiento de los cultivares. Actualmente se están realizando estudios tendientes a desarrollar protocolos para la crio-conservación de meristemas. Deshidratación La deshidratación del explante es un paso crucial para el éxito de la crio-conservación, ya que es necesario eliminar toda el agua libre presente en el tejido vegetal, minimizando así posibles daños debidos a congelación. La deshidratación del tejido puede realizarse en una cámara a 0ºC o en cámaras herméticamente cerradas utilizando sustancias higroscópicas como silica gel o glicerol (5-20%), o sometiendo al explante a una corriente de aire en un flujo laminar de aire estéril. Aclimatación Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 181

166 La aclimatación puede realizarse en forma rápida o lenta. La aclimatación rápida consiste en colocar el explante directamente en nitrógeno líquido, con o sin la adición exógena de crioprotectores. La aclimatación lenta se realiza bajando gradualmente la temperatura (0.1-3ºC/min.). Este punto debe ser manejado cuidadosamente, pues una deshidratación excesiva de las células puede exponerlas a una alta concentración interna de solutos. Por esta razón, el material generalmente se congela lentamente, a una velocidad adecuada, hasta alcanzar una temperatura próxima a los -40 ºC. Luego se lleva directamente a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 ºC). A fin de preparar (aclimatar) el explante para enfrentar las bajas temperaturas a las que será sometido, se utilizan sustancias crioprotectoras como azúcares (sacarosa, glucosa), alcoholes (glicerol, etileglicol, manitol y sorbitol), dimetilsulfóxido (DMSO) y polivinilpirrolidona (PVP). También pueden utilizarse soluciones de vitrificación, que son una combinación de varios crioprotectores tales como el PVS2, que está compuesto por 30% de glicerol, 15% de etilenglicol, 15% de DMSO y 0.04M de sacarosa. Tanto los crioprotectores como las soluciones de vitrificación actúan fundamentalmente como agentes anticongelantes, aumentando la viscosidad del tejido vegetal y reduciendo la permeabilidad de las células. Almacenamiento De acuerdo al material vegetal que se utilice, se presentan dos grandes sistemas: - Sistemas secos: comprenden todos aquellos tejidos vegetales endógenamente resistentes y tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratación. - Sistemas hidratados: son todos aquellos tejidos vegetales no tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratación, por lo cual se requiere de una protección exógena. Esta protección puede lograrse a través del uso de crioprotectores o bien por la utilización de soluciones de vitrificación. Los sistemas secos, por tratarse de tejidos más resistentes, necesitan de una menor preparación para el almacenamiento y comprenden aquellas especies que habitan zonas frías y/o templadas. En cambio, los sistemas hidratados son más susceptibles a las bajas temperaturas y están representados por todas aquellas especies que habitan zonas tropicales y subtropicales, las cuales no están adaptadas para soportar temperaturas inferiores a 0ºC. Por este motivo estos tejidos deben ser protegidos exógenamente mediante el uso de crioprotectores. Descongelamiento y rehidratación Cuando se desea recuperar el explante mantenido en nitrógeno líquido se puede realizar un descongelamiento rápido en baño de agua (generalmente 1-2 min. a ºC) o en forma lenta, sometiendo al explante a la temperatura del laboratorio o a una corriente de aire en el flujo laminar de aire estéril. Tests de viabilidad Los tests de viabilidad nos permiten comprobar la/s zona/s del tejido que ha/n muerto y cuál/es ha/n sobrevivido al frío. La evaluación de la viabilidad puede llevarse a cabo en forma visual, realizando el re-cultivo y determinando la capacidad de regeneración, utilizando TTC (cloruro de 2,3,5 Trifenil- Tetrazolio) que colorea el tejido que ha sobrevivido a la crioconservación o midiendo la conductividad eléctrica, que permite estimar el daño producido en las membranas celulares. Técnicas de almacenamiento del material a preservar En la última década han surgido numerosas técnicas que combinan el uso de crioprotectores y de soluciones de vitrificación con técnicas de deshidratación y encapsulación, las cuales básicamente pueden resumirse en técnicas de: - Encapsulación-deshidratación - Vitrificación - Encapsulación-vitrificación - Desecación - Precultivo - Precultivo-desecación - Gotita congelada. En la Tabla 1 se detallan las especies y 182 SCOCCHI, Adriana; REY, Hebe

167 Tabla 1: Utilización de técnicas de crioconservación en diferentes explantes de algunas especies de interés agronómico. Técnica Empleada Encapsulación- Deshidratación Vitrificación Encapsulación- Vitrificación Desecación Precultivo Precultivo- Desecación Gotita Congelada Explante y Especie Suspensiones celulares de Catharanthus roseus. Meristemas de 125 variedades de Solanum spp. Meristemas de Dioscorea alata, Malus domestica, Pyrus spp. y Morus spp. Apices de Pyrus spp., Malus spp., Saccharum spp. ysolanum tuberosum Apices caulinares de Camellia japonica, Coffea racemosa x Coffea sessiliflora, Citrus spp, ydesaccharum spp. Embriones somáticos de Elaeis guineensis. Células nucelares de Citrus sinensis. Líneas celulares embriogénicas de Pinus silvestris. Suspensiones celulares y callos embriogénicos de Gossypium hirsutum. Meristemas de Pyrus communis, Malus spp ydepyrus spp., Ipomoea batata, Manihot esculenta (15 genotipos), Prunus spp.,ydesolanum spp. Meristemas, polen y anteras de Arachis hypogaea. Ápices de Ananas comosus, Colocasia esculenta. Yemas adventicias de Guazuma crinita Mart., Populus alba. Semillas de Bletilla striata Semillas y protocormos de Dendrobium candidum. Suspensiones celulares embriogénicas de Oryza sativa. Embriones somáticos de Abies cephalonica Semillas, embriones cigóticos, polen, anteras y suspensiones celulares de Triticum spp. Meristemas, segmentos nodales, segmentos de raíz y yemas adventicias de Guazuma crinita, ydefragaria x ananassa. Apices de Dyanthus cariophyllus, Armoracia rusticana, Lilium spp. ydewasabia japonica Meristemas de Morus spp. Embriones somáticos de Cucumis melo, ydeelaeis guineensis Embriones somáticos y ejes embriogénicos de Camellia japonica. Ejes embriogénicos de Junglans cinerea. Ejes embriogénicos y semillas de Gossypium hirsutum. Semillas de Pinus silvestris, ydeapium graveolens. Meristemas de Musa spp. Embriones cigóticos de Triticum aestivum, Phaseolus vulgaris y Oryza spp. Polen y anteras de Oryza spp Líneas celulares y callos de Oryza sativa. Embriones somáticos de Phoenix dactylifera, Coffea spp., Pyrus spp., Cucurbita spp., Cocos nucifera, ydeelaeis guineensis (aplicada como rutina a 80 clones). Apices de 150 variedades de Solanum tuberosum. explantes en los cuales cada una de estas técnicas ha sido empleada con resultados satisfactorios. -Encapsulación-Deshidratación La técnica de encapsulación-deshidratación se basa en la metodología aplicada a las semillas sintéticas, en la cual un explante es recubierto por una matriz de alginato de sodio y polimerizado en una solución de cloruro de calcio, formando un gel de alginato de calcio alrededor del explante. Una vez encapsulados, los explantes son pretratados, generalmente con sacarosa (desde 0.3 has- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 183

168 ta 1.5M), que actúa como crioprotector. En especies tolerantes al frío la exposición de las plantas madres a bajas temperaturas durante varias semanas, previo a la criopreservación, incrementa la supervivencia. La deshidratación puede llevarse a cabo sometiendo las cápsulas de alginato (conteniendo a los explantes) a una corriente de aire en el flujo laminar o exponiéndolas en cámaras herméticamente cerradas con silica gel. Las cápsulas, así deshidratadas, pueden sumergirse directamente en nitrógeno líquido o bien pueden ser llevadas a un descenso lento de temperatura. - Vitrificación Esta técnica involucra el pretratamiento de las muestras con soluciones de vitrificación, como el PVS2, ya mencionado, o bien otra, compuesta por 40% de etilenglicol, 15% de sorbitol y 6% de albúmina sérica bovina. Luego de la exposición a las soluciones de vitrificación (generalmente a una temperatura de 0ºC, a fin de disminuir los riesgos de fitotoxicidad), las muestras pueden ser sumergidas directamente en nitrógeno líquido o a través de un descenso lento de la temperatura. Las soluciones crioprotectoras recomendadas en los protocolos de vitrificación son generalmente tóxicas para las células. El tiempo de exposición a la solución debe estar relacionado con el tamaño del explante y la misma debe ser removida rápidamente luego del descongelado. - Encapsulación-Vitrificación La técnica de encapsulación-vitrificación es una combinación de las técnicas de encapsulación-deshidratación y vitrificación. Las muestras son encapsuladas en alginato de calcio y sometidas a vitrificación durante el enfriamiento. La supervivencia del material vegetal cuando se utiliza esta técnica es un 30% mejor que cuando se usa la de encapsulación-deshidratación. Esto puede explicarse debido a que las cápsulas de alginato de calcio reducen la toxicidad de las soluciones de vitrificación. - Desecación La técnica de desecación es un proceso muy simple que sólo requiere la deshidratación del material vegetal, la cual es crucial para el éxito de la crioconservación. Esta técnica consiste en someter al explante a una corriente de aire en un flujo laminar o en cámaras herméticamente cerradas, que contienen silica gel, luego de lo cual se realiza un enfriado rápido sumergiendo el material directamente en nitrógeno líquido. - Precultivo La técnica del precultivo involucra la incorporación de crioprotectores (durante distintos tiempos que dependen del explante) antes del congelamiento. Como ejemplos pueden citarse la adición de altas dosis de sacarosa para la crioconservación de meristemas de Musa spp.; la utilización de polietilenglicol (PEG) y DMSO en el caso de embriones cigóticos de Triticum aestivum y Phaseolus vulgaris; la utilización de sacarosa y DMSO o glicerol en semillas, embriones cigóticos, polen y anteras de Oryza spp., y la utilización de ácido abscísico para la conservación de líneas celulares y de callos de Oryza sativa. - Precultivo-Desecación Esta técnica es una combinación de dos de las técnicas descriptas anteriormente. Las muestras son tratadas con crioprotectores, parcialmente desecadas y luego sometidas a enfriamiento rápido o lento. Generalmente en el precultivo se emplean azúcares como sacarosa o glucosa. La duración del tratamiento es variable, desde horas, como en el caso de la conservación de embriones maduros de Cocos nucifera, donde el cultivo dura hs., hasta días, como en el caso de embriones somáticos de Elaeis guineensis, que dura 7 días. - Gotita congelada Esta técnica ha sido aplicada con éxito en ápices de Solanum tuberosum. Consiste en pretratar el material con DMSO por 2-3 hs. en medio líquido y formar una microgota (2.5 ml), la cual se suspende sobre papel de aluminio y luego se sumerge directamente en nitrógeno líquido. Este procedimiento es una adaptación de la técnica clásica desarrollada para meristemas de mandioca. Esta técnica ha sido satisfactoriamente aplicada en 150 variedades de Solanum tuberosum, con un porcentaje de supervivencia del 40%. 184 SCOCCHI, Adriana; REY, Hebe

169 3 Conclusiones Los recursos fitogenéticos constituyen un reservorio de información genética imprescindible para la solución de muchos de los problemas a los que se enfrenta la agricultura. Los métodos para asegurar su conservación son diversos y cada uno de ellos posee sus ventajas e inconvenientes. Por ello, se considera que el conjunto de técnicas de conservación in situ y ex situ son métodos complementarios, no excluyentes, para lograr el objetivo común de preservar los recursos fitogenéticos, como parte esencial de una estrategia global para la conservación de la biodiversidad. En la última década se han producido avances significativos en el desarrollo de técnicas in vitro de conservación. La disponibilidad de bancos de germoplasma in vitro, tanto en condiciones de crecimiento lento como la conservación a temperaturas ultrabajas (crioconservación), han contribuido a dicho avance. Las ténicas de crecimiento lento son utilizadas como rutina en centros internacionales tales como el CIAT (Cali, Colombia), donde se aplican a la conservación de germoplasma de mandioca y para la conservación de germoplasma de papa en el CIP (Centro Internacional de la Papa, Perú). Las técnicas de crioconservación ofrecen una alternativa muy valiosa cuando se piensa en conservar los recursos fitogenéticos por tiempo ilimitado (años), si bien hasta el momento sólo se aplica como rutina para la conservación de líneas celulares en laboratorios de investigación y para la conservación de algunos genotipos pertenecientes a los géneros Rubus spp., Pyrus spp., Solamun spp. y Elaeis guineensis. 4 Lecturas recomendadas ENGELMANN, F Status report on the development and application of in vitro techniques for the conservation and use of plant genetic resources. Engelmann, F. (ed.) IPGRI :1-63. ENGELMANN, F. and H. TAKAGI Cryopreservation of tropical plant germoplasm. Current research progress and application. Engelmann, F. and H. Takagi (eds.) JIRCAS-IPGRI pp 496. MROGINSKI, L.A., W.M. ROCA, K.K. KARTHA Criopreservación del Germoplasma. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. Roca W. M. y L. A. Mroginski (eds.) CIAT (32) : ROCA, W.M., D.I. ARIAS y R. CHÁVEZ Métodos de conservación in vitro de germoplasma. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. Roca, W.M. y L.A. Mroginski (eds.) CIAT (31) : Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 185

170 PARTE VI Métodos de análisis de la variabilidad Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 187

171 188 OLMOS, Sofía y DI RENZO, Miguel

172 VI.-Capítulo 1 Consideraciones estadísticas y biológicas para estimar variabilidad genética Olmos, Sofía; Di Renzo, Miguel 1 La variación biológica La variabilidad genética es un hecho universal en las poblaciones reproductivas y una condición preliminar necesaria para el cambio evolutivo y para la respuesta al mejoramiento genético mediante selección o hibridación. Por otra parte son conocidos los peligros que implica la uniformidad y la falta de diversidad en las especies cultivadas y en los animales domésticos, como consecuencia de la erosión genética. La variación que presentan los individuos de una población puede ser discontinua o continua. Los caracteres cualitativos de variación discontinua, como los marcadores moleculares, permiten clasificar a los individuos sin ambigüedades, ya que estos caracteres están regidos por uno o por pocos genes y el ambiente no tiene efecto en su manifestación fenotípica. En cambio, los caracteres cuantitativos, representados por la mayoría de los caracteres de interés agronómico, presentan variación continua y los fenotipos, que están determinados por poligenes y por efectos ambientales, son difíciles de clasificar en categorías discretas. Para su análisis deben emplearse métodos biométricos, que no miden el efecto de genes individuales o de segmentos cromosómicos específicos, sino de todo el genoma. Durante los últimos años ha surgido un consenso entre los mejoradores y genetistas moleculares sobre la conveniencia del uso de marcadores moleculares para asistir a la selección de caracteres cuantitativos (MAS, Marker Assisted Selection). La biotecnología ha colaborado mediante la construcción de mapas genéticos saturados, esto es, con innumerables marcadores moleculares a lo largo de los cromosomas, que permiten ubicar regiones de actividad cuantitativa (QTL, Quantitative Trait Loci). De esta manera, un carácter de variación contínua puede ser manejado como si se tratara de un carácter de herencia mendeliana mediante la introgresión de un fragmento de cromosoma conteniendo un QTL por retrocruzamientos sucesivos en las variedades comerciales. Los QTL representan un nuevo sistema de enfocar el estudio básico y el manejo práctico de los sistemas poligénicos y de la genética cuantitativa. 2 Experimento científico La ciencia, que tiene como objetivo la explicación y la predicción de los hechos, cuenta con el método científico como un procedimiento que contempla un proceso en flujo desde los hechos observados hasta la proposición de hipótesis explicatorias. Un requisito fundamental en toda ciencia fáctica es la contrastación de las hipótesis planteadas, poniendo a prueba las mismas mediante una confrontación con la experiencia. El diseño experimental crea artificialmente las condiciones para la contrastación de la hipótesis y brinda la metodología estadística correspondiente para el análisis de los datos. El experimento científico, que como queda dicho es un ensayo destinado a probar la validez de una hipótesis, se basa en la reproducción de ciertos fenómenos bajo condiciones controladas con el objeto de medir el efecto que produce la modificación de uno o varios factores en estudio (tratamientos) sobre la variable dependiente. El ensayo, cuidadosamente diseñado, deberá ser lo más simple posible, evitando los errores tendenciosos y sistemáticos (biass=sesgo) de manera tal que los datos recavados provean conclusiones con un amplio rango de validez. Por otra parte, para magnificar el efecto de los tratamientos y disminuir el error experimental, se procura minimizar el efecto de otros factores no controlados que ejercen influencia en las observaciones. Esto se logra utilizando materiales y condiciones experimentales lo más homogéneas posibles. De esta manera, las variaciones observadas se deberán casi exclusivamente a los tratamientos. Para conocer el efecto de los factores controlados y el de los factores no controlados (error experimental) sobre el material Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 189

173 experimental es necesario formular claramente una hipótesis, utilizar un diseño experimental apropiado y analizar e interpretar los resultados obtenidos. Por ejemplo, la aplicación de distintos tratamientos (ej.: distintas dosis de fertilizante = causa), producen variaciones sobre una característica de interés (ej. rendimiento = efecto): - Variable independiente: es la causa que afecta los resultados del experimento y está representada por los distintos niveles del factor cuyo efecto se quiere medir (tratamientos) o que se quiere controlar (bloques). - Variable dependiente: variable respuesta o simplemente «variable» es el rasgo o carácter de interés cuyas mediciones constituyen los datos u observaciones del experimento. Ej. rendimiento (kg./ha), diámetro de colonia (mm); (variables continuas), tiempo a panojamiento (días), tamaño de camada, número de colonias (número), grado de respuesta a un patógeno (tolerante, intermedio, susceptible), (variables discretas). La variación de estos datos permite cuantificar el efecto del factor al que está sometido el material. 3 Hipótesis estadística Terminología - Factor: es la causa cuyo efecto se quiere medir (ej. fertilizante, competencia, medio de cultivo) - Nivel: es cada una de las categorías o alternativas del factor en estudio (ej. dosis de un fertilizante, densidades de siembra, ph de los medios de cultivo). - Tratamiento: Es cada nivel del factor en estudio. Si se estudia el factor fertilizante, cada dosis (o nivel) es un tratamiento distinto. Si se prueba el efecto de concentraciones crecientes de un fertilizante los tratamientos tendrían un orden natural (discreto ordinal); pero si se prueban distintas combinaciones de fertilizantes (NPK), no habría un orden entre los tratamientos (discreto categórica). Cuando se estudian dos (o más) factores simultáneamente, los distintos tratamientos resultan de la combinación de cada nivel de un factor con cada nivel del otro factor. Por ejemplo, si se estudia el efecto de fertilizante y competencia, cada tratamiento resulta de la combinación de una dosis de fertilizante y una densidad de siembra determinada. Como se indicara previamente, el experimento científico es un ensayo destinado a probar la validez de una hipótesis. Las hipótesis estadísticas plantean supuestos referentes a algún parámetro poblacional. Por lo general se utiliza la hipótesis nula (Ho), que se refiere a la igualdad entre los parámetros probados. Frente a la Ho se plantea una hipótesis alternativa (Ha). Para determinar si un tratamiento tuvo algún efecto, se considera a la Ho como la ausencia de efectos, lo que equivale probar la igualdad entre las medias de los tratamientos. La Ha plantea que al menos una de las medias difiere significativamente del resto, o sea que al menos uno de los niveles del factor probado tiene efecto sobre la variable de interés. Las hipótesis estadísticas también prueban otras características poblacionales, como por ejemplo la igualdad entre varianzas o entre coeficientes de regresión. El ensayo y las pruebas de significancia permiten calcular la probabilidad a favor de la hipótesis nula. Es decir que P es la probabilidad que la Ho sea verdadera. Si la probabilidad calculada es igual o mayor que un nivel de significancia preestablecido (de 0,05 por ejemplo), la Ho no se rechaza y se infiere que no hay diferencias significativas entre las medias de los tratamientos. Se concluye que los tratamientos no tienen efecto significati- 190 OLMOS, Sofía y DI RENZO, Miguel

174 vo en la variabilidad del carácter estudiado y las diferencias observadas no son mayores que las que se producirían por azar. En cambio si la probabilidad calculada es pequeña (P 0,05) se rechaza la Ho y se infiere, de acuerdo con la Ha, que hay diferencias significativas entre los tratamientos. Si P 0,01 se dice que las diferencias son altamente significativas. El nivel de significancia, generalmente designado por α, representa hasta qué punto, en términos de probabilidad, estamos dispuestos a aceptar un error de tipo I, es decir, rechazar una Ho que sea verdadera. Esto conlleva a que aceptemos una Ho como verdadera con una probabilidad 1-α. Si se fija α = 0,05 estamos dispuestos a aceptar el error tipo I aproximadamente una de cada 20 veces. 4 Análisis univariado Los análisis univariados emplean una variable dependiente, mientras que los análisis multivariados comparan muestras sobre la base de dos o más variables que están relacionadas. La significancia estadística de una diferencia entre dos medias puede verificarse mediante una prueba t o mediante una prueba F. Ambas son equivalentes, t 2 = F. La prueba F, que es un cociente de varianzas, es una generalización de la prueba t, especialmente útil cuando se comparan más de dos tratamientos. En el análisis de la varianza (ANOVA), por ejemplo, se utiliza la prueba F para verificar la igualdad de medias. Prueba F Una prueba F consiste en un cociente entre dos varianzas: F = s 2 entre / s2 dentro Para realizar la prueba F resulta necesario descomponer la varianza total (s 2 ) en dos total componentes: s 2 y s 2 entre dentro El análisis de la varianza es un procedimiento aritmético que permite la descomposición de la varianza total en varianzas parciales. El cociente entre las varianzas permite obtener un valor de F calculado (Fc), el cual se compara con un F de tabla (Ft) para un determinado nivel de significación (por ejemplo α = 0,05) y los grados de libertad de los tratamientos y del error. Los programas de computación calculan directamente el P (la probabilidad) del test. Varianza total Se puede considerar a la variación total como la resultante de dos fuentes de variación: una fuente de variación debida a las diferencias entre grupos o tratamientos, señaladas por los promedios de éstos y otra debida a la diferencia dentro de los tratamientos, que se calcula sobre la base de las diferencias entre las observaciones de cada tratamiento. Varianza entre tratamientos Para aislar la variación entre los grupos necesitamos suprimir la variación dentro de los tratamientos. Podemos obtener este resultado haciendo a todos los individuos de un mismo grupo iguales entre sí e iguales a la media del grupo. Mediante esta operación, la variación entre los grupos no se modifica mientras que toda la variación dentro del grupo queda anulada. Varianza dentro de tratamientos Para obtener la varianza dentro de los grupos debemos tener en cuenta solamente la variación entre las observaciones de un mismo tratamiento. La variación dentro de un tratamiento se debe a las desviaciones que presentan los valores individuales en ese grupo en relación con la media de ese grupo. 5 Análisis multivariado El análisis multivariado brinda los métodos estadísticos para el análisis conjunto de dos o más variables que pueden estar interrelacionadas. Esta rama de la estadística comprende procedimientos y técnicas para la síntesis, la presentación y el análisis multidimensional de caracteres, tanto cualitativos como cuantitativos, obtenidos a par- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 191

175 tir de un número de individuos, una OTU «Operational Taxonomic Unit», objetos o tratamientos. Debido a que las variables se consideran en forma simultánea, estas técnicas permiten realizar interpretaciones más complejas a las que surgen mediante la utilización de métodos univariados. El análisis multivariado colabora en la comprensión más adecuada y completa de las ciencias biológicas; por tal motivo, en este capítulo se brindará un panorama simplificado y algunos comentarios sobre las técnicas más usuales con la finalidad de poder discernir y elegir la metodología más apropiada para analizar la información que se disponga. Hay algunas razones que justifican el análisis conjunto de diferentes variables en lugar de analizar cada variable separadamente por métodos univariados. Por ejemplo, cuando se trata de probar hipótesis mediante procedimientos de inferencia estadística. En este caso, la aplicación del análisis univariado a cada una de las variables aumenta el error Tipo I mientras que la aplicación del análisis multivariado preserva el valor de α y aumenta en muchos casos el poder del test (1-β). El análisis multivariado utiliza las relaciones (correlaciones) entre las variables o entre los objetos que el método univariado directamente no considera. El análisis multivariado aprovecha estas relaciones para buscar en los datos patrones o estructuras enriqueciendo así la descripción de los mismos. En el capítulo siguiente (VI.2) se desarrollarán en más detalle algunas metodologías multivariadas, seleccionandose aquellas que se utilizan con mucha frecuencia y que no requieren demasiados conocimientos previos. Análisis exploratorio y confirmatorio Con los datos provenientes de observaciones realizadas sobre un hecho en particular es necesario, en primer lugar, realizar un análisis exploratorio. Posteriormente, mediante las inferencias realizadas a partir de este análisis y con la información que se pueda disponer acerca de los mecanismos que originan el proceso biológico, es posible desarrollar un análisis confirmatorio y así plantear un modelo descriptivo de causalidad, el que, a su vez, es confirmado mediante una prueba de bondad de ajuste. En otras palabras, toda investigación llevada a cabo especialmente en áreas nuevas, donde existen pocos antecedentes, comienza con una exploración de los datos con el objeto de reconocer cualquier estructura o patrón no aleatorio que requiera una explicación. En una segunda etapa, es posible que surja la necesidad de formular la pregunta, lo cual es a menudo más interesante que buscar la respuesta subsiguiente, ya que el objetivo primordial es, en primer lugar, generar hipótesis interesantes que promuevan estudios más avanzados. En este caso, los métodos que están diseñados para responder a preguntas específicas no serían necesarios. En cambio resultarían apropiados aquellos métodos que puedan detectar un patrón de comportamiento no previsto en los datos y que, además, abran un amplio campo de posibles explicaciones del proceso. Estas técnicas generalmente se caracterizan por el énfasis puesto en la utilización de representaciones visuales y gráficas y por la carencia de modelos estocásticos, donde la significación estadística de los resultados pierde importancia. La aplicación de los análisis confirmatorios se vuelve más apropiada cuando el investigador tiene en mente hipótesis bien definidas. Es aquí donde son necesarias las pruebas de significación estadística. Sin embargo, no existe una división muy estricta entre técnicas exploratorias y confirmatorias. Por ello sería importante que el investigador tenga una perspectiva flexible y pragmática para analizar sus datos y una experiencia suficiente que le permita elegir la herramienta analítica adecuada. El error más grave que se podría realizar en este sentido sería arribar a conclusiones que expliquen causas a partir de datos exploratorios y descriptivos sin haber realizado ningún tipo de diseño experimental para probarlos. Se plantea como causa probable de esta tendencia generalizada el mal uso semántico entre las terminologías estadísticas y las biológicas. El uso estadístico de términos como «efectos» o «variable independiente» no implica causalidad. Síntesis de métodos: objetivos y limitaciones Los análisis multivariados más comúnmente adoptados, en orden decreciente, son: 192 OLMOS, Sofía y DI RENZO, Miguel

176 análisis de componentes principales, análisis de funciones discriminantes, análisis de agrupamientos o clusters, regresión múltiple, análisis multivariado de la varianza, análisis de correspondencia, coordenadas principales, análisis factorial, correlación canónica, modelos logarítmicos lineales, escalamiento multidimensional, y la regresión logística múltiple. En la Tabla 1 se mencionan los objetivos generales de los métodos de análisis multivariado más utilizados. Los procedimientos enumerados del 1 al 7 utilizan combinaciones lineales de las variables, estos métodos son más eficientes con datos continuos, mientras que aquellos métodos enumerados del 8 al 12, comprenden métodos no lineales y son más apropiados cuando se cuenta con datos binarios. Los métodos lineales son apropiados cuando se quiere interpretar combinaciones óptimas de variables (por ejemplo, componentes principales en ACP (análisis de componentes principales), factores en AF (análisis factorial, funciones discriminantes en AD (análisis discriminante). Quienes aplican métodos lineales, usualmente asumen que los valores de las variables incrementan o decrecen regularmente y que entre ellas no hay interacciones. Estas relaciones no lineales en el MANOVA aparecen en los términos de las interacciones y pueden revelar efectos no lineales importantes en el análisis de datos experimentales. Para examinar con mayor eficiencia datos binarios (presencia/ausencia) y datos en rangos, se pueden usar otros modelos donde las variables se combinan acordes con funciones no lineales. Cuando se utilizan combinaciones de variables hay que considerar que el coeficiente que afecta a una variable representa la contribución de esta variable a la combinación lineal y que este valor depende de las otras variables incluidas en el análisis. No se considera correcto el empleo de estos coeficientes individuales para la interpretación de dichas correlaciones. Antes de aplicar cualquier técnica de análisis resulta imprescindible realizar un examen inicial de los datos. El examen inicial, básicamente, consiste en la evaluación de datos faltantes, identificación de «outliers» (fuera del rango o fuera de tipo) y cuando el análi- Tabla 1. Objetivos y limitaciones de los 12 tipos de análisis multivariados más comúnmente utilizados. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 193

177 sis multivariado a emplear así lo requiera, verificar si se cumplen los supuestos básicos de normalidad, homogeneidad de varianzas, independencia de error y linealidad. Por otro lado, y al igual que en el análisis univariado, hay que tener precauciones con el uso del nivel de significancia (α) que se adopte, de las subsiguientes inferencias estadísticas y de las conclusiones a que se arriba luego del análisis. Las conclusiones confirmatorias solamente se justifican si los estudios estuvieron basados en un muestro apropiado. Esto significa que la inferencia está justificada en relación a la forma en que los datos fueron tomados y en que el experimento fue realizado, más que en la técnica de análisis en sí misma. Las inferencias sólo están justificadas cuando los datos son tomados de una muestra grande y bien definida. Cuando esto no ocurre, los valores de probabilidad directamente no se deberían informar y las conclusiones a las que se arriba sólo deberían limitarse a los datos utilizados y a las condiciones en las que se desarrolló el experimento. De la misma manera resulta poco aconsejable elaborar generalizaciones demasiado amplias cuando los estudios se realizan sobre casos particulares o específicos que no son representativos. A menudo sucede que el investigador prefiere o necesita interpretar las variables en forma separada cuando maneja un grupo de variables correlacionadas. En estos casos sería más apropiado utilizar métodos univariados, con el complemento de pruebas de Bonferroni ajustadas. Sin embargo, cuando sea posible, la consideración conjunta de las variables, mediante la aplicación del análisis multivariado, puede brindar conclusiones más fuertes que las logradas a través de un grupo de comparaciones simples. Si se tiene cuidado durante el proceso de in- 194 OLMOS, Sofía y DI RENZO, Miguel

178 terpretación de resultados, las combinaciones de variables (componentes, factores, etc.) podrían ser de significativa importancia para estudiar un proceso. El uso racional de la estadística multivariada, el modelamiento y el conocimiento biológico pueden ayudar al investigador a diseñar con criterio un experimento crucial y a llegar a conclusiones consistentes. Como dijimos anteriormente, el análisis multivariado aprovecha las relaciones entre las variables para buscar patrones o estructuras en los datos. En este sentido, podría encontrarse un origen de patrones cuando se realizan mediciones sobre grupos de objetos similares. Pueden existir casos donde no se conoce a priori si los grupos están ya formados, cuántos son, o cuáles objetos pertenecen a cada grupo; es allí donde habría que ver qué tipo de análisis es más apropiado. En general, en esta etapa se podrían usar métodos como los de ordenamiento de objetos (donde se logra la reducción de dimensiones entre las variables o entre objetos a una o pocas dimensiones). Otra posibilidad es hacer análisis de agrupamientos donde los objetos se clasifican en categorías jerárquicas sobre la base de matrices de similitud entre los mismos. En el primer caso, los objetos son representados en un espacio gráfico en los cuales los ejes constituyen gradientes de combinaciones de variables. El método de análisis de componentes principales (ACP), que es un ejemplo de análisis por ordenamiento, utiliza para tal fin las estructuras de los autovectores (también llamados eigens ó raíces latentes) de la matriz de correlación o bien de una matriz de varianza-covarianza entre las variables originales. El ACP y el análisis factorial (AF) tienen como objetivo encontrar una estructura más simple reduciendo la dimensionalidad de las variables sin perder información. Para simplificar el análisis de los datos se reduce el número de variables a un pequeño número de índices o factores. Algunas diferencias entre estas dos técnicas son que las componentes principales están definidas como una combinación lineal de la variables originales y no están basadas en un modelo estadístico particular y por lo tanto no se requiere el cumplimiento de supuestos previos. En el AF las variables están expresadas como una combinación de factores, está basado en un modelo especial y requiere el cumplimiento de distintos supuestos. Por otra parte mediante el ACP se busca explicar una gran parte de la varianza total, mientras que con el AF se enfatiza el estudio en las relaciones entre las variables explicadas con las covarianzas o correlaciones. El AF resulta apropiado cuando el objetivo consiste en encontrar un grupo de variables similares, altamente correlacionadas, y postular que esas similitudes provienen del hecho de que éstas son variables «latentes o factores» que actúan en forma particular sobre el proceso estudiado. Cuando el investigador está interesado en definir grupos homogéneos de objetos y estudiar la estructura natural de las observaciones puede aplicar el análisis de clusters. El objetivo consiste en descomponer un conjunto de objetos en dos o más grupos basados en la similitud de los objetos debido a una serie de características especificadas. El uso tradicional de clusters ha sido para propósitos exploratorios. Dado que no es una técnica de inferencia estadística, para que los clusters de objetos exhiban la mayor homogeneidad interna y la mayor diferenciación entre clusters sólo se requiere que la muestra sea representativa y que las variables no sean multicolineales. En este análisis, además, sólo se deben incluir aquellas variables que contribuyan a caracterizar los objetos y que se encuentren relacionadas con los objetivos del análisis. Este análisis es similar al AF, la diferencia es que éste agrupa a variables, mientras que el análisis de clusters agrupa a objetos. Se recomienda que un análisis de clusters sea posteriormente complementado con un análisis de funciones discriminantes (AD) sobre los grupos previamente identificados. El escalamiento multidimensional (EMD), involucra una serie de técnicas que ayudan al analista a identificar dimensiones subyacentes en la evaluación de objetos. Es especialmente utilizado en ciencias del comportamiento, ya que permite identificar dimensiones no conocidas que afectan el comportamiento. Se basa en evaluaciones comparativas de objetos cuando las bases de comparación son desconocidas o indefinibles. Se transforma el comportamiento de quienes perciben los objetos en distancias, las que fi- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 195

179 nalmente se representan en un espacio multidimensional. Si bien mediante el análisis de clusters los objetos se agrupan de acuerdo con sus características, con el EMD no se enfoca el interés en los objetos en sí sino más bien, en cómo éstos son percibidos. Esta técnica mide la correlación o covarianza de los estímulos derivados de las características de los objetos a ser evaluados. Así, las representaciones gráficas enfatizan las relaciones entre los estímulos que se estudian. El análisis de correspondencia (AC) es un procedimiento de ordenación apropiado para datos de frecuencias (tablas de contingencia). En este caso, la distinción entre objeto y variable es menos relevante porque éstos son ordenados en forma simultánea. Cuando los objetos o individuos se reúnen en dos o más grupos, definidos a priori, frecuentemente se plantea el problema de cómo describir las diferencias entre grupos sobre la base de un conjunto de variables. El propósito básico del AD es estimar la relación que existe entre una variable dependiente cualitativa (machos vs. hembras o genotipos resistentes vs. genotipos susceptibles) y entre un grupo de variables independientes cuantitativas con distribución normal. Lo mismo que en el caso de ACP y AF, el AD se basa en la posibilidad de encontrar una combinación lineal de las variables originales. Como característica, el AD permite identificar aquellos grupos ya formados a los cuales pueden ser asignados nuevos objetos en estudio (individuos, genotipos). Posibilita además la identificación de cuál o cuáles de las variables independientes contribuye más a la diferenciación entre grupos. El análisis multivariado de la varianza (MANOVA) es un procedimiento de inferencia estadística usado para evaluar la significancia de la diferencia entre los grupos, que se hallan delimitados sobre la base de las distintas variables independientes discretas o tratamientos. Es una extensión del ANOVA, sólo que las diferencias se establecen teniendo en cuenta simultáneamente dos o más variables dependientes cuantitativas de distribución normal. Por ello este análisis es particularmente útil cuando los datos provienen de diseños experimentales. También pude ser considerado como una extensión del AD, aunque en éste la única variable dependiente es categórica y las variables independientes son cuantitativas, mientras que el MANOVA involucra un grupo de variables dependientes cuantitativas y las variables independientes son cualitativas. Las correlaciones canónicas (CC) reducen las dimensiones de dos grupos de variables provenientes de un mismo conjunto de objetos o individuos de manera que se puedan estudiar las relaciones conjuntas entre los grupos. Es similar al AD sólo que en las CC las variables (no los objetos o individuos) son divididas en grupos, por lo que el interés se centra sobre las relaciones entre los grupos de variables. Por ejemplo, las CC se pueden utilizar cuando interesa conocer la relación existente entre los patrones de marcadores moleculares, que representan diferentes genotipos, y algunas características ambientales donde viven los individuos muestreados. La regresión múltiple (RM) se considera el método apropiado cuando se presume que los valores de una variable continua dependen de los valores que tomen las otras variables. Esta técnica, que explora todo tipo de relaciones dependientes, tiene como objetivo predecir los cambios en una variable dependiente cuantitativa en respuesta a los cambios en las distintas variables independientes o predictoras. Los modelos de RM constituyen la base para la estimación de parámetros en genética cuantitativa. Son ejemplos de su aplicación la descomposición del valor genotípico en el efecto medio de cada alelo y las interacciones debidas a dominancia y epistasis, el cálculo de la estabilidad de los genotipos mediante la descomposición de la interacción genotipo ambiente, el parecido entre parientes, la ubicación y la utilización de QTL mediante marcadores moleculares. La ecuación de regresión es una combinación lineal de las variables independientes que mejor predicen la variable dependiente. La selección de las variables con mayor poder de predicción se realiza mediante aproximaciones secuenciales, llamadas estimaciones «stepwise» (pasos inteligentes). Mediante los coeficientes de regresión estandarizados es posible determinar la importancia relativa de cada variable predictora. Las variables in- 196 OLMOS, Sofía y DI RENZO, Miguel

180 dependiente y dependiente deben ser cuantitativas si bien, mediante transformaciones previas, es posible incluir variables independientes no métricas. La aplicación del análisis de RL permite predecir una variable dependiente binaria (0,1). Es importante tener en cuenta que para asignar causalidad en forma justificada es necesario disponer de una cantidad adecuada de datos biológicos experimentales. Si se cumplen los supuestos básicos, en especial la normalidad de las variables, no hay mayores diferencias entre la RL y el AD, sólo que en el caso que sea posible formar más de dos grupos, este último resulta el más apropiado. Los modelos logarítmicos lineales (LOGL) comprenden a otros análisis que permiten mostrar las relaciones que existen entre variables categóricas. Lecturas recomendadas EVERITT, B.S.; DUNN, G Applied Multivariate Data Analysis. E. Arnold, London. HAIR, J.F.; ANDERSON, R.E.; TATHAM, R.L.; BLACK, W.C Multivariate Data Analysis. 4ta. Ed. Prentice Hall - Upper Saddle River, New Jersery. MANLY, B.F Multivariate Statistical Methods. A Primer. Chapman and Hall, London. RENCHER, A.C Methods Of Multivariate Analysis. J. Wiley & Sons, Inc. New York. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 197

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182 VI.-Capítulo 2 Métodos para estimar variabilidad genética Winzer, Nélida; Di Renzo, Miguel; Olmos, Sofía 1 Introducción La información procesada a partir de las técnicas que se desarrollan en este libro pueden ser de diversos tipos y puede tratarse, por otro lado, del análisis de una sola variable o de varias variables evaluadas en cada individuo o muestra. Los análisis estadísticos a utilizar dependen de estos dos aspectos, tipo de datos y número de variables, y, además, de qué objetivo se haya planteado el investigador. Si se trata de una sola variable se podrán aplicar las técnicas aprendidas en un curso básico de estadística (comparación de dos medias, análisis de la varianza, análisis de regresión, pruebas chi-cuadrado, etc.), o bien alguna de sus generalizaciones. En este capítulo se desarrollarán en más detalle algunas metodologías multivariadas. Se han seleccionado aquellas que se utilizan con mucha frecuencia y que no requieren demasiados conocimientos previos. Los datos multivariados se ordenan en una matriz. A efectos de unificar el lenguaje se considerará que cada fila de la matriz representará un individuo, una muestra, una especie; en definitiva, una OTU (Operational Taxonomic Unit). Las columnas representarán los caracteres o variables que se observan en cada OTU. 2 Tipo de datos DATOS DOBLE ESTAD: Son los también llamados datos binarios o dicotómicos. Estos datos se presentan cuando el carácter puede tomar sólo dos estados posibles. Habitualmente se codifican como «0» ó «1». Hay que reconocer dos tipos de situaciones donde pueden aparecer datos binarios. a) Datos de presencia o ausencia. Sólo se registra la presencia ó ausencia del carácter. Ejemplo: Presencia o no de una banda en una corrida electroforética de isoenzimas o marcadores moleculares. b) Datos doble estado excluyentes. El carácter tiene sólo dos estados posibles y la asignación del «0» ó el «1» es indistinta. Ejemplos: Carácter: Sexo. Codificación: Hembra = 0, Macho = 1, ó Hembra = 1, Macho = 0. Tipo de Fruto: dehiscente ó indehiscente. Clasificación de hojas: paripinadas ó imparipinadas. La distinción entre uno u otro tipo de dato binario es importante al momento de seleccionar la medida de asociación. DATOS MULTIESTADO CUALITATIVOS: El carácter puede tomar un conjunto finito de estados. Ejemplos: Margen de la hoja: aserrado, lobulado, entero. Color de la flor: blanca, roja o rosada. Disposición de folíolos en el raquis: alternos, subopuestos, opuestos. Identificación de los nucleótidos presentes en una determinada secuencia de ADN: A,C, T, G. Identificación de los aminoácidos esenciales presentes en una proteína: Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Leu, Pro, Phe, Tyr, Met, Trp, Asn, Gln, His, Asp, Glu, Lys, Arg. Clases de embriones somáticos: globular, acorazonado, torpedo, cotiledonar. DATOS MULTIESTADO CUANTITATIVOS DISCRETOS: están asociados a valores de conteo. Ejemplos: Número de hileras por espiga, número de macollos por planta, número de inflorescencias. DATOS MULTIESTADO CUANTITATIVOS CONTÍNUOS: Representan propiedades que se pueden expresar en una escala contínua. Ejemplos: Biomasa de plantas, peso de semillas, longitud de partes verdes, concentración de proteína del grano, frecuencia relativa de un alelo. 3 Medidas de asociación y distancia Un objetivo frecuente suele ser la descripción del grado de parecido que hay entre las Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 199

183 OTUs,. Para ello será necesario medir ese grado de similitud. Se describirán a continuación algunas de las medidas que aparecen con mayor frecuencia en la literatura. Hay dos tipos de medidas: los índices de asociación y las distancias. Los primeros miden el grado de similitud: Cuanto más parecidas sean 2 muestras, mayor será su asociación. Las segundas miden el grado de disimilitud: cuanto más parecidas son 2 muestras menor será su distancia. Para datos binarios es usual trabajar con medidas de asociación. Entonces, para caracterizar a dos OTUS existen 4 valores a considerar: a = Nº de caracteres donde ambas muestras coinciden en el «1»; b = Nº de caracteres donde la primera muestra tiene un «1» y la otra un «0»; c = Nº de caracteres donde la primera muestra tiene un «0» y la otra un «1»; d = Nº de caracteres donde ambas muestras coinciden en el «0». La suma de estos 4 valores dará el total de caracteres medidos. OTU 2 OTU a b 0 c d J 12 a a b c Es la proporción de caracteres presentes que comparten, respecto al total de caracteres presentes en las 2 OTUs. 2a a DICE D12 2a b c (a b) (a c) 2 Es la proporción de caracteres copresentes respecto al promedio de los caracteres presentes en cada OTU. Se puede probar que Jaccard siempre dará un valor de asociación menor que Dice, salvo cuando toman el valor 0 ó 1, caso en que siempre coinciden. Más aún, ambos están relacionados mediante la ecuación J = D/ (2-D) ó D = 2J/(1+J). Esta relación tiene como consecuencia, entre otras, que en un Análisis de Cluster, cuando se usa ligamiento simple o completo, den los mismos grupos, sólo que con distintos valores de asociación. Ejemplo: Como resultado de la aplicación de la técnica RAPD sobre 6 muestras se registró la siguiente información sobre la presencia o ausencia de 8 bandas generadas por un cebador: Este es un proceso típico en el análisis de la información a partir de bandas. Primero se codifica la información, se construye la matriz de datos y, en este caso, se calcularon Si los datos son de presencia/ausencia, un criterio válido es considerar que dos muestras son más parecidas cuantos más «unos» compartan. La coincidencia de «ceros» no aporta a la similitud porque puede estar generado por falta de información (la no amplificación de un fragmento RAPD no informa si esto es producido por la carencia del sitio de hibridación del cebador o bien como consecuencia de una mutación de punto en dicho sitio, por ejemplo). Dos de los índices que comparten este criterio son Jaccard y Dice. JACCARD A B C D E F Codificación A B C D E F A B C D E F A B C D E F Matriz de Datos Bandas A B C D E F Asociación de Jaccard Asociación de Dice A B C D E F A B C D E F WINZER, Nélida; DI RENZO, Miguel y Sofía OLMOS

184 las matrices de asociación de Jaccard y Dice a efectos de observar las características mencionadas más arriba. Entre las muestras A y C no se observaron bandas en común, por lo tanto a = 0 y tanto Jaccard como Dice dan 0. Por otro lado, A y E comparten la presencia de las mismas bandas: a = 5, b = 0, c = 0. Tanto Jaccard como Dice dan 1. Entre B y E: a = 3, b = 1, c = 2. Por lo tanto, de las 6 bandas presentes en una u otra muestra comparten 3. Así Jaccard vale 0.5. El total de bandas de B es 4 y el total de bandas detectadas en E es 5. El promedio de estos totales da 4,.5 por lo que la asociación de Dice da (3/4,5) = 2/3 = 0,667. Se observa también que, salvo los 0 y los 1, todos los valores de Jaccard son menores que los de Dice. Además, ambas matrices son simétricas: la asociación entre A y E es la misma que la que se da entre E y A. Por eso, basta mostrar la mitad de la matriz de asociación. Esta observación será válida para todas las medidas que se presenten en este capítulo. Si los datos son binarios pero de estados equivalentes, 2 muestran deberán considerarse más asociadas tanto cuando comparten «unos» como «ceros», ya que la codificación que se les asigna es indistinta. Un índice recomendable por su simplicidad es el de Simple Matching o de Concordancia Simple: a d SIMPLE MATCHING SM12 a b c d Simplemente es la proporción de caracteres que comparten las dos muestras. Si se piensa que la matriz de datos anterior corresponde a 8 caracteres binarios de estados equivalentes la matriz de asociación con el índice de Simple Matching dará: A B C D E F A B C D E F 1 Se observa que A y E comparten todos los caracteres, por lo tanto tienen la máxima asociación. En cambio C y E no coinciden en ninguno, su asociación es 0. La asociación entre C y D y entre D y E es 0,5, lo que significa que coinciden en la mitad de los caracteres evaluados. Además de las que se han definido hasta ahora, existen muchas otras medidas para datos binarios. También se pueden definir medidas de distancia o asociación para distintos tipos de datos multiestado. Para no extender en demasía esta sección se presentarán algunas distancias definidas específicamente para frecuencias alélicas. 4 Distancias genéticas Se pueden clasificar en 2 grupos: las basadas en un modelo geométrico (Cavalli-Sforza y Rogers) y las basadas en modelos consideraciones biológicas (Nei). Para n poblaciones, hay n(n-1)/2 pares, y si en cada una de ellas se tiene la información sobre los loci para m alelos, y también sus frecuencias correspondientes, éstas pueden expresarse de la siguiente manera: Pob. 1: p 1, p 2,..., p m Pob. 2: q 1, q 2,..., q m Distancia Cuerda de CAVALLI-SFORZA y EDWARDS (1967) m d pq i i ) i 1 Los puntos P* = ( p 1, p 2,..., p m) y Q*= ( q 1, q 2,..., q m) están sobre una esfera de radio 1. La distancia Cuerda es, precisamente, la longitud de la cuerda que une esos 2 puntos. Para el caso m = 2, se ve en el gráfico la distancia cuerda entre los puntos P = (0.3, 0.7) y Q = (0.8, 0.2). Los puntos originales son llevados a la esfera (círculo) de radio 1 y luego se calcula la distancia entre esos 2 puntos: d = Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 201

185 1 0.8 P P* Los dos últimos términos equivalen a un estado de homocigosis en la población 1 y 2, respectivamente. Nei define primero la Identidad normalizada (varía entre 0 y 1) : Q Q* I m i 1 pq m m 2 2 pi qi i 1 i 1 i i Si se consideran simultáneamente varios loci la distancia Cuerda se calcula así: m r i d pijq ij ) i 1 j 1 Distancia de ROGERS (1972) r m 1 i R (p q ) 12 ij ij r i 1 j 1 En el gráfico, ésta es la distancia habitual entre los puntos P y Q. Distancia Estándar de NEI (1972): Esta distancia tiene una base biológica. Expresa la probabilidad de que dos alelos tomados al azar de dos poblaciones diferentes sean idénticos (con respecto a la probabilidad de que lo sean dos alelos tomados al azar de la misma población). Sean, como antes, las poblaciones 1 y 2 y las frecuencias alélicas de un solo locus: pq i i se puede interpretar como la probabilidad que 2 alelos sean iguales si uno ha sido elegido al azar de la población 1 y el otro de la población 2. sería la probabilidad que 2 alelos elegidos al azar de la población 1 sean iguales; sería la probabilidad que 2 alelos elegidos al azar de la población 2 sean iguales. 2 y luego la Distancia Estándar: D 12 = - ln I. Si se usan varios loci se trabaja con el promedio aritmético de las probabilidades definidas anteriormente resultando: D 12 ln i i Ejemplo: Para la información de la tabla, en el caso de las frecuencias de cinco alelos provenientes de dos loci, se tiene: I = y, por lo tanto, D = En las poblaciones naturales una de las formas de realizar el agrupamiento jerárquico de las mismas en razas, es mediante el empleo de medidas de divergencia genética. Aquí, las llamadas distancias genéticas tienen su mayor aplicación. Las medidas de distancias genéticas basadas en modelos biológicos son las más empleadas en estudio de genética poblacional, debido a que resumen los conocimientos obtenidos de las fuerzas evolutivas que conllevan a los cambios genéticos es decir, mediante mutaciones y deriva genética. La medida de distancia genética estándar de Nei es más confiable cuando se utilizan r m i 1 j 1 pq r m r mi 2 2 pij qij i 1 j 1 i 1 j 1 ij ij 202 WINZER, Nélida; DI RENZO, Miguel y Sofía OLMOS

186 datos provenientes de muchos alelos. La distancia de Nei está formulada para un modelo donde se asume que las mutaciones ocurren en forma infinita, con la misma probabilidad para todos los alelos a una tasa de mutación neutral, y que la variabilidad genética inicial en la población está en equilibrio entre la variabilidad producida por mutaciones y por deriva genética, siendo el tamaño efectivo de la población, en cada una, constante. Basándose en estos supuestos, y de que todos los loci sean equivalentes entre sí, se espera que la Distancia de Nei incremente linealmente con el tiempo. Si las frecuencias alélicas en cada población han sido estimadas con pocas muestras se pueden utilizar en cambio algunas modificaciones a la Distancia Estándar de Nei como las propuestas por Nei, (1978) y Hillis, (1984). La distancia de Cavalli-Sforza y Edwards, por el contrario, asume que las diferencias entre las poblaciones no provienen de mutaciones sino solamente como consecuencia de la deriva genética. Además, no asume que el tamaño poblacional ha permanecido constante en todas las poblaciones. Considera que el tamaño de la población cambia en forma lineal pero no con el tiempo sino con 1/N, donde N es el tamaño efectivo de la población. Así en estos casos, los conocimientos básicos de genética poblacional brindarán las herramientas necesarias en el momento de la elección del método más apropiado para el análisis de nuestros datos. 5 Análisis de coordenadas principales Si se tiene una matriz de distancias entre N muestras será posible representar cada muestra mediante un punto de manera tal que las distancias resultantes reproduzcan las de la matriz? Veamos dos ejemplos: (i) Si se tiene la siguiente matriz D de distancias entre las muestras A, B y C: D se podrían hacer algunos de los siguientes gráficos: B B B Coordenadas de A, B y C: I:(1.444, 0.881); (0.445, 0.94); (1.111, 1.179) II:(0.444, ); (-0.555, -0.06); (0.111,0.179) III: (0.444, 0.119); (-0.555, 0.06); (0.111,-0.179) Si se calcula la distancia euclídea entre los puntos en uno cualquiera de estos gráficos se ve que se han reproducido exactamente los valores de la matriz D. Por ejemplo: 2 2 d E (A, B) ( ) ( ) 1 en el gráfico I. (ii) Si se tuviera la matriz de distancias entre las muestras P 1, P 2 y P 3 : # D C C C A A A I II III Es fácil ver que es imposible representar en un plano puntos separados por estas distancias porque si P 1 y P 2 se ubican como extremos de un segmento de longitud 0.9, no hay manera de ubicar un punto P 3 que esté a 0.5 de P 1 y a 0.3 de P 2. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 203

187 P 1 P 2 P 1 P 3? P 3? P 2 Se van a considerar, por ahora, distancias como las del ejemplo i). Esto es, distancias para las que se puedan encontrar puntos que reproduzcan esas distancias. Otro aspecto a considerar es el número de coordenadas necesarias para esos puntos. Es intuitivo que si sólo hay 2 muestras a una distancia dada se pueden graficar en una recta (dimensión =1); si hay 3 muestras ya se vió que se pueden graficar en un plano (dimensión = 2); si se tuvieran 4 muestras ya son necesarias 3 coordenadas (dimensión = 3);... y si se tienen N muestras se necesitarán, en general, N-1 coordenadas. Con lo cual si se quieren graficar 40 muestras serán necesarias 39 coordenadas!!! Es evidente que esto no es cómodo si el objetivo es obtener una representación gráfica de los puntos o muestras. Lo ideal sería obtener dos coordenadas pues se podrían graficar en un plano, o bien tres para graficar en 3 dimensiones. El problema, entonces, es encontrar las 2 mejores coordenadas (ó las 3 mejores) para obtener esta representación. Ese es el objetivo del Análisis de Coordenadas Principales (ACOOP): encontrar las k mejores coordenadas para las muestras de manera tal que si se calculan las distancias euclídeas entre ellas reproduzcan lo mejor posible una matriz de distancias dada. Habitualmente k = 2 ó 3, a éstas, se las llama Coordenadas Principales. Naturalmente se perderá la información de las restantes coordenadas. Como se vió en el ejemplo (i) hay muchas representaciones posibles. Ahí se han dado 3 pero se podrían haber dado muchas más. Una manera de reducir las opciones es obtener coordenadas de manera tal que los puntos estén centrados en el origen, como en II ó III. Se explicará el método de obtención de las Coordenadas Principales partiendo de una matriz de Asociación S. En este caso las distancias que se van a reproducir son las definidas por: d 2 (i, j) = S ii + S jj - 2 S ij ( 1 ) donde S ij es la asociación entre la muestra i y la j. Si la asociación de una muestra consigo misma es 1, es decir S ii = 1, como ocurre con la mayoría de los índices, la ecuación se reduce a: d 2 (i, j) = 2(1- S ij ). ( 2 ) Se detallarán los pasos que se deberían realizar para hacer este análisis al simple efecto de poder manejar con idoneidad los programas estadísticos de que se dispongan. Los pasos 1) a 3) son responsabilidad de esos programas. El usuario deberá, fundamentalmente, indicarle qué asociación o distancia desea calcular y cuántas coordenadas quiere. PASO 1) Centrar doblemente la matriz S S 0. PASO 2) Calcular los autovalores y autovectores de S 0. PASO 3) Calcular las coordenadas de los puntos representativos de las muestras. PASO 4) Graficarlos. El PASO 1 tiene como fin hacer que los puntos resultantes estén centrados. Cada elemento de la matriz de asociación S se centra por filas y por columnas: (3) donde S i es el promedio de la fila i de S, S j es el promedio de la columna j y S es el promedio de todos los elementos de S. En el PASO 2 se encuentran: a) una matriz NxN donde cada columna es un vector de longitud uno. Son los autovectores. b) N números ordenados en forma decreciente: los autovalores. Estos elementos son característicos de cada matriz S 0. Por eso también se los conoce como vectores y valores característicos. Cada autovector está asociado a un autovalor. Si la matriz de distancias es «representable» (como la del ejemplo (i)) los autovalores serán positivos o ceros (el más chico es siempre cero para estas matrices «representables»). 0 S ij 204 WINZER, Nélida; DI RENZO, Miguel y Sofía OLMOS

188 0 s ij En el PASO 3, si se desean k coordenadas, se toman los k primeros autovectores y se multiplican por la raiz del autovalor respectivo. El primer autovector da la primera coordenada de todas las muestras, el segundo la segunda coordenada y así siguiendo hasta la k-ésima. Si sólo se desean 2 coordenadas para graficar los puntos en un plano se toman los 2 primeros autovectores (k=2). Veamos un ejemplo sencillo: S Doble centrado S Autovalores de S 0 : 1 = = =0 v 1 v 2 v Autovectores de S 0 : Columnas de V Primeras 2 Coordenadas: v 11 v 22 Muestra Muestra Muestra Gráfico: Es el Gráfico II que se vió más arriba donde A es la muestra 1, B la 2 y C la muestra 3. Las distancias ( 2 ) calculadas a partir de la matriz de asociación S dan la matriz de Distancias D. Por esa razón ambas matrices tienen la misma representación. d 2(1 S ) 2(1 0.5) 1 d d 2(1 S ) 2(1 0.9) 0.2 d d 2(1 S ) 2(1 0.75) 0.5 d OBSERVACIÓN 1: Como en el ejemplo sólo hay 3 muestras los autovectores tienen 3 componentes. Si se trabajara con una matriz de asociación entre 40 muestras, los autovectores tendrían 40 componentes, una por cada muestra. OBSERVACIÓN 2: Para la matriz S se han reconstruído totalmente las distancias porque sólo son 3 muestras. Si hubiera más (N=40, por ejemplo) sólo se reconstruirían totalmente las distancias si se usan 39 coordenadas. Si se usan sólo las dos primeras se reconstruye, en general, sólo un porcentaje de las distancias. Hay 2 tipos de porcentajes que se pueden calcular: Porcentaje de Dispersión: = x 100% n si sólo se usan 2 coordenadas. Este porcentaje se interpreta teniendo en 2 cuenta que: 2N (λ λ N ) = d ij, sumando sobre todos los pares de muestras. En cambio, la suma del cuadrado de las distancias reconstruidas con las dos coordenadas es igual a 2N (λ 1 + λ 2 ). Por lo tanto, este porcentaje mide cuánto se reconstruye del cuadrado de todas las distancias. Si se usan más de 2 coordenadas se van sumando los autovalores correspondientes en el numerador. En nuestro ejemplo: α 1 = 100%. Porcentaje de Distorsión: = x 100% n Este valor mide cuánto se acercan los valores de la matriz de asociación reconstruída respecto de la matriz de asociación original S 0. Más exactamente: 2= 0 0* 2 0 0* 1- S-S (S ij- S ij) x 100%= S (S ij) x 100% 2 En este algoritmo se ve que lo que se está comparando son las asociaciones originales, 0*,con las reconstruidas, s ij, una a una. Para el cálculo de α 2 se usa la primera fórmula por lo que el lector no debe traumatizarse con la segunda. OBSERVACIÓN 3: Si se hubieran obtenido autovalores negativos la primera medida no es recomendable. Hasta podría darse el caso que α 1 fuera mayor al 100%. La segunda, en cambio, sigue teniendo sentido. Por Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 205

189 otro lado, no se podrían calcular coordenadas asociadas a ese autovalor porque no se puede calcular λ. i La aparición de autovalores negativos no es necesariamente un problema grave para la representación siempre que los autovalores negativos sean pocos y pequeños. Por ejemplo, si se trabaja con 50 muestras, en el PASO 2 se obtendrán 50 autovalores, de los cuales uno, seguramente, es cero. Para la representación en el plano se usan sólo los 2 primeros. Si los últimos 10 son negativos no se verán afectados los cálculos de las coordenadas. Hay asociaciones y distancias que nunca dan autovalores negativos, entre ellos se encuentran Jaccard, Ochiai, Russell y Rao, Simple Matching, y distancia euclídea. Si en lugar de tener una matriz de asociaciones se tiene una matriz de distancias el procedimiento consiste en calcular una matriz S cuyos elementos son: (4) 2 dij sij 2 y luego seguir los PASOS 1, 2, 3 y 4 anteriores. OBSERVACIÓN 4: Cada autovector de S 0 es un vector de longitud 1 en una cierta dirección. Pero por cada dirección podemos tener 2 vectores: v y -v. Por ejemplo: v y v No debe causar sorpresa, entonces, que con un programa se obtenga un gráfico y con otro el mismo gráfico pero con una reflexión sobre uno u otro eje, o sobre los dos. Por otro lado, también es lícito cambiar, por alguna razón, el signo de una coordenada. Por ejemplo, esto puede ser útil cuando se quieren comparar Análisis de Coordenadas Principales realizados con distintas asociaciones o distancias sobre el mismo conjunto de muestras. Ejemplo: Presentamos la caracterización de 8 cultivares comerciales y 35 cultivares en experimentación mediante análisis isoenzimático de semillas de Amaranthus. Estas accesiones pertenecen a siete especies: A. caudatus, A. cruentus, A. hypochondriacus, A. mantegazzianus, A. dubius, A. tricolor, y A. hybridus. Del total de 43 cultivares, 31 fueron polimórficas con 7 sistemas isoenzimáticos. Se aplicó análisis de coordenadas principales el cual, estuvo basado en la presencia o ausencia de las 23 bandas polimórficas. En la figura puede observarse el nivel de diversidad genética dentro de este germoplasma representado por las coordenadas 1 y 2. Este análisis agrupó la mayoría de los cultivares de acuerdo a su clasificación taxonómica así como mostró que existen relaciones entre diferentes accesiones. Se concluye que el análisis isoenzimático de semillas fue efectivo para caracterizar los cultivares destinados a los programas de mejoramiento de Amaranthus. A.cruen. A.hypoch A.caudat. A.manteg. A.dubius A.tricolor A.hybrid. Cualquiera de estos dos vectores pueden usarse como segundo autovector y, más aún, algunos programas pueden dar como resultado el primero y otros el segundo. Como consecuencia de esta selección se obtendrá el gráfico II ó el III. Se ve que el único efecto de usar uno u otro vector es una reflexión del gráfico respecto del primer eje. Si se cambia el signo de v 1 se obtendrá una reflexión respecto del segundo eje. Ninguno de estos cambios modifica la distancia entre los puntos WINZER, Nélida; DI RENZO, Miguel y Sofía OLMOS

190 Matriz de datos Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 207

191 V1 V2 CP1 CP Autovalores: α 1 = α 2 = 78.2 Al sólo efecto de que el lector pueda repasar algunos cálculos se dan los primeros 10 elementos de los 2 primeros autovectores y las 2 primeras coordenadas Principales. 6 Análisis de agrupamientos (cluster) Esta técnica tiene como objetivo formar grupos de muestras, poblaciones, individuos u OTUs que sean similares entre sí y diferentes a los elementos de los otros grupos. El primer problema es fijar el criterio para decidir cuándo dos elementos son similares. Si se tuviera un mazo de cartas, cómo formar grupos? por el valor de la carta?, porque comparten el palo?. Según el criterio que se aplique los grupos que se formen serán distintos. En la sección anterior hemos visto distintas maneras de definir la similitud o disimilitud entre OTUs. Cada una de ellas, u otras que no se han presentado aquí, plantean distintas formas de medir la similitud entre los elementos a agrupar. Existen, además, muchos métodos para formar los grupos. Uno de los más usados son los agrupamientos jerárquicos que pueden, a su vez, ser divisivos o aglomerativos. Los primeros comienzan con todos los elementos en un solo grupo y en sucesivas divisiones se van formando grupos cada vez más pequeños. Los aglomerativos, por el contrario, empiezan considerando tantos grupos como elementos se tienen y se van agrupando según su grado de parecido. Los sucesivos pasos de uno y otro método se pueden representar en un gráfico denominado dendrograma. En esta sección se tratarán solamente los métodos jerárquicos divisivos. Aquí se plantea un segundo problema: Qué tipo de ligamiento se va a utilizar? Esto es, una vez realizado el primer agrupamiento, cómo se define la distancia entre ese grupo y los restantes elementos? Supongamos que en un primer paso se han agrupado los elementos A y B porque son los que presentan la menor distancia entre sí. La distancia entre el nuevo grupo AB y otro elemento C se puede definir según el criterio empleado para incorporar al nuevo elemento: LIGAMIENTO SIMPLE: d(ab,c) = mín {d(a, C), d(b, C)}, LIGAMIENTO COMPLETO: d(ab,c) = máx {d(a, C), d(b, C)}, LIGAMIENTO PROMEDIO: d({a,b},c) = d(a,c) d(b,c) 2 En el caso del ligamiento simple, la incorporación del nuevo elemento está basada en la extracción de los menores valores de distancias entre el nuevo elemento y el grupo preformado, y entre el nuevo elemento y las restantes OTUs que se consideren. En cambio, el ligamiento completo lo que hace es extraer los mayores valores de distancia, respectivamente. Si A, B y C son grupos formados en pasos anteriores, se usan los mismos algoritmos en el caso del ligamiento simple o completo. Para el ligamiento promedio hay que promediar todas las distancias entre ele- 208 WINZER, Nélida; DI RENZO, Miguel y Sofía OLMOS

192 mentos de AB y de C: d(ab,c) n i,j AB donde d ij es la distancia entre el elemento i del grupo AB y el j de C; n AB y n C son los números de elementos en el grupo AB y C, respectivamente. Este ligamiento promedio se conoce también por las siglas UPGMA (Unweighted Pair Groups Method with Arithmetic Averages). Consideremos la matriz de distancias de la tabla. Se realizará un agrupamiento aplicando ligamiento simple. En primer lugar se agrupan los elementos A y E porque están a menor distancia (son iguales). Formado ese primer grupo habría que calcular las nuevas distancias del grupo AE a los restantes elementos pero como d(a, U) = d(e, U) para todos los restantes elementos U se mantienen esas distancias. En el segundo paso se observa que la menor distancia es la de B a F; se forma ese grupo y se recalculan las distancias del nuevo grupo a los restantes. Y así hasta que se han agrupado todos. También se puede detener el proceso fijando algún otro criterio para ello. Por ejemplo, cuando se ha alcanzado una distancia máxima fijada previamente. A continuación se aplica el ligamiento completo. Los 2 primeros agrupamientos coinciden en este ejemplo, por lo que sólo se muestran los tres últimos pasos. El ligamiento promedio conduce a las siguientes agrupaciones: Los mismos métodos se pueden aplicar sobre matrices de asociación cambiando los conceptos de «menor distancia» por el de «menor asociación». En general, el ligamiento simple produce agrupamientos en cadena: a los grupos for- d n ij C A B C D E F A B C D E F AE B C D F AE B C D F AE BF C D AE BF C D AEBF C D AEBF C D AE BF C D AE BF C D AEBF C D AEBF C D AEBFD C AEBFD C AE BF C D AE BF C D AEBF C D AEBF C D AEBFD C AEBFD C AEBFC D AEBFC D mados inicialmente se van acoplando los restantes elementos. En cambio, el ligamiento completo tiende a generar muchos grupos chicos que se reunirán en los últimos pasos. El análisis de Agrupamientos sólo debe tomarse como un método exploratorio. Si originalmente los datos forman grupos bien separados cualquier método de agrupamiento dará, aproximadamente, los mismos resultados. Pero si las muestras forman un contínuo, cada método y cada medida de distancia pueden conducir a resultados muy Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 209

193 dispares. En este caso las conclusiones deben realizarse con cautela. A veces es conveniente realizar un Análisis de Coordenadas Principales para determinar si existen grupos claramente definidos o no. 7 Lecturas recomendadas CAVALLI-SFORZA, L.L. y A.W.F. EDWARDS Phylogenetic analysis: models and estimation procedures. Am. J. Hum. Gen. 19: DI RENZO, M.; BONAMICO, N.; GESUMARIA, J Characterisation of amaranth accessions by isozymic patterns. Seed Science And Technology, v.29 (1): W.C Multivariate Data Analysis. 4ta. Ed. Prentice Hall - Upper Saddle River, New Jersery. HILLIS D, Misuse and modification of Nei s genetic distance. Syst Zool 33: MANLY, B.F Multivariate Statistical Methods. A Primer. Chapman and Hall, London. NEI, M Genetic distances between populatios. Am. Nat. 106: NEI, M Estimation of average heterozygosity and genetic distance from small number of individuals. Genetics 76: RENCHER, A.C Methods Of Multivariate Analysis. J. Wiley & Sons, Inc. New York EVERITT, B.S.; DUNN, G Applied Multivariate Data Analysis. E. Arnold, London. HAIR, J.F.; ANDERSON, R.E.; TATHAM, R.L.; BLACK, 210 WINZER, Nélida; DI RENZO, Miguel y Sofía OLMOS

194 PARTE VII Genómica Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 211

195 212 ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.

196 VII.-Capítulo 1 Genómica Echenique,Viviana; Schrauf, Gustavo; Selva, Juan P. 1 Introducción La «genómica» se desarrolló en los últimos 10 años como consecuencia de los avances realizados en biología molecular e Informática, dos áreas de la ciencia que han tenido un desarrollo tecnólogico enorme, generando una revolución en el conocimiento y en la comprensión de los procesos biológicos. El término fue acuñado en 1986 por Thomas Roderick para referirse a la subdisciplina de la genética que se ocupa del mapeo, secuenciación y análisis de las funciones de genomas completos y sirvió de nombre para una revista especializada en la publicación de los mencionados temas, Genomics. Consiste en la caracterización molecular de genomas enteros y aporta información acerca de la secuencia y de la función de cada sector del genoma en diferentes situaciones de desarrollo y bajo diferentes condiciones ambientales, así como de los mecanismos implicados en la regulación de la expresión e interacción génica. Para ello, las herramientas que se utilizan para el análisis individual de genes o pequeñas regiones cromosómicas, se aplican al análisis global de genomas completos, estudiando en conjunto los miles de genes, proteínas y metabolitos que constituyen un organismo, así como las complicadas redes de interacciones que operan entre ellos. La información generada es enorme y es clave para la identificación y el aislamiento de genes de interés y permitirá interpretar, en términos moleculares, los procesos biológicos. Para ayudar en este proceso han surgido poderosas herramientas bioinformáticas que permiten almacenar e interpretar esta información. Las aplicaciones de la genómica alcanzan a todos los ámbitos de la actividad humana relacionados con la biología, como la salud, la alimentación y el medio ambiente. En pocos años estarán disponibles las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de todos los genes y productos génicos codificados por los genomas de varios organismos complejos. Estas servirán para el estudio de enfermedades humanas complejas y para comprender fenómenos tales como la fisiología celular, el desarrollo, la conducta, la evolución, etc. También aportarán información acerca de todos los aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal, diferenciación y respuesta a estreses bióticos y abióticos. Gracias al potencial de relacionar fenotipos biológica y económicamente importantes con los genes responsables de los mismos será posible identificar genes de interés que puedan ser transferidos a otros organismos por medio de tecnología génica. Por otro lado, el conocimiento de la secuencia de los genes posibilitará el desarrollo de marcadores perfectos, basados en la secuencia del mismo gen, lo cual facilitará la selección y la transferencia de los mismos a variedades de interés. La conjunción entre tecnología génica, marcadores moleculares, genómica y bioinformática revolucionará el mejoramiento genético vegetal, dando origen a lo que se denomina mejoramiento molecular y conducirá al desarrollo de nuevos y promisorios cultivares (Fig. 1). La genómica se divide en dos grandes áreas: - Genómica estructural, que se ocupa de la caracterización física de genomas enteros. - Genómica funcional, que caracteriza el transcriptoma, que está constituído por el conjunto completo de transcriptos, producidos por un organismo, el proteoma o conjunto de proteínas codificadas por un genoma, y el metaboloma o conjunto total de metabolitos de una célula, consecuencia de la función de los RNA y proteínas. El objetivo de la genómica es la dilucidación completa y exacta de la secuencia de ADN de un genoma haploide representativo de una especie. Cuando esta secuencia se conoce, abre la puerta a numerosas posibilidades. Por análisis computacional de la misma y utilizando principios conocidos de genética y el análisis molecular de los transcriptos y proteínas es posible: - Comparar secuencias similares presentes en diferentes entidades biológicas y comprender el papel de dichas secuencias. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 213

197 Figura 1: La conjunción entre tecnología génica, marcadores moleculares, genómica y bioinformática revolucionarán el mejoramiento vegetal, conduciendo al desarrollo de nuevos cultivares. Los nuevos genes hallados serán introducidos en plantas por tecnología génica. Esto a su vez permitirá establecer la funcionalidad de los mismos. El conocimiento de la secuencia permitirá la obtención de mapas, marcadores perfectos y realizar selección asistida por marcadores moleculares (MAS), así como el fenotipeado molecular. Gentileza de G. Spangenberg. - Realizar predicciones acerca de todas las proteínas codificadas por una especie. - Establecer las variaciones genéticas entre distintas poblaciones de una misma especie. - Comparar secuencias de diferentes especies y entender procesos evolutivos. Figura 2: Sintenia entre los genomas de varias gramíneas. El genoma de arroz contiene grupos de marcadores que se hallan altamente conservados en muchos cereales, por lo cual dichos genomas pueden sintetizarse básicamente como compuestos por «bloques de ligamiento de arroz». En la figura se muestra el alineamiento de los cromosomas y segmentos de cromosomas (identificados con letras mayúsculas) de varias gramíneas con los del arroz (centro). El genoma del maíz tiene dos copias semejantes de cada bloque de genes por lo que está representado por dos anillos del círculo. Las líneas externas punteadas conectan sectores adyacentes de los cromosomas de trigo. Modificado de Gale y Devos (1998) y de Snustad et al. (2003) Esto ha dado origen a la genómica comparativa y ha demostrado que existe considerable sintenia es decir una localización conservada de genes en posiciones equivalentes en especies relacionadas (Fig. 2). También ha sido una excelente herramienta para identificar motivos de secuencia altamente conservados y, por lo tanto, funcionalmente importantes en regiones codificantes y no codificantes del genoma. Catalogar las variaciones genéticas entre individuos ayudará a identificar aquellos cambios que conducen a enfermedades genéticas, investigar nuevas terapias y establecer la resistencia o susceptibilidad a diferentes factores. En Febrero de 2001, coincidiendo con el cincuenta aniversario de la publicación del modelo estructural del DNA por Watson y Crick, la revista Nature publicó el primer borrador del genoma humano, que ha sido secuenciado completamente. También se han secuenciado exitosamente en los últimos años los genomas completos de más de 30 bacterias y de varios eucariotas, entre los que se encuentran la levadura, Saccharomyces cerevisiae, el nematodo Caenorhabitis 214 ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.

198 elegans, la mosca del vinagre Drosophila melanogaster y una planta, Arabidopsis thaliana. Actualmente se encuentran en marcha proyectos de secuenciación de los genomas de diferentes modelos animales como rata, ratón, perro, gato, cerdo, etc. y vegetales como arroz, maíz, colza, soja, trébol, raigrás, etc. A continuación se brinda un panorama global acerca de la forma en que se articulan los proyectos de genómica, algunos resultados relevantes, las aplicaciones en agricultura y el estado de la investigación en Sudamérica. 2 Genómica estructural Como su nombre lo indica, el objetivo de la misma es caracterizar la estructura del genoma. Conocer la estructura de un genoma individual puede ser de utilidad para manipular genes y segmentos de ADN en una especie particular. El análisis comparativo de diferentes genomas posibilitará deducir reglas generales que gobiernan la estructura de todos los genomas. La genómica estructural procede a través de niveles incrementales de resolución analítica, comenzando con la asignación de genes y marcadores a cromosomas individuales, mapeando estos genes y marcadores dentro de los cromosomas, finalizando con la preparación de un mapa físico a través de la secuenciación. Es decir, que se procede desde un mapeo genético de baja resolución, basado en el análisis de recombinación meiótica, hacia uno de alta resolución, basado en marcadores moleculares, llegando a la realización de un mapa físico, basado en la secuencia de fragmentos clonados parcialmente solapantes (Fig. 3). Figura 3: Niveles de complejidad de la genómica estructural. La genómica estructural procede desde un mapeo genético de baja resolución, basado en el análisis de recombinación meiótica, a uno de alta resolución, basado en marcadores moleculares hasta la realización de un mapa físico, basado en la secuencia de fragmentos clonados solapantes. Modificada de Griffths et al. (2000). Los pasos serían: - Mapeo cromosómico de baja resolución (ubicación de genes que producen fenotipos mutantes conocidos y algunos marcadores). Las distancias genéticas se basan en frecuencias de entrecruzamientos («crossing overs») y son medidas como porcentaje de recombinación en centimorgans (cm). - Mapeo genético de alta resolución de cada cromosoma (con marcadores moleculares ubicados muy próximos entre sí). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 215

199 - Mapeo físico, basado en distancias moleculares, resultantes de mapas de fragmentos de restricción parcialmente superpuestos. La distancia entre dos marcadores puede ser medida determinando el tamaño de los fragmentos de restricción que los contienen, siendo el fragmento más pequeño que lleva ambos marcadores una estimación de la distancia entre ellos. Utilizando combinaciones de sondas y enzimas de restricción puede construirse un mapa físico determinando qué fragmentos poseen marcadores en común. Las distancias físicas se miden en kilobases (Kb) o megabases (Mb). - Anclado del mapa genético en el mapa físico. - Secuenciación de ADN a gran escala, que brinda un mapa completo de cada cromosoma. - Anclado del mapa genético y del mapa físico en el de secuencia. Las distancias físicas generalmente no se correlacionan directamente con las distancias genéticas porque las frecuencias de recombinación no son siempre proporcionales a las distancias moleculares. Sin embargo, a menudo las dos correlacionan razonablemente bien en las regiones eucromáticas de los cromosomas (aquellas menos condensadas, que se colorean de manera más difusa ). En humanos, un cm es equivalente, en promedio, a aproximadamente 1 Mb de ADN. 2.1 Asignación de loci a cromosomas específicos Se utilizan los siguientes métodos: - Ligamiento a loci conocidos: análisis tradicional basado en cruzamientos, en especies en las que es factible hacerlo. - Electroforesis de campo pulsátil: se usa en el caso de especies que poseen cromosomas pequeños, separables por esta técnica, como sucede con los de levaduras. Las bandas en el gel corresponderían a cromosomas individuales y pueden utilizarse para localizar nuevos genes por hibridación. Primero, utilizando sondas de localización conocida se establece que banda corresponde a cada cromosoma. Luego, un nuevo gen clonado de ubicación desconocida se utiliza como sonda para asignarle una posición en un cromosoma determinado. - Híbridos celulares interespecíficos, por ejemplo humano-ratón. Se utiliza exclusivamente en mapeo del genoma humano o de especies animales. Se establecen bancos de líneas celulares que contengan todos los cromosomas del roedor y un cromosoma humano particular. Siempre incluye un cromosoma humano que lleva un alelo salvaje defectivo para una función bioquímica determinada en el genoma del ratón. Si sobreviven en un cultivo deficiente para el factor que no sintetizan es porque llevan el alelo humano equivalente, que complementa la función faltante. 2.2 Ubicación de los genes a lo largo del cromosoma El próximo nivel de resolución consiste en determinar la posición de un gen o marcador molecular sobre el cromosoma. Este paso es importante porque los mapas genéticos pueden alinearse con los mapas físicos y utilizarse para validar los mismos. - Mapeo por recombinación: en los casos en que ha sido factible hacerlo -organismos experimentales como levaduras, la mosca de la fruta, ratón, Arabidopsis, etc- ha posibilitado la construcción de mapas que a lo largo de los años aparecen repletos de genes con efectos fenotípicos determinados. Sin embargo, los intervalos recombinacionales entre genes conocidos contienen cantidades muy grandes de ADN. Estos intervalos o «gaps» no pueden ser completados utilizando análisis de ligamiento debido a la ausencia de marcadores en esas regiones. Para llenarlos y construir mapas de alta resolución surgieron los marcadores moleculares, entre los que se encuentran los RFLP y los SSLP (mini y microsatélites) (ver II.-4 y IV.-2). Estos marcadores permiten la construcción de mapas genéticos con una densidad de un marcador /centimorgan (cm). Aunque tal resolución es un logro muy importante, un centimorgan representa, en humanos, una megabase, lo que equivale a un millón de pares de bases o 1000 kb. Para lograr mayor resolución actualmente existen los SNP, que son marcadores basados en el polimorfismo de un solo nucleótido. - Hibridación in situ: cuando se dispone 216 ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.

200 de un gen clonado éste puede ser utilizado como sonda para hibridar con los cromosomas in situ, para lo cual se lo marca radiactivamente o por fluorescencia. Puede, de ese modo, identificarse a los cromosomas portadores de la secuencia, determinar si son secuencias específicas de un cromosoma y determinar la posición del gen en el mismo. En el caso de fluorescencia, la técnica se denomina FISH («fluorescence in situ hybridization»). La localización del fragmento en el cromosoma se visualiza como un punto brillante (ver II.-5). - Mapeo físico de los cromosomas: aporta un nivel de resolución mayor. Se trata de identificar un conjunto de fragmentos de ADN clonados superpuestos que juntos representen un cromosoma o un genoma completo. Los mapas así obtenidos se llaman mapas físicos, porque el ADN es el material físico del genoma. El mapa físico es útil en tres aspectos: 1- Los marcadores genéticos ubicados en los clones pueden ordenarse y contribuir al proceso general de mapeo. 2- Cuando se han obtenido los clones contiguos, ellos representan una genoteca ordenada de secuencias de DNA que puede utilizarse para futuros análisis genéticos, como, por ejemplo, correlacionar fenotipos mutantes con disrupciones en regiones moleculares específicas. 3- Estos clones constituyen la materia prima para secuenciar en proyectos genómicos a gran escala. 2.3 Secuenciación a gran escala del genoma - Generación de bancos de EST (etiquetas de secuencias expresadas) La complejidad de los genomas eucariotas hace aconsejable, como primera aproximación, no abordar el estudio del genoma completo. Es preferible estudiar sólo una fracción del mismo, es decir, aquellos genes que se están expresando en un momento determinado de la vida del organismo. Para ello se obtienen poblaciones de ADNc (que reflejan sólo secuencias expresadas) que se secuencian de forma masiva para generar miles de secuencias parciales conocidas como ESTs (ver VII.- 2). Estas secuencias de entre pb suelen ser suficientes para la identificación de los genes mediante comparación con las secuencias existentes en las bases de datos públicas (ej. Genbank, EMBL), utilizando para ello programas de análisis informático. Si la información contenida en la secuencia parcial no es suficiente, habría que determinar la estructura del ADNc completo para estudiar su función por otros métodos. - Secuenciación genómica La aproximación anterior no permite identificar genes que se expresan a bajo nivel o en situaciones fisiológicas no consideradas o regiones no representadas en el ARNm. Para obtener esta información debe secuenciarse el genoma completo. Para ello, el ADN genómico total se digiere con enzimas de restricción apropiadas o se fragmenta mecánicamente para generar fragmentos de gran tamaño ( kb), que se clonan en vectores apropiados, para construir genotecas que contienen, al menos, una representación completa del genoma, que puede estudiarse en detalle y secuenciarse (ver II.-3). A fin de distinguir las regiones codificantes para genes, que en muchos organismos representan un porcentaje bastante pequeño del genoma, de las no codificantes, las secuencias se comparan con las secuencias de ESTs y ADNc previamente estudiadas. a) Secuenciación de los clones y ensamblado de los fragmentos El clonado comienza obteniendo un número elevado de fragmentos al azar que se clonan en un vector apropiado. En la preparación de mapas físicos de genomas se utilizan vectores como los cósmidos, los YAC, los BAC y los PAC, que aceptan insertos de gran tamaño (ver II.-3). El contenido de estos clones se caracteriza y se ordenan, buscando los puntos de solapamiento o superposición. Un conjunto de clones solapantes se llama contiguo (contig). Para establecer el solapamiento de clones al azar se secuencian regiones cortas del inserto proximales al sitio de clonado utilizando primers posicionados en el vector. Los vacíos (gaps) se completan utilizando el final de un Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 217

201 fragmento clonado para llegar al siguiente (primer walking). A medida que se van caracterizando los clones, los contiguos se alargan y van convergiendo unos con otros. El proyecto termina cuando se tiene un conjunto de contiguos que equivale al número de cromosomas de la especie en estudio. En la Fig. 4 se resume una estrategia de secuenciación jerárquica (hierarchical shotgun sequencing). Esta se usa para genomas grandes. Para genomas más pequeños se utiliza otra, llamada secuenciación de genomas completos (whole genome shotgun sequencing). Todos los estadíos del análisis genómico como la preparación de clones, el aislamiento de ADN, la electroforesis y la secuenciación han sido bien adaptados a diferentes máquinas o robots, automatizando el trabajo. b) Ordenamiento de los clones Se utilizan varias técnicas para ordenar los clones en contiguos. Entre ellas: - FISH: para localizar las posiciones aproximadas de insertos grandes. - Fenotipificación (fingerprinting): se corta el clon con enzimas de restricción que generan un grupo de bandas que representan un «fingerprint» o «huella digital» del clon. Las bandas generadas por varios clones pueden alinearse visualmente o por un programa de computación para determinar si se superponen o solapan. - STS («sequence tag sites» o sitios de secuencia marcada): son secuencias cortas de insertos grandes clonados. Se reúne un conjunto de clones al azar y se cortan en fragmentos más pequeños que se clonan en λ y se secuencian pequeñas regiones de cada uno. Para ello se diseñan primers que amplifican una secuencia corta de ADN (STS). Figura 4: Estrategia de secuenciado jerárquico («hierarchical shotgun sequencing strategy»). El primer paso consiste en construir una genoteca por fragmentación del ADN e introducción del mismo en vectores que aceptan grandes insertos, en este caso de BACs. Los fragmentos de ADN representados en la misma son organizados en un mapa físico y los clones individuales son seleccionados y secuenciados para lo cual se hace una nueva genoteca de trozos más pequeños («shotgun library»). La secuencia de los clones se ensambla finalmente para reconstruir la secuencia del genoma. Modificada de la publicación del International Human Genome Sequencing Consortium, Utilización de mapas genómicos para el análisis genético Los mapas genéticos y los mapas físicos son un importante punto de partida para varios tipos de análisis genético, incluyendo el aislamiento de genes y genómica funcional. Por ejemplo: - Aislamiento de genes por clonado posicional: para ubicar un gen cuya secuencia se desconoce se puede partir de un marcador conocido que esté estrechamente ligado al mismo. Este marcador actúa como 218 ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.

202 punto de partida para el procedimiento de caminado cromosómico (chromosome walking), por el cual los fragmentos finales del marcador ligado son utilizados como sondas para seleccionar otros clones de la genoteca. Del segundo grupo de clones (los que solapan con el inicial) se hacen mapas de restricción y los fragmentos obtenidos son utilizados para hacer una nueva ronda de selección de clones superpuestos. Así el proceso de «caminado» se mueve hacia ambos lados a partir del sitio inicial, que culmina cuando se llega al gen de interés. Existe otra técnica relacionada llamada salto cromosómico, que permite saltar a través de áreas distantes y potencialmente no clonables del ADN y genera «marcas», ampliamente espaciadas a lo largo de la secuencia, que pueden utilizarse como puntos de inicio para múltiples caminatas cromosómicas bidireccionales. Esta técnica consiste en crear fragmentos grandes (entre kb) por restricción del ADN en la región que se cree contiene al gen de interés. Cada fragmento de ADN es luego circularizado, poniendo en contacto los extremos libres. Este procedimiento acerca puntos relativamente distantes de la región de genoma en estudio. Se trata de generar en esa unión un sitio que no sea cortado en una posterior restricción, de manera que esas dos regiones que estaban distantes en el genoma ahora esten unidas en un fragmento. El círculo se corta con una nueva enzima de restricción y los fragmentos obtenidos, entre los que se encuentran los sitios de unión, se clonan en fagos. Esto es lo que se llama una «genoteca de saltos». Una sonda del sector de comienzo de la región que contiene al gen de interés puede utilizarse como punta de partida para comenzar a «saltar» por el genoma. Un salto puede, por ejemplo, avanzar unos 50 kb hacia el locus de interés. Una vez allí, el otro extremo de la unión del fragmento inicial se corta y se usa para buscar el siguiente punto de salto en la genoteca. O sea que a través de las uniones se va avanzando hacia el punto donde se encuentra el locus. Cada posición de salto es un punto de partida para una caminata cromosómica. Estas regiones se van secuenciando. Allí comienza la búsqueda de genes utilizando programas de predicción y se seleccionan las secuencias candidatas. Esta estrategia de saltos se utilizó para clonar el gen de la fibrosis quística, que es una enfermedad humana que resulta fatal y es causada por mutaciones en gen de gran tamaño localizado en el cromosoma 7. - Estrategia del gen candidato: la caracterización de una región cromosómica hace que aparezcan varios genes de función desconocida. Si un gen de interés es mapeado en esa región, estas secuencias pasan a ser «candidatas». Para cada una de ellas, o para la más probable de acuerdo al análisis de secuencia, se diseñan experimentos tendientes a determinar en cuales tejidos se expresa, en qué condiciones, etc., utilizando Northern blot o RT-PCR. Si el patrón de expresión encontrado coincide con el patrón esperado es altamente probable que hayamos encontrado el gen de interés. El experimento ideal para confirmar esto, sería la transformación de un individuo mutante para esta función con el gen normal. Si se produce la reversión del fenotipo mutante (complementación), tendremos la prueba irrefutable de que estamos frente al gen buscado. - Genes con patrones complejos de herencia: no todos los genes muestran patrones simples de herencia. Puede suceder que: - La variación fenotípica sea cuantitativa, como peso o altura. Este tipo de variación se debe a la interacción acumulativa entre alelos + y de varios genes y el ambiente. La disponibilidad de miles de marcadores moleculares como los SSLP, dispuestos a lo largo del cromosoma, ha posibilitado el mapeo de algunos de estos genes que contribuyen a la variación cuantitativa cuyos loci son llamados QTL (quantitative trait loci). Para abordar este problema, se buscan dos tipos de líneas que muestren fenotipos contrastantes para un carácter cuantitativo y se cruzan para generar descendencia homocigota que contenga solo un segmento o un pequeño número de segmentos de una de las líneas. Se realizan cruzas y retrocuzas y se obtienen líneas endocriadas recombinantes (RIL). Estos individuos pueden caracterizarse por su fenotipo y puede estimarse la contribución de los segmentos específicos a la variación observada. (ver IV.2) En el futuro, el análisis de SNP (polimorfismos de un nucleótido simple) promete ace- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 219

203 lerar el mapeo de caracteres complejos. Nuevos enfoques de mapeo de QTL y QTN (quantitative trait nucleotide) están disponibles. El concepto emergente es la posibilidad de explorar directamente la variación dentro de genes y no a través de marcadores anónimos. 4 Análisis funcional de los genes Una vez secuenciado el genoma completo pueden identificarse la mayoría de los genes de una especie. Restaría entonces determinar cuál es la función de cada uno de ellos y cómo interaccionan para definir un fenotipo determinado. La genómica funcional intenta resolver esta cuestión a través del estudio de: - El transcriptoma: se refiere al estudio de los perfiles de expresión de todos los genes presentes en el genoma. El método más utilizado es el de micromatrices de ADN, que permite analizar simultáneamente la expresión de miles de genes, pudiéndose disponer genes (ESTs, ADNc, oligonucleótidos) sobre un portaobjetos utilizando un sistema robotizado. Sobre este chip de ADN se realizan experimentos de hibridación con muestras marcadas radioactivamente o con fluoróforos apropiados, y los resultados se cuantifican mediante análisis con phosphorimager o microscopía confocal (ver VII.-2). De esta manera se pueden identificar, de forma simultánea, los patrones de expresión de miles de genes en un momento del desarrollo o en respuesta a diferentes estímulos ambientales. El análisis bioinformático de estos datos permite asociar grupos de genes que se expresan de forma coordinada y proporciona información importante sobre la función de los mismos, ver (VII.3). - El proteoma: comprende el conjunto total de proteínas expresadas por un genoma completo, incluyendo las modificadas después de la traducción. El estudio del transcriptoma debe ser complementado con el análisis de expresión de las proteínas codificadas por los transcriptos, puesto que estas macromoléculas están al final de la ruta de expresión génica. El método más utilizado para estudiar la abundancia relativa de cientos de proteínas es la electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D- PAGE), que permite separar con gran resolución, la mayoría de los polipéptidos celulares combinando de forma secuencial diferencias en carga y en masa molecular. Utilizando sistemas computarizados de análisis de imagen se seleccionan las proteínas cuya abundancia relativa cambia durante el desarrollo o en respuesta a diferentes estímulos ambientales. Los polipéptidos se purifican y digieren con proteasas para generar una colección de péptidos que se analizan por espectrometría de masas o se secuencian a partir del extremo amino. Para identificar la proteína, los perfiles de masa molecular o secuencias de aminoácidos obtenidos se comparan con las bases de datos de proteínas existentes. - El metaboloma: comprende el conjunto total de metabolitos de una célula. En plantas, el metabolismo secundario (conjunto de reacciones que no son vitales para el individuo y que conducen a la produción de compuestos que no tienen una función reconocida en el manteniento de los procesos fisiológicos fundamentales de los organismos que los sintetizan pero que a veces ayudan a la supervivencia, como por ejemplo antraquinonas, alcaloides, digoxina, taumatina, vainillina, menta, etc.) produce una enorme variedad de compuestos diferentes de los que se han identificado y se estima que aún quedan por descubrir alrededor de Los investigadores que trabajan en este nuevo campo de la química aplicada a la biología (metabolómica) consideran que sólo de esta forma se podría definir, en términos moleculares, un fenotipo concreto. En metabolómica se emplean herramientas analíticas muy sensibles (tales como espectrometría de masa, cromatrografía líquida o gaseosa y resonancia magnética nuclear) para analizar los cambios metabólicos provocados por mutaciones génicas o por la expresión de transgenes. La metabolómica puede ser aplicada al monitoreo de estreses inducidos, para identificar pasos metabólicos limitantes, para el análisis de mutantes y hasta para realizar la evaluación de manejos agronómicos, tales como el efecto de fertilizantes sobre el metabolismo, etc. - La bioinformática intenta dar sentido 220 ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.

204 a la información derivada de las técnicas anteriormente descritas. La importancia de esta ciencia resulta obvia cuando se considera que los genomas poseen miles de millones de pares de bases (ver VII.-3). 5 Modelos El mapeo comparativo ha demostrado que la organización de los genes dentro de los genomas ha permanecido muy conservada a través de la evolución, existiendo estrechas relaciones de colinearidad entre los genomas de casi todas las gramíneas cultivadas, entre las solanáceas, entre las brasicaceas cultivadas y Arabidopsis, entre los pinos, rosáceas y varias leguminosas. Por ello, teniendo en cuenta la envergadura de un proyecto de secuenciado de un organismo, los emprendimientos genómicos tomaron especies modelo, representativas de un genoma vegetal. El primer modelo vegetal fue una dicotiledónea, Arabidopsis thaliana. Le siguió una monocotiledónea, el arroz, cuyo genoma es seis veces menor que el del maíz y 37 veces menor que el del trigo. El estudio de estas dos especies permitirá arribar a conocimientos clave para el mejoramiento vegetal. Arabidopsis thaliana es una dicotiledónea que posee uno de los genomas vegetales más pequeños. Carece de importancia económica pero resulta ser un excelente organismo para la investigación puesto que es fácil de transformar y su ciclo de vida tarda sólo 7 semanas, de semilla a semilla. Alrededor de científicos trabajan coordinadamente en Arabidopsis, conformando el más avanzado sistema de experimentos en biología de plantas del mundo. Su secuencia genética es de libre acceso en el sitio Web así como también las experiencias biotecnológicas que se están o se han realizado con esta planta. En un artículo publicado en Nature (2000) se analiza el genoma de esta planta a partir de las megabases secuenciadas (de un total de 125). Pudo establecerse que la evolución de Arabidopsis involucró una duplicación completa del genoma, seguida por una subsecuente pérdida y duplicación de genes, lo cual dio origen a un genoma dinámico, enriquecido por una transferencia lateral de genes de cianobacterias. El genoma contiene genes que codifican para familias de proteínas, con una diversidad funcional similar a la encontrada en Drosophila y Caenorhabditis elegans. Arabidopsis posee varias familias de proteínas nuevas pero carece de otras comunes, indicando que los conjuntos de proteínas en común han experimentado una expansión y contracción en estos tres grupos eucariotas. 6 Algunas generalizaciones acerca de los genomas Los estudios en especies modelo han permitido arribar a varias generalizaciones. Una de ellas es que el número de genes no es la base de la complejidad. La mosca de la fruta tiene unos genes, Caenorhabitis elegans 18000, Arabidopsis y los humanos Si el número de genes nos es muy diferente entre estas especies, cuál es la base de la mayor complejidad en los humanos? La explicación estaría en el proteoma, más que en el genoma. Las proteínas codificadas por los genes pueden agruparse en familias en base a su similitud y muchas de estas familias proteicas son compartidas por todos los grupos mencionados, aunque el número de miembros por familia es mayor en humanos. Esto es particularmente evidente en aquellos genes involucrados en el desarrollo. Los humanos tenemos 30 genes para factores de crecimiento del fribroblasto, mientras que Drosophila y Caenorhabitis elegans tienen 2. Las nuevas proteínas surgen a través de cortes y empalmes alternativos de un mismo ARN (alternative splicing), lo que permite aumentar considerablemente la diversidad proteica a partir de los mismos mensajes. Las predicciones indican que el 60 % de los genes humanos tiene dos o más alternativas de splicing. En Caenorhabitis el 22%. Un elevado número de factores de transcripción y modificaciones postraduccionales también conducen a una mayor complejidad. En el caso de Arabidopsis, cerca del 9 % de los genes son factores de transcripción Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 221

205 (FT). Si se compara la proporción con los genomas de otras especies, se observa que Arabidopsis no sólo tiene más genes que algunos animales pequeños, sino que la proporción de FT es más alta que en cualquier clase de organismo estudiado. Esto parece reflejar el hecho de que las plantas deben adaptarse a una amplia variedad de condiciones medioambientales, a diferencia de los animales, que pueden movilizarse y cambiar de lugar si este no les resulta propicio. En humanos, los genes ocupan una cuarta parte del genoma, y sólo el 1,5% codifica para proteínas. Las secuencias correspondientes a los exones (secuencias del mensajero que se encuentran representadas en la proteína, las secuencias correspondientes a los intrones no lo están) comprenden un porcentaje bajo del genoma, mientras que los intrones comprenden el 24%. Los genes no están distribuídos en forma pareja. Algunos se encuentran agrupados en ciertas regiones del genoma mientras que otros se encuentran aislados. En la mosca, el nematodo y Arabidopsis la disposición de los genes es mucho más regular. Aproximadamente la mitad del genoma humano consiste de secuencias repetitivas, siendo la mayoría de ellas secuencias «parásitas» de elementos transponibles que se propagan replicándose e insertando una copia de sí mismos en otras regiones del genoma. En la actualidad solo dos tipos de elementos son activos, Alu y LINE1. La mayoría de los mismos se encuentran en regiones ricas en A y T, mientras que los genes se encuentran en áreas con elevado contenido de G y C. Fragmentos de estos elementos también se encontraron en las secuencias regulatorias que controlan la expresión de varios genes, por lo que se ha sugerido que, de alguna manera, podrían afectar positivamente su expresión y evolución. Los genomas vegetales también están plagados de estas secuencias repetitivas. Haciendo uso de la posibilidad que nos brindan las bases de datos de llevar a cabo «Northerns electrónicos» fue posible encontrar elementos repetitivos en las bases de EST de trigo, cebada y centeno, siendo 0.15 % de las EST similares a retrotransposones (elementos genéticos transponibles, es decir que pueden movilizarse de un sector del genoma a otro y cuyo movimiento depende de la transcripción reversa. Son secuencias sin función aparente que han contribuído a lo largo de la evolución a la expansión de los genomas de plantas y animales superiores). Ejemplo aplicado al mapeo y caracterización de los genes de vernalización de los cereales Un ejemplo interesante para aplicar varios de estos conceptos ha sido la investigación que llevó al mapeo y caracterización de los genes de vernalización de trigo (Yang y col., 2004). El descubrimiento de estos genes es un buen ejemplo de cómo se encaran algunos proyectos de genómica. Se utilizó trigo diploide (2n=2x=14 AA) debido a la menor complejidad de su genoma que los del trigo pan y candeal y se confeccionaron detallados mapas genéticos y físicos para la región cromosómica que los contenía en trigo, arroz y sorgo. Haciendo uso de las herramientas de la genómica comparativa se determinó que uno de estos genes, VRN1, está involucrado en la transición de los ápices desde un estado de crecimiento vegetativo a uno reproductivo. Este gen es similar a uno hallado en Arabidopsis llamado APETALA1, que no está involucrado en la respuesta a la vernalización. El otro gen involucrado en el proceso, VRN2 es un represor dominante de la floración en cereales de invierno. Por mapeo genético de alta densidad, utilizando una población de trigo diploide obtenida de cruzar progenitores con hábitos contrastantes de crecimiento, uno primaveral y el otro invernal, se determinó que este gen se encuentra ubicado en el brazo largo del cromosoma 5A. A partir de aquí se realizó el clonado posicional del mismo. Esto significa que a partir de marcadores conocidos ubicados en el genoma se comenzó una caminata cromosómica. De esta manera se construyó un mapa físico o de secuencia de la región que contenía el gen. Para ello se utilizaron marcadores moleculares distruibuídos en la región, genotecas de BAC y genotecas de ADNc. La comparación de la secuencia de esta región con regiones equivalentes de cebada y de arroz permitió establecer que esta región contenía ocho genes, 222 ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.

206 Figura 5: La inhibición de la expresióndel gen VRN2 por transgénesis acelera la floración en aproximadamente un mes en comparación con la misma variedad de trigo no modificada. De Yan et al. (2004), gentileza Dr. Jorge Dubcovsky. cinco de los cuales se encontraron en el mismo orden y orientación que en la cebada y tres como en el arroz. La función de algunos de estos genes es aún desconocida. La región también contenía elementos repetitivos o retrotransposones. Dos de los genes allí ubicados, denominados ZCCT1 y ZCCT2, codificaban para proteínas muy similares, lo cual permitió inferir que los mismos provienen de un evento de duplicación que ocurrió millones de años atrás. Estas proteínas resultaron ser similares a una proteína de Arabidopsis y de arroz que está involucrada en la regulación del tiempo de floración. Por ello, este gen era un candidato atractivo para ser el represor de floración, es decir VRN2. Los transcriptos de este gen son muy poco abundantes en las hojas y desaparecen durante el proceso de vernalización, no obstante ello, el análisis de su expresión permitió determinar que junto con la desaparición de los transcriptos de VRN2 se produce un incremento de los transcriptos de VRN1, lo cual resultaba coherente con la interacción epistática entre los dos genes y con el hecho de que VRN2 actúe como un represor de la floración, que directa o indirectamente reprime la transcripción de VRN1. Todas las pruebas de localización de los transcriptos y niveles de expresión condujeron a concluir que ZCCT1 era VRN2. También se estableció que las diferencias entre variedades invernales y primaverales de trigo estarían dadas por diferencias en la región codificante de este gen (es decir en aquella región que está representada en el ARN mensajero). En una accesión de hábito primaveral se encontró una mutación de punto que redundaba en un cambio de un aminoácido arginina por un triptofano en una región crítica del gen, lo cual afectaría su función. La arginina se encuentra en todas las proteínas del tipo ZCCT de Arabidopsis, arroz y cebada. Esta mutación de punto sería la causante del hábito primaveral. El análisis de este sitio en variedades cultivadas de trigo diploide permitió verificar que la mutación está ausente en todas las variedades de trigo invernal. Lo mismo ocurrió en cebada. Todo esto llevó a sugerir que la gran adaptabilidad de los cereales de clima templado fue favorecida por un sistema muy flexible de regulación de la iniciación de la floración. El hábito ancestral de crecimiento invernal, esencial para la adaptación a clima frío, poseería el potencial para generar formas primaverales por mutaciones de pérdida de función en los dos principales loci de vernalización. Para validar la hipótesis de que ZCCT1 era VRN2 se transformó trigo pan invernal con una construcción que inactivaba los mensajeros del mismo, técnica denominada de ARN de interferencia (ver III.3). Estas plantas transformadas, donde estaba inhibida la expresión del gen (efecto que semejaba la inhibición del mismo por frío) mostraron una aceleración en el tiempo de floración (23 días) en relación a los controles no transformados (Fig.5). Esto confirmó que la disminución en los niveles de los transcriptos de VRN2 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 223

207 (ZCCT1) está directamente relacionada con la aceleración del tiempo de floración. Este experimento demostró, además, que esta tecnología puede ser utilizada para manipular el tiempo de floración del trigo y confirmó que VRN2, un factor de transcripción, juega un rol central en la regulación de la floración. Este sería entonces un nuevo tipo de gen involucrado en la regulación de otros Figura 6: Categorización funcional de ESTs de Deschampsia antarctica. El objetivo de este proyecto es encontrar genes involucrados en la resistencia a bajas temperaturas para ser transferidos, por tecnología génica, a especies de cultivo. Gentileza de G. Spangenberg. genes de floración. En variedades invernales de trigo, VRN2 evita la floración. Cuando la planta se expone a un período de frío durante la vernalización, la actividad del mismo disminuye y permite que la planta florezca. A diferencia del gen VRN1, VRN2 es diferente de un gen de Arabidopsis que tiene una función similar. Esto permitió sugerir que en su evolución, Arabidopsis y los cereales y pastos de clima templado desarrollaron diferentes mecanismos de vernalización, que incluyen genes similares y genes muy diferentes. De ello también se concluye que si bien los modelos son importantes, no siempre se adaptan a todos los casos y hay que analizar todos los detalles antes de extrapolar información para aplicarla a la comprensión de los fenómenos biológicos. 7 Genómica y Agricultura Especialistas en varias disciplinas han llegado a la conclusión de que el alcance de la genómica será mayor en lo que se refiere a la economía y la calidad de vida que en el ámbito de la salud humana. Gracias al aporte de grupos de investigación de todo el mundo se dispone de bases de datos públicas con información genómica de utilidad para los mejoradores. El conocimiento de cómo actúan los genes en una especie puede ayudar a los mejoradores a perfeccionar su función en otra especie. La secuencia de los genomas de Arabidopsis y de arroz proporcionarán información relevante acerca de otros cultivos, como el maíz y el trigo. Dado que estos tres cereales representan más de la mitad de la producción alimentaria mundial y que el arroz es el alimento básico de más de la mitad de la población del planeta, la trascendencia de la genómica en la agricultura es indiscutible. La similitud entre las especies de cereales también implica que cuando se trasladan genes de una especie de cereales a otra, tenderán a funcionar bien y en la misma forma con una mínima manipulación genética. A través de esfuerzos públicos y privados podrán identificarse conjuntos de genes asociados con caracteres como rendimiento, resistencia a la sequía, calidad de los alimentos, resistencia a insectos y tolerancia a herbicidas. De esta manera se acelerará significativamente el aporte de nuevas variedades al mercado, ya sea por modificación genética o por selección con marcadores moleculares o utilizando criterios de selección a partir de la información molecular. La genómica comparativa, basada en el análisis de ESTs de diferentes plantas tolerantes a estreses abióticos, permitirá la identificación de redes de genes comunes asociados con estreses ambientales, tales como salinidad, sequía, bajas y altas temperaturas. El análisis de especies tolerantes a situaciones extremas permitirá localizar genes involucrados en los mecanismos que las hacen tolerantes. Dichos genes podrán entonces ser transferidos a especies de cultivo. Como ejemplos pueden citarse Agrostis adamsonii y Agrostis robusta, tolerantes a salinidad, Microlaena stipoides, tolerante a aluminio y Deschampsia antarctica, toleran- 224 ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.

208 te a bajas temperaturas (la única gramínea que crece en la Antártida) (Fig. 6). También se ha mencionado que los factores de transcripción serían las llaves para desbloquear funciones génicas que aprovechen la diversidad de la naturaleza para producir mejores cultivos. Estos son genes que virtualmente controlan todo carácter importante, desde el punto de vista agrícola, en las plantas, incluyendo rendimiento, resistencia a las enfermedades, protección contra las heladas y sequía, producción de químicos, proteínas usadas en farmacéutica, etc. La mayoría de los caracteres vegetales a los que interesa aplicar la ingeniería genética son multigénicos (ej. tolerancia al estrés hídrico) y los genes involucrados se expresan en cascadas de forma tal que genes primarios activan a genes secundarios que a su vez activan a genes terciarios. Los factores de transcripción serían los responsables de hacer funcionar a los genes primarios, obteniéndose largas cascadas de expresión de genes por la manipulación de un solo gen. Durante los últimos años se ha obtenido una gran colección de FT de plantas, funcionalmente caracterizados, no sólo en Arabidopsis, sino también en especies como tomate, maíz y soja. En total hay cerca de 1900 FT en Arabidopsis pero en el contexto de la genómica funcional el interés recae en unas 60 familias que tienen funciones reconocidas. La herramienta primaria que se utiliza para conocer la función de los FT consiste en sobre-expresarlos y/o detener la expresión de algunos de ellos por disrupción génica o knock out. Se puede, por ejemplo, medir el efecto de cada FT en la composición de los lípidos en las semillas aceiteras y la composición de lípidos en las hojas, la composición de azúcares, de esteroides, etc., estudiar procesos básicos, a través de la dilucidación de sus efectos en el desarrollo vegetal y la resistencia a las enfermedades, o tratar de identificar el FT que regula el consumo de nitrógeno (N). El N es uno de los insumos más costosos para la agricultura, por lo que identificar los genes que controlan y modifican la respuesta al N sería de gran valor. En este sentido también existen proyectos genómicos sobre leguminosas y sus simbiontes fijadores de nitrógeno. Recientemente se han secuenciado los genomas de las especies de Mesorhizobium y Sinorhizobium y se han producido cientos de miles de EST de Medicago truncatula, Lotus corniculatus y soja. En el caso de M. truncatula no sólo se han disectado los pasos que controlan las señales entre la bacteria fijadora y la planta sino también entre la planta y otro simbionte, las micorrizas (asociación de un hongo con la raíz de una planta superior. Esta asociación no es específica de especie como el caso de Rhizobium y las leguminosas. El hongo puede ser de varios géneros y aportan fósforo a la planta,). Recientemente se logró la identificación, en alfalfa, de un receptor requerido para el reconocimiento de señales bacterianas de nodulación, los llamados factores NOD. Las plantas medicinales aportan el 25% de los compuestos activos utilizados actualmente por la industria farmacéutica. Entre estos compuestos se encuentran los citocromos P450, que participan en la biosíntesis de muchos compuestos anticancerígenos, alcaloides, fitoesteroides, antioxidantes y antimicrobianos. También tienen un rol muy importante en la detoxificación de xenobióticos (herbicidas y pesticidas). Se han identificado 1052 citocromos P450 y el objetivo actual es, utilizando herramientas de metabolómica, determinar su función bioquímica precisa. Otro de los objetivos de la metabolómica es el estudio de la síntesis de las esencias que confieren perfume a las flores y el mejoramiento del sabor de algunas plantas utilizadas en alimentación humana, como por ejemplo Cassava, donde el objetivo sería la eliminación de los glicósidos cianogénicos que le confieren sabor amargo. La devastación de los bosques es motivo suficiente para invertir en proyectos de genómica tendientes a la identificación de genes involucrados en perennidad, desarrollo, interacción con herbívoros, respuesta a estrés y síntesis de metabolitos secundarios como lignina y celulosa. Se han comenzado a colectar EST de álamo, abedul, abeto, pino y eucaliptus. El álamo se utiliza como sistema modelo para el análisis de los genes involucrados en la formación de madera. Otro objetivo en este campo es la búsqueda de estrategias para inducir floración temprana, Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 225

209 que es un factor crítico en el mejoramiento de forestales. La secuenciación de los genes y la dilucidación de las vías que controlan la floración en los cereales, que difiere en varios aspectos con los corresponientes en Arabidospsis, ha sido otro de los logros de la genómica. Como se mencionara anteriormente en este capítulo, recientemente se localizaron y caracterizaron, en trigo y cebada, los genes VRN1 y VRN2, que son los genes centrales en la vía de vernalización en trigo, cebada y otros cereales invernales. Este conocimiento es clave en agricultura, ya que permitiría, potencialmente, controlar la floración en cultivos de gran importancia económica, como los cereales y los forrajes. 8 Aportes de la genómica al mejoramiento de trigo El trigo pan (Triticum aestivum L 2n= 6x= 42; AABBDD) es uno de los principales cultivos alimenticios ya que provee cerca del 55% de los carbohidratos consumidos por el hombre. La genética de este cultivo resulta compleja, es de naturaleza hexaploide, con tres genomas homeólogos denominados A, B y D, que aportan 7 pares de cromosomas cada uno. Los genes redundantes son una norma, con sets homoalélicos triplicados en la mayoría de ellos. Dentro de los cereales, el genoma de trigo pan es el de mayor tamaño (17000 Mb trigo, 2800 Mb maíz, 800 Mb sorgo, 450 Mb arroz). Más del 80% del genoma de trigo lo constituyen secuencias de ADN altamente repetitivo. El restante 20% está compuesto por ADN de bajo número de copias o copia única, donde se encuentran la mayoría de los genes. Si bien las secuencias del ADN altamente repetitivo varían de especie en especie, las secuencias de los genes en general son conservadas. Esta característica permite el uso de sondas heterólogas (de otros genomas) en experimentos de hibridación de tipo RFLP (ver II.4) para identificar secuencias conservadas en especies diferentes dentro de una misma familia taxonómica (Devos y Gale, 2000). En 1989 se publicó el primer mapa genético molecular de trigo correspondiente a los cromosomas homeólogos del grupo 7, observándose que en gran parte de los tres genomas de trigo hexaploide se conservaba el orden de los genes y marcadores. Esta fue la primera prueba de colinearidad en gramíneas y posibilita el desarrollo de la genética comparativa en cereales. En trabajos posteriores pudo comprobarse que largos segmentos de los cromosomas de maíz, sorgo, arroz, trigo y cebada conservan la presencia y el orden de marcadores y genes, aunque en algunos casos la correspondencia cromosómica ha sido modificada por duplicaciones, inversiones o translocaciones. En la actualidad se ha logrado consensuar un mapa unificado de gramíneas en el que se detallan secuencias y genes conservados en diferentes genomas (Fig. 2). A partir de esta herramienta es posible transferir información proveniente de plantas de genomas pequeños (arroz, sorgo) a plantas de genomas más complejos como el trigo. Esto facilita la ubicación más precisa de genes para tolerancia a estrés biótico y abiótico, prebrotado, dormición, vernalización, etc. y el desarrollo de marcadores útiles para el mejoramiento. La información generada a partir de los proyectos genómicos de Arabidopsis, arroz y maíz con el descubrimiento de nuevos genes y QTLs permitirá el desarrollo de marcadores perfectos, generados a partir de la información de la secuencia del gen a seleccionar, en lugar de marcadores genéticamente ligados. Actualmente el acceso a los principales genes que afectan la calidad ha abierto nuevas vías para el desarrollo comercial de diferentes productos derivados del trigo. Es posible obtener variedades con diferente calidad de almidón, diferente textura de grano, diferente composición de gluteninas y gliadinas en función del uso industrial. Por otro lado, el descubrimiento de nuevos genes valiosos de otros genomas y la posibilidad de incorporarlos al trigo a través de la transformación permitirá resolver problemas del cultivo, como pueden ser limitantes debido a estreses bióticos y abiótico o desarrollar nuevas generaciones de transgénicos en función de las necesidades del consumidor con mayor contenido de aminoácidos esenciales como la lisina, vitaminas, etc. La complejidad del genoma del trigo ha hecho aconsejable abordar los estudios genómicos a través del transcriptoma. Para ello, se han establecido consorcios interna- 226 ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.

210 cionales. Las bases de datos de EST han crecido exponencialmente en la última década, de manera que en el National Center for Biotechnology Information dbest database ( en Marzo de 2004 había 20 millones de ESTs. Esto incluye cerca de 1 millon de ESTs de trigo hexaploide y sus parientes más cercanos de la tribu Triticeae, que son Hordeum vulgare L., especies diploides y tetraploides de Triticum, Secale cereale L. y Aegilops speltoides Tausch. Toda esta información permite inferir que la biotecnología puede cambiar el escenario del trigo en dos áreas principales: (1) protegiendo al cultivo de estreses bióticos y abióticos y (2) modificando el concepto de producción de «commodities» por el de producción de «specialities» derivadas de trigo, de mayor valor agregado, como noodles (tipo de fideo muy utilizado por los asiáticos), galletitas dulces, crackers (un tipo de galletita que se rompe fácilmente), masa congelada, pan de molde, pasta, almidones, plásticos biodegradables, etc. 9 Genomas trabajadores La genómica aplicada a dilucidar los mecanismos por los cuales funcionan los microorganismos puede conducir al aislamiento de sus componentes para desarrollar nanoestructuras que lleven a cabo complejas funciones. Como ejemplos pueden citarse: Methanococcus jannaschii: es una bacteria que produce metano, una importante fuente de energía. Contiene enzimas que soportan temperaturas y presiones elevadas por lo que son potencialmente útiles para fines industriales.deinococcus radiodurans: soporta niveles de radiación extremadamente elevados por lo cual tiene un alto potencial para limpiar desechos radiactivos. Thalassiosira pseudonana: se trata de una diatomea marina que es la principal participante en el bombeado biológico de carbono hacia las profundidades de los océanos, por lo que posee un elevado potencial para mitigar los cambios climáticos del planeta 10 Proyectos de Genómica en Sudamérica En Sudamérica se han desarrollado y se encuentran en ejecución algunos proyectos genómicos. Frente al estado del desarrollo de estas áreas en el mundo, existen en la región serias carencias, tanto de recursos humanos entrenados como de infraestructura y equipamiento. En Brasil se estableció una red de cooperación que secuenció completamente el genoma de Xylella fastidiosa, bacteria que ataca a los cítricos causando importantes pérdidas económicas. También incursionó en el estudio de genómica funcional de células cancerosas y de secuenciación del genoma de caña de azúcar, Saccharum oficinalis. En Argentina se ha trabajado en la secuenciación de Brucella abortus, agente causal de la brucelosis bovina. Investigadores argentinos participan también en proyectos de genómica en cooperaciones internacionales, como el consorcio involucrado en la secuenciación del genoma de Trypanosoma cruzzi, el proyecto que llevó a la clonación y caracterización de los genes de vernalización en trigo o el proyecto de búsqueda de genes de tolerancia a frío en Deschampsia antarctica. En Chile se ha completado recientemente la secuenciación de Piscirickettsia salmonis, patógeno intracelular de salmones que causa importantes pérdidas en esta industria. Otros ejemplos son el desarrollo de marcadores de microsatélites (ver II.4) de diversas especies, como girasol (colaboración de INTA-Argentina con empresas semilleras locales), vides (INIA-Chile como parte de un consorcio internacional), alpacas y otros camélidos sudamericanos (INIA-Chile), entre otros. Actualmente se está desarrollando en Chile un programa de genómica funcional coordinado por diversos ministerios, destinado a enfrentar problemas de postcosecha y enfermedades en plantas de interés agrícola. En varios países se han secuenciado fragmentos de genomas de virus, y viroides (Argentina, Chile, Uruguay). Los objetivos para programas de genómica sudamericanos deberían enfocarse hacia el aumento de la productividad y la mejora de la calidad de los productos, desarrollando capacidades para identificar genes Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 227

211 propios del germoplasma regional, de manera de disminuir la dependencia de variedades y genes desarrollados y aislados por países del primer mundo y buscar soluciones para problemas propios de la región, que difícilmente pueden ser enfrentados por programas de mejoramiento genético ajenos a la misma. 11 Lecturas recomendadas CENCI A., CHANTRET N., XY K., GU Y., ANDERSON O.D., FAHIMA T., DISTELFELD A., y DUBCOVSKY J Construction and characterization of a half million clones Bacterial Artificial Chromosome (BAC) library of durum wheat. Theor Appl Genet 107: ECHENIQUE V., STAMOVA B., WOLTERS P., LAZO G., CAROLLO V y DUBCOVSKY J Frequencies of Ty1- copia and Ty3-gypsy retroelements within the Triticeae EST databases. Theor. Appl. Genet. 104: GALE M. y DEVOS K Plant comparative genetics after 10 years. Science, 282: DEVOS, K.M,; GALE, M.D Genome relationship: the grass model in current research. Plant Cell 12: GOFF, S.A.; RICKE, D.; LAN, T.H.; PRESTING, G.; WANG, R.; DUNN, M.; GLAZEBROOK, J.; SESSIONS, A.; OELLER, P.; VARMA, H. et al A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science, 296: GRIFFITHS, A.; MILLER, J.; SUZUKI, D.; LEWONTIN, R.; GELBART, W An introduction to the genetic analysis. Séptima Edición. W:H:Freeman, N:York. 860 pp. KNIGHT, JONATHAN News Feature. A Dying Breed Nature 579, vol. 421 KONCZ, C Plant Biotechnology. From genome projects to molecular breeding. Current Opinion in Biotechnology 14: KUMAR, A. y BENNETZEN, J.L Annu Rev Genet 33: LAGUDAH, E.; DUBCOVSKY, J. y POWELL, W Wheat Genomics. Plant Physiology and Biochemistry. 39: MORGANTE, M. y SALAMINI, F From plant genomics to breeding parctice.current Opinion in Biotechnology14: RAFALSKI, A Applications of single nucleotide polymorphisms in crop genetics. Curr Opin Plant Biol, 5: SANMIGUEL, P.; RAMAKRISHNA, W.; BENNETZEN, J. L.; BUSSO, C. y DUBCOVSKY, J Transposable elements, genes and recombination in a 215-kb contig from wheat chromosome 5A. Functional and Integrative Genomics. 2: SCHNEIDER, K.; WEISSHAAR, B.; BORCHARDT, D.C.; SALAMINI, F SNP frequency and allelic haplotype structure of Beta vulgaris expressed genes. Mol Breed, 8:63-74 SNUSTAD, D.; SIMMONS, M Principles of Genetics. 3th. edition. John Wiley and Sonds, Inc. 840 pp. WADE, C.M.; KULBOKAS, E.J. III; KIRBY, A.W.; ZODY, M.C.; MULLIKIN, J.C.; LANDER, E.S.; LINDBLAD-TOH, K. y DALY, M.J The mosaic structure of variation in the laboratory mouse genome. Nature, 420: YAN, L.; ECHENIQUE, V.; BUSSO, C. S.; SANMIGUEL, P.; RAMAKRISHNA, W.; BENNETZEN, J.L.; HARRINGTON, S. y DUBCOVSKY, J Cereal genes similar to Snf2 define a new subfamily that includes human and mouse genes. Molecular and General Genomics 268: YAN, L.; LOUKOIANOV, A.; BLECHL, A.; TRANQUILLI, G.; RAMAKRISHNA, W.; SANMIGUEL, P.; BENNETZEN, J.; ECHENIQUE, V. y J. DUBCOVSKY Positional cloning of wheat VRN2 gene reveals a new vernalization pathway. Science. En prensa. YANO, M.; KATAYOSE, Y.; ASHIKARI, M.; YAMANOUCHI, U.; MONNA, L.; FUSE, T.; BABA, T.; YAMAMOTO, K.; UMEHARA, Y.; NAGAMURA, Y. Y SASAKI, T Hd1, a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice, is closely related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS. Plant Cell, 12: YU, J.; HU, S.; WANG, J.; WONG, G.K.; LI, S.; LIU, B.; DENG, Y.; DAI, L.; ZHOU, Y.; ZHANG, X. et al A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica). Science, 296: The Arabidopsis Genome Initiative: Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 2000, 408: The Caenorhabitis elegans Sequencing Consortium. Science, 282, The Genome International Sequencing Consortium. Nature, 409, The Yeast Genome Directory, Nature, 387, supplement ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.

212 VII.-Capítulo 2 Métodos para el estudio de la expresión de genes Pessino, Silvina C.; Martelotto, Luciano G. 1 Introducción La capacidad de secuenciar genomas completos desarrollada en la última década ha impulsado a la investigación científica en la dirección de definir la función de cada uno de los genes identificados. Para contribuir con ese objetivo se han diseñado técnicas que permiten estudiar la expresión génica global en un determinado tejido y en un momento particular del desarrollo, posibilitando la identificación inicial y el agrupamiento en clases funcionales de secuencias nuevas con una actividad asociada. Los procedimientos para esta evaluación han progresado desde los métodos desarrollados para el análisis de genes únicos específicos (como el Northern slot y dot blotting, la RT-PCR semicuantitativa y cuantitativa y los ensayos de protección de nucleasas) hacia otros enfocados en la identificación de múltiples transcriptos que difieren en su representación entre las diversas muestras experimentales (como la hibridación substractiva, el display diferencial, el ADNc-AFLP, la secuenciación de etiquetas expresadas o EST, el análisis serial de la expresión de genes o SAGE y la hibridación de microarreglos). La organización de las secuencias dentro de grupos funcionales basada en los datos de expresión y de homología proporciona un marco básico para conducir nuevos estudios dirigidos a definir la actividad precisa de cada producto génico. 2 Hibridación substractiva Los métodos de hibridación substractiva fueron creados a principios de la década que comenzó en 1980 con el propósito de construir bibliotecas de ADNc para obtener sondas de genes expresados diferencialmente. Fueron los primeros que se utilizaron de manera amplia con el propósito de identificar genes regulados positiva o negativamente en una escala global. Sus ventajas incluyen la habilidad de aislar genes de función relacionada sin tener conocimientos previos de su secuencia o identidad y el uso de técnicas comunes de biología molecular que no requieren equipos especializados de detección y análisis. El procedimiento general consiste en la hibridación de ADNc provenientes de una muestra prueba (tester) con un exceso de ARNm proveniente de una muestra control (driver). Los transcriptos expresados en ambas muestras (tester y driver) forman moléculas de ARNm/ADNc híbridas, mientras que las secuencias de ADNc que están presentes únicamente en la muestra tester permanecen como hebras simples. Las moléculas de hebras simples y dobles se separan usando cromatografía en hidroxilapatita. Los ADNc expresados diferencialmente pueden entonces ser recuperados y clonados o usados directamente como sondas para analizar una biblioteca. Dos limitaciones importantes del protocolo original son: i) el requerimiento de grandes cantidades de ARNm y ii) la tendencia a una menor eficiencia en la identificación de transcriptos poco abundantes. La hibridación substractiva es aplicable sólo a comparaciones de pares de muestras y debe ser realizada por duplicado con el tester y el driver invertidos para detectar tanto aumentos como disminuciones en los niveles de expresión. Además no genera una medida cuantitativa y aunque es eficiente en la identificación de genes que están completamente ausentes en el driver no revela fácilmente a aquellos que están presentes en ambas muestras en distinta proporción. A fin de mejorar el protocolo original se realizaron modificaciones que incluyen la producción de ADNc con marcas de biotina u oligo(dt)30-látex de manera de refinar la separación de las moléculas de cadena simple y doble. También se incorporó la amplificación de ADNc selectos por PCR para disminuir la cantidad inicial de marn requerido y aumentar la eficiencia de clonado de los transcriptos seleccionados. En la actualidad se utiliza más comúnmente un protocolo ingenioso conocido como hibridación substractiva de supresión (SSH) que fue diseñado para favorecer la detección de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 229

213 transcriptos raros expresados diferencialmente. Este incluye una normalización en la representación de los transcriptos diferenciales basada en la inhibición de la amplificación de aquellos que son más abundantes, eliminando también la necesidad de separar moléculas de cadena doble y simple (Fig.1). 3 Display diferencial y RAP-PCR Las técnicas conocidas en general como «huellas digitales genéticas de ARN» (ARN fingerprinting) incluyen al display diferencial (DD) y al fingerprinting de ARN con una PCR cebada arbitrariamente (RAP-PCR). Ambos métodos están basados en una amplificación por PCR de subgrupos al azar de transcriptos a partir de dos o más muestras. La primera etapa de ambos procedimientos es común y consiste en generar ADNc haciendo una transcripción reversa de una fracción de las moléculas de ARNm de una muestra. En el display diferencial esto se logra utilizando como cebador de la transcripción reversa a un polit anclado con una o más bases adicionales al extremo 3 del ARN mensajero (por ejemplo (T) 12 AC). Estos oligonucleótidos se fijan al ARN mensajero a través de la unión de las bases adicionales, impidiendo que el polit «resbale» sobre distintas zonas del poli A. El único grupo de ARNm que es transcripto en forma reversa es el integrado por las moléculas que llevan las bases complementarias a las bases adicionales del polit en el extremo del mensajero adyacente al polia. En contraste, la RAP-PCR utiliza oligonucleótidos de secuencia arbitraria para la transcripción reversa. Estos cebadores tienen normalmente 10 bases de largo y se unen a sus secuencias com- Figura 1: Esquema general que describe el procedimiento de hibridización substractiva de supresión (SSH). El ADNc prueba (tester) se divide en dos porciones iguales que se ligan a dos adaptadores diferentes y son hibridizadas por separado con un exceso de ADNc de la muestra control (driver), lo que conduce a la formación de los productos de tipo a, b, c y d que se indican en la figura. Luego ambas muestras se mezclan y se rehibridizan en presencia de un exceso adicional del driver desnaturalizado, lo que origina los productos a, b, c, d y e. Los extremos de las hebras dobles se rellenan y los fragmentos se amplifican por PCR utilizando cebadores complementarios a los adaptadores. El enriquecimiento en las moléculas e se logra durante la amplificación por PCR ya que: i) a y c pueden unir un solo cebador por lo que se amplifican linealmente; ii) la amplificación de b está suprimida debido a la complementariedad de unas terminaciones largas repetidas invertidas presentes en la secuencia del adaptador que promueven la formación de estructuras secundarias internas en las hebras simples; iii) d no contiene sitios de unión a los adaptadores. Los productos de PCR resultantes provendrán de transcriptos presentes esencialmente en el tester y ausentes en el driver y además su representación estará normalizada ya que los fragmentos diferenciales abundantes tendrán mayores posibilidades de formar moléculas de tipo b. Este esquema fue adaptado de Diatchenko et al PESSINO, Silvina C.; MARTELOTTO, Luciano G.

214 plementarias permitiendo formar una hebra de ADNc desde este sitio. En este caso el subgrupo de ARNms que sufre transcripción reversa estará integrado por aquellas moléculas que presenten la secuencia complementaria a la del cebador orientada en el sentido adecuado. Luego de haberse realizado la síntesis de la primer hebra del ADNc, se amplifican segmentos de los transcriptos usando pares múltiples de cebadores de PCR. Tanto para el display diferencial como para la RAP-PCR, el cebador superior es un oligonucleótido arbitrario de 10 pares de bases. El cebador inferior es el mismo oligonucleótido polit anclado (para el caso del display diferencial) o el decámero arbitrario (para el caso de RAP-PCR) que se usaron alternativamente para hacer la transcripción reversa. Se ha estimado que los productos de PCR de 240 combinaciones particulares de pares de cebadores de display diferencial (por ejemplo todas las combinaciones de 20 oligonucleótidos arbitrarios y 12 oligonucleótidos anclados) representan estadísticamente a todos los ARNm originalmente presentes en la muestra. Los productos de PCR pueden ser marcados por incorporación de un nucleótido radiactivo o de una molécula que pueda ser detectada a través de su interacción con un anticuerpo conjugado a un sistema de detección (por ejemplo digoxigenina). También puede usarse un cebador unido a un fluoróforo u optarse por no marcar los fragmentos amplificados y usar luego una tinción con nitrato de plata para revelar los geles. La visualización de los productos de PCR se logra luego de la electroforesis en geles de poliacrilamida seguida de la apropiada generación y detección de imágenes, que son evaluadas comparando la intensidad relativa de las bandas producidas a partir de diferentes muestras experimentales. Los fragmentos que están presentes en una muestra y ausentes en la otra o aquellos que están presentes con diferentes intensidades relativas en los distintos tratamientos experimentales representan potenciales transcriptos de ARNm de expresión diferencial. Típicamente, las bandas son evaluadas sólo si amplifican en forma consistente en reacciones de PCR duplicadas para cada muestra (Fig. 2). La fase final del display diferencial consiste en la identificación de la secuencia del transcripto representado por el producto de PCR y la confirmación de que este realmente se expresa en forma contrastante. Estas etapas se logran localizando físicamente y escindiendo la sección del gel de poliacrilamida que contiene al producto de Figura 2: Representación gráfica del método de display diferencial. Las muestras de ARN son transcriptas en forma reversa usando como cebador un oligonucleótido polit de secuencia 5 T(T) n TXY 3 (donde 10 Í n Í 12) que se fija en forma estable al extremo 3 de los transcriptos a través de la unión de las bases adicionales de secuencia arbitraria X e Y. Una vez sintetizada la primer hebra del ADNc, ésta se usa como molde para una reacción de PCR que utiliza como cebadores el mismo polit anclado y un decámero de secuencia arbitraria. Distintas combinaciones de polits y decámeros generan numerosos perfiles de amplificación a partir de diversas subpoblaciones de ARN mensajeros. El patrón de bandas de las muestras experimentales se compara en busca de diferencias de tipo presencia-ausencia o alteraciones en la intensidad de las bandas. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 231

215 interés. En la mayoría de los casos debe realizarse un alineamiento de las imágenes de los fragmentos de amplificación con el gel de poliacrilamida seco. En los casos en que se utiliza tinción con nitrato de plata no es necesario realizar este paso, por lo cual la recuperación de la banda es mucho más eficiente. Los productos de PCR son purificados del gel y reamplificados. Se han utilizado varias estrategias para confirmar la expresión diferencial de los transcriptos, que incluyen el uso de los fragmentos como sondas de Northern, la siembra de los fragmentos en membranas para someterlos a análisis de Northern inverso y el clonado y secuenciación de los productos para diseñar cebadores específicos que permitan realizar PCR semicuantitativas. Independientemente de cuál sea la táctica usada para confirmar la expresión diferencial, las secuencias de los fragmentos de los genes expresados diferencialmente se requieren siempre para comenzar a entender la función del gen. El aislamiento de la secuencia completa de los genes involucrados puede lograrse usando los clones diferenciales en estudios de bibliotecas de ADNc o realizando experimentos de 5 RACE. Dos ventajas importantes de los métodos de fingerprinting de ARN con respecto a los de hibridización substractiva son la capacidad de comparar muestras experimentales múltiples en forma simultánea y la de identificar genes que están regulados tanto positiva como negativamente en una muestra respecto de las otras. Sin embargo, los métodos de fingerprinting de ARN comparten con el SSH la limitación de que no son cuantitativos. Además suelen aparecer numerosos falsos positivos, es decir, fragmentos de genes que parecen estar diferencialmente expresados pero son artefactos de PCR. Otro problema es que estas técnicas deben aplicarse en general a muestras provenientes del mismo individuo sometido a distintas condiciones o sobre individuos genéticamente idénticos (por ejemplo, isolíneas). Cuando se comparan los perfiles de ARNm de individuos diferentes genéticamente, pueden aparecer falsos positivos que son resultado de una amplificación diferencial debida a una variación en la secuencia de los transcriptos más que a diferencias en su representación. Ese problema puede ser evitado utilizando estrategias de análisis de segregantes en grupo (BSA) aplicadas al estudio de perfiles de ARN. Finalmente, la investigación de todos los genes que potencialmente se expresan en forma diferencial requiere el uso de equipamiento de última generación y una inversión extensiva de tiempo y trabajo para detectar y confirmar la expresión diferencial de cada uno de los genes individuales. 4 Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de ADNc amplificados (ADNc-AFLP ) La tecnología de AFLP Ò, generalmente utilizada para producir huellas genéticas de ADN genómico, puede ser aplicada también a preparaciones de ADNc de doble hebra para obtener un perfil del transcriptoma. Los patrones obtenidos por esta técnica son una herramienta confiable y eficiente para la identificación de los ARNm expresados diferencialmente. La técnica de ADNc-AFLPÒ detecta fragmentos de restricción de ADN por medio de amplificación por PCR. Comprende las siguientes etapas: i) generación de ADNc, ii) restricción del ADNc con dos endonucleasas específicas, preferiblemente una que reconoce sitios de 6 bases y otra que reconoce sitios de 4 bases, iii) ligación de adaptadores de cadena doble a los extremos de los fragmentos de restricción, iv) amplificación de un subgrupo de los fragmentos de restricción usando dos cebadores complementarios al adaptador que llevan bases selectivas adicionales en el extremo 3 v) electroforesis de los fragmentos de restricción amplificados en geles de poliacrilamida, vi) visualización de las huellas digitales genéticas mediante el uso de autorradiografías, fosfoimágenes y otros métodos (Fig. 3, ver pág.7). Las mayores ventaja del uso de la tecnología de ADNc-AFLPÒ son: i) no se requiere información previa de secuencia; ii) se puede estudiar una fracción muy grande de todos los genes expresados, iii) es una técnica muy sensible que permite la detección de transcriptos de baja abundancia, iv) los fragmentos son extraídos fácilmente de los geles 232 PESSINO, Silvina C.; MARTELOTTO, Luciano G.

216 y las secuencias correspondientes pueden determinarse sin necesidad de clonados previos. 5 Etiquetas de secuencia expresadas («Expressed sequence tags, EST») Los avances tecnológicos que facilitan la secuenciación masiva condujeron a principios de los años 90 a idear el concepto de las bibliotecas de etiquetas de secuencia expresadas (bibliotecas de ESTs). Las secuencias EST son generadas tomando clones al azar de una biblioteca de ADNc y realizando una sola reacción de secuenciación que abarca pb del clon. Las diferencias en la expresión de genes pueden ser identificadas considerando el número de veces en que aparece representada una secuencia en particular. Sin embargo, las secuencias EST a menudo se generan a partir de bibliotecas de ADNc que han sido normalizadas para ecualizar la abundancia de clones que corresponden a los diferentes transcriptos. Los EST secuenciados a partir de estas últimas pueden ser comparados para identificar transcriptos que se expresan en una biblioteca y están completamente ausentes en otra, pero si se pretende obtener datos cuantitativos exactos que describan abundancia relativa se debe recurrir indefectiblemente a bibliotecas de ADNc no normalizadas. La posibilidad de detectar diferencias en la expresión de genes a través de la comparación de la abundancia de secuencias en las bases de datos de EST se incrementa con el crecimiento de estas bases. La combinación de la información generada por los EST (nivel y localización espacio/ temporal de la expresión génica) y la de los proyectos de secuenciación de genomas (secuencias completas de los genes y sus promotores) permite realizar asociaciones de expresión y homología estructural que en muchos casos facilitan la inferencia de la posible función de los genes identificados. Por supuesto, esto constituye una instancia inicial en la identificación de la función de cada gen. Para determinar su actividad precisa deben hacerse estudios particulares en general dirigidos a bloquear o aumentar su expresión por ingeniería genética y a modificar estructuralmente la molécula de manera de alterar la actividad de los diferentes dominios de la proteína que codifica. 6 Análisis serial de la expresión de genes El análisis serial de la expresión de genes (SAGE) consiste esencialmente en una versión acelerada de la secuenciación de EST. Está basada en el concepto de que una etiqueta corta de unas pocas bases es suficiente para identificar inequívocamente a un transcripto, siempre y cuando esté ubicada en una posición definida dentro de la secuencia del mensajero. Una etiqueta SAGE consiste típicamente en 9 bases de secuencia ubicadas por debajo del último sitio de reconocimiento de una endonucleasa específica en el transcripto blanco. Múltiples etiquetas SAGE se ligan juntas en un vector de clonado de manera que una reacción de secuencia de 300 a 500 pb genera las secuencias de 20 a 30 etiquetas al mismo tiempo (Fig. 4, ver pág.7). Como cada etiqueta SAGE representa un único transcripto de ARNm, es posible obtener una visión general de todos los genes expresados en la muestra original. Las diferencias en la expresión de genes entre muestras experimentales pueden entonces ser identificadas comparando la abundancia relativa de etiquetas SAGE específicas en diferentes bibliotecas. Los genes o las secuencias EST representados por las etiquetas SAGE son localizados en las bases de datos detectando aquellos transcriptos que tengan la etiqueta SAGE en la posición adecuada. Una limitación del SAGE es la identificación de los genes representados por las secuencias de etiquetas. Este proceso está en primer lugar restringido a secuencias que estén accesibles en las bases de datos. Sin embargo, esta limitación se tornará menos problemática a medida que se generen más secuencias EST y que a las secuencias existentes se les asignen asociaciones y función. Otra limitación potencial es la identificación errónea de las etiquetas. Esto puede resultar de errores de secuenciación y de la identificación fallida de la región que corresponde al SAGE en la base de datos de secuencia. Además, ciertos transcriptos pueden estar ausentes en la muestra, dependiendo de cuál sea la enzima específica usada para generar la biblioteca de SAGE. Otros ARNm por el contrario Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 233

217 pueden estar representados por múltiples etiquetas SAGE a causa de la existencia de polimorfismos en un sólo nucleótido o el procesamiento alternativo de los transcriptos. Se espera que muchos de esos problemas afecten a una porción relativamente pequeña de los genes representados, pero no deberían ser dejados de lado en la interpretación de los resultados. Por otra parte, dos ventajas importantes del SAGE sobre la hibridación substractiva y el display diferencial es que los datos obtenidos son cuantitativos y acumulativos. Si se genera la suficiente cantidad de información de secuencia se obtienen perfiles exactos de la expresión de los transcriptos, que describen la abundancia de todos los genes expresados en una célula o tejido. Existe una base de datos pública de expresión génica que ha sido creada para el almacenamiento y análisis de secuencias de SAGE cuyo poder continuará creciendo a medida que se contribuya con más información. Otra característica de los datos de SAGE es que pueden complementar datos de ESTs generados a partir de bibliotecas de ADNc normalizadas o substraídas. Los EST brindan información de secuencia mientras que el SAGE provee datos cuantitativos describiendo la abundancia de los transcriptos. Finalmente, a pesar de que el SAGE requiere capacidad de secuenciación de última generación, la cantidad de datos que aporta puede ser 20 veces mayor que el que posibilita la misma cantidad de secuenciación EST. 7 Hibridación de microarreglos o micromatrices La evaluación de la expresión de genes usando la tecnología de micromatrices ha demostrado ser un procedimiento muy efectivo para una variedad de aplicaciones. Los tres tipos generales de micromatrices incluyen: i) «chips» de oligonucleótidos, construídos realizando la reacción de síntesis de cebadores cortos directamente sobre una matriz de vidrio, ii) arreglos de oligonucleótidos, construídos depositando oligonucleótidos sobre placas de vidrio o membranas de nylon, iii) arreglos de ADNc, obtenidos depositando insertos amplificados por PCR a partir de una biblioteca sobre placas de vidrio o membranas de nylon. Uno de los aspectos más importantes de la experimentación con micromatrices es la selección de los fragmentos de ADN que contendrá. Aún cuando el número de genes representado suele ser grande (3000 a 10000), pueden faltar algunos que sean importantes para una cuestión experimental particular. La selección de la biblioteca más adecuada para una aplicación en particular y la elección de los clones son factores críticos que determinan el éxito de estos experimentos. En algunas situaciones, puede ser más efectivo enfocar los experimentos en un grupo pequeño de genes seleccionados por criterios más específicos como, por ejemplo, perfiles de distribución de tejidos, clasificación funcional o cambio de expresión conocidos. Se pueden adquirir clones de fuentes comerciales u otras fuentes y/o clonar secuencias específicas usando técnicas estándar de biología molecular. Después de que los clones han sido seleccionados deben ser ensamblados y organizados para generar el arreglo de ADNc junto con los controles apropiados. Típicamente, el largo de los insertos será mayor a 500 bases, pero esto depende de los clones seleccionados. Los productos de PCR son purificados y luego depositados (o «impresos») en lugares precisos sobre una placa de vidrio o una membrana de nylon. Los instrumentos usados para la producción de micromatrices han mejorado en los últimos años. Las opciones varían desde la construcción de un arreglo por raspado hasta la compra del sistema completo. Independientemente de cuál sea el origen de los clones, es esencial saber con seguridad la secuencia de cada sonda que está siendo ubicada sobre la matriz para asegurar una interpretación exacta de los datos resultantes. Por la tanto, puede ser necesario secuenciar por duplicado todos o una porción de los fragmentos organizados (Fig. 5, ver pág.8). El ARNm que representa las muestras experimentales se prepara para la hibridación con las micromatrices de ADNc por transcripción reversa y marcado con nucleótidos fluorescentes (Cye3 y Cye5 dutp) o radiactivos ([ 33 P] dctp). Las moléculas 234 PESSINO, Silvina C.; MARTELOTTO, Luciano G.

218 Figura 3: Generación de una huella digital de ARN por la técnica de ADNc-AFLP. El RNA mensajero se transcribe en forma reversa utilizando un polit como cebador. Las hebras de ADNc se digieren con dos enzimas de restricción, una de corte raro y otra de corte frecuente. Se ligan adaptadores complementarios a ambos extremos y se preamplifican por PCR los fragmentos utilizando cebadores que reconocen la secuencia de los adaptadores. Los fragmentos que contienen adaptadores diferentes en los extremos son amplificados preferentemente a causa de que en general tienen un tamaño intermedio. Luego se realiza una segunda amplificación utilizando cebadores anclados con una o dos bases adicionales en el extremo 3 que amplifican una subpoblación de fragmentos. El cebador correspondiente al adaptador para la enzima de corte raro está marcado radiactivamente. La combinación de diferentes cebadores anclados genera perfiles provenientes de distintos subgrupos de ARNms. Figura 4: Procedimiento general para la obtención de etiquetas de secuencia SAGE. El ARN mensajero es transcripto en forma reversa utilizando un polit biotinilado como cebador. Luego es digerido con una enzima de restricción ancla que reconoce sitios de 4 bases frecuentes en la secuencia de los mensajeros. Es probable que la mayoría de los mensajeros sean digeridos por esta enzima en algún sector de su secuencia. Los extremos 3 de las moléculas son recuperados por unión a esferas de estreptavidina. La muestra se divide en dos partes iguales que se ligan alternativamente a dos adaptadores diferentes (A y B). A continuación son digeridas con una segunda enzima de restricción (enzima de etiquetado) que reconoce un sitio dentro de la secuencia del adaptador pero corta al transcripto unos 20 pares de base más abajo generando un extremo romo. Ambas muestras se mezclan, se ligan y amplifican con dos oligonucleótidos A y B complementarios a los respectivos adaptadores. Los amplicones se digieren nuevamente con la enzima ancla y los fragmentos se ligan como concatémeros y se clonan. Este diagrama fue adaptado a partir del presentado por Velculescu et al Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 235

219 Figura 5: Expresión de genes controlada a través del uso de microarreglos de ADNc. Los clones amplificados por PCR se imprimen sobre un soporte sólido. Las muestras a analizar se marcan con diferentes fluoróforos y se hibridizan con la matriz. Un detector permite medir por separado la emisión de cada fluoróforo. La intensidad de la señal de hibridización será proporcional al contenido de cada molécula particular de ARN en la muestra. Los patrones de emisión de ambas muestras son comparados para detectar expresión diferencial. 236 PESSINO, Silvina C.; MARTELOTTO, Luciano G.

220 fluorescentes generalmente se usan para marcar sondas con las que se hibridarán placas de vidrio, mientras que las radiactivas se incorporan a sondas que se usarán sobre membranas de nylon. Los fluoróforos Cye3 y Cye5 presentan diferentes espectros de emisión, por lo tanto dos muestras experimentales pueden ser marcadas alternativamente con cada uno de ellos, hibridadas juntas en una reacción única competitiva y luego evaluadas en forma separada con un detector de fluorescencia. Por el contrario, las muestras radiactivas deben ser hibridadas individualmente en reacciones seriales y pueden ser detectadas usando un sistema de fosfoimágenes. Independientemente del diseño experimental, el análisis de micromatrices se basa en la premisa de que la intensidad de la señal de hibridación resultante para una secuencia es proporcional a la cantidad de ARNm que corresponde a esa secuencia en la muestra original. La expresión relativa de cada secuencia representada en el microarreglo es evaluada comparando las señales de intensidad de hibridación generadas por las diferentes muestras experimentales. Cada experimento de micromatrices genera una gran cantidad de datos y es crítico realizar un procesamiento apropiado de los mismos. El análisis de la información obtenida puede ser dividido en tres componentes: i) identificación y cuantificación de las intensidades de hibridación; ii) visualización de los datos; iii) técnicas de agrupamiento. El primer componente incluye la identificación exacta de los puntos de la imagen, la normalización según el fondo, la cuantificación de las intensidades de hibridación y la salida de los datos en una forma utilizable. La visualización de los datos incluye su clasificación y presentación en una forma lógica y su organización en diferentes formatos para apuntar a la resolución de cuestiones múltiples. Finalmente, los algoritmos de agrupamiento permiten identificar conjuntos de genes con patrones de expresión similar a través de distintas muestras experimentales. En base a la presunción de que la expresión de los genes con funciones relacionadas están regulada en forma coordinada, el agrupamiento de datos de microarreglos se convierte en un método poderoso para asignar posibles clasificaciones funcionales a genes nuevos. 8 Conclusión Los métodos descriptos en este capítulo son tecnologías eficaces que expanden los estudios de expresión desde los genes únicos hasta el nivel genómico. Ninguno de estos procedimientos per se es óptimo para todas las aplicaciones y la mejor estrategia para situaciones específicas puede ser crear combinaciones de varios de ellos. El continuo refinamiento de las técnicas genómicas y de la bioinformática relacionada proporcionará a los investigadores nuevas herramientas para estudiar la expresión de la información hereditaria y lograr un mejor entendimiento sobre el control genético de los procesos fisiológicos. 9 Lecuras Recomendadas ADAMS, M. D.; J. M. KELLEY, J. D. GOCAYNE, M. DUBNICK, M. H. POLY-MEROPOULOS, H. XIAO, C. R. MERRIL, A. WU, B. OLDE, R. F. MORENO Complementary DNA sequencing: expressed se-quence tags and human genome project. Science (Wash DC) 252: DAVIS, M. M.; D. I. COHEN, E. A. NIELSEN, M. STEINMETZ, W. E. PAUL, L. HOOD Cell-typespecific ADNc probes and the murine 1 region: the localization and orientation of Ad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: DIATCHENKO, L.; Y.-F. C. LAU, A. P. CAMPBELL, A. CHENCHIK, F. MOQA-DAM, B. HUANG, S. LUKYANOV, K. PUKYANOV, N. GURSKAYA, E. D. SVERDLOV, P. D. SIEBERT Suppression subtractive hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific ADNc probes and libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: GURSKAYA, N. G.; L. DIATCHENKO, A. CHENCHIK, P. D. SIEBERT, G. L. KHASPEKOV, K. A. LUKYANOV, L. L. VAGNER, O. D. ERMOLAEVA, S. A. LUKYANOV, E. D. SVERDLOV Equalizing ADNc subtraction based on selective suppression of polymerase chain reaction: cloning of Jurkat cell transcripts induced by phytohemaglutinin and phorbol 12-myristate 13-acetate. Anal. Biochem. 240: LIANG, P.; A. B. PARDEE Differential display of eukaryotic messenger ARN by means of the polymerase chain reaction. Science (Wash DC) 257: MOODY D. E Genomics techniques: an overview of methods for the study of gene expression. J. Anim. Sci. 79 (E. Suppl.): E128-E135. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 237

221 OKUBO, K.; N. HORI, R. MATOBA, T. NIYAMA, A. FUKUSHIMA, Y. KOJIMA, K. MATSUBARA Large scale ADNc sequencing for analysis of quantitative and qualitative aspects of gene expression. Nat. Genet. 2: SARGENT, T. D.; I. B. DAWID Differential Gene expression in the gastrula of Xenopus laevis. Science (Wash DC) 222: SCHENA, M.; D. SHALON, R. W. DAVIS, P. O. BROWN Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science (Wash DC) 270: VELCULESCU, V. E.; L. ZHANG, B. VOGELSTEIN, K. W. KINZLER Serial analysis of gene expression. Science (Wash DC)270: WELSH, J.; K. CHADA, S. S. DALAL, R. CHENG, D. RALPH, M. McCLELLAND Arbitrarily primed PCR fingerprinting of ARN. Nucl. Acids Res. 20: PESSINO, Silvina C.; MARTELOTTO, Luciano G.

222 VII.- Capítulo 3 Análisis informático de secuencias moleculares Paniego, Norma; Heinz, Ruth; Fernández, Paula; Lew, Sergio; Hopp, Esteban 1 Introducción La Bioinformática es el área de las ciencias de la computación que aborda la búsqueda de soluciones a los problemas biológicos con herramientas computacionales. Tanto el análisis genómico como sus disciplinas relacionadas pueden ser abordados desde una perspectiva diferente a partir de la enorme disponibilidad de secuencias moleculares acumuladas en las bases de datos internacionales como GenBank [1], EMBL [2], DDBJ [3] y SwissProt [4]. El impacto de los proyectos genómicos durante los últimos 10 años, ha sido por un lado la creciente disponibilidad de secuencias, y por el otro la gran diversidad de datos biológicos acumulados. Esto, junto con el desarrollo de las tecnologías informáticas y el arribo de Internet transformando la estructura de almacenamiento y acceso de los datos, ha permitido el desarrollo de aspectos fundamentales para el avance de los conocimientos sobre los sistemas biológicos, como lo son la búsqueda de similitud en secuencias moleculares, el análisis comparativo (filogenético, taxonómico y sinténico) de las especies, el análisis de macromoléculas, la ingeniería y diseño de estructuras proteicas, entre otros [5]. El propósito de este capítulo es introducir los conceptos y las herramientas básicas de la Bioinformática a los estudiantes de un curso de biotecnología vegetal o de biología molecular de plantas. De ninguna manera este material pretende cubrir la totalidad de los recursos existentes para la materia, por el contrario el objetivo es guiar el interés de los estudiantes en la exploración y el uso de métodos computacionales decisivos para el desarrollo de su actividad científica o profesional futura. Por lo cual, en primer lugar describiremos las bases de datos generales para secuencias de ADN y proteínas y las bases de datos específicas de plantas remitiendo en cada caso al estudiante a visitar las paginas principales de los sitios mencionados para ampliar el conocimiento de los mismos. Posteriormente, con la misma orientación abordaremos aspectos relacionados a la búsqueda, el análisis y la interpretación de secuencias biológicas. 2 Bases de datos moleculares Un proyecto típico de análisis genómico genera secuencias nucleotídicas las cuales se hacen públicas enviándolas a las bases de datos internacionales. No sólo lo hacen los proyectos dedicados a la secuenciación a gran escala. También lo hacen los investigadores involucrados en proyectos más específicos de biología molecular, dado que el depósito de la secuencia es una condición frecuentemente exigida por las revistas internacionales que publican estos trabajos. Así, las bases de datos moleculares se alimentan constantemente y contienen una enorme y heterogénea cantidad de datos que incluyen secuencias de ácidos nucleicos, proteínas, estructuras macromoleculares, etc., asociados a recursos informáticos que asisten el acceso, el envío, la actualización, y la extracción de datos. Existen varios cientos de bases de datos accesibles desde la Web, pero la dinámica enunciada no asegura tener el máximo provecho sustentable de las mismas, empezando por mantener una actualización constante. Con este fin, se pueden revisar catálogos como DBCAT [6], o el componente DATABANK de la plataforma SRS (Sequence Retrieval System [7]) de integración de datos del European Molecular Biology Laboratory (EMBL). Otra fuente de actualización exhaustiva la constituye el primer número de cada año de la revista Nucleic Acid Research [8] de acceso libre a través de Internet, que presenta una colección actualizada de artículos de los sitios más importantes como son las bases de datos generales National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA), European Bioinformatics Institute (EBI, EU) y DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Japón) y bases de datos más específicas. Otro punto de interés es que la calidad de las secuencias varía notablemente: desde secuencias obtenidas a partir de un pasa- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 239

223 je por amplificación por PCR por secuenciación única (es decir, con posibles artefactos técnicos y sin rechequeos) hasta secuencias obtenidas de clones independientes y que han sido secuenciadas en ambas hebras. Lo mismo pasa con la función hipotética de los genes representados. Típicamente los proyectos de biología molecular básica generan datos muy bien caracterizados en cuando a la función de los genes estudiados, mientras que los proyectos genómicos generan secuencias anónimas cuya funcionalidad es primero hipotética, es decir, deducida a partir de su similitud con otros genes de función conocida (ver predicción de genes, más abajo) y debe ser corroborada funcionalmente, por ejemplo, mediante experimentos de complementación genética. Incluso los perfiles de usuarios que atienden estas bases de datos pueden ser bastante heterogéneos: desde el típico biólogo molecular que clonó y secuenció un gen involucrado en su tema de estudio (por ejemplo, genes que se activan a partir de una aplicación hormonal) hasta evolucionistas interesados en redefinir la taxonomía tradicionalmente basada en características fenotípicas. A pesar de esta heterogeneidad de intereses y de recursos disponibles, lo más común es que los usuarios frecuenten las tres bases de datos generales de acceso público. Estos sitios colaboran desde 1982 manteniendo las bases de datos de nucleótidos de Genbank (NCBI), EMBL Nucleotide Sequence Database (EMBL-Bank, EBI), y DDBJ [8]. Estos grupos coleccionan una porción del total de las secuencias producidas y reportadas en el mundo, e intercambian diariamente todas las secuencias nuevas o actualizadas. Las bases de datos de proteínas incluyen aquellas que derivan de las bases de datos de nucleótidos como Swissprot, TrEMBL [4] y PIR [9], y las bases de datos estructurales como PDB (Protein Data Bank [10]) que contiene mas de estructuras resueltas por cristalografía o resonancia magnética nuclear y Macromolecular Structure Database (MSD) [11] que es una base de datos de EBI derivada en parte de PDB. El NCBI, el EBI y el DDBJ disponen de otros recursos como bases de datos de transcriptos (dbest), polimorfismos de un solo nucleótido (dbsnp), sitios de secuencia específica (dbsts), genomas completos, taxonomía, literatura, vectores, etc. por lo cual recomendamos explorar estos recursos visitando la página «About NCBI» [12] y «2CAN» [13] del EBI. En general, las bases de datos archivan la información a partir de una organización o estructura lógica, cada entrada en la base de datos se identifica con un código único que es una cadena de números y letras. Este identificador o número de acceso de la secuencia nunca cambia y es la forma en que se cita la secuencia en las publicaciones. A este identificador se le suma otro código que da cuenta de la versión de la secuencia depositada (seq.versión, geninfo identifier, GI). A medida que la secuencia se va actualizando, el número de acceso incorpora un punto seguido de un valor incremental que corresponde a la versión actualizada, mientras que el GI toma un valor diferente en cada actualización. Las proteínas también poseen identificadores o números de acceso (protein_ids) (Fig. 1). 2.1 Sistemas de búsqueda de las bases de datos: ENTREZ, SRS y DBGET Las bases de datos no solo proveen la información molecular, sino también los medios adecuados para acceder fácilmente a esa información. Las interfases de búsqueda principales son ENTREZ [14], SRS [7] y DBGET [15]. La más usada probablemente sea el sistema ENTREZ del NCBI, una de las características únicas del mismo es que fue el primero en incorporar relaciones lógicas o nexos entre las entradas individuales de datos en distintas bases de datos públicas (Fig. 2). La interfase SRS reúne unas 400 bases de datos (Fig. 3), en el último año se desarrolló como un sistema integrado de búsqueda y recuperación de datos asociados y aplicaciones para análisis de secuencias [16]. DBGET es un sistema simple de acceso de datos a un grupo diverso de bases de datos moleculares (Fig. 4) Uso avanzado de ENTREZ y SRS NCBI desarrolló Entrez como una herramienta para permitir a los usuarios interac- 240 PANIEGO, N.; HEINZ, R.; FERNÁNDEZ, P.; LEW, S.; HOPP, E.

224 Figura 1: La Figura muestra los códigos asignados por las bases de datos a cada secuencia ingresada. A) Número de acceso y gi de una secuencia nucleotídica. B) Número de acceso y gi de la secuencia de aminoácidos correspondiente. cionar o consultar estas bases de datos. Desde el punto de vista informático, Entrez es Figura 2: Representación gráfica de las relaciones del sistema Entrez para la búsqueda y la recuperación de datos depositados en el sitio NCBI. Entrez es una plataforma dinámica, en la cual se agregan constantemente nuevos componentes o cambian de manera dinámica las vínculos establecidas entre los elementos. una interfase de usuario. Es decir, constituye el nexo entre el usuario y las bases de datos subyacentes. Esto le permite al usuario realizar consultas simples y obtener resultados, aún desconociendo la arquitectura de las bases de datos. Sin embargo, para realizar consultas más poderosas (en selectividad y eficiencia), es necesario conocer dicha arquitectura u ordenamiento de la estructura de la base de datos, al menos en parte, y saber como restringir las búsquedas a ciertas áreas de la base de datos. Para profundizar en los alcances y la operabilidad de Entrez se recomienda visitar el documento de ayuda en la página del NCBI [17]. Sin embargo, desde el punto de vista de la facilidad de uso, tal vez SRS sea una mejor opción, dado que los formularios de búsquedas avanzados son un tanto más explícitos que en el caso de Entrez. SRS es un paquete de manejo de bases de datos desarrollado por EBI y accesible desde distintos si- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 241

225 Figura 3: Algunas de las Bases de Datos accesibles desde el servidor SRS. tios, que a diferencia de Entrez, puede ser operado de manera local Uso de PubMed (ENTREZ) Otra forma muy popular de acceso es a través del PubMed, usualmente utilizado para el relevamiento bibliográfico por la mayoría de los científicos. Se basa en el mapeo automático de términos (automatic term mapping): cuando se ingresa un término para realizar una búsqueda en PubMed, el servidor que recibe el requerimiento intenta identificar el tipo de búsqueda que se está intentando hacer: está el usuario intentando buscar un autor, o una revista, o un área de conocimiento? Entonces el servidor filtra los términos de búsqueda a través de listas sucesivas para intentar responder dicha pregunta y usar los términos en forma eficiente. Este proceso utiliza las siguientes listas MeSH (Medical Subject Headings): vocabulario controlado utilizado para indexar artículos en PubMed. Journals: nombre completo de la revista, abreviaturas usadas en MedLine y números ISSN. Lista de frases: cientos de miles de frases generadas a partir de MeSH y otros vocabularios controlados similares. Índice de autores: apellido e iniciales. Si el término ingresado está presente en alguna de estas listas, la búsqueda se limitará a ese campo de la base de datos. En caso contrario, el término será utilizado para buscar sobre todos los campos de la base de datos. Es evidente que si uno sólo está interesado en buscar publicaciones en determinada revista (por ejemplo «Cell»), es ineficiente utilizar el término «Cell» como palabra clave, ya que muy probablemente exista algún autor llamado así, y la palabra «Cell» se encuentre presente en varios títulos o resúmenes. 242 PANIEGO, N.; HEINZ, R.; FERNÁNDEZ, P.; LEW, S.; HOPP, E.

226 Figura 4: Representación gráfica de las relaciones del sistema DBGET para la búsqueda y la recuperación de datos El mapeo automático de términos puede evitarse en primer lugar encerrando el término o frase entre comillas. Esto evitará el filtrado a través de listas, realizando una búsqueda sobre todos los campos de la base de datos en forma directa. Además, en caso de una búsqueda con una frase (más de una palabra), esto fuerza la búsqueda usando la frase tal como fue ingresada (con las palabras en ese orden), lo cual puede resultar útil en algunos casos. Los términos de una búsqueda pueden proporcionarse truncados (truncation), utilizando un asterisco (*). Por ejemplo, una búsqueda con el término enzym* retornará citas conteniendo la palabra enzyme, pero también enzymes, enzymology, enzymatic, etc. La búsqueda con términos truncados desactiva el mapeo automático, por lo cual las búsquedas utilizando este método van a diferir de las que no lo usan. PubMed ignora ciertas palabras en las búsquedas, estas son llamadas stopwords y corresponden a palabras muy comunes, presentes en la gran mayoría de las citas de la base de datos: artículos, proposiciones, adverbios, etc. La lista de stopwords se encuentra en la documentación de PubMed. Entrez permite combinar términos utilizando operadores lógicos (AND, OR, NOT). Los operadores lógicos, también llamados operadores voléanos (boolean operators), deben ser ingresados en mayúsculas para ser reconocidos como tales por Entrez (por ejemplo: vitamin C OR zinc, DNA AND Crick AND 1993). Entrez lee los operadores lógicos de izquierda a derecha. Es posible cambiar el orden de evaluación de los ope- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 243

227 radores usando paréntesis. Para focalizar las búsquedas es recomendable utilizar códigos de calificación de términos (search field qualification). Esto es, describir qué tipo de término se está usando: si se busca por nombre de un autor, de una revista, o por fecha, etc. La calificación de términos se realiza agregando una etiqueta entre corchetes al lado del término a calificar. Es muy poco intuitivo el criterio de uso de estos calificadores, por lo que se recomienda leer el manual como fue sugerido al inicio del capítulo. Entrez realiza las búsquedas sobre cierto tipo de campos de la base de datos. Estos campos se encuentran indexados, y es posible acceder a los índices para evaluar la eficacia de nuestra estrategia de búsqueda. Cuando se realiza una búsqueda, se selecciona en Preview/Index, esto permite acceder a un formulario para ver los índices y eventualmente agregar un término a la búsqueda Uso de SRS El SRS ofrece a los usuarios la posibilidad de buscar datos y analizarlos a través de distintos paquetes de software en el mismo sitio. La página de inicio de este servidor presenta distintas opciones: Comenzar un proyecto temporario o permanente. Correr una aplicación. Acceder a información disponible sobre las bases de datos. Acceder a la documentación en línea. Para realizar una búsqueda hay que seleccionar sobre Start a Temporary Project, con lo que se abre una página que muestra las bases de datos disponibles en el sitio. Una vez allí deberá seleccionarse la(s) base(s) de datos sobre la cual(es) buscar. Es posible seleccionar todas las bases de datos seleccionando sobre el botón all. Luego se accede a la solapa de búsqueda estándar (denominada QUERY) donde se definen las opciones de búsqueda y se ingresan las palabras clave. Dentro de las opciones de búsqueda, si seleccionamos Append wildcards to words la búsqueda se realizará sobre las palabras claves ingresadas y también sobre todas aquellas posibles terminaciones de dichas palabras. Combine searches with permite relacionar los términos de la búsqueda mediante los conectores & AND, OR y BUTNOT. Number of entries to display per page permite definir el número máximo de registros listados en cada página. Pueden hacerse búsquedas extendidas para lo cual hay que ingresar al sitio seleccionando sobre el botón Extended, habiendo seleccionado primero una base de datos. En este formulario se pueden definir los mismos parámetros que en el formulario estándar (wildcards, número de registros por página, etc.), pero a su vez contiene una lista de áreas de datos (que varían de acuerdo con el tipo de base de datos utilizada) sobre la cual pueden realizarse búsquedas. Una vez elegido el campo sobre el cual se quiere buscar, simplemente hay que ingresar la(s) palabra(s) clave en el cuadro de texto de la derecha. 3 Otras bases de datos moleculares Aparte de las bases de datos generales existe un gran número de bases de datos especializadas de gran importancia para focalizar proyectos y obtener información adicional generalmente no accesible desde las bases generales como son fenotipos, datos experimentales, datos de mapeo, etc.; bases de datos derivadas del análisis de las bases de datos generales (bases de datos de motivos funcionales y estructurales) y bases de datos de interacciones. Un área de estas bases especializadas por especies la constituye el área de proyectos genómicos de plantas. Aquí las iniciativas centrales la constituyen la secuenciación completa de especies modelo como Arabidopsis thaliana [18] y el arroz, Oryza sativa var. indica [19] y Oryza sativa var. japonica [20]. Sin embargo, están en marcha muchos proyectos de secuenciación parcial de genomas en gramíneas, crucíferas, solanáceas, compuestas, etc., que aportan información para sustentar el análisis comparativo de regiones de interés entre genomas ampliando los conocimientos sobre la estructuración de genes y genomas de las plantas. La identificación de regiones sinténicas (conservación de las posiciones cromosómi- 244 PANIEGO, N.; HEINZ, R.; FERNÁNDEZ, P.; LEW, S.; HOPP, E.

228 cas relativas de secuencias marcadoras homólogas en especies relacionadas, es decir, conservación de mapas genéticos a escala evolutiva) hará posible el aislamiento de genes en especies con genoma complejo, usando la información de genes homólogos en especies con genomas más pequeños y más profusamente estudiados (los así llamados clonados posicionales en base a mapas) [21]. Desde lo académico, el análisis comparativo de los genomas usando una estrategia bioinformática persigue entender cuales son los mecanismos esenciales para el funcionamiento mínimo de una planta, su crecimiento normal, su desarrollo y metabolismo, entender las bases de la especiación y la diversidad, los mecanismos básicos de la adaptación y la enorme diversidad química [22]. 3.1 Bases de datos de motivos Existe otro conjunto de bases de datos denominadas secundarias porque derivan de las bases de datos generales, son las llamadas de motivos estructurales y funcionales. Estas bases de datos introducen el concepto de patrones y perfiles de secuencias. Los patrones definen secuencias cortas de aminoácidos conservados que corresponden a sitios activos, sitios de unión, etc. Al ser regiones acotadas, no dan cuenta del resto de la secuencia adyacente y son muy poco sensibles al momento de encontrar secuencias relacionadas que presenten una divergencia mínima en la región definida por el patrón [23, 24, 25]. Los perfiles compensan esta debilidad dado que cubren áreas más largas de la secuencia a través de la representación numérica de las posiciones conservadas en un alineamiento múltiple. En otras palabras, los perfiles representan las posiciones comunes y características de aminoácidos de una colección particular de secuencias, frecuentemente de una familia de proteínas. Usando perfiles es posible encontrar miembros muy divergentes de familias de proteínas que presenten muy baja identidad de secuencia [23, 24, 25]. Base de Datos Descripción URL Blocks Database of protein alignment blocks CDD Conserved domain database CluSTr Clusters of SWISS-PROT and TrEMBL proteins DOMO Protein-domain database based on sequence alignments InterPro Integrated documentation resource for protein families, domains and functional sites IproClass Integrated protein classification database MetaFam Database of protein family information Pfam Collection of multiple sequence alignments and hidden Markov models PIR Protein Information Resource PIR-ALN Curated database of protein sequence alignments PRINTS-S Compendium of protein fingerprints ProClass Non-redundant protein database organized by family relationships ProDom Automatic compilation of homologous domains PROSITE Database of patterns and profiles describing protein families and domains ProtoMap Automatic hierarchical classification of SWISS-PROT proteins SBASE Curated protein domain library based on sequence clustering SMART Simple Modular Architecture Research Tool - a collection of protein families and domains SWISS- PROT Protein sequence databases and TrEMBL Systematic re-searching method for sequence searching and SYSTERS clustering or TIGRFAMs Protein families based on hidden Markov models Tabla 1: Bases de datos y recursos para el análisis de datos de familias de proteínas, dominios y motivos [25]. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 245

229 Dentro de este grupo de bases de datos que proveen información para la búsqueda de secuencias homólogas remotas y para la predicción de función se incluyen Prosite, PRINT-S, Pfam, SMART, TIGRfam y Blocks entre otras listadas en la Tabla 1. 4 Alineamiento de Secuencias: Fundamentos 4.1 Alineamiento de pares de secuencias Una de las maneras mas frecuentes de obtener información sobre una o un grupo de secuencias incógnitas, es mediante la búsqueda comparativa utilizando la información depositada en distintas bases de datos. Uno de los métodos comparativos más comunes es el alineamiento de pares de secuencias, la descripción del resultado del mismo trae aparejado el uso (o mal uso) de los términos: identidad, similitud y homología. La identidad significa que existe exactamente el mismo nucleótido o aminoácido en la misma posición de las secuencias alineadas. Similitud expresa una medida observable que considera por un lado las identidades y por otro lado, le da valor a las sustituciones favoreciendo aquellas que sean conservativas respecto de las que no lo son. Finalmente, homología significa que las secuencias no sólo se parecen mucho entre sí, sino que también comparten una historia evolutiva [26, 27]. Los algoritmos de comparación de secuencias más comunes tales como BLAST [28], FASTA [29] y SSEARCH [30, 31] miden similitud o identidad entre secuencias pero no miden homología. La forma que estos algoritmos emplean para darle significado a cada uno de los alineamientos posibles es asignándole un valor (score) a cada uno de ellos, el score más alto corresponde al mejor alineamiento. La manera más común de asignar este valor es, a través de una suma simple de scores especificados para cada alineamiento de pares de letras (que representan igualdades o sustituciones), y de letras con caracteres nulos (que representan deleciones o inserciones). El conjunto de estos scores mencionados representa una matriz de scores, las más populares son las matrices de bloques de sustitución BLOSUM [32] y las matrices de mutaciones puntuales aceptables PAM [33, 34]. La construcción de estas matrices se basa en el modelo de Dayhoff [33], que establece que relaciones lejanas entre secuencias pueden modelarse con suficiente precisión usando la información de secuencias estrechamente relacionadas. Ambas matrices se basan en grupos de alineamientos altamente confiables de proteínas homólogas, a partir del cual miden la frecuencia de todas las sustituciones a través de métodos diferentes [26]. Las matrices PAM fueron calculadas sobre la base de un modelo de distancia evolutiva sobre alineamientos de secuencias muy relacionadas, así PAM1 define una unidad de cambio evolutivo y representa la probabilidad de que 1 aminoácido en 100 haya experimentado una sustitución. Multiplicando PAM1 por sí mismo se obtiene una familia de matrices de sustitución arbitrarias que representan distintos grados de parentesco. La matriz PAM120 es considerada una buena matriz de sustitución para analizar secuencias evolutivamente más cercanas, mientras que PAM250 es más apropiada para comparar secuencias más distantes [26, 27]. Las matrices BLOSUM son calculadas de manera similar pero usando una estrategia diferente para estimar las frecuencias de sustitución [27, 32]. Los bloques representan alineamientos múltiples de secuencias relacionadas (a diferencia de PAM, que usa secuencias estrechamente relacionadas). Los números asociados a estas matrices indican el valor de corte del porcentaje de identidad que define el grupo. Por lo tanto, las matrices con valores de corte más bajo (ej. BLOSUM62) admiten una mayor diversidad de secuencias en los grupos y son óptimas para comparar secuencias más distantes. No obstante, los eventos de mutación no sólo incluyen sustituciones sino también inserciones y deleciones, por lo cual también se asigna un score a los intervalos vacíos o gaps observables en los alineamientos. Una vez definido el score para un alineamiento arbitrario, surge la necesidad de encontrar el alineamiento óptimo entre los muchos alineamientos posibles. Dado que lo más común entre secuencias de ADN o proteínas es que sean similares en algunos seg- 246 PANIEGO, N.; HEINZ, R.; FERNÁNDEZ, P.; LEW, S.; HOPP, E.

230 mentos y no en toda la extensión de las secuencias involucradas, lo más frecuente es usar en esta instancia programas basados en el algoritmo de Smith-Waterman que busca óptimos en alineamientos locales de pares de secuencias [35]. No obstante, tratándose de métodos de programación dinámica, para los cuales el tiempo de cálculo es proporcional al cuadrado del tamaño de las secuencias que se comparan [23], son extremadamente lentos para realizar búsquedas exhaustivas en las bases de datos de mayor Figura 5: Resultado de una búsqueda en BLAST. A) el encabezado muestra el nombre de la secuencia incógnita y el nombre de la base de datos analizada. Como el programa usado fue BLASYx, la secuencia fue traducida en las seis marcos de lectura correspondientes y comparada con la base de datos nr («non redundant»}de proteínas mantenida por NCBI. B) muestra una representación gráfica de los alineamientos. C) muestra un resumen de los alineamientos mas significativos junto con el score normalizado y el valor E. D) muestra los lineamientos detallando las propiedades Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 247

231 referencia (GenBank, Swissprot, etc.). En cambio, tanto FASTA como BLAST emplean otro tipo de desarrollo llamado heurístico, que favorecen la velocidad a cambio de la sensibilidad y la selectividad [26]. Ambos programas operan de manera similar pero usando distintas estrategias para localizar las posiciones donde es más probable que ocurra el mejor alineamiento. FASTA busca cadenas de letras exactamente iguales de un tamaño fijo establecido (words). BLAST, en cambio, usa matrices de sustitución (tomando de base BLOSUM62 para secuencias de aminoácidos) para encontrar words que sin ser exactamente iguales muestren el score más alto, en este nivel de búsqueda ambos algoritmos no admiten gaps. BLAST realiza algunas otras operaciones como filtrar las regiones de baja complejidad (regiones repetitivas), y elimina words con baja probabilidad de producir un score alto. Una vez que se identifican estas regiones de alto score, se aplican algoritmos más sofisticados de programación dinámica, ahora sí permitiendo la existencia de gaps. En esta segunda etapa BLAST busca segmentos similares a la lista de words establecidos en toda la base de datos y cuando encuentra un alineamiento posible trata de extenderlo hacia ambas direcciones, hasta tanto el score continúe incrementándose. Luego BLAST evalúa si el valor E de los alineamientos obtenidos satisface el umbral seleccionado por el usuario (normalmente entre 0,1-0,001) para finalmente informar la lista de los seleccionados. La Figura 5 muestra un resultado obtenido a partir de BLAST. El encabezado cita la versión del algoritmo empleado y su referencia, el nombre y la longitud de la secuencia analizada y la base de datos que se usó como blanco. La segunda parte del informe presenta un resumen de todas las secuencias que produjeron alineamientos significativos junto con un valor de score normalizado y el valor E. La tercera parte muestra los alineamientos detallando los valores de los scores, identidad y valor E obtenidos y la última parte del informe muestra los parámetros utilizados en la búsqueda. Para interpretar los resultados obtenidos de la búsqueda de similitud en bases de datos moleculares usando cualquiera de los algoritmos (FASTA, BLAST o SSEARCH), el valor más representativo es el valor E [26, 35]. Este depende del valor de score, del largo de la secuencia incógnita y del tamaño de la base de datos analizada y mide las chances de que el alineamiento obtenido sea solamente causa del azar. Así un valor E de (que es el valor de corte más usado par las búsquedas con BLAST) significa que hasta 1 de cada 1000 alineamientos puede haberse dado por azar. Un valor cercano o menor a 1 e -50 es menos frecuente de encontrar, y resulta muy confiable en cuanto a que las secuencias alineadas estén evolutivamente relacionadas, no obstante esta apreciación exige una confirmación mediada por un análisis filogenético. 4.2 Alineamiento múltiple de secuencias Como se mencionó más arriba, el advenimiento de proyectos genómicos a gran escala ha llevado a la acumulación de un enorme y heterogéneo número de secuencias depositadas en bases de datos públicas. El alineamiento múltiple de secuencias juega un papel importante en la biología molecular actual. Tanto la anotación (edición por corrección e interpretación de hipotéticas funciones por homología) de dichas secuencias como las herramientas de análisis dependen de alineamientos múltiples adecuados. El objetivo de la aplicación ha pasado de una simple transferencia de anotación funcional de una secuencia a otra, a un enfoque genómico más amplio. El análisis de familias proteicas, la predicción de su estructura secundaria, la estimación de los diferentes tipos de plegamientos así como la detección de homólogos entre especies distantes como pasos intermedios en la construcción de árboles filogenéticos, se han constituido en los principales objetivos de este tipo de alineamiento [37, 23]. El alineamiento múltiple de secuencias puede ser visto como una generalización del alineamiento de pares de secuencias, donde la complejidad de esta aproximación crece exponencialmente con el número de secuencias que intervienen. La posibilidad de resolver el problema por métodos manuales [38] debe quedar descartada por la enorme complejidad del problema, limitándose su uso a casos con pequeños grupos. Por analogía con la comparación de pares de secuencias, es 248 PANIEGO, N.; HEINZ, R.; FERNÁNDEZ, P.; LEW, S.; HOPP, E.

232 posible aplicar la misma técnica de programación dinámica al caso exhaustivo multidimensional, pero el crecimiento exponencial de la complejidad de método limitó su aplicación práctica [39, 40, 41]. Introdujeron un esquema de acotamiento que utiliza alineamientos de parejas de secuencias para limitar el volumen del espacio N dimensional que se necesita para el alineamiento exhaustivo, resultando en importantes mejoras en la velocidad, que posibilitaron su implementación en el programa MSA [42] y la aplicación del método a pequeños grupos de secuencias. Por lo general tampoco es posible alinear más de 10 secuencias usando el riguroso modelo del programa MSA. De esta forma es fácilmente entendible la proliferación de métodos aproximados para conjuntos más grandes de secuencias. Los programas desarrollados abarcan una amplia gama, desde aquellos que utilizan métodos progresivos tradicionales [43, 44, 45] a aquellos iterativos y con mayores requerimientos computacionales [40, 46, 47, 48]. Los métodos iterativos tienden a una optimización de la función de puntajes. El objetivo buscado es que la función de puntaje refleje una función biológica tal que su optimización lleve a un alineamiento biológicamente correcto. El alineamiento múltiple puede dividirse en dos categorías principales: aquellos métodos de alineamiento de secuencias en toda su extensión (globales) y aquellos métodos que alinean regiones con alta similitud. Tradicionalmente se ha focalizado en los métodos globales tales como el método CLUSTAL W, que son aplicables a casos en los que las secuencias comparadas tienen extensiones similares. Sin embargo más recientemente se ha puesto mayor interés en los métodos de alineamiento múltiple local para el alineamiento de secuencias derivadas de proyectos genómicos que sólo alinean parcialmente [37]. En los métodos de alineamiento global, la solución clásica se basa en la formación de agrupamientos (clusters) de secuencias, los cuales se resuelven progresivamente [48]. Para ello, dada una medida del parecido o semejanza entre dos secuencias, se elige aquel par correspondiente al valor más alto y se alinean y agrupan entre sí para formar un único grupo o cluster de secuencias. A partir de este momento este cluster será tratado como una sola secuencia, y el proceso se repetirá hasta tener un solo cluster con todas las secuencias que intervenían en el alineamiento múltiple. Posiblemente, los programas más difundidos de este tipo sean CLUSTAL V [45] o CLUSTAL W en su última versión [49], y PILEUP, el cual utiliza el método heurístico para el cálculo de los niveles de semejanza entre las secuencias [50]. La aplicación de esta estrategia no garantiza resultados óptimos (en una primera etapa evalúa por coincidencias de residuos, por lo que sí utilizará esquemas de puntuación, aunque podrían existir otras soluciones posibles con puntuación mayor). Sin embargo, la calidad de los alineamientos es bastante aceptable, y permiten alinear algunos pocos cientos de secuencias [51, 52]. Otro algoritmo de comparación múltiple global progresivo es el POA que no generaliza perfiles sino que emplea gráficos parcialmente ordenados partiendo de las secuencias más similares y va adicionando otras secuencias progresivamente. Este programa permite comparar no sólo secuencias relacionadas originadas por mecanismos de deleción, inserción o mutación sino secuencias más distantes [53]. Los algoritmos de comparación múltiple local, como el DIALIGN, alinean segmentos completos en vez de residuos simples. Inicialmente realiza alineamientos de pares, seleccionando luego las regiones sin intervalos no apareados que aparecen como diagonales de una matriz, para progresar en una comparación iterativa [46]. Otros programas como el T-Coffee combinan alineamientos múltiples globales y locales, realizando primero una comparación de a pares global utilizando el algoritmo CLUSTAL W y luego una comparación local utilizando FASTA [47]. Tanto el DIALIGN como el T-Coffee arrojan mejores resultados con grupos de secuencias más diversas pero tienen altos requerimientos computacionales. Con la idea de mejorar la sensibilidad de estos resultados, también se han propuesto numerosas posibilidades híbridas, tales como la representada por el programa MACAW [54] basado tanto en información estadística sobre alineamientos de segmentos de las secuencias como en la posibilidad de interacción con el usuario. Así mismo, se ha Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 249

233 propuesto la utilización de matrices de consenso [55] para describir la preferencia de cada aminoácido, o de cada deleción, para situarse en el alineamiento. También se ha recurrido a información sobre las estructuras secundarias [56, 57], o a la localización de motivos y/o dominios conservados en las secuencias [58], o a la utilización de las características físico-químicas de los aminoácidos en cada posición [59]. 5 Búsqueda por perfiles para localizar homólogos remotos Existe una tercera generación de métodos más elaborados para realizar búsquedas de similitud con mayor sensibilidad [60]. Los más exitosos son PSI-BLAST y los métodos basados en los modelos ocultos de Markov (HMM, [61]). El primero es un método extremadamente sensible para detectar similitudes débiles basándose en un proceso iterativo mediante el cual el algoritmo de BLAST puede ser generalizado para utilizar un perfil en vez de una secuencia [5], se recomienda usar este algoritmo cuando no se encuentran resultados significativos a partir de una búsqueda estándar a través de BLASTP. El proceso de PSI-BLAST comienza con una secuencia provista por el usuario, la cual es alineada mediante el algoritmo BLASTP contra una base de datos seleccionada. A partir de los alineamientos más significativos, el programa usa de base aquellos alineamientos que presentan un valor E menor que 0.005, construye una matriz de scores específicos de posición o perfil (position-specific scoring matrix, PSSM o profile). En la segunda ronda, la versión adaptada del algoritmo BLAST usa la matriz como entrada para realizar una búsqueda más refinada. De una manera similar, HMMs genera perfiles a partir de alineamientos múltiples de secuencias, tales como los obtenidos usando Clustal W o X [49, 62] y calcula scores específicos de posición que guarda en un archivo de formato compatible que luego se usa para analizar una base de datos. Tanto PSI-BLAST como HMMs facilitan el desarrollo de bases de datos secundarias como las bases de datos de dominios de proteínas [63, 64] que permiten el análisis de la arquitectura modular de las proteínas y sus unidades funcionales. Hoy en día se prefiere usar estas bases de datos para predecir o confirmar la función de genes o proteínas, dado que resultan más confiables que las bases de datos primarias que reciben grandes cantidades de información regularmente lo cual hace difícil controlar que las anotaciones de los datos sean correctas. 6 Predicción de Genes La expansión de los proyectos genómicos en los últimos años ha sido tal que al día de hoy existen 717 iniciativas de este tipo en el mundo, 140 de los cuales corresponden a genomas completos, entre ellos el genoma humano, el genoma de Arabidopsis thaliana [18], Oryza sativa variedad indica [19] y Oryza sativa variedad japonica [20], 235 corresponden a organismos eucariotas, 38 de los cuales son genomas vegetales y 342 corresponden a organismos procariotas (GOLD [65]). La gran cantidad de datos generados por estos, y otros proyectos de análisis genómico parcial fuerzan las necesidades de disponer de las herramientas adecuadas para darle interpretación biológica a estos datos. Una de las etapas más críticas de este proceso es la de identificar todos lo genes y sus proteínas asociadas. La manera más directa de abordar esta tarea es mediante métodos comparativos como los descriptos anteriormente basados en encontrar una secuencia altamente similar a la secuencia incógnita en otro organismo usando generalmente bases de datos de proteínas. Sin embargo, sólo un 50-70% de los genes nuevos suelen encontrar homología con genes o proteínas conocidas [66]. La caracterización del resto de las secuencias requiere la aplicación de métodos predictivos, los mismos tratan de identificar secuencias codificantes a partir de patrones característicos, usualmente secuencias cortas sobre el ADN genómico que representan sitios claves para procesos como la transcripción (sitios de unión a factores de transcripción, cajas TATA), el procesamiento postranscripcional del ARN (sitios de splicing) y la traducción (codones de iniciación y terminación) [67]. Existen muchos programas para predecir genes, la mayoría de los cuales son accesibles desde la Web, el 250 PANIEGO, N.; HEINZ, R.; FERNÁNDEZ, P.; LEW, S.; HOPP, E.

234 sitio Computational Gene Recognition mantenido por W Li [68] ofrece una lista completa y actualizada de publicaciones y software dedicado a este tema. Sin embargo, aunque los recursos son vastos y los algoritmos de predicción han ido avanzando junto con los desarrollos en informática y el avance de los conocimientos, cimentados en una mayor disponibilidad de información biológica caracterizada, actualmente no existen métodos precisos para identificar estas señales en las secuencias moleculares. Este problema se acentúa cuando se trata de predecir genes eucarióticos que tienen una organización y una estructura más compleja que la de los genes de organismos procarióticos. En genomas complejos los genes no están dispuestos en forma continua, están separados por distancias intergénicas enormes y a su vez están estructurados en fragmentos codificantes (exones) separados por regiones no codificantes (intrones), los cuales además varían en tamaño y número dentro y, más aún, entre especies. Algunos programas, además de reconocer y modelar las señales de patrones específicos, tratan de incorporar un modelo estadístico de las propiedades que definen de manera más global exones, intrones y regiones intergénicas, aprovechando los sesgos de composición de bases (en regiones codificantes es más alto el porcentaje de G+C) [69], el uso de codones, la frecuencia de hexámeros o dicodones [70, 71, 72, 73], la periodicidad de aparición de bases [74], etc. Sin embargo, todas estas consideraciones no son suficientes para reconocer con exactitud exones e intrones cuando éstos son cortos. En la mayoría de los casos, los programas más promisorios para reconocer genes en la especie bajo estudio deben ser analizados particularmente, a partir de lo cual muchos son redefinidos o diseñados específicamente [67]. Dado que los algoritmos usan distintas medidas y scores para predecir regiones codificantes, lo recomendable es combinar el resultado de algunos o varios de ellos para construir el mejor modelo, en este sentido existen distintas herramientas de acceso libre como RiceGAAS [75, 76], y GenMachine [77, 78], GenMark [79], entre muchos otros. 7 Conclusiones La biología moderna ha generado una explosión de información en el área de secuenciación de genomas completos, la proteómica, la transcriptómica, la genómica funcional, la interactómica, la metabolómica, etc. Todo esto genera la necesidad constante de actualizar esta información y aplicarla en beneficio de los proyectos particulares. Para ello, es necesario entender cómo se genera esa información, cuán confiable es, cómo se maneja y cómo se analiza. En este proceso juega un papel clave el desarrollo de la bioinformática, que se define como un área de fusión entre la biología, la matemática avanzada y la computación cuyo objetivo discurre en observar la biología en términos de macromoléculas, con el fin de ordenar y entender la información contenida en las mismas a partir de recursos de la informática. En este sentido, la bioinformática enfoca tres áreas básicas, la primera tiene que ver con el desarrollo de un sistema simple de organización de los datos biológicos de manera de favorecer el acceso y el ingreso de nuevas entradas a las bases de datos compartidas. La segunda área tiene que ver con el desarrollo de recursos y herramientas para analizar la información coleccionada en las bases de datos, lo cual implica conocimientos sólidos en las teorías computacionales y biológicas.el tercer área, implica el uso de estas herramientas para analizar los datos e interpretar los resultados de manera biológicamente significativa. En este capítulo hemos intentado dar una visión amplia de la bioinformática focalizando dos elementos fundamentales como son las secuencias y los alineamientos, familiarizando a los lectores con los recursos básicos disponibles para el acceso a la información y su análisis, e instalando el concepto de que existen diferentes caminos para resolver un problema. Sin dejar de tener en cuenta que la mayoría de los métodos computacionales se basan en conocimientos limitados sobre genes, proteínas y caminos biosintéticos por lo cual todos los resultados obtenidos a través de estos medios exigen una verificación experimental. En su defecto, es recomendable explorar dis- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 251

235 tintos programas que aborden el problema desde perspectivas diferentes. En este sentido, también es aconsejable no confiar en los parámetros de base (defaults) de los programas sino experimentar valores diferentes (tales como valor E, enmascarado de regiones de baja complejidad, matriz de score, etc.) para lo cual es crucial leer la documentación asociada a los programas o bases de datos usadas. 8 Lecturas Recomendadas 1. GenBank: index.html 2. EMBL: 3. DDBJ: 4. SWISSPROT: 5. Kanehisa M y Bork P Bioinformatics in the postsequence era. Nature Genetics 33: DBCAT: 7. SRS: page+databanks+-id+2yjt1ljskf 8. Nucleic Acid Research: content/full/31/1/1 9. PIR: pirpsd.html 10. PDB: MSD: About NCBI: index.html 13. 2can: index.html 14. ENTREZ: DBGET: Zdobnov EM, Lopez R, Apweiler R, y Etzold T The EBI SRS server- new features. Bioinformatics 18: ENTREZ Help: query/static/help/helpdoc.html 18. The Arabidopsis Initiative Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408: Yu J, Hu S, Wang J, Wong GK, Li S, Liu B, Deng Y, Dai L, Zhou Y, Zhang X, Cao M, Liu J, Sun J, Tang J, Chen Y, Huang X, Lin W, Ye C, Tong W, Cong L, Geng J, Han Y, Li L, Li W, Hu G, Huang X, Li W, Li J, Liu Z, Li L, Liu J, Qi Q, Liu J, Li L, Li T, Wang X, Lu H, Wu T, Zhu M, Ni P, Han H, Dong W, Ren X, Feng X, Cui P, Li X, Wang H, Xu X, Zhai W, Xu Z, Zhang J, He S, Zhang J, Xu J, Zhang K, Zheng X, Dong J, Zeng W, Tao L, Ye J, Tan J, Ren X, Chen X, He J, Liu D, Tian W, Tian C, Xia H, Bao Q, Li G, Gao H, Cao T, Wang J, Zhao W, Li P, Chen W, Wang X, Zhang Y, Hu J, Wang J, Liu S, Yang J, Zhang G, Xiong Y, Li Z, Mao L, Zhou C, Zhu Z, Chen R, Hao B, Zheng W, Chen S, Guo W, Li G, Liu S, Tao M, Wang J, Zhu L, Yuan L, Yang H A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica). Science 296 : Goff SA, Ricke D, Lan TH, Presting G, Wang R, Dunn M, Glazebrook J, Sessions A, Oeller P, Varma H, Hadley D, Hutchison D, Martin C, Katagiri F, Lange BM, Moughamer T, Xia Y, Budworth P, Zhong J, Miguel T, Paszkowski U, Zhang S, Colbert M, Sun WL, Chen L, Cooper B, Park S, Wood TC, Mao L, Quail P, Wing R, Dean R, Yu Y, Zharkikh A, Shen R, Sahasrabudhe S, Thomas A, Cannings R, Gutin A, Pruss D, Reid J, Tavtigian S, Mitchell J, Eldredge G, Scholl T, Miller RM, Bhatnagar S, Adey N, Rubano T, Tusneem N, Robinson R, Feldhaus J, Macalma T, Oliphant A, Briggs S A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science 296: Bal, AA, Katsumi S, y Sasaki T Rice at the forefront of plant genome informatics Genome Informatics 11: Sasaki T, Sederoff RR Genome studies and molecular genetics: The rice genome and comparative genomics of higher plants. Current Opinion in Plant Biol 6: Dopazo J. y Valencia A La bioinformática y la genómica. bioinfo.cnio.es/docus/courses/ leon2002/ BioinfoGenomica.pdf 24. Banerjee-Basu S y Baxevanis AD Predictive methods using protein sequences. In: Bioinformatics: A practical guide to the analysis of genes and proteins Editado por: Baxevanis AD y Oullette BFF.USA. Wiley-Liss, Inc pp Mudler NJ, y Apweiler R Tools and resources for identifying protein families, domains and motifs. Genome Biology 3: Perstsemlidis A y Fondon III JW Having a BLAST with bioinformatic (and avoiding BASTphemy). Genome Biology 2: Schuler GD. Sequence alignment and database searching. In: Bioinformatics: A practical guide to the analysis of genes and proteins. Editado por: Baxevanis AD y Oullette BFF USA. Wiley-Liss, Inc pp Altschul, SF, Gish, W, Miller, W, Myers, EW, y Lipman, DJ Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol, 215: Pearson WR y Lipman DJ Improved tools for biological sequence comparison, Proc. Natl, Acad. Sci. 85: Altschul SF, Boguski MS, Gish W, Wootton JC Issues in searching molecular sequence databases. Nat Genet 6: PANIEGO, N.; HEINZ, R.; FERNÁNDEZ, P.; LEW, S.; HOPP, E.

236 31. Pearson WR 1991 Searching protein sequence libraries: comparison of the sensitivity and selectivity of the Smith- Waterman and FASTA algorithms. Genomics 1991, 11: Henikoff S, Henikoff JG 1992 Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc Natl Acad Sci 89: Dayhoff MO, Schwartz RM, Orcutt BC: A model of evolutionary change in proteins. In: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.5. Editado por Dayhoff MO. Washington DC: National Biomedical Research Foundation; 1978 pp States DJ, Gish W, Altschul SF 1991 Improved sensitivity of nucleic acid database searches using application-specific scoring matrices. Methods: A Companion to Methods in Enzymology 3: Altschul SF 1998 Fundamentals of database searching. Trends Guide to bioinformatics. TIBS Brenner SE 1998 Practical database searching Trends Guide to bioinformatics. TIBS Lassmann T y Sonnhammer LL Quality assessment of multiple alignment programs. FEBS Letters 529: Barber AM. y Maizel JVJ Sequence editing aligner: A multiple sequence editor and aligner, Genet. Anal. Tech. Appl., 7: Murata M, Richardson JS y Sussman JL (1985). Simultaneous comparison of three protein sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. 82: Gotoh O 1996 Significant improvement in accuracy of multiple protein sequence alignments by iterative refinement as assessed by reference to structural alignments. J Mol Biol. 13: Carrillo H. y Lipman DJ The multiple sequence alignment problem in biology, SIAM J.Appl.Math, 48: Lipman DJ, Altschul SF, y Kececioglu JD A tool for multiple sequence alignment Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86: Feng DF y Doolittle RF Progressive sequence aligment as a prerequisite to correct phylogenetic tree. J Mol Biol 25: Higgins DG y Sharp PM 1988 CLUSTAL: a package for performing multiple alignment on a microcomputer. Gene 73: Higgins DG, Bleasby AJ y Fuchs R CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment CABIOS 8: Morgenstern B 1999 DIALIGN 2: improvement of the segment-to-segment approach to multiple sequence alignment Bioinformatics 15: Notredame C, Higgins D, y Jeringa J T-Coffee: a novel method for fastand accurate multiple sequence alignment. J. Mol. Biol. 302: Corpet F 1988 Multiple sequence alignments with hierarchical clustering.nucleic Acids Res. 16: Thompson JD, Higgins DG y Gibson TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: Wilbur WJ y Lipman DJ Improved tools for biological sequence comparison. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80: Barton GJ. Y Sternberg MJE Evaluation and improvements in the automatic alignment of protein sequences», Protein Eng., 1: Taylor WR Multiple sequence alignment by a pairwise algorithm. CABIOS 3: Lee C, Grasso C. y Sharlow M Multiple sequence alignment using partial order graphs. Bioinformatics 18, Schuler, G.D.; Altschul, S.F. and Lipman, D.J A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins Struct. Func. Genet.9: Alexandrov N Local multiple alignment by consensus matrix. CABIOS,8: Smith RF y Smith TF Pattern induced multisequence alignment (PIMA) algorithm employing secondary structure dependent gap penalties for use in comparative protein modelling. Protein Eng 5: Godzik A y Skolnick J (1994). Flexible algorithm for direct multiple alignment of protein structures and sequences. CABIOS: Boguski MS.,Hardison RC, Schwarz S y Miller W Analysis of conserved domains and sequence motifs in cellular regulatory proteins and locus control regions using new software tools for multiple alignment and visualization. New Biol. 483: Livingstone CD y Barton GJ (1993). Protein sequence alignments : a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation. CABIOS 9: Park S, Karplus K, Barrett C, Hughey R, Haussler D, Hubbard T, Y Chothia C, Sequence Comparisons Using Multiple Sequences Detect Three Times as Many Remote Homologues as Pairwise Methods. J. Mol. Biol. 284, Krogh A, Brown M, Saira Mian I, Sjölander K Y Haussler D Hidden Markov Models in Computational Biology: Applications to Protein Modeling, J Mol Biol 235: Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, y Higgins DG The CLUSTAL_X windows interface: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 253

237 flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucl. Acids. Res. 25: Falquet L, Pagni M, Bucher P, Hulo N, Sigrist CJA, Hofmann K, Y Bairoch A The PROSITE database, its status in 2002 Nucleic Acids Res. 30: Haft D, Loftus BJ, Richardson DL, Yang F, Eisen JA, Paulsen IT, y White O 2001 TIGRFAMs: a protein family resource for the functional identification of proteins Nucleic Acids Res. 29: GOLD: Mathé C, Sagot M-F, Schiex T y Rouzé P Current methods of gene prediction, their strengths and weaknesses. Nucleic Acid Research 30: Pertea M y Salzberg SL 2002 Computational gene finding in plants. Plant Mol Biol 48: Computational Gene Recognition: linkage.rockefeller.edu/wli/gene 69. Duret L, Mouchiroud D y Gautier C Statistical analysis of vertebrate sequences reveals that long genes are scarce in GC-rich isochores. J. Mol. Evol. 40: Hutchinson GB y Hayden MR The prediction of exons through an analysis of spliceable open reading frames. Nucleic Acids Res 20: Milanesi L, Kolchanov NA, Rogozin IB, Ischenko IV, Kel AE, Orlov YL, Ponomarenko MP y Vezzoni P GenView: a computing tool for protein-coding regions prediction in nucleotide sequences. In Lim,H.A., Fickett,J.W., Cantor,C.R. and Robbins,R.J.(eds), Proceedings of the Second International Conference on Bioinformatics, Supercomputing and Complex Genome Analysis. World ScientiÆc Publishing, Singapore, pp Zhang MQ 1997 Identification of protein coding regions in the human genome by quadratic discriminant analysis. Proc. Natl Acad.Sci 94: [Erratum (1997) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 94, 5495] 73. Snyder EE. y Stormo GD 1995 Identification of protein coding regions in genomic DNA. J. Mol. Biol. 248: Lio P Wavelets in bioinformatics and computational biology: state of art and perspectives. Bioinformatics 19: RGAAS: Numa H, Sakata K, Nagamura Y, Antonio B, Idonuma A, Shimizu Y, Horiuchi I, Matsumoto T, Sasaki T y Higo K RiceGAAS: An Automated Annotation System for Rice Genome. Genome Informatics 12: GENEMACHINE: genemachine/abstract.shtml. 78. Makalowska I., Ryan JF, y Baxevanis AD 2001 GeneMachine: Gene Prediction and Sequence Annotation. Bioinformatics, 17: GENMARK: GeneMark 254 PANIEGO, N.; HEINZ, R.; FERNÁNDEZ, P.; LEW, S.; HOPP, E.

238 PARTE VIII Aplicaciones Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 255

239 256 ESCANDÓN, Alejandro S.

240 VIII.-Capítulo 1 2 El cultivo de tejidos en ornamentales Biotecnología en el Cultivo de Especies Ornamentales Escandón, Alejandro S. 1 Introducción La industria florícola es de una importancia más que relevante a escala mundial, ya que representa un negocio de alrededor de millones de dólares. Tradicionalmente se ha empleado el mejoramiento clásico para obtener variedades exitosas que satisfagan las demandas de un mercado ávido de novedades, que busca nuevas características en cuanto a colores, formas, aromas, etc. Sin embargo, las tendencias actuales hacia la mejora ecológica de los cultivos y la necesidad de incorporar caracteres tales como resistencia a herbicidas, insectos, enfermedades, mayor vida en postcosecha, modificar la arquitectura de las flores, etc., ha conducido a la industria de la floricultura a adoptar las nuevas biotécnicas. El presente capítulo tiene como objetivo brindar un panorama sobre la situación actual de la Biotecnología en relación al cultivo de plantas ornamentales. No se profundizará en los detalles de las técnicas involucradas, que ya han sido tratadas en otros capítulos de este volumen. Una de las técnicas biotecnológicas que se emplean en ornamentales es el cultivo de tejidos. Esta técnica no sólo permite la producción masal de plantas, sino que también posibilita el estudio y caracterización de la biología del desarrollo de las mismas. Dependiendo del objetivo planteado es posible clonar individuos utilizando cultivo de ápices o meristemas, o bien buscar aumentar la variabilidad genética por medio del cultivo de callos, suspensiones celulares o protoplastos. La técnica de micropropagación (Fig.1) es una excelente herramienta que ha sido am- Figura 1. Cultivo de tejidos de Santa Rita. A: Desarrollo de la yema principal y de brotes subsidiarios en la base de la misma que serán cultivados in vitro. B: Brotes subsidiarios aislados. C: La flecha señala la yema principal, los restantes son brotes subsidiarios cultivados en forma aislada. D: Estadío previo a la transferencia de los brotes al medio de enraizamiento. E: Plantas ex vitro enraizando en sustrado artificial. F: Plantas ex vitro floreciendo en condiciones de invernáculo. Modificado de Escandón et al. RIA 32 (1): Abril Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 257

241 pliamente utilizada para la propagación a gran escala de especies ornamentales, ya que no sólo permite la obtención de miles de individuos a partir de un genotipo «elite» seleccionado, sino que también permite la multiplicación de plantas raras o en peligro de extinción, resguardando la estabilidad genética de las mismas. Algunos géneros y especies de plantas que se pueden cultivar in vitro a partir de diferentes explantos son: - Cultivo de meristemas: Ghypsophyla, Chrysantemum, Maranata sp., Gladiolus, Iris sp., Pelargonium, Saintpaulia spp. - Apices: Diphaenbachia, Daphne L., Dracaena sp., Gerbera sp., Mammillaria sp., Rosa L., Iris sp. - Yemas o segmentos nodales: Dianthus, Bignoniaceae, Nierembergia, Jacaranda mimosifolia, Bougainvillea, Blandfordia sp., Anthurium sp. Bromeliaceas, Maranta sp., Campanula sp., Daphne L., Dracaena sp., Gerbera sp., Mammillaria sp., Mediocactus coccineus, Zinnia elegans, Rosa L., Gardenia, Chrysantemum, Gladiolus, Impatiens, Iris sp., Saintpaulia spp. - Segmentos de médula: Chrysantemum, Orchidea, Saintpaulia spp. - Pecíolos: Rhododendron sp., Anthurium sp., Gerbera sp., Chrysantemum. - Discos de hojas: Rhododendron sp., Bromeliaceas. Begonia sp., Gardenia. Chrysantemum, Saintpaulia spp. - Lámina: Saintpaulia spp. - Escamas: Lilium - Bulbos o Segmentos de bulbos: Sego lily, Narcissus - Rizomas: Cymbidium - Cotiledones: Zinnia elegans. - Semillas: Cattleya sp., Mammillaria sp., Orchidea, Saintpaulia spp. - Embriones maduros: Alstroemeria sp., Zinnia elegans, Impatiens, Iris sp. - Embriones inmaduros: Alstroemeria sp., Orchidea spp. - Secciones de flores: Iris sp. - Anteras: Saintpaulia spp. - Segmentos de pétalos: Chrysantemum. - Segmentos de inflorescencia: Chrysantemum, Saintpaulia spp.. - Capítulos: Gerbera sp. - Ovulos: Impatiens - Callos: Chrysantemum, Iris sp. - Protoplastos: Chrysantemum. - A partir de plántulas in vitro: Bromeliaceae, Gerbera sp., Cyclamen persicum, Gardenia, Scoparia sp. La lista precedente es apenas una muestra de la gran diversidad de explantos que se utilizan para la multiplicación in vitro de plantas y, como tal, está muy lejos de abarcar el total de las especies ornamentales que se multiplican por este método. Además de la micropropagación, la posibilidad de obtener plantas libres de virus por medio del cultivo de meristemas también ha sido explotada en ornamentales. Hace más de 50 años Morel y Martín informaron la regeneración de plantas de dalia libres de virus por escisión y cultivo del domo meristemático de ápices de plantas infectadas. Este descubrimiento dio un gran impulso al cultivo de tipo intensivo en general. El cultivo de meristemas es uno de los métodos más eficaces para la eliminación de virus, más aún si se lo combina con termoterapia y/o métodos químicos; es de gran aplicación en el campo de los cultivos intensivos tanto ornamentales como hortícolas. Como la mayoría de los cultivos ornamentales se multiplican asexualmente, estas enfermedades virales suelen ser un problema importante. La elección errónea de un material, por error o desconocimiento, provocaría la diseminación de estas enfermedades, con las consecuentes pérdidas económicas Gerbera representa un claro ejemplo de la necesidad de la aplicación de estas técnicas en la industria florícola. En Europa la demanda anual del mercado de plantas de este género oscila entre 15 y 20 millones de unidades. Con el método convencional (semillas o división de la corona sobre sustrato artificial e inerte) se logra una tasa de multiplicación de 30 plantas por año. Por otro lado, se hace necesario eliminar de los cultivos de esta especie los virus que los afectan normalmente, entre ellos el del mosaico del coliflor (CMV). Si bien existe una dependencia del genotipo, por medio de la multiplicación de yemas apicales in vitro es posible obtener una tasa de multiplicación de hasta 300 yemas por ápice cultivado en 90 días, libres de virus. En general, con todos los genotipos, 258 ESCANDÓN, Alejandro S.

242 estas técnicas de producción superaron largamente los rendimientos del método convencional, por lo que fueron adoptadas como método de rutina para la multiplicación comercial de este género. El cultivo in vitro también puede ser fuente de variabilidad genética. La producción de plántulas por regeneración a partir de callos, suspensiones celulares o protoplastos, puede dar origen a individuos que presentan algún rasgo diferente respecto de la planta madre. Esto también puede lograrse utilizando mutágenos durante el cultivo in vitro asociados con una presión de selección conferida por factores tales como ph, salinidad, toxinas y baja temperatura. Las plantas regeneradas luego de estos tratamientos pueden mostrar características que difícilmente se puedan obtener por otra vía. La inducción de variantes somaclonales tiene especial significado en la floricultura debido a la constante búsqueda de nuevas variedades, seleccionándose las variantes prometedoras y estables e incorporándolas a los programas de mejoramiento. En la actualidad se conoce un importante número de variantes en ornamentales. Se han obtenido individuos con diferencias en la forma, el color y el tamaño de la flor (en Chrysantemum, Zinnia, Geranium y Saintpaulia). En Chrysantemum, se han obtenido individuos con resistencia al estrés salino y con cambios interesantes en la forma de las hojas. Otro ejemplo de variación somaclonal es el caso de Zinnia. Los somaclones en este género se obtuvieron a través del desarrollo de yemas adventicias a partir de cotiledones cultivados con diferentes concentraciones de tidiazuron (TDZ). Este fue un avance importante para la especie Z. marylindica, que es un híbrido estéril. A partir de este tratamiento se recuperó una gran cantidad de variantes, plantas con diferentes tamaños, hábitos de floración, color de pétalos y, lo que es más interesante, en algunos casos se restauró la fertilidad. Aquellas variantes cuyos nuevos caracteres mostraron ser heredables se seleccionaron para incorporar en el programa de mejoramiento. Asimismo, la variación somaclonal también se ha utilizado a fin de seleccionar genotipos resistentes a enfermedades fúngicas en el género Rosa, lo mismo que la fusión de protoplastos. En este caso se obtuvieron yemas a partir de callos originados de protoplastos interespecíficos fusionados que habían sido pretratados con antimetabolitos como iodoacetato o rodamina-6g o, alternativamente, con rayos X. La obtención de plantas completas y fértiles a partir de estos materiales hace a esta estrategia muy promisoria para incorporar nuevos caracteres. Una técnica tradicional para la obtención de mutantes in vitro que también se utiliza en especies ornamentales es la aplicación de inductores de poliploidía, como la colchicina y los herbicidas orizalina y trifluralina, que ha sido aplicada en Rhododendron y Lilium. Esta técnica se está utilizando en el Centro Tecnológico en Flori, Fruti y Horticultura (CETEFFHO) con el objetivo de obtener cruzamientos interespecíficos viables en especies de los géneros Calibrachoa y Scoparia. Para ello, una vez efectuado el cruzamiento, se duplican los cromosomas del híbrido a fin de que sea fértil. Las plantas de Calibrachoa que sobrevivieron al tratamiento demostraron ser quimeras diploides/tetraploides. Se multiplicaron las tetraploides y se espera la floración a fin de establecer la posibilidad de cruzarlos con otras especies del género. 3 Marcadores moleculares para el mejoramiento y la selección de ornamentales Los marcadores moleculares como herramienta para la caracterización y diferenciación entre genotipos fueron rápidamente utilizados por genetistas y mejoradores de plantas. Su neutralidad en relación al proceso de selección, su poder de resolución y la celeridad con que se obtiene la información, son algunas de las ventajas que ofrece esta herramienta. A pesar de que diferentes clases de marcadores moleculares fueron probados en ornamentales, los AFLPs y los microsatélites son los más frecuentemente utilizados por su alta reproducibilidad y la gran cantidad de información que brindan. Estos marcadores moleculares aplicados a la diferenciación de genotipos son un arma muy poderosa para la protección de los derechos de los mejoradores y productores. Para detectar la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 259

243 propagación fraudulenta de un cultivar el método tradicional se basa en el análisis y la comparación de los caracteres fenotípicos de plantas crecidas y en período de floración. Esta estrategia tiene la desventaja de que requiere mucho tiempo y depende de factores ambientales. Esto se soluciona utilizando marcadores moleculares de manera más rápida y precisa. La genómica también está realizando aportes en el área de las plantas ornamentales. La rosa, que como flor de corte es uno de los cultivos ornamentales más importantes del mundo, es un ejemplo interesante. A mediados de la década de 1990, se inició un proyecto conjunto entre las Universidades de Clemson y Texas a fin de obtener el mapa genético de esta especie. El mismo tiene como objetivos, a largo plazo, ubicar los genes involucrados en la producción de la fragancia y los de la resistencia a la enfermedad de la mancha negra, causada por el hongo Diplocarpon rosae. Esta enfermedad es la de mayor incidencia en el producción de rosas. Se caracteriza por la presencia en las hojas de manchas negras de contorno irregular, defoliación, pérdida del vigor de la planta, y disminución en la producción de flores. La enfermedad se controla con aplicaciones de fungicidas. Un hecho de importancia es que se han detectado variedades de rosas que manifiestan resistencia a la enfermedad y se están buscando los genes que la confieren. Con este fin los investigadores texanos están analizando la F2 de un cruzamiento seleccionado entre una variedad susceptible y una resistente, donde la progenie segregó además para varios caracteres de interés para la industria florícola, como color de la flor (rosa vs blanco), número de pétalos (5 vs. 10 o más), presencia o ausencia de espinas en el tallo, floración una vez al año o siempre florecida. A partir del análisis de esta F2 se está construyendo un mapa de alta densidad con distintos marcadores moleculares, entre los que se encuentran los AFLPs. Una vez construído este mapa, se procederá al análisis de los perfiles detectados a fin de establecer la asociación entre los marcadores utilizados y los caracteres de interés. Esto permitiría llevar a cabo en el género Rosa un programa de mejoramiento asistido por marcadores moleculares. Como el resto de las técnicas biotecnológicas, la de marcadores moleculares está siendo intensamente aplicada en especies ornamentales, sobre todo por la relevancia Tabla 1: Aplicación de marcadores moleculares para determinar la distancia genética (DG), identificación varietal (I.V) y análisis genético (A.G), en algunos géneros ornamentales. Género I. V. D. G. A. G. Alstroemeria X X X Calladium X Cephalotaxus X Cymbidium X Dahlia X Dedrathema X X Dianthus X X Euphorbia X X Geranium X Gerbera X Heliconia X Jacaranda X Junipers X X Lilium X Osteospermum X Ozothamnus X Pelargonium X Petunia X X X Rhododendron X X X Rosa X X X Scaevola X Syringa X Viola X que estos están adquiriendo en la verificación de los criterios de distinguibilidad, estabilidad y uniformidad de las nuevas variedades que año a año ingresan al mercado. En la Tabla 1 se mencionan los cultivos ornamentales en los cuales se han aplicado marcadores moleculares. 4 Mejorando la ecología de los cultivos y modificando las formas y los colores de las flores La tecnología génica es otra de las estra- 260 ESCANDÓN, Alejandro S.

244 tegias que se ha aplicado exitosamente en el mejoramiento y se ha difundido en forma sostenida entre los principales cultivos ornamentales. Varios factores han contribuído a este importante desarrollo, entre los que se puede considerar un profundo conocimiento de la bioquímica de las plantas (sobre todo en lo que hace a la síntesis de pigmentos), un notable manejo del cultivo de tejidos en las especies de interés, el alto valor agregado que implica la aplicación de la técnica, además de las ventajas adicionales que se pueden lograr en la incorporación de un caracter determinado (por ejemplo: ahorro de insumos, incremento en el rendimiento, etc.). Asimismo, y desde un punto de vista totalmente ligado el mercado, los organismos genéticamente modificados (OGMs) ornamentales, no generan el mismo tenor de controversias que provocan los OGMs ligados al consumo alimentario humano como los cereales y las oleaginosas. Para el mejoramiento de ornamentales por transgénesis existe un considerable interés en la incorporación de características tales como: resistencia a insectos, a enfermedades fúngicas y virales, tolerancia a herbicidas, androesterilidad, etc., que son los de aplicación en la mayoría de los cultivos. A estas se suman los caracteres específicos para la floricultura, como son la modificación del color y la forma de las flores, el incremento de la vida post cosecha, la modificación de la fragancia, el control de la floración y el mejoramiento de la eficiencia de enraizamiento. En el tema donde más se ha avanzado es en la modificación de los pigmentos de los pétalos. El color de las flores se debe a tres tipos de pigmentos. De los colores amarillo y naranja son responsables los carotenoides. Del rojo y del rosa son responsables los flavonoides (cianidina y pelargonidina, flavonoides, se encuentran en las flores rosas y rojas respectivamente). El color azul se debe a un pigmento denominado delfinidina. La modificación del color de las flores se planteó como objetivo por los grupos de mejoradores de ornamentales. El primer informe acerca de la modificación de los colores de flores por ingeniería genética lo efectuó en 1987 el Instituto Max Planck de Colonia, Alemania. Desde mediados de la década que comenzó en 1990 se sucedieron una serie de publicaciones acerca de la alteración de la pigmentación de flores de crisantemo por aplicación de la tecnología antisentido para el gen de la chalcona sintetasa (chs). En clavel se utilizó la secuencia antisentido de la flavonona 3-hidroxilasa (Fht), para bloquear la vía metabólica de las antocianinas. De esta manera se logró la modificación del color original y se obtuvieron nuevos genotipos de la variedad utilizada en el ensayo. Asimismo, se encontró que los genotipos transgénicos que tenían reprimida la expresión de Fht resultaron tener mucho más fragancia que los controles. Estudios de cromatografía gaseosa mostraron incrementos de 10 a 100 veces en los niveles de los derivados del ácido benzoico, por lo que a partir de la alteración de la expresión de un transgen, se logró la modificación de dos caracteres. La introducción de la secuencia en sentido del gen de la chalcona sintetasa en petunia permitió redireccionar la vía metabólica de los flavonoides hacia la producción de chalconas, lo que derivó en la obtención de flores amarillas en el género por acumulación de pigmentos como chalconas, auronas y algunos flavonoles en los pétalos. El color azul no es muy frecuente en las flores. Sólo en petunia el azul tiene la intensidad que los mejoradores pretenden. Este color depende de tres factores: la síntesis de un pigmento denominado delfinidina (3,5 - hidroxiantocianina), la presencia de copigmentos como flavonas y un ph alcalino en las vacuolas de las células de los pétalos. La obtención de flores dentro de la gama del azul se constituyó un desafío para las semilleros. Una idea de la relevancia de este tema lo indica el hecho que en el año 1986 se fundó en Melbourne, Australia, la compañía Florigene cuyo principal objetivo era el desarrollo de claveles, crisantemos y rosas de color azul (las tres especies abarcan el 50% del mercado mundial de flores de corte). Esta empresa aisló el gen que codifica para la enzima clave para la biosíntesis de delfidina, la flavonoide 3',5'-hidroxilasa, el Blue Gene. A mediados de la década que comenzó en 1990 se obtuvieron claveles azules. Otro gen involucrado en la producción de delfinidina fue identificado en Este gen codifica para un citocromo del tipo b5. La expresión Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 261

245 del mismo incrementa la producción de la antocianina 3,5 sustituída. El silenciamiento de este gen en plantas de petunia redunda en un 60% menos de acumulación de delfinidina en relación a plantas no tratadas. En la actualidad existen en el mercado siete variedades de claveles cuya pigmentación fue modificada por ingeniería genética por incorporación del Blue Gene. En cuanto a la obtención de rosas azules, un inconveniente a resolver es que la vía metabólica de producción de pigmentos en estas plantas es muy diferentes a la petunia, ya que la rosa es deficiente en la enzima flavonoide 3',5' hidroxilasa. En consecuencia no puede sintetizar los pigmentos adecuados. Otro inconveniente es el ph vacuolar, que en las rosas es ácido y bajo estas condiciones la delfidina se torna de color rosa. Los datos indican que el microambiente de las células del pétalo de la rosa no sería el más propicio para la producción de pigmentos azules vía flavonoides, por lo que esta estrategia no sería la más adecuada para la producción de una rosa de color azul. En la actualidad Florigene está probando el citocromo P450 (responsable de la detoxificación hepática en mamíferos), como alternativa para la obtención de rosas de color azul. Experimentos efectuados en la Universidad de Queensland demostraron que bacterias transformadas con el gen que codifica para el P450 son capaces de generar un color azul intenso usando como sustrato compuestos con grupos indólicos, que se encuentran normalmente presentes en los vegetales. Si bien presenta la ventaja de que se trata de una vía metabólica directa (de un solo paso), habría que determinar si los productos de la conversión de grupos indol no presentan fitotoxicidad. Todavía no se han obtenido resultados concluyentes con la aplicación de esta estrategia para la obtención de rosas azules. Otro importante avance tecnológico, desarrollado y patentado por la misma empresa, es la producción de claveles «larga vida» («long vessel life», LVL) por bloqueo de la síntesis de etileno. La vía metabólica de producción de esta hormona es bien conocida, la enzima ACC (ácido 1 amino ciclo propano-1- carboxílico) sintetasa, convierte a la S- adenosilmetionina en ACC que, por acción de la ACC oxidasa se transforma en etileno. Aplicando tecnología antisentido se logró suprimir la expresión de ambas enzimas, por lo que se bloqueó la producción de etileno en los claveles transgénicos. La falta de producción de etileno impide el deterioro prematuro de las flores una vez cortadas (principalmente, el enrollamiento de los pétalos), retrasando su envejecimiento. La tecnología ofrece una importante ventaja tanto en lo comercial como en lo ecológico, ya que los productores podrán abandonar el uso de las sales de plata, muy contaminantes, para prevenir la producción de etileno en el período post-cosecha. En otros laboratorios se ha modificado la forma de las flores de crisantemo por la introducción del gen rol C de Agrobacterium rhizogenes, obteniéndose plantas de menor tamaño, flores de menor diámetro y pétalos y hojas modificados. En clavel la incorporación de este transgén produjo una serie de modificaciones morfológicas muy ventajosas como ser disminución de la dominancia apical, mayor capacidad de enraizamiento, mejor incorporación de metabolitos y mayor producción de varas (se incrementó tres veces Tabla 2: Algunos avances logrados en el mejoramiento de ornamentales por ingeniería genética 262 ESCANDÓN, Alejandro S.

246 en relación al producto no transgénico). En términos prácticos estas modificaciones implican una sensible mejora en el rendimiento del cultivo. La Tabla 2 resume algunos avances logrados en el mejoramiento de ornamentales por ingeniería genética. 5 La situación en la Argentina La revisión de los libros de resúmenes del Primer Congreso Argentino de Floricultura y del V Simposio de Redbio Argentina 2002 muestra que en nuestro país son muy pocos los laboratorios que trabajan en biotecnología de ornamentales. La lista alcanza a 5 instituciones trabajando en el área. En el Dpto. de Agronomía de la Universidad Nacional del Sur y en el Centro de Recursos Naturales Renovables de la Zona Semiárida (CERZOS) se trabaja en multiplicación in vitro de Lilium. En el laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botánica del Noreste (IBONE) y Universidad Nacional del Noreste (UNNE) se multiplican orquídeas in vitro. Este Instituto en colaboración con el Dpto. de Agronomía de la Universidad Nacional del Sur estudia la variabilidad genética en la micropropagación de paraíso (Melia azaderach). Sobre esta misma especie en el IBONE se efectúan estudios de crioconservación. En el Laboratorio de Propagación y Producción Vegetal del Centro Austral de Investigaciones Científicas de Usuahia se trabaja en Berberis sp. En el Centro de Producción Vegetal (CEPRoVe) de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de La Plata se está trabajando en la micropropagación de Pelargonium. En la Cátedra de Producción Vegetal de la Facultad de Agronomía de la UBA se han realizado experiencias en la micropropagación de Pelargonium, Lupinus, Jasminum mensyi y Gerbera. En el CETEFFHO, futuro Instituto de Floricultura de INTA-Castelar, se trabaja desde hace algunos años en micropropagación de especies ornamentales como, entre otras, alstroemeria, clavel, rosa, orquídeas, Poinsetia, Ghypsophylla, Gerbera, etc. Dentro del mismo Instituto y en el marco del proyecto INTA-JICA: «Desarrollo de la Floricultura A C Figura 2. A) Individuos tetraploides del género Scoparia (izq.) obtenidos a partir de un diploide (der.) tratado con colchicina en condiciones in vitro, comparados con el correspondiente control. B). Comparación entre las flores de ambas plantas, tetraploide (izq.) y control (der.). C) Hojas de la planta tetraploide (arr.) y de la planta control (ab.). D) Planta tetraploide florecida. en la Argentina» se está trabajando en flora nativa de importancia ornamental, entre otros con los géneros: Tabebuia, Jacaranda, Tecoma, Nierembergia, Lilium, Calibrachoa, Bougainvillea y Scoparia (Fig.2). Además de importantes avances en el establecimiento in vitro de Tabebuia y Tecoma, se han logrado interesantes resultados en la micropropagación de J. B D Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 263

247 mimosifolia, Bougainvillea sp, Lilium sp, Calibrachoa sp y Scoparia spp. En algunos casos con el objetivo de micropropagación en sí misma, y en otros, para aplicar mutagénesis in vitro. Otra de las áreas en las que se trabaja en el CETEFFHO es la puesta a punto de técnicas de marcadores moleculares para la identificación, vía «fingerprinting» (fenotipeado), de los individuos que se obtienen por mejoramiento. Se han obtenido resultados promisorios en la aplicación de microsatélites anclados en la caracterización molecular de clones de Jacarandá, siendo la primera vez que se informa un resultado de esta índole para el género. De esta revisión se desprende que en nuestro país la herramienta biotecnológica de aplicación en cultivos de interés ornamental es la multiplicación in vitro. Si bien a partir del desarrollo del proyecto INTA-JICA «Desarrollo de la Floricultura en la Argentina» se dieron pasos sustanciales en la formación de recursos humanos, nuestro país debería potenciar el desarrollo y aplicación de las nuevas tecnologías en el área del mejoramiento de cultivos ornamentales. Estos dos aspectos son fundamentales para que el país pueda intervenir en el mercado mundial de ornamentales, aprovechando los inmensos e interesante recursos naturales de los cuales dispone. Se espera que la incorporación de nuevas variedades al mercado incidirá en forma positiva sobre el desarrollo de la industria local y permitirá el ingreso de la Argentina en el mercado florícola mundial como generador de germoplasma mejorado. 6 Perspectivas El advenimiento de la genómica y proteómica y el desarrollo de la bioinformática han aportado herramientas de utilidad que podrían aplicarse en el mejoramiento de especies ornamentales. Los estudios sobre el genoma de Arabidopsis facilitarán la comprensión de la estructura y función del genoma de los cultivos ornamentales, en especial a través de la identificación de genes involucrados en estrés abiótico, síntesis de hormonas, resistencia a patógenos, etc. También será sustancial el aporte que se haga acerca de los mecanismos que intervienen en el establecimiento de la arquitectura de la planta, en el funcionamiento de los meristemas (en especial de las flores), o en los componentes de la resistencia a enfermedades. La identificación y el aislamiento de estos genes posibilitará su incorporación, vía transgénesis, a los cultivos ornamentales a fin de lograr un mejoramiento sustancial que involucre todos los aspectos del cultivo. Los avances efectuados en fotobiología y en el conocimiento de los ritmos circadianos vegetales permitirán ajustar finamente el control de procesos tan importantes como la floración. También se abren nuevas y muy interesantes perspectivas para la creación, selección y uso de la variabilidad genética. 7 Lecturas Recomendadas ARNAU, G.; LALLEMAND, J.; BOURGOIN, M. Are AFLP markers the best alternative for cultivar identification? (abstract). International Symposium on Molecular Markers for characterizing genotypes and identifying cultivars in horticulture. Acta Hort ARUS, P Molecular Markers for ornamental breeding. Proc. 19 th Int. I Symposium Improvement Ornamental Plants. Ed. Cadic, A. Acta Hort. 508: ISHS. BAJAJ, Y. P. S.; SIDHU, M. M. S.; GILL, A. P. S Micropropagation of Chrysantemum. En: Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol.: 20. Hightech and Micropropagation IV. Capítulo V, (Ed. Bajaj, Y. P. S. Springer.). BIJMAN, J Flower Colour is Major Target in Genetic Engineering of Cut Flowers. Biotec. & Development Monitor. Nro 20, p10. BRACALENTI, P.; SOTO, S.; KOBAYASHI, N.; ESCANDÓN, A Multiplicación in vitro de S. montevidiensis, una herbácea con potencial ornamental como planta en maceta o para borduras. Libro de Resúmenes del I Congreso Argentino de Floricultura y Plantas Ornamentales. Buenos Aires. CALLAWAY, M. B.; CALLAWAY, D. J Genetic and its applications. En: Breeding Ornamental Plants. Capitulo 1. Ed. por Callaway, D. J.; Callaway, M. B. Timber Press Portland, Oregon, USA. CURTIS, H.; BARNES, S DNA recombinante, las herramientas del oficio. En Biología (Ed. por Schnek, A.; Flores, G.) Editorial Médica Panamericana, Bs. As. Argentina. DE JONG, J Genetic engineering for resistance, quality and plant habit. XIX International Symposium Improvement Ornamental Plants. Ed. Cadic, A. Acta Hort. 264 ESCANDÓN, Alejandro S.

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249 -My love is like a blue, rose blue. The scientist. Nasto, B. - Ornamental Plant Biotechnology ornamental_files - Plant Biotechnology Applied To Horticultural Crops. Boxus, P. World Conference on Horticultural Research. Junio, 1998, Roma,Italia. - Proceeding of the XIX International Symposium Improvement Ornamental Plants. Acta Hort.508, Proceeding of the XX International Eucarpia Symposium. Section Ornamentals. Strategies for New Ornamentals II. Acta Hort. 572, Researchs and technology - Towards blue carnation. Practical Hydroponics. Issue: 33 (1997). Fox, R. - True Blue Rose. Russell. J ESCANDÓN, Alejandro S.

250 VIII.-Capítulo 10 Estrategias para el control de insectos plaga Ferrero, Adriana A.; Descamps, Lilian; Reviriego, María 1. Introducción La categorización de un organismo como peste o plaga está determinada por el hombre, es decir, tiene carácter antropocéntrico, considerándose éste como el factor principal en el sistema. Así, insectos que se alimentan de plantas y granos, que actúan como vectores de agentes patógenos en los vegetales o que alteran la salud humana son considerados plagas. La población humana está sumergida en un mar de insectos. Si se considera su número solamente, la tasa estimada de insectos en relación con los humanos en nuestro planeta es de 200 millones a 1, existiendo alrededor de 160 millones de insectos por hectárea. Basados en su biomasa y abundancia, los insectos son los organismos más exitosos en la tierra, siendo el 1% de ellos los que caen en la categoría de plagas. Se supone que las formas más primitivas de insectos conocidas eran consumidores de detritus. El hábito de alimentarse de plantas parece, en algunos casos, haber evolucionado independientemente. Los insectos han atravesado un largo y variado período de coevolución y coadaptación con sus plantas huéspedes estableciendo modelos de asociación con distintas estrategias en el ciclo biológico y en los mecanismos alimentarios necesarios para la explotación de éstas. La producción primaria neta de las especies de plantas vasculares, que habitan las zonas secas de la superficie de la tierra, ha sido estimada en unas 115 x10 9 toneladas por año. Esto representa un recurso potencialmente disponible para ser explotado por los insectos fitófagos. El impacto de los insectos sobre las cosechas es conocido desde los tiempos bíblicos, cuando las plagas de langostas se extendieron por el territorio egipcio. Sin embargo, el estudio global de la interacción y del impacto de los insectos sobre la vegetación natural se ha desarrollado en los últimos cien años. En la actualidad, los insectos plaga y los organismos patógenos (hongos, bacterias y virus) son responsables del 14 % de las pérdidas en cosechas en el mundo (Fig. 1). Las actividades agrícolas incrementan las oportunidades para el surgimiento de las plagas a través del desarrollo de monocultivos, del cultivo en áreas donde no existen enemigos naturales de la plaga, del uso de fertilizantes y herbicidas, del desarrollo del cultivo en un área nueva permitiendo así que las especies nativas de insectos se alimenten de éste y se conviertan en plagas, de la eliminación de los enemigos naturales de la plaga por cambios en el manejo del cultivo y del uso continuo del mismo producto químico, generando adaptación a éste y posibilitando la aparición de resistencia. En los agroecosistemas modernos la evidencia experimental sugiere que la biodiversidad puede ser utilizada para mejo- Figura 1: Principales destinos de la agricultura mundial. El hombre debe competir por las cosechas con insectos plaga, malezas y enfermedades que reducen el rendimiento de los cultivos. Gentileza del Prof. Germán Spangenberg. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 335

251 rar el manejo de las plagas. Varios estudios muestran que es posible estabilizar las comunidades de insectos en un agroecosistema constituyendo arquitecturas vegetales que soporten a las poblaciones de enemigos naturales y/o inhiban el ataque de las plagas. Es difícil imaginar una tecnología que produzca la cantidad necesaria de alimento para la humanidad y el mantenimiento adecuado de la salud pública sin recurrir al uso de plaguicidas, adquiriendo particular relevancia dentro de este grupo los insecticidas destinados a combatir y/o reducir una población de insectos plaga. 2 Insecticidas El uso de insecticidas en el mundo es muy generalizado. Su aplicación para mantener a los cultivos libres de insectos representa cuantiosas inversiones económicas (Fig.2). Las pérdidas en cosechas debidas a los insectos sumado al costo de los herbicidas representan una inversión mundial de unos 3 billones de dólares anuales. El método más preciso de clasificación de los insecticidas es de acuerdo con su composición química. Los grupos más importantes son los organoclorados, organofosforados, carbamatos y piretroides. Los organoclorados constituyen el grupo más antiguo y más utilizado de insecticidas Figura 2: Uso de insecticidas en los principales cultivos agrícolas y el monto de las inversiones realizadas. orgánicos. Estos contienen cloro, hidrógeno y carbono en su molécula y, ocasionalmente, oxígeno y azufre. Aunque son muy efectivos, estables y persistentes, se acumulan en grasas y dan origen al conocido fenómeno de biomagnificación. Sus efectos sobre la vida silvestre, el medio ambiente y la salud humana están muy bien documentados en el libro La primavera silenciosa, escrito en el año 1962 por la bióloga Raquel Carlson. A partir de 1950/1960 los organoclorados fueron reemplazados por los organofosforados y los carbamatos. Los organofosforados se desarrollaron en Alemania durante la Segunda Guerra Mundial; químicamente derivan del ácido fosfórico, son menos estables en presencia de la luz y se descomponen rápidamente en compuestos no tóxicos. La ruptura de estos compuestos se produce en horas o días en comparación con los organoclorados, que demoran meses o años. Los carbamatos son insecticidas de amplio espectro muy utilizados en la agricultura, desarrollados por la corporación Geigy. Son derivados del ácido carbámico y similares en la persistencia en el ambiente a los organofosforados. Entre 1970 y 1980 siguieron los insecticidas piretroides, derivados del ácido crisantémico. Su fotodegradación es rápida y en la actualidad son los más utilizados por ser más seguros para la vida silvestre y el ambiente. Como grupo, los compuestos sintéticos mencionados son los más potentes para el control de las plagas. Debido a su amplio espectro de acción en la naturaleza, pueden resultar perjudiciales al hombre tanto en los agroecosistemas como en los ecosistemas naturales, no sólo destruyendo a la plaga sino también a otros insectos que actúan como enemigos naturales o favoreciendo el resurgimiento de plagas secundarias. A menudo, algunas de las causas de estos efectos indeseables están relacionadas con la elección del producto, la dosis y el modo en que éstos se aplican. 336 FERRERO, Adriana A.; DESCAMPS, Lilian; REVIRIEGO, María

252 Continuamente se buscan compuestos más selectivos, más específicos y con blancos para accionar específicos de los insectos. Muchos insecticidas convencionales afectan el sistema nervioso del insecto, que tiene funciones similares a las del hombre o al de otros animales. Esto hace que el interés en ellos se reduzca por los potenciales riesgos para la salud humana y animal. En las últimas tres décadas se han logrado avances tecnológicos significativos que han permitido descubrir, identificar y sintetizar químicos específicos que regulan o median el crecimiento, comportamiento y desarrollo del insecto. En este grupo se encuentran los llamados reguladores del crecimiento, que se caracterizan por causar muerte prematura y metamorfosis anormales. Dado su modo de acción su uso es seguro. Otro grupo de insecticidas son los naturales, que pueden ser aceites minerales obtenidos del refinamiento del petróleo o botánicos. Los aceites refinados de petróleo presentan ventajas como bajo costo, buena cobertura de las superficies a tratar y facilidad en su formulación. Se los ha utilizado como coadyuvantes de otros insecticidas y son seguros para el ambiente. Sin embargo, son inestables en almacenaje, inefectivos contra ciertas plagas y algunos insectos presentan resistencia a los mismos. Los insecticidas botánicos son derivados de las plantas o de parte de ellas y han sido utilizados durante mucho tiempo antes que cualquier otro insecticida. Las plantas producen una diversidad de compuestos, sin un rol aparente en los procesos fisiológicos básicos de las mismas, y a los que se conoce con el nombre de metabolitos secundarios. Un considerable número de ellos son tóxicos para los insectos ocasionándoles lesiones o la muerte, dependiendo de las circunstancias y de la cantidad ingerida. Los más conocidos son los alcaloides. Además de éstos, existen análogos químicos de las hormonas de los insectos, que pueden actuar interrumpiendo su ciclo biológico. También existen proteínas, dentro de las cuales están incluidas enzimas tales como quitinasas, lectinas e inhibidores de enzimas digestivas, con la misma función. Actualmente es posible introducir en plantas genes que confieren resistencia a insectos para reducir su susceptibilidad a los mismos. Estos genes pueden tener diversos orígenes y constituyen una herramienta importante en el desarrollo de variedades resistentes. Su importancia radica en su efectividad, selectividad contra la plaga, baja estabilidad relativa y compatibilidad con otras tácticas. Además, las variedades resistentes pueden ser introducidas fácilmente y en forma económica resultando en ganancias en corto tiempo. Sin embargo, el tiempo requerido para su desarrollo, los problemas de biotipos y que, a veces, las características agronómicas de un cultivar puedan ser beneficiosas para otra plaga son algunas de sus desventajas. Las barreras químicas de las plantas pueden ser interpretadas como un mecanismo de defensa contra los insectos que se alimentan de ellas y que la planta ha adquirido por selección natural. Sin embargo, es difícil demostrar esta afirmación. Los metabolitos secundarios tienen funciones alternativas, muchos son considerados como agentes antimicrobianos que protegen las plantas de posibles enfermedades. De todas maneras existen ejemplos que demuestran que durante la alimentación de los insectos con una planta puede inducirse en la misma un incremento en la concentración de algunos metabolitos secundarios, que serán efectivos contra sucesivos ataques. La relación entre el estímulo químico de la planta y la respuesta del insecto es una forma de comunicación química entre estos organismos. Esta comunicación se realiza mediante compuestos conocidos como semioquímicos, que suelen llamarse agentes antiinsectos y que pertenecen al grupo de los biorracionales. Los semioquímicos incluyen a las feromonas, sustancias producidas por insectos que permiten la comunicación entre individuos de la misma especie y a los aleloquímicos, que permiten la comunicación entre individuos de diferentes especies. Es necesario destacar que en la última década se han investigado intensamente las posibilidades de aplicar comercialmente las feromonas con fines de control. En la práctica sólo el 5% de las mismas se ha logrado sintetizar. Hasta el momento no se encuentran en la bibliografía casos instalados de resistencia a feromonas, pero poco uso se ha hecho de ellas. Los aleloquímicos pueden subdividirse en Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 337

253 allomonas y kairomonas. Las allomonas cumplen función defensiva, produciendo respuestas negativas en los insectos y reduciendo el contacto y la utilización de la planta. Entre ellas se encuentran los repelentes y los compuestos que alteran la oviposición y la alimentación. Las kairomonas provocan respuestas positivas en el insecto favoreciendo la localización del huesped, la oviposición y la alimentación. Estas incluyen atractantes, excitantes y estimulantes. El estudio de la interacción entre la plaga y los compuestos presentes en las plantas ofrecen un potencial importante para mejorar, en el futuro, el control de las plagas en muchos cultivos. Dentro del grupo de los biorracionales también resultan de interés los productos de fermentación bacteriana y las proteínas cristalinas. Entre los primeros se encuentran las avermectinas, que son una mezcla de productos naturales producidos por un actinomicete del suelo, Streptomyces avermectilis. Este moderno insecticida y también acaricida debe su mecanismo de acción a la actividad como agonista del ácido gama amino butírico (GABA), que es una neurohormona del sistema nervioso de los invertebrados. Las avermectinas actuarían en los mismos receptores específicos para GABA provocando la parálisis y muerte del insecto. Entre los segundos se encuentran las endotoxinas de Bacillus thuringiensis, también conocidas como Bt. Los productos basados en Bacillus thuringiensis (Bt) son los más difundidos entre los llamados «insecticidas biológicos» porque poseen bajo riesgo ambiental y humano. No obstante, su aplicación ha sido muy restringida. En la actualidad, debido a los avances logrados en su formulación y a la biotecnología se han descubierto cepas de Bt. con mayor potencia y espectro de acción. Las Bt son bacterias Gram positivas que producen, durante la esporulación, una inclusión cristalina parasporal proteica. Esta inclusión es disuelta por ingestión en el intestino medio de los insectos, donde se libera la llamada delta endotoxina. Los cristales de las diferentes cepas de Bt contienen más de un tipo de proteína con poder insecticida. Son bioactivas frente a lepidópteros, dípteros o coleópteros. La estructura de las delta endotoxinas varía según el gen que las codifica. Se identificaron y clasificaron numerosos genes que las codifican, que son de dos tipos, denominados cry (por cristal), y cyt (toxinas citolíticas). Ya hay más de 100 genes identificados pertenecientes a estas familias. El modelo actualmente vigente para el mecanismo de acción sugiere que por unión de la toxina a su receptor específico se induce la formación de poros en la membrana celular que generan un desbalance iónico que conduce finalmente a la muerte del insecto. Una nueva clase de insecticidas que surgieron a partir de las bacterias mencionadas es la que corresponde a la llamada clase VIP (vegetative insecticidal protein). Estas moléculas se sintetizan durante el ciclo vegetativo de las bacterias y actúan como exotoxina que al ser ingerida por la plaga, cesa la alimentación y muere rápidamente. Gracias a los avances de la tecnología del ADN recombinante se pudieron aislar los genes de las deltas endotoxinas de Bacillus thuringiensis y expresarlos en plantas y bacterias del suelo. Esta biotecnología condujo a nuevas formas de liberación de las toxinas para controlar insectos plaga. Los genes Bt que más comúnmente se utilizan, en la actualidad en algodón tienen dos orígenes, uno es el CryAc utilizado por Monsanto en sus variedades Bollgard y el otro es un gen híbrido que fue desarrollado por el sector público (Academia de Ciencias Agrarias de China, CAAS). Se trata de un gen Cry1Ab/Cry1Ac. Existe otro gen CpTi («cowpea trypsyn gene») que se emplea unido a Bt en alguna variedades chinas. Otro gen dual es el CryAc/ Cry1F. La utilización de dos genes simultáneamente es una importante herramienta para demorar el comienzo de la resistencia. Las dos toxinas juntas resultan en un control redundante que conferiría una resistencia más duradera e incrementa el espectro de insectos que permite controlar. En la actualidad se han informado especies de insectos que atacan al algodón, de los cuáles 10 producen pérdidas importantes desde el punto de vista económico, la mayoría de los cuales son lepidópteros. Cabe mencionar que las toxinas expresadas en la plantas Bt son idénticas o similares a las encontradas en la naturaleza y a las que se encuentran en el microorganismo que se 338 FERRERO, Adriana A.; DESCAMPS, Lilian; REVIRIEGO, María

254 utiliza en las aplicaciones convencionales de Bt. Esta toxina es inocua para insectos que naturalmente no son sensibles al Bt, para aves, peces y mamíferos, entre los que se incluye el hombre. En cuanto a la evaluación del impacto ambiental ver IX.2 y 3. El cultivo a gran escala de variedades Bt, comenzó en 1996 y se incrementó rápidamente, alcanzando los 14 millones de has. en el En el 2001 variedades comerciales de maíz, algodón y papa fueron plantadas en 5 millones de hectáreas en EE.UU., Argentina, Canadá, China, Australia, Sudáfrica, México, España, Francia, Portugal, Rumania y Ucrania En el 2003 el maíz Bt ocupó el segundo lugar en importancia en el mundo, con una superficie de 12,3 millones de has, lo que equivale al 13 % del área total de cultivos transgénicos (67,7 millones de has). Los países que lo han adoptado son Estados Unidos, Canadá, Argentina, Sudafrica, España, Filipinas, Honduras, Uruguay y Alemania. En un año la superficie sembrada aumentó de 9,9 millones de has a 12,3 millones. El maíz tolerante a herbicidas e insectos (eventos combinados por cruzamiento convencional) con 3,2 millones de has representa el 5 % de la superficie y el algodon Bt tiene una superficie equivalente. El algodón tolerante a herbicidas e insectos ocupa 2,6 millones de has (4%) Este tipo de biotecnología tiene mucha importancia en los países en vías de desarrollo. Los beneficios que otorgan estos productos son la reducción en el uso de insecticidas convencionales, en algunos casos de más del 50 %, el incremento del valor del cultivo, mejor control natural de la plaga, protección de los enemigos naturales, reducción en la contaminación ambiental y posibilidad de combinar esta tecnología con otras tácticas para el control de la plaga. También se han registrado incrementos en el rendimiento y menores costos de producción, ya que el gen se expresa en todos los estadios de crecimiento y en todos los órganos de la planta, evitando tener que aplicar insecticida en tiempos determinados; no existe riesgo de lavado por la lluvia ni pérdida de actividad debida a la luz del sol, como sucede cuando se aplican las formulaciones derivadas del microorganismo directamente. (Fig.3 y 4). Figura 3: Cañas de maíz convencional (arriba) y protegido de insectos (abajo) con el gen cry1ab específico para el barrenador del tallo, Diatraea saccharalis. (Gentileza Monsanto Argentina). Figura 4: Ensayo experimental de soja tolerante a insectos lepidópteros. En primer plano, variedad convencional (Gentileza Monsanto Argentina). Como un efecto indirecto de la protección contra insectos del maiz Bt, se ha podido determinar una reducción en la presencia de fumonisinas (micotoxinas producidas por diferentes especies de Fusarium sp). Estas micotoxinas son toxicas y cancerigenas para un número de especies animales y se han relacionado con los altos indices de cancer esofágico observados en agricultores de Africa y China. Los niveles de reducción de fumonisinas en maices protegidos del daño de los insectos (que constituyen vías de entrada del hongo), varían entre 3 y 8 veces en diferentes países y años. Otra ventaja es el ahorro en consumo de agua que implica la menor utilización de insecticidas, que, como se sabe es uno de los recursos más limitantes del planeta (ver VIII.12). El volumen de agua utilizada en una Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 339

255 simple aplicación de insecticida es de 40 a 80 litros por ha. El ahorro en consumo de agua debido a la utilización de tecnologías como Bt puede estimarse de la siguiente manera: durante 2001, 81 millones de kg de insecticidas fueron aplicados en el cultivo de algodón en el mundo, a un promedio de 0,45 kg/ha/ aplicación en el Esto representa 180 millones de has. fumigadas, lo que es consistente con un promedio global de 5,5 aplicaciones sobre 33,5 millones de has. La cantidad de agua utilizada para aplicar 81 millones de kg de insecticida es de 12,6 billones de litros. El ahorro en consumo de agua con esta tecnología podría ser del 50%, es decir 6.3 billones de litros anuales. También significa una reducción de 5,6 millones de litros de combustible y de un millón de kg de deshechos industriales generados en la fabricación de insecticidas convencionales. Dados los recientes avances en biotecnología, se podría esperar que las plantas transgénicas resistentes jueguen a futuro un importante rol en el control de insectos plaga. Hasta donde se conoce, no ha evolucionado una plaga que exprese a campo resistencia a los cultivos Bt. No obstante, el Bt aplicado como «spray» ha generado moderados a elevados niveles de resistencia en poblaciones de polilla de las coles y en algunos ensayos se observó resistencia a plantas Bt en experimentación, como por ejemplo a plantas transgénicas de bróccoli. Existen al menos 7 cepas resistentes de 3 insectos plaga que sobreviven sobre cultivos Bt. A fin de contrarrestar la aparición de resistencia se desarrolló la estrategia de refugio, basada en la teoría desarrollada en docenas de publicaciones durante los últimos 25 años y en la limitada experiencia de trabajos experimentales a pequeña escala. Se trata de plantar refugios de plantas no Bt en áreas próximas a los cultivos Bt para permitir la supervivencia de los insectos susceptibles. De manera ideal, la resistencia es conferida por alelos raros, recesivos y los adultos más resistentes de los cultivos Bt se aparearán con los adultos susceptibles de los refugios. Si esto es así, la teoría predice que la aparición de resistencia se verá demorada sustancialmente. Aunque no existen informes detallados acerca de las evaluaciones a gran escala de esta estrategia de refugio, los experimentos muestran que pueden ocurrir algunas violaciones a algunas de las asunciones clave (baja frecuencia de alelos de resistencia y herencia recesiva de la resistencia a Bt) en algunos sistemas. De esta manera, dado el difundido uso de los cultivos Bt contra varios insectos plaga, la resistencia podría evolucionar rápidamente en algunas situaciones a pesar de la presencia de refugios. Contrariamente a esto, no se han documentado hasta la fecha incrementos en la frecuencia de resistencia a las toxinas Bt en poblaciones de insectos a campo a causa de la exposición a cultivos comerciales que expresan Bt. Los factores clave para la demora en la aparición de resistencia son probablemente: los refugios, las bajas frecuencias iniciales de los genes de resistencia, la herencia recesiva de la misma, los costos asociados con el desarrollo de la resistencia, que reducen la aptitud de los individuos resistentes en relación a los individuos susceptibles sobre los cultivos Bt y las desventajas sufridas por las cepas resistentes sobre los huéspedes Bt en relación a su desempeño sobre cultivos no Bt. La importancia relativa de estos factores varía entre los sistemas de las plagas y los cultivos Bt. Una lección que nos brindan estos pocos años de cultivos Bt es que debemos ser cautelosos y reconocer que la habilidad para predecir tasas de evolución de la resistencia en el campo es limitada. El éxito de los cultivos Bt hasta la fecha excede las expectativas de muchos, pero no previene los problemas de resistencia en el futuro. El monitoreo constante y las estrategias biotecnológicas en continuo desarrollo serán fundamentales para conservar este recurso de control biológico Insecticidas naturales vs insecticidas sintéticos La pregunta que nos deberíamos hacer es: son los insecticidas naturales más seguros que los sintéticos? Los científicos responden que puede ser que sean, dependiendo del insecticida natural o sintético que se esté comparando. Cuando se evalúa el riesgo o la seguridad de cualquier plaguicida se debe recordar que 1) la toxicidad es una función de 340 FERRERO, Adriana A.; DESCAMPS, Lilian; REVIRIEGO, María

256 la estructura química y no de su origen, 2) la seguridad de un plaguicida depende del tiempo y frecuencia con que el individuo estuvo expuesto y de la dosis de exposición y que 3) la percepción del riesgo a veces no es coincidente con el riesgo real o actual de un plaguicida. En algunas plagas, no se puede detener la aparición de resistencia a insecticidas convencionales, biopesticidas o nuevos cultivos transgénicos. La resistencia en insectos es un caso de toxicidad selectiva intraespecie. Según una definición, el fenómeno de resistencia consiste en la habilidad desarrollada en una cepa de insectos para tolerar dosis de tóxicos que serían letales para la mayoría de los individuos de una población normal de la misma especie, siendo esta habilidad de carácter genético y heredable. Los insecticidas crean una presión de selección que elimina progresivamente los individuos sensibles dejando un nicho vacío que pasan a ocupar los individuos resistentes. La resistencia es un caso de evolución preadaptativa. Los insecticidas naturales y/o sintéticos no inducen sino que seleccionan cepas resistentes. El mecanismo más común por el cual una cepa resulta resistente a un insecticida es por la modificación de la toxicocinética o toxicodinámica. La toxicocinética de los insecticidas naturales o sintéticos tienen que ver con las etapas de penetración, distribución, acumulación, biotransformación y excreción en el insecto. La llegada al sitio de acción se denomina toxicodinámica y tiene que ver con la reacción fundamental del insecticida o su metabolito activado con una enzima o receptor vital. Estas etapas dependen críticamente de las propiedades fisicoquímicas de los compuestos antiinsectos. 3. Consideraciones finales Sin duda, varias tácticas pueden ser implementadas para evitar la pérdida de las cosechas por acción de los insectos plaga. Así programas de Manejo Integrado de la Plaga (MIP) deben ser desarrollados para cada cultivo y en cada región, manteniendo la población de la plaga debajo del nivel de daño económico. Se debe entender al MIP como una filosofía y una metodología que enfatizan la necesidad de utilizar estrategias de manejo de la plaga para minimizar el resurgimiento de la misma. A pesar de todo, los insecticidas han sido y probablemente continuarán siendo los métodos más efectivos para controlar el desarrollo de las plagas. Decía el Dr. Edgardo Wood, en una conferencia relacionada con la resistencia a insecticidas: «El hombre contemporáneo debería comprender que las tácticas químicas eficaces para controlar las plagas como asimismo los blancos sensibles y viables deben protegerse como patrimonio de la humanidad, porque de la irracionalidad en el uso de la química contra la naturaleza podrá sobrevenir una crisis debida a resistencia generalizada en la que no contaremos con moléculas naturales o sintéticas efectivas ni con blancos viables. Entretanto la esperanza radica en el conocimiento cada vez mayor del problema y su potencialidad para ser cuidadosos en el aporte y utilización de las soluciones. El primer gran paso ya está dado: el no desconocer el fenómeno.» 4. Lecturas Recomendadas ALTIERI. M.A Biodiversity and Pest Management in Agroecosystems. Ed:TheHaworth Press, Inc. New York, London, Norwood (Australia). 185 pp. ANÓNIMO World Health Expert Committee on Insecticide, 7 th Report, Who Technical Report Series Nª 125. BENEDICT, J.H Strategies for Controlling Insect, Mite and Nematode Pests. In: Plants, Genes and Crop Biotechnology. Chrispeels, M.J. y Sadava, D.E. Ed. Jones y Bartlett Publishers, Sudbury, Massachusets. 562pp. CASIDA, J.E. Y QUISTAD, G.G Golden age of insecticide research: past, present or future?. Ann. Rev. Entomol. 43: COATS, J. R Risks from Natural versus Synthetic Insecticides. Ann. Rev. Entomol: 39: DE BACH, PAUL Control Biológico de las Plagas de Insectos y Malas Hierbas. Ed: Lycsa Impresores. México. 949 pp. FRANCO, O.L.; RODRIGUES MELO, F.; MATTAR DA SILVA, M.C. y GROSSI DE SÁ, M. F Resistência de Plantas a Insetos. Biotecnologia, Ciencia y Desenvolvimiento: ELLIS, T. R.; STOCKHOFF, L.S.; SCHNEPF, H.E.; SCHWAB, G.E.; KNUTH, N.; RUSSELL, J.; CARDINEAU, G.A. y NARVA, K. E Novel Bacillus thuringiensis binary insecticidal Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 341

257 cristal proteins active on western Rootworm, Diabotrica virgifera virgifera LeConte. Appl. Envirom. Microbiol. 68 (3): HODKINSON, I.D. y HUGHES, M.K La Fitofagia en los Insectos. Ed: Oikos-tau. Barcelona. España. 99 pp. MUNKVOLD, HELLMICH y RICE (1999). Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Maize Bt hybrids and non transgenic hybrids. Plant Disease 83 (2): PEDIGO, L. P Entomology and Pest Management. Ed. Prentice Hall, New Jersey. 679 pp. «RESISTENCIA A INSECTICIDAS: UN PROBLEMA ECOTOXICOLÓGICO» Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad Nacional de la Pampa. 83 pp. TABASHNIK, B.E.; CARRIERE, Y.; DENNEHY, J.T.; MORIN, S.; SISTERSON, M..S.; ROUSH, R.T.; SHELTON, A.M. y ZHOU ZHAO, J Insecticde Resitance to transgencic Bt Crops. Lesson from the laboratory and field. Journal of Economic Entomology. EC Version FERRERO, Adriana A.; DESCAMPS, Lilian; REVIRIEGO, María

258 VIII.-Capítulo 11 Estrategias para el manejo integrado de malezas: problemática, resistencia a herbicidas y aportes de la biotecnología. Sabbatini, M.R.; Irigoyen, J.H.; Vernavá, M.N. 1 Definiciones, características y daños ocasionados por las malezas Se define a las malezas como plantas que crecen en sitios no deseados por el hombre, por lo que puede ser considerada maleza toda planta que disminuye el rendimiento de un cultivo, resulta tóxica para el ganado, invade el césped de un jardín o la que crece en el techo de una casa dificultando el desagüe de sus tuberías. Este concepto de maleza o de planta indeseable causa por lo general un rechazo especialmente por parte de botánicos que no admiten que se catalogue de esta manera a una especie vegetal. Contrariamente, para un productor agropecuario, las malezas constituyen plantas nocivas que deben ser eliminadas de los campos en producción, debido a que en la mayoría de los cultivos y pasturas su presencia ocasiona perjuicios económicos de mayor o menor grado de severidad. La referencia negativa a estas plantas se traslada a otros países; así, por ejemplo, en España se las denomina «malas hierbas» y en Brasil «plantas dañinas». El concepto de maleza tiene por ello un origen antropocéntrico, ya que en realidad no existe ninguna característica morfológica o fisiológica que permita caracterizar a una especie vegetal como maleza. Así, existen algunas especies que de acuerdo con el lugar donde crecen pueden ser consideradas cultivos o malezas. Un buen ejemplo de ello lo constituye el «raigrás» (Lolium multiflorum), en la provincia de Buenos Aires, que es una maleza importante del cultivo de trigo pero paralelamente es una forrajera ganadera muy deseable. Las malezas conforman una pequeña proporción del mundo vegetal: de las especies de angiospermas, sólo cerca de se comportan como malezas y no más de 250 representan serios problemas para las actividades humanas. En agroecosistemas, la mayoría de las malezas tienen algunas características claves que aseguran su éxito y les otorgan la habilidad de invadir, dominar y persistir. Entre ellas se encontrarían una alta dispersión por semillas u otros disemínulos, que les asegura una asociación cercana a hábitat manejados por el hombre; un alto potencial de colonización que les permite incrementar la población rápidamente e integrarse a la comunidad vegetal, y una alta capacidad de persistencia en el sitio, fundamentalmente a través de comportarse como hábiles competidoras frente a los cultivos y presentar un banco de semillas o propágulos abundante y longevo. El banco de semillas del suelo es la reserva de simientes que se encuentra enterrada en los suelos agrícolas y constituye la única fuente de reposición de las especies anuales, que son aquellas que se reproducen únicamente por semillas. Las especies perennes presentan en el banco, además de semillas, propágulos vegetativos (tubérculos, rizomas, estolones, bulbos) que originan plantas genéticamente idénticas a las plantas madres. La eficiencia reproductiva a través de la vía sexual (semillas) permite la formación de nuevos genotipos capaces de colonizar y dominar nuevos ambientes. Por otro lado, la vía asexual (propágulos vegetativos) les permite perpetuarse en los ambientes ya colonizados. Los principales inconvenientes ocasionados por las malezas a los agricultores, que se traducen generalmente en un perjuicio económico, son los siguientes: - Compiten con los cultivos por nutrientes, agua y luz, disminuyendo el rendimiento de los productos cosechados (granos, tubérculos, frutos, etc.). - Interfieren en las labores de cosecha y disminuyen la calidad de los productos cosechados. - Causan toxicidad directa al ganado y disminuyen la calidad de las pasturas. - Interfieren con el manejo del agua en sistemas de agricultura bajo riego. - Actúan como huéspedes de insectos, enfermedades y otras plagas de la agricultura. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 343

259 - Liberan sustancias alelopáticas, que afectan el normal desarrollo de los cultivos. El problema no es menor. Debemos por ejemplo considerar que algunas malezas disminuyen el valor de la tierra, ya que limitan la posibilidad de producir determinados cultivos. Por ejemplo, la abundancia de malezas invasoras perennes como el «gramón» (Cynodon dactylon) o el «sorgo de alepo» (Sorghum halepense) reducen el valor de los campos en la provincia de Buenos Aires, ya que es necesario implementar un intenso y costoso programa de control si se deseara implantar la mayoría de los cultivos primavero-estivales, producidos normalmente en esa zona. Otro ejemplo lo constituye la zona bajo riego del valle inferior del Río Negro, en la cual algunas chacras no son cultivadas cuando existe la presencia en abundancia de Centaurea repens, una maleza perenne de muy difícil erradicación y que impide la producción rentable de cultivos hortícolas. El problema lo podríamos cuantificar indicando que es mayor la inversión que realizan los agricultores para controlar dichas malezas (labores mecánicas, aplicaciones de herbicidas) que la que realizan para controlar otras plagas como insectos, hongos, nematodos, etc. Así, por ejemplo, se ha calculado que cerca del 50% del mercado mundial de plaguicidas corresponde a herbicidas. 2 Estrategias en el manejo de las malezas Desde que el hombre comenzó a cultivar vegetales necesitó extirpar las plantas no deseadas que crecían junto a ellos, de forma tal que el manejo y control de malezas es tan antiguo como el desarrollo mismo de la agricultura. Por miles de años el control manual y el uso de cultivadores arrastrados por animales constituyeron la principal práctica disponible para solucionar el problema de las malezas. Posteriormente, el control mecánico sustituyó dichas prácticas hasta que a mediados del siglo XX, comenzó a generalizarse el uso de compuestos químicos (herbicidas) para el control de malezas. El manejo de las especies consideradas maleza puede ser enfocado a través de diferentes estrategias. Todo programa de control deberá inexorablemente responder con tácticas de manejo en concordancia con los ciclos de vida, tasa de crecimiento y otros atributos de las malezas. El enfoque táctico es diferente si se trata de malezas de ciclo anual o perenne. Como regla general, se puede aseverar que las especies anuales son vulnerables a los métodos de control en los estadios de plántula y vegetativo, aunque cierto grado de éxito también pueda alcanzarse en el estadio de floración. Las malezas perennes, que cuentan con sistemas de propagación vegetativa, requieren de un programa a largo plazo que combine diferentes medidas de control previo y durante el desarrollo del cultivo. Existen cuatro estrategias básicas de control relacionadas con la problemática de las malezas: a) El control cultural involucra todas las medidas tendientes a generar condiciones favorables o ventajas competitivas que beneficien al cultivo frente a las malezas. Así, la siembra de un cultivo con semillas de adecuada sanidad, valor cultural y vigor, puede generar condiciones para el rápido establecimiento y desarrollo del cultivo en relación con las malezas. b) Los controles manual y mecánico implican la remoción de las malezas emergidas directamente por el hombre o mediante la utilización de diferentes implementos como cultivadores, escarificadores, rastras, arados, etc. La topografía y el tipo de suelo, la profundidad de la napa freática, el tipo de maleza y el estadio fenológico del cultivo son factores determinantes de su factibilidad de implementación. Es una de las prácticas de control más utilizada debido fundamentalmente a su practicidad. c) El control biológico de malezas consiste en la utilización de organismos, agentes biológicos o enemigos naturales que se encuentran en el ambiente y que a través de su interacción (parasitismo, predación o herbivoría, acción patogénica, alelopatía) afectan negativamente el desarrollo de una población de malezas. Esta táctica de control representa la máxima aspiración en el manejo de malezas, fundamentalmente en términos ecológicos y de preservación del ambiente. Una condición necesaria en el control biológico es la especificidad que debe 344 SABBATINI, M.R.; IRIGOYEN, J.H. y M.N. VERNAVÁ

260 tener el agente controlador, para evitar que afecte a los cultivos o la flora natural. De esta forma, su operatividad potencial se ve restringida debido a la diversidad de la flora de malezas generalmente presente. Además, el aislamiento y comercialización de organismos de control biológico específicos frente a un amplio espectro de malezas determina que esta táctica se adapte, en mayor medida, a situaciones donde una especie de maleza constituye el problema dominante. Un ejemplo en desarrollo en nuestro país es el del control de «yuyo esqueleto» (Chondrilla juncea) en la zona del sudoeste de la provincia de Buenos Aires, mediante la liberación del ácaro exótico (Eriophyes chondrillae) que forma agallas en los tallos de la maleza reduciendo su producción de flores y semillas. d) El control químico constituye en la actualidad la estrategia más difundida en el manejo de malezas. Las principales ventajas son su rápida acción, su versatilidad y adaptación a diferentes equipos de aplicación y sistemas de cultivo y su potencialidad de aplicación en grandes extensiones. Como contrapartida, pueden contaminar suelos, acuíferos y alimentos, afectar organismos benéficos, disminuir la biodiversidad, causar cambios en las comunidades de malezas, conduciendo al reemplazo de malezas susceptibles por tolerantes y, además, desencadenar problemas de resistencia, como se verá más adelante. 3 Características de los herbicidas y su modo de acción Los herbicidas son sustancias químicas que ocasionan la muerte de plantas o que inhiben su normal crecimiento. Así, existen herbicidas selectivos o específicos, que permiten controlar malezas sin afectar a los cultivos y herbicidas no selectivos o de acción total, que se utilizan generalmente en los barbechos, previo a la implantación del cultivo. Reemplazan las tareas de labranza tradicional y constituyen la herramienta fundamental de manejo en los cultivos resistentes a herbicidas. La selectividad es la propiedad que presentan algunos herbicidas de ejercer su acción fitotóxica sobre algunas especies vegetales (malezas) pero sin afectar a otras plantas (cultivos). Así, por ejemplo, el 2,4-D (ácido 2,4-dicloro-fenoxi-acético) es un herbicida selectivo para cultivos de cereales o gramíneas en general (trigo, avena, maíz, etc.), ya que controla malezas de hoja ancha o latifoliadas. Sin embargo, el carácter de selectividad generalmente se restringe a determinados estadios fenológicos dentro del ciclo de desarrollo del cultivo y a una dosis determinada del herbicida. Efectivamente, el 2,4-D pierde su selectividad en el cultivo de trigo cuando se lo aplica fuera del estadio de macollaje del cultivo (período en que emite tallos secundarios) y también cuando se aplica en dosis superiores a las recomendadas. El herbicida puede ser pulverizado en cobertura total o en forma parcial (sobre las bandas del cultivo) por lo que se adapta a diferentes tecnologías de aplicación. A su vez, los mismos pueden ser aplicados sobre la canopia de malezas emergidas denominándose herbicidas postemergentes, o pueden ejercer su acción desde el suelo, denominándose entonces preemergentes. Una de las propiedades más relevantes de algunos herbicidas llamados sistémicos lo constituye su capacidad de transportarse dentro de los sistemas de conducción de las plantas hasta alcanzar el sitio o blanco de acción biológica. Existen algunos herbicidas postemergentes cuya movilidad es reducida o nula, ejerciendo su acción solamente en las áreas que alcanza cuando es pulverizado. Estos herbicidas se denominan de contacto. Un ejemplo lo constituye el paraquat, herbicida desecante de contacto que ejerce su acción sólo sobre el sistema aéreo de la planta, sin afectar el sistema subterráneo del vegetal. Para que un herbicida sea efectivo debe tomar contacto con la maleza, ser absorbido, transportarse hacia el sitio de acción sin ser desactivado y alcanzar niveles tóxicos en el sitio de acción biológica. Se puede definir como modo de acción de un herbicida a la secuencia de eventos que ocurren en la planta desde que la sustancia herbicida es absorbida hasta la ocurrencia de la muerte del vegetal. Asimismo, se define como mecanismo de acción a la interferencia bioquímica o biofísica primaria impuesta por la presencia de moléculas del herbicida que conduce al efecto letal en el vegetal. Algunas plantas son capaces de desactivar o degradar rápidamen- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 345

261 te a un determinado herbicida, logrando sobrevivir a su efecto tóxico. El maíz, por ejemplo, es tolerante a los herbicidas de la familia de las triazinas debido a que puede conjugar o enlazar dichas sustancias tóxicas con compuestos químicos naturales dentro de la planta de maíz. Existe un gran número de herbicidas en el mercado. En la Argentina, actualmente se comercializan aproximadamente 100 ingredientes activos, agrupados en familias de herbicidas, que a su vez pueden asociarse de acuerdo con su mecanismo de acción (Tabla 1). Una de las vías de desarrollo del control químico es el continuo mejoramiento de técnicas de aplicación de los herbicidas. Así, para que una sustancia alcance su máxima potencialidad biológica debe garantizarse su traslado desde el equipo aplicador hasta el sitio de acción en el vegetal, donde ejercerá su efecto letal. Para ello se han diseñado equipos de aplicación muy precisos y la industria química ha perfeccionado la formulación de los principios activos con el agregado de distintos vehículos, coadyuvantes, diluyentes, etc., que los acondicionan para su mejor desempeño biológico. En los últimos años, debe destacarse el importante avance en el uso de protectores de herbicidas, mal denominados antídotos. Un protector de herbicidas es un compuesto que protege a las plantas de un cultivo de los daños de una sustancia herbicida dirigida al control de malezas. Estos compuestos protectores actúan únicamente sobre el cultivo, reduciendo la habilidad de las sustancias herbicidas para alcanzar o interferir el sitio de acción donde actúan. En la actualidad existe más de una decena de protectores disponibles para uso comercial en cultivos de maíz, trigo, arroz, sorgo y otros cereales. El alcance de estos protectores ha permitido que herbicidas de acción específica sobre malezas de la familia de las gramíneas puedan ser utilizados selectivamente en cultivos de gramíneas, como por ejemplo el trigo o el maíz. El desarrollo de esta tecnología se inició con la aparición del NA (1,8-naftalen-anhídrico), patentado en 1971, para uso en tratamientos de semillas de maíz con el objeto de protegerlo de los daños ocasionados por los herbicidas tiocarbamatos y actualmente se encuentran registrados protectores para un gran número de herbicidas disponibles en el mercado. 4 Resistencia de las malezas a los herbicidas El desarrollo de resistencia a herbicidas en malezas es un proceso evolutivo. Se define como resistencia a herbicidas a la habilidad hereditaria de una población de malezas de sobrevivir y reproducirse luego de ser expuesta a una dosis de herbicida a la cual era originalmente susceptible. La resistencia de malezas a herbicidas es un proceso por el cual, a través de una alta intensidad de selección, escasos biotipos resistentes -presentes en una población susceptible- se vuelven mayoritarios, convirtiéndose la población en resistente. Se asume que la existencia o no de resistencia en una maleza se limita a la «dosis agronómica», o sea la dosis normalmente utilizada a campo para el control de malezas. Algunas plantas (ya sean cultivadas o malezas) son «naturalmente» resistentes a algunos herbicidas aplicados en la dosis agronómica, característica denominada tolerancia a herbicidas. Lo anterior implica que no hubo selección o manipulación genética para hacer tolerante a la especie. El reiterado uso de herbicidas en un mismo predio hace que la presión de selección actúe como un filtro que elimina a las plantas susceptibles, dejando que sobrevivan sólo las resistentes. Se dice que existe resistencia cruzada cuando un biotipo ha desarrollado uno o varios mecanismos de resistencia a un herbicida que le permite ser también resistente a otros herbicidas. Este fenómeno se observa frecuentemente con herbicidas que pertenecen a una misma familia y que pueden tener o no el mismo sitio de acción. Para ejemplificar lo anterior, se daría resistencia cruzada cuando luego de un intenso empleo del herbicida A en un lote se encuentra que los biotipos resistentes a este herbicida lo son también a un herbicida B, que nunca había sido aplicado antes. La resistencia múltiple se refiere a biotipos que evolutivamente han desarrollado resistencia a varios herbicidas por procesos diferentes de selección. Por ejemplo, un biotipo que desarrolló resistencia a un herbicida A es tratado con un her- 346 SABBATINI, M.R.; IRIGOYEN, J.H. y M.N. VERNAVÁ

262 Tabla 1. Mecanismo y sitio de acción de las principales familias de herbicidas, frecuentemente utilizadas en el control de malezas en la República Argentina y su riesgo potencial de ocasionar resistencia en las especies de malezas controladas. bicida B, hacia el cual es inicialmente susceptible; luego de un tiempo de intenso uso del herbicida B la población se torna resistente a éste, por lo cual ahora es resistente a ambos herbicidas. Los mecanismos más comunes de resistencia son: (i) Modificaciones en los sitios de acción, o sea en los sitios bioquímicos dentro de la planta con los cuales el herbicida interactúa directamente. Cuando el herbicida actúa sobre un solo sitio de acción, este tipo de mecanismo normalmente deriva en una resistencia completa, es decir que el biotipo resistente no manifestará ningún síntoma como consecuencia de la aplicación del herbicida. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 347

263 (ii) Cambios en el metabolismo de los herbicidas, referido al proceso bioquímico dentro de la planta que generalmente modifica los herbicidas hacia compuestos menos tóxicos. Diferencias en la tasa de metabolización de herbicidas entre malezas y cultivos es la causa principal de selectividad de los cultivos. En este caso, generalmente la resistencia es parcial (no completa), conduciendo a un control poco efectivo del biotipo resistente. La resistencia de insectos a insecticidas es un hecho ampliamente documentado desde mediados del siglo XX, pero la de malezas a herbicidas fue considerada hasta principios de los 90 más como una curiosidad que un problema que afecte la producción agrícola. Sin embargo, la aparición en el mercado agropecuario, entre 1980 y 1990, de herbicidas que actúan en un único sitio de acción, condujo a que la resistencia de malezas a herbicidas sea actualmente el tema de mayor interés en el manejo de malezas en todo el mundo. Se han identificado aproximadamente 260 biotipos de malezas resistentes a herbicidas, que incluyen 160 especies diferentes. El país con mayores casos registrados es Estados Unidos, seguido por Australia y Canadá. En la Argentina no se ha informado acerca de regiones severamente afectadas con poblaciones de malezas resistentes, aunque en el centro y norte del país se han aislado biotipos de la maleza Amaranthus quitensis («yuyo colorado»), resistentes a herbicidas de la familia de las imidazolinonas. La Tabla 1 indica con cuáles familias de herbicidas existe un riesgo alto, mediano o bajo de desarrollar poblaciones de malezas resistentes. Las familias que en la actualidad ocasionan mayores perjuicios en la agricultura son aquellas cuyo modo de acción se basa en la inhibición de la enzima ALS (acetolactato sintetasa) y ACCasa (acetil coenzima A carboxilasa), que afectan en las plantas la biosíntesis de aminoácidos y de lípidos, respectivamente. Varios herbicidas incluidos en dichas familias son intensamente utilizados en la actualidad en la Argentina, por lo que la resistencia representa una amenaza para los agricultores en el corto plazo, especialmente en cultivos extensivos como trigo, soja, girasol y maíz. El grupo de los herbicidas que presentan un riesgo mediano a adquirir resistencia incluye algunos productos muy utilizados en nuestro país, como por ejemplo atrazina, trifluralina y paraquat. Entre los que tienen bajo riesgo a adquirir resistencia se incluye el glifosato, herbicida intensamente utilizado en los planos tanto nacional como internacional. El desarrollo de cultivos resistentes a herbicidas (CRH) se ha basado principalmente en el uso de este herbicida, ya que permite controlar un amplio espectro de malezas, es de bajo costo y reducido impacto ambiental. Entre los factores que conducen a acelerar el proceso de resistencia se encuentran: a) Frecuencia inicial de mutaciones en el pool génico: las mutaciones siempre ocurren, se usen o no herbicidas, siendo letales la mayoría de los genes mutantes. Los que no son letales se encuentran en bajas frecuencias porque son competidores débiles frente a los tipos salvajes, dominantes. La frecuencia de los genes que confieren a la planta resistencia a varios herbicidas es variable en la naturaleza. Por ejemplo, los alelos que confieren resistencia a los herbicidas con sitio de acción en la enzima ALS (caso de las sulfonilureas, por ejemplo) aparecen con una frecuencia de uno en un millón, se heredan a través del núcleo y se comportan fenotípicamente como dominantes en la mayoría de las dosis de aplicación del herbicida. Contrariamente, las mutaciones que confieren resistencia al afectar la proteína D1 quinona del fotosistema II (por ejemplo las triazinas) se heredan recesivamente y ocurren en el genoma de los cloroplastos. Debido a que las mutaciones en los cloroplastos ocurren a frecuencias muy inferiores a las nucleares, la resistencia a ALS evoluciona más rápidamente que la resistencia a la proteína D1 quinona. Así, mientras que las malezas resistentes a sulfonilureas se hacen evidentes a campo en un período medio de tres a cinco años, las resistentes a triazinas lo hacen entre 7 a 10 años, y como consecuencia de un uso continuo y a gran escala de herbicidas de dicha familia. b) Presión de selección: cuanto mayor sea el efecto letal del herbicida sobre el 348 SABBATINI, M.R.; IRIGOYEN, J.H. y M.N. VERNAVÁ

264 biotipo susceptible y mayor la supervivencia de los biotipos resistentes, más rápido será el proceso. Además, la presión de selección será máxima con herbicidas persistentes, con larga acción residual en el suelo. Cuanto mayor sea el éxito reproductivo del biotipo resistente, mayor será su potencial para dominar en la población. Asimismo, el tamaño del banco de semillas será crucial para retardar la aparición de resistencia al «diluir» las semillas resistentes entre las semillas producidas por las plantas susceptibles. c) Adaptación del biotipo resistente: si bien en ausencia del herbicida los individuos resistentes poseen en general una capacidad adaptativa menor que los individuos susceptibles, existe una notable variación de acuerdo con el herbicida. Retomando el ejemplo anterior, los biotipos resistentes a las triazinas se adaptan bastante menos al ambiente que los biotipos susceptibles, lo que implica una rápida vuelta a la situación previa (es decir, mayoría de biotipos susceptibles en la población) una vez que el herbicida deja de aplicarse. Contrariamente, las diferencias de adaptación entre biotipos resistentes y susceptibles a las sulfonilureas son mínimas, lo que implica un problema mucho más prolongado en los cultivos enmalezados. Si bien en estos últimos años se ha acrecentado la importancia de la resistencia monogénica, derivada de herbicidas que actúan en un solo sitio de acción, existen casos recientes de malezas que han desarrollado resistencia multigénica. En este último caso la resistencia se desarrolla como consecuencia de muchas y diferentes mutaciones en los alelos, cuya acumulación en la población por repetida selección confiere cada vez mayores niveles de resistencia, especialmente cuando la dosis es gradualmente incrementada. Este tipo de resistencia se ha encontrado recientemente en Lolium rigidum en Australia al aplicarse en forma reiterada el herbicida diclofop-metil y se produce como consecuencia del mal uso del herbicida (bajas dosis, herbicidas adulterados, baja calidad en las aplicaciones, etc.). De lo expuesto se desprende que el tema de la resistencia de las malezas a los herbicidas es realmente complejo y si bien la resistencia puede ser demorada, su desarrollo es prácticamente inevitable. Como estrategia general para demorar la aparición de resistencia podría recomendarse el empleo de los herbicidas en las situaciones en las que sea estrictamente necesario, la combinación en lo posible del control químico con métodos mecánicos y/o biológicos de control de malezas, la rotación y mezcla de herbicidas con diferentes sitios de acción y la rotación de cultivos de verano e invierno, que permitirán ampliar el espectro de malezas controladas y las medidas de control utilizadas. 5 La biotecnología y su inserción en el manejo de malezas Las malezas han ido adaptándose a los cambios impuestos por el hombre desde los inicios de la agricultura, constituyéndose en un claro ejemplo de la teoría Darwiniana de la selección natural. La reciente introducción del sistema de siembra directa en la pampa húmeda de la Argentina es un buen ejemplo de cómo modificaciones introducidas en el ambiente se traducen en cambios en la comunidad de malezas. La siembra directa es un tipo de labranza conservacionista que acumula residuos de cosecha en superficie e implica una menor remoción del suelo que el sistema de labranza convencional. Como consecuencia, en pocos años se han producido cambios importantes en predios cultivados con soja, como por ejemplo un aumento en las poblaciones de malezas gramíneas anuales en detrimento de las latifoliadas y una notable disminución de la riqueza florística natural. La evolución de las malezas dentro de los hábitat creados por el hombre fue lograda por diferentes vías: a partir de formas silvestres colonizadoras que se adaptaron al disturbio continuo del ambiente debido a las actividades del hombre; como consecuencia de la hibridación natural entre formas silvestres y cultivadas; y, aunque menos frecuente, a partir de cultivos que se convirtieron en malezas. De esta forma, actualmente muchas especies de malezas presentan morfología muy similar a la de los cultivos, mimetizándose con ellos de tal manera que en muchas ocasiones plantas cultivadas y malezas presen- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 349

265 tan los mismos requerimientos fisiológicos y nutricionales. Un ejemplo lo constituye la colza cultivada (Brassica napus), que crece junto a malezas del mismo género, como por ejemplo Brassica campestris. Esto implica un riesgo potencial por la posible hibridación entre ambas. Sin embargo, muchas malezas consideradas como altamente nocivas no son necesariamente las más exitosas desde el punto de vista evolutivo. Su carácter nocivo está asociado a una dificultad para su manejo o control y a una fuerte tendencia a deprimir el crecimiento y la producción de los cultivos. El flujo génico, en sus variadas formas, ha sido clave en la evolución de las malezas. El accionar del hombre ha acelerado este proceso de transferencia genética, principalmente como consecuencia de la aproximación de especies distantes geográficamente y de las modificaciones producidas en el hábitat, que determinaron la creación de nuevos nichos para la sobrevivencia, persistencia y diseminación de nuevos genotipos, productos de hibridación. El desarrollo de cultivos resistentes a herbicidas (CRH) es otra de las vías que contribuyó en el avance del control químico de las malezas, debido a que ha generado una nueva estrategia de manejo. Un CRH es una variedad o biotipo de un cultivo que es resistente a la acción de un herbicida que normalmente resulta letal para las variedades tradicionales del mismo cultivo. La obtención de CRH ha sido lograda a través de procesos de selección o a través de la inserción de genes en el genoma del vegetal que le confieren la propiedad de alterar o bloquear el sitio de acción donde actúa el herbicida. Cultivos resistentes obtenidos por las dos vías mencionadas se emplean comercialmente en la Argentina. Un ejemplo del primer proceso es la obtención de CRH de la familia de las imidazolinonas como el girasol Clearfield, resistente al herbicida imazapir (Clearsol ). La selección de esta variedad se produjo en Kansas, Estados Unidos, donde los girasoles con tolerancia al herbicida fueron descubiertos bajo condiciones naturales del cultivo. El segundo proceso implica la obtención de organismos genéticamente modificados, en este caso particular, cultivos trans- Figura 1: Soja «RR»(surcos a derecha e izquierda) y convencional (surco central) en ensayos de eficacia de aplicación de herbicida a base de glifosato. génicos. Un ejemplo lo constituye la obtención de resistencia al glifosato por la transferencia de un gen, que codifica para un producto que inhibe la actividad de la enzima EPSP sintetasa (Tabla 1), desde una especie de Agrobacterium al genoma de la soja. Este proceso de transferencia génica dio como resultado la obtención de la denominada soja RR (soja Roundup Ready ) resistente a la acción herbicida del glifosato (Fig. 1). Posteriormente, dicho gen también fue introducido en el maíz, generando el híbrido de maíz RR (maíz Roundup Ready ), también resistente a glifosato. En este cultivo se ha obtenido también la variedad Liberty Link, resistente a glufosinato de amonio, herbicida no selectivo conocido comercialmente como Liberty. En este último ejemplo, el gen incorporado codifica una enzima (fosfinotricin-n-acetil transferasa) que es la responsable de convertir al glufosinato en un metabolito inocuo para maíz. El desarrollo de CRH ha generado un impacto económico y biológico de magnitud sobre la producción agrícola, pudiéndose 350 SABBATINI, M.R.; IRIGOYEN, J.H. y M.N. VERNAVÁ

266 destacar los siguientes beneficios: - Amplían el espectro de malezas controladas, ya que se utilizan herbicidas no selectivos, como glifosato y glufosinato de amonio, que permiten el control de un extenso espectro de malezas, tanto anuales como perennes. - Reducen los daños al cultivo, dada su alta tolerancia a estos herbicidas y al no uso de otros herbicidas normalmente utilizados en cultivos no resistentes, que pueden ocasionar fitotoxicidad. - Un menor costo, debido al bajo precio de los herbicidas empleados y a la reducción en el número de labores culturales y mecánicas, previas o durante el ciclo de crecimiento del cultivo. - Los herbicidas utilizados tienen baja residualidad en suelos y aguas, por lo que presentan escasas restricciones para la rotación de cultivos, y además baja toxicidad para el hombre y animales. - Las malezas controladas tienen bajo riesgo de adquirir resistencia, ya que tanto el glifosato como el glufosinato de amonio evitan el empleo de otros herbicidas de alto riesgo, como por ejemplo los inhibidores de ALS (Tabla 1). - Simplifican y flexibilizan el manejo del cultivo. La tecnología asociada a los CRH no requiere de un entrenamiento especial por parte del productor y asimismo facilitan algunas de las prácticas relacionadas con el cultivo. Un ejemplo de ello es la prolongación del período crítico para la aplicación del herbicida en comparación al de los herbicidas selectivos frecuentemente empleados en cultivos no resistentes, en el que dicho período suele ser muy limitado. Una prueba de las ventajas de esta técnica la constituye el hecho de que el 92% de la totalidad de soja cultivada en la Argentina corresponde a soja RR. El uso de este cultivo resistente permite realizar tres o cuatro aplicaciones por año del herbicida, lo cual elimina casi por completo la competencia de las malezas. No obstante, existen riesgos o amenazas potenciales que es importante considerar en el momento de decidir acerca del uso de los CRH, ellos son: - La aparición de especies de malezas resistentes como consecuencia del uso continuo y repetido de un mismo herbicida, así como cambios en las poblaciones de malezas por el incremento de especies naturalmente tolerantes al herbicida. Si bien tanto el glifosato como el glufosinato de amonio tienen bajo riesgo de seleccionar biotipos de malezas resistentes (Tabla 1), existen casos probados en el mundo de la aparición de resistencia. Asimismo, las especies naturalmente tolerantes encuentran nuevos nichos para su crecimiento y desarrollo y por lo tanto incrementan su frecuencia y abundancia. Un ejemplo de esto último lo constituye la maleza «iresine» (Iresine difusa) informada por el INTA Oliveros como tolerante a glifosato y que surge como un nuevo problema en esta zona. - El uso de CRH y de los herbicidas asociados a ellos implica un impacto significativo sobre la composición florística de las malezas, ya que disminuyen la diversidad genética de la comunidad (erosión genética). - La aparición de las denominadas «supermalezas» por la transferencia de los genes de resistencia desde los CRH a sus especies salvajes emparentadas a través del polen. El fenómeno de hibridación, por polinización cruzada, no es raro en la naturaleza y la probabilidad resulta mayor para las especies emparentadas. Ejemplos de cultivos considerados con riesgo de hibridarse con malezas cercanas son: el sorgo cultivado (Sorghum saccharatum) con la maleza «sorgo de alepo» (Sorghum halepense) y el girasol (Helianthus annus) con el «girasol silvestre» (Helianthus petiolaris). Aquí es importante destacar que la transferencia horizontal de genes entre organismos taxonómicamente muy distantes es poco frecuente en la naturaleza pero muy relevante en términos evolutivos. La producción de plantas transgénicas acelera en ciertos aspectos la evolución de las malezas, ya que la hibridación representa un riesgo potencial de transferencia de la resistencia a herbicidas desde el cultivo hacia la maleza. La aparición de CRH voluntarios en un predio donde no fueron sembrados y que, por lo tanto, se comportan como una maleza. El problema grave radica en su resistencia al herbicida empleado para el control. - Reducción en el rendimiento (5-10 %) de algunas variedades o híbridos de CRH Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 351

267 como consecuencia fundamentalmente de la adición de genes extraños. Esto ha sido informado en algunos casos puntuales. - La contaminación de cultivos por flujo génico, especialmente los orgánicos, que se encuentran en predios aledaños mediante la polinización cruzada desde los cultivos transgénicos a los no transgénicos. - Riesgos ambientales por la persistencia de algunos de los herbicidas utilizados, como por ejemplo los pertenecientes a la familia de las imidazolinonas, que pueden acumularse en el ambiente y afectar la productividad y sustentabilidad del sistema agrícola. - Riesgo de reducción en la exportación de productos de origen transgénico como consecuencia del sentimiento antibiotecnología que existe en los consumidores de varios países de Europa. Hasta el momento, Argentina no ha tenido ninguna dificultad de acceso a los mercados de destino para sus exportaciones de soja transgénica y a pesar de las percepciones negativas de algunos consumidores, los diferenciales de precios entre la soja convencional y transgénica en el mercado mundial no penalizan a esta última, por lo que no es sorprendente que prácticamente toda la soja cultivada en el país sea transgénica. Si consideramos los principales cultivos transgénicos en el mundo encontramos que en la actualidad la soja transgénica resistente a herbicidas es el mayoritario en 7 países (Estados Unidos, Argentina, Canadá, México, Rumania, Uruguay y Sudáfrica), ocupando una superficie de 41,4 millones de has en el mundo, lo que representa el 61 % del área total ocupada por cultivos transgénicos que comprende 67,7 millones de has. Le sigue el maíz Bt con 12,3 millones de has (13 % del área total). El tercer cultivo de mayor importancia es la canola tolerante a herbicidas, con 3,6 millones de has (5 % del área total) y se siembra en dos países, Canadá y Estados Unidos. Otros tres cultivos ocupan, cada uno, un 5 % de la superficie total y son maíz tolerante a herbicidas e insectos (3,2 millones de has), maíz tolerante a herbicidas (3,2 millones de has) y algodón Bt (3,1 millones de has). El algodón, tolerante a herbicidas e insectos, ocupa 2,6 millones de has (4%) y el algodón tolerante a herbicidas 1,5 millón (2%). 6 Manejo Integrado de Malezas: única solución sustentable Debido a que las malezas continuarán adaptándose a las diferentes metodologías de control, los agricultores siempre necesitarán de nuevas tácticas y estrategias. La biotecnología ha realizado un valioso aporte al suministrar nuevas herramientas para el control de malezas, siendo los CRH la más importante. Sin embargo, sería un grave error suponer que esta técnica permitirá anular el problema de las malezas en el futuro, ya que debemos enfatizar que todas estas técnicas son sólo herramientas de las que puede valerse el hombre en su afán y esfuerzo para controlar las malezas y que no existe una única y fácil solución. Un programa de Manejo Integrado de Malezas es un sistema de manejo que enfoca el problema de las malezas de una manera compatible con la preservación de la calidad del ambiente, utilizando todas las tácticas y estrategias de control (técnicas adecuadas y conocimientos existentes) con el objeto de reducir una población de plantas indeseables a niveles tales que los perjuicios económicos producidos se hallen por debajo de un umbral económico aceptable para el sistema general de producción. Este programa puede involucrar, en muchos casos, métodos de control físicos, químicos, mecánicos, genéticos y biológicos juntamente con medidas preventivas y estudios básicos sobre la biología y ecología de malezas. Es un sistema interdisciplinario, ya que no consiste simplemente en la aplicación de una o dos medidas de control sino que abarca estrategias de control provenientes de varias disciplinas así como también involucra el entrenamiento de técnicos y la extensión a los productores. Tanto la teoría ecológica como la experiencia práctica acumulada durante más de 50 años de intentar disminuir los daños ocasionados por las plagas indican que una única herramienta de control (por ejemplo los CRH) es una solución sólo temporal para el problema de las malezas. Un manejo integrado de malezas, en el que múltiples estrategias son implementadas de una manera racional, es la única solución en el marco de un manejo sustentable del sistema productivo. 352 SABBATINI, M.R.; IRIGOYEN, J.H. y M.N. VERNAVÁ

268 7 Bibliografía CASAFE (2003) Guía de productos fitosanitarios para la República Argentina. Tomos I y II, Cámara de Sanidad Agropecuaria y Fertilizantes, República Argentina. COMITÉ DE PREVENCIÓN DE RESISTENCIAS A HERBICIDAS (en español). ( hrac_articles_espanol.html) COUSENS, R. & MORTIMER, M. (1995) Dynamics of Weed Populations. Cambridge University Press. CRONK, Q.C.B. (1995) Changing Worlds and Changing Weeds. BCPC Symposium Proceedings, 64: DAVIES, J. (2001) Herbicide Safeners - Commercial Products and Tools for Agrochemical Research. Pesticide Outlook doi: /b100799h. FERNÁNDEZ, O.A. (1982) Manejo Integrado de Malezas. Plantas Danhinas, Vol 2: FUENTES, C.L. (1991) Origen, evolución y algunos aspectos genéticos de las plantas invasoras (malezas o malas hierbas). Revista Comalfi, Volumen 18, 3: GARCÍA TORRES, L. Y FERNÁNDEZ QUINTANILLA, C. (1991) Fundamentos sobre malas hierbas y herbicidas. Edic. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, Madrid - Mundi-Prensa, Madrid, 348 pp. GRESSEL, J. (1997) Can the evolution of herbicide resistance in weeds be delayed? Proceedings of XXI CBCPD, Caxambu-MG, Brazil, pp GUNSOLUS, J.L. & CURRAN, W.S. (1992) Herbicide Mode of Action and Injury Symptoms. North Central Regional Extension Publication Educational Development System, Minnesota Extension Service. HGCA (2003) Managing and preventing herbicide resistance in weeds - Weed Resistance Action Group guidelines. 12 pp. ( HOLT, J.S.; POWLES, S.B. & HOLTUM, J.A.M. (1993) Mechanisms and agronomic aspects of herbicide resistance. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 44: INTERNATIONAL SURVEY OF HERBICIDE RESISTANT WEEDS. ( KLINGMAN, G.C. & ASHTON, F.M. (1975) Weed Science: Principles & Practices. John Wiley & Sons, Inc. Noordhoff, L.J - Wiley-Interscience Publication, 439 pp. KNEZEVIC, S.Z. & CASSMAN, K.G. (2003) Use of Herbicide Tolerant Crops as a Component of an Integrated Weed Management Program. Plant Management Network. Online. Crop Management doi: /cm MG. MALLORY-SMITH, C.A. & RETZINGER, J.E. JR (2003) Revised Classification of Herbicides by Site of Action for Weed Resistance Management Strategies. Weed Technology 2003, Volume 17: PROOST, R.; BOERBOOM, C.; DOLL, J. & SCHMIDT, R. (2002) Avoiding Herbicide Resistance in Weeds (A3615, NPM, November 2002). Nutrient and Pest Management Program - University of Winsconsin-Madison. ( ipcm.wisc.edu) RICHES, C.R. & VALVERDE, B.E. (2002) Agricultural and Biological Diversity in Latin America: Implications for Development, Testing and Commercialization of Herbicide-Resistant Crops. Weed Technology, Vol. 16: TRANEL, P.J. (2003) Weeds and Weed Control Strategies. En: Plant Genes and Crop Biotechnology - M.J. Chrispeels & D.E. Sadava - Jones & Bartlett Pub., 560 pp. TRIGO E., CHUDNOVSKY, D.E., CAP E. Y LÓPEZ A (2002). La difusión de organismos genéticamente modificados en la agricultura argentina. departamentos/economia/seminarios VITTA, J.; FACCINI, D.; NISENSOHN, L.; PURICELLI, E.; TUESCA, D. Y LEGUIZAMÓN, E. (1999) Las malezas en la región sojera núcleo argentina: Situación actual y perpectivas. Cátedra de Malezas, Facultad de Ciencias Agrarias, U.N.R. Editada por DowAgro Sciencies Argentina S.A., 47 pp. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 353

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270 VIII.-Capítulo 12 Tolerancia a factores abióticos Puebla, Andrea F.; Del Viso, Florencia 1 Introducción La radiación, la temperatura, el agua y los nutrientes son factores del medio ambiente que afectan el crecimiento y el desarrollo de las especies vegetales. La distribución de las plantas sobre la tierra depende, por lo tanto, de la existencia e intensidad de estos factores. Para alimentar a una población futura de 8 billones de habitantes con las prácticas agrícolas actuales se requeriría de un incremento del 12 % en la cantidad de tierras cultivables (Fig. 1), lo cual será imposible dada la densidad demográfica esperada. Fig. 1: La cantidad de tierra destinada a la agricultura, calculada en acres/persona ha ido disminuyendo paulativamente. Se estima que para alimentar a una población futura de 8 billones de habitantes, con las tecnologías actualmente en uso, se requeriría de un incremento de un 12 % en la cantidad de tierra cultivables. Gentileza Prof. Germán Spangenberg. Por otro lado la agricultura es la principal consumidora de agua en el mundo, uno de los recursos más limitantes para el futuro. Las reservas de agua del planeta han ido disminuyendo a medida que los consumos han ido aumentado con el crecimiento de la humanidad y las prácticas agrícolas (Fig. 2). Un informe reciente de IIPRI (2002) «Global Water Outlook to 2005: an impending crisis» predice que si la crisis del agua continúa, cabría esperar para el 2025 una reducción de 350 millones de toneladas métricas en la producción de granos, lo cual representa un poco más de la producción actual de Estados Unidos. Como resultado, el precio del arroz incrementaría en un 40%, el del trigo en un 80% y el del maíz en un 120 % si se considera la demanda actual. Dado que la agricultura consume el 70 % de toda el agua utilizada por el hombre, resulta obvio que la mejor forma de ahorrar agua es a través de la implementación de prácticas agrícolas que tiendan a reducir el consumo. Una forma es la reducción del riego mediante la creación de plantas resistentes a sequía, otra es la disminución en el uso de insecticidas mediante la utilización de estrategias de control biológico contra insectos (ver VIII.10) y plantas tolerantes a herbicidas (ver VIII.11). Estas dos últimas estrategias también reducen el riesgo de contaminación de las fuentes de agua potable disponibles Levitt (1980) define a los estreses ambientales como cambios en las condiciones del medio que reducen o cambian desfavorablemente el crecimiento o desarrollo de las plantas. Los estreses ambientales provocan en las plantas respuestas complejas y constituyen un problema fundamental para la agricultura, ya que influyen sobre la supervivencia y la productividad de los cultivos. Estas respuestas se manifiestan a nivel celular, fisiológico y del desarrollo (Levitt, 1980) y son caracteres de variación continua («cuantitativos»), controlados por un importante número de genes aditivos y probablemente sinérgicos (Bohnert y col., 1995). Se ha visto, por ejemplo, en estudios citogenéticos, que al menos diez de los veintiún pares cromosómicos en el trigo están comprometidos en la respuesta a las bajas temperaturas (Sutka y Vesz, 1988). Los genes inducidos bajo condiciones de estreses abióticos, tales como las bajas temperaturas, la salinidad y la sequía, codifican proteínas que tienen funciones de señalización, transducción de señales y protección celular, como por ejemplo, proteínas constituyentes de canales de agua que alteran el Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 355

271 Fig. 2: Las reservas de agua del planeta son limitadas, siendo la agricultura la principal consumidora de agua en el mundo. Los consumos han ido aumentado con el crecimiento de la humanidad y las prácticas agrícolas. Gentileza Prof. Germán Spangengenberg. potencial agua celular, enzimas requeridas para la síntesis de sustancias protectoras (azúcares, prolina y betaína), desaturasas lipídicas para modificar la composición de las membranas celulares, proteínas protectoras como las de tipo LEA («Late Embryogenesis Abundant» o proteínas abundantes en la embriogénesis tardía), proteínas anticongelantes, chaperonas, proteasas y enzimas detoxificantes como la catalasa y la ascorbato peroxidasa. 2 Señales para la respuesta a estreses abióticos La hipótesis de señalización actual postula que las señales ambientales son percibidas primero por receptores específicos, que con su activación inician o suprimen una cascada de transducción de señales intracelulares y, en muchos casos, activan factores de transcripción nucleares, que inducen la expresión de grupos específicos de genes. Una forma común de señal de iniciación es la fosforilación de proteínas acoplada a receptores. Aunque todavía no se han determinado con certeza en plantas ninguno de los receptores de respuesta al frío, sequía o de ABA (ácido abscísico, la hormona relacionada al estrés), el conocimiento reciente de una vía de señalización de estrés salino indica que los receptores con características de proteín-kinasas y las histidin-kinasas de dos componentes serían buenos candidatos para cumplir la función de sensores potenciales de estas señales de estrés (Xiong y Zhu, 2001). Receptores tipo proteínkinasas (RTK): se encuentran tanto en animales como en plantas y están estructuralmente compuestos por un dominio extracelular, que funciona por unión a un ligando o por interacción proteína-proteína, por un dominio transmembrana y por un dominio kinasa intracelular. Las RTK de plantas son también responsables de respuestas a patógenos estando además involucradas en el desarrollo. Estas kinasas deberían ser constitutivas, considerando las rápidas respuestas celulares (como las respuestas a inositol-p y Ca 2+ ) cuando las plantas son expuestas a un estrés (Hong y col., 1997). Sistema de dos componentes tipo histidin-kinasas: en estos sistemas cuando el sensor extracelular percibe la señal, una histidina del dominio citoplasmático se autofosforila y el residuo fosfato es pasado a un aspartato aceptor, en una respuesta regulatoria que se acopla a una cascada dependiente de MAP kinasas (Mitogen activated), o por fosforilación directa de blancos específicos que inician la respuesta celular. Se ha demostrado que, en cianobacterias, la fluidez de la membrana podría actuar como el primer sensor para las bajas temperaturas y es el disparador de histidin-kinasas que modulan la expresión de genes de desaturasas (Murata y Los, 1997; Suzuki y col., 2000). 2.1 Segundos mensajeros Numerosos estudios sugieren que el Ca 2+ forma parte de varios procesos de señalización intracelular (revisión de Sanders y col., 1999; Örvar y col., 200; Sangwan y col., 2001). La concentración intracelular de Ca 2+ se encuentra firmemente controlada: el Ca 2+ citosólico se encuentra en bajas concentra- 356 PUEBLA, Andrea F.; DEL VISO, Florencia

272 ciones, aunque luego de la estimulación se libera de las reservas intracelulares o entra en la célula a través de varios canales. El Ca 2+ extracelular puede entrar en la célula por cambios de voltaje, operado por receptores, o a través de canales específicos. El Ca 2+ intracelular puede liberarse a través de canales sensibles a mensajeros ligandos o a segundos mensajeros, entre los que se incluyen a los inositol polifosfatos y la ADP-ribosa cíclica (cadpr) (Fig. 3). 3 Inducción de genes en respuesta al estrés Los genes inducidos por estrés incluyen genes de respuesta temprana y genes de respuesta tardía. Los primeros son inducidos en pocos minutos y a menudo transitoriamente. Su inducción no requiere de síntesis de nuevas proteínas, ya que estos componentes de señalización serían constitutivos. En contraste, los genes de respuestas tardías son activados más lentamente (en horas) y su expresión es generalmente sostenida durante el tiempo en que el estrés se encuentra actuando. Los genes tempranos codifican factores de transcripción que activan a los genes de respuesta tardía, que constituyen la vasta mayoría de los genes inducidos por estrés (Figura 3). Figura 3: Vías principales de señalización en plantas en respuesta a estreses abióticos (Frío, Sequía y Salinidad). La vía I de señalización involucra la producción de antioxidantes y osmolitos involucrando la transducción de señales a través de MAP kinasas. La vía II involucra la producción de diferentes tipos de proteínas (tipo LEA y otras) y está mediada por CDPK. La vía III involucra a la vía SOS, específica del estrés iónico. No se detallan las moléculas de señalización o segundos mensajeros. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 357

273 4 Genómica de la tolerancia a estreses ambientales Los recientes avances en el estudio molecular y genético de las respuestas a estreses abióticos llevaron a la identificación de un gran número de loci cualitativos únicos, QTL, y genes relacionados con la tolerancia a estreses abióticos. Estos nuevos conocimientos posibilitarán modificar la forma de seleccionar en el mejoramiento de cultivos importantes, desde una selección fenotípica a una genotípica (a través de selección asistida por marcadores), aumentando así las posibilidades de mejoras genéticas en los cultivos. Como se mencionó anteriormente, la tolerancia a estreses ambientales no depende de un único gen sino que es un carácter poligénico, de variación continua. Recientemente se construyeron mapas que contienen los determinantes que afectan la tolerancia a estreses abióticos en las Triticeae (Cattivelli y col., 2002). Se demostró que el grupo de cromosomas 5 en trigo contiene la concentración más alta de loci que controlan la adaptación de la planta al ambiente, particularmente los relacionados con la tolerancia a las heladas y a la salinidad, mientras que una región del cromosoma 7 es crucial en la tolerancia a la sequía (Cattivelli y col., 2002). Se identificó un locus en el cromosoma 5A de trigo, Vrn-Fr1, que tiene un importante efecto en la tolerancia a las heladas (Galiba y col., 1995). Las variedades de invierno poseen el alelo vrn1, y son más tolerantes a las bajas temperaturas que las variedades de primavera que poseen el alelo Vrn1. También se demostró que las diferencias en la tolerancia a las bajas temperaturas encontradas entre distintas variedades de invierno pueden ser explicadas, en algunos casos, por las diferencias en este locus (Storlie y col., 1998). Actualmente se conocen dos genes, VRN1 y VRN2 presentes en este intervalo, los cuales están directamente involucrados en la respuesta a la vernalización en el trigo diploide (Triticum monoccocum) (Law y col., 1975; Dubcovsky y col., 1998: Tranquilli y col., 2000). En sorgo se construyeron varios mapas de ligamiento utilizando RFLP y otros marcadores moleculares (Xu y col., 1994; Taramino y col., 1997; Kong y col., 2000) y se identificaron también varios QTLs con efectos significativos en la tolerancia a la sequía (Tunistra y col., 1997). Las nuevas tecnologías para el análisis genómico (microarreglos de ADN, genética directa y reversa) produjeron una revolución en el análisis genético de las especies y permitieron cambiar el enfoque en el análisis, yendo desde estudios de un solo gen a estudios que abarcan todo el genoma. Utilizando tanto macro como microarreglos de ADN (Lin y col., 2003; Seki y col., 2001, 2002a, 2002b; Kawasaki y col., 2001; Oono y col., 2003) se estudiaron genes inducidos o suprimidos en condiciones de estrés abiótico (frío, sequía, salinidad). La mayor parte de estos estudios se realizaron en Arabidopsis debido al hecho, entre otros factores, de que su genoma ha sido completamente secuenciado, facilitando así la construcción de los microarreglos y el análisis de las secuencias obtenidas. Los resultados de estos trabajos indicarían la existencia de una mayor intersección entre las vías de señalización de ABA, sequía y salinidad, comparada con las vías en común entre ABA y frío (Seki y col., 2002b). A partir de estos estudios también se identificaron numerosos genes que son inducidos por uno solo de los tratamientos, los cuales se clasificaron como específicos de cada respuesta. Los resultados obtenidos hasta el momento permiten sugerir que la tecnología de microarreglos será de mucha utilidad para el aislamiento de nuevos genes, para el estudio de perfiles generales de expresión tejido-específico ante distintas condiciones de estrés abiótico y también para la identificación de genes y potenciales elementos en cis de factores de transcripción. 4.1 Tolerancia a las bajas temperaturas Las especies vegetales adaptadas a regiones templadas del planeta varían durante transcurso del año en su habilidad para sobrevivir a las bajas temperaturas. Las plantas capaces de aclimatarse al frío perciben las bajas temperaturas sobre cero durante el avance del invierno y disparan procesos bioquímicos específicos que resultan en la tolerancia, aún, de temperaturas de congelamiento (Thomashow, 1999). 358 PUEBLA, Andrea F.; DEL VISO, Florencia

274 La aclimatación al frío está asociada a la expresión de novo de genes, síntesis de proteínas y varios cambios fisiológicos (Guy, 1990). Los mecanismos que contribuyen a la tolerancia incluyen la prevención de la desnaturalización de proteínas inducida por bajas temperaturas, la prevención de la precipitación de moléculas y la atenuación de las consecuencias de la formación de hielo intercelular. Muchos estudios indican que en las plantas los sistemas de membranas de la célula son los primeros sitios dañados por el congelamiento (Levitt, 1980; Steponkus, 1984). Entre estos daños se incluyen la lisis celular inducida por expansión, las transiciones de los lípidos de membrana (de laminares a fase hexagonal II) y las lesiones por fracturas. Los mecanismos involucrados en la estabilización de las membranas celulares en respuesta al frío son múltiples. Los más importantes serían los cambios en la composición de lípidos, aunque también se ha observado la acumulación de solutos compatibles (moléculas que pueden acumularse en la célula sin modificar el metabolismo central) en células de plantas sometidas tanto a estrés por frío como por sequía. La acumulación de sacarosa y otros azúcares, que típicamente ocurre en plantas tolerantes durante la aclimatación, parece contribuir a la estabilización de las membranas. Estas moléculas demostraron proteger in vitro a las membranas durante el congelamiento (Strauss y Hauser, 1986; Anchordoguy y col., 1987). En muchas especies de gramíneas de clima templado se ha observado la acumulación de fructanos, polímeros de fructosa, cuando las plantas son expuestas a bajas temperaturas sobre cero. El incremento en el contenido de estos polímeros parece estar relacionado al proceso de aclimatación a las bajas temperaturas (Pontis, 1989; Tognetti y col., 1989; Santoiani y col., 1993; Puebla y col., 1997,1999a). El metabolismo de los fructanos en gramíneas ha sido estudiado en su mayor parte en cereales de importancia agronómica y se lo ha señalado como uno de los mecanismos de tolerancia a bajas temperaturas. En la Argentina existen especies nativas que están adaptadas a ambientes de climas rigurosos y son tolerantes a condiciones severas de estrés abióticos. Bromus pictus, por ejemplo, es una especie distribuida en las estepas áridas de la meseta patagónica, donde las bajas temperaturas imperan en la mayoría de los días del año (la temperatura media en julio es de 1,9ºC) y las precipitaciones promedio sólo llegan a los 168 mm anuales. Esta especie contiene elevados niveles de fructanos en sus tejidos y una creciente actividad de fructosil-transferasas, enzimas responsables de la síntesis de estos azúcares, cuando las plantas son tratadas con bajas temperaturas. Los genes que codifican estas enzimas fueron aislados recientemente y, a través de la transformación de tejidos heterólogos con los mismos, fue posible estudiar la función de estos azúcares en la tolerancia a frío (Puebla y col., 1999b) Identificación y caracterización de genes de tolerancia a frío Numerosos genes inducibles por bajas temperaturas y sus promotores han sido aislados y caracterizados en varias especies vegetales, incluyendo alfalfa, Arabidopsis, cebada y trigo. Una gran parte de estos genes codifican proteínas de función conocida, que contribuyen a la tolerancia a las bajas temperaturas. Por ejemplo, el gen de Arabidopsis FAD8 codifica una desaturasa de ácidos grasos que alteraría la composición lipídica de las membranas. También se conocen genes de chaperonas en espinaca y Brassica napus que responden a las bajas temperaturas y genes regulados por frío que intervienen en la transducción de señales (Fig. 3). Sin embargo, muchos genes inducidos durante la aclimatación a bajas temperaturas codifican proteínas de función desconocida. Muchas de éstas presentan homología con las proteínas LEA, ya mencionadas. Los polipéptidos LEA son sintetizados en la semilla durante la embriogénesis tardía antes de la desecación y también en plántulas, en respuesta a la deshidratación. Estas proteínas son altamente hidrofílicas, tienen una composición simple de aminoácidos y en muchas se predicen regiones capaces de formar α-hélices anfipáticas. Otras proteínas, de función desconocida, que no se encuentran agrupadas con las LEA, Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 359

275 son las codificadas por genes COR («cold resistant» o resistente a frío), también designados LT1, KIN, RD y ERD, de Arabidopsis. Estas proteínas también presentan regiones con capacidad para formar α-hélices anfipáticas que podrían tener roles en la estabilización de las membranas durante las bajas temperaturas. Algunos de estos genes, bajo promotores constitutivos (35S CaMV), han sido utilizados para transformar plantas susceptibles a frío y se han realizado estudios de adquisición de tolerancia a estrés con las plantas transgénicas obtenidas. Los resultados sugieren que la tolerancia a bajas temperaturas depende de varios genes de tolerancia y no de un gen particular. 4.2 Regulación de la respuesta a la aclimatación: el regulón CBF Los estudios iniciales de la expresión de genes regulados por frío establecieron que algunos promotores de estos genes eran activados en respuesta a bajas temperaturas y sequía. Los análisis posteriores determinaron que en Arabidopsis existen elementos regulatorios en los promotores de estos genes: las repeticiones C (CRT) en el elemento DRE (elemento que responde a sequía) que estimulan la expresión de genes en respuesta a las bajas temperaturas, a la sequía y a la salinidad. Se identificaron poco después activadores transcripcionales que se unen a estos elementos CRT/DRE. Las proteínas que codifican contienen un dominio de unión al ADN tipo AP2/EREBP y están codificadas por genes que se encuentran en tandem sobre el cromosoma 4 de esta especie. La expresión constitutiva de estos activadores transcripcionales bajo el promotor 35S del CaMV en plantas transgénicas de Arabidopsis induce la expresión de múltiples genes regulados por bajas temperaturas que poseen los elementos CRT/DRE, sin mediar ningún estímulo de frío. 5 Tolerancia al estrés hídrico La disponibilidad de agua es el factor abiótico más importante que modela la evolución de las plantas. El estrés hídrico, en su sentido más amplio, incluye tanto a la sequía como a la salinidad. Estos estreses, junto al frío, constituyen problemas cruciales para la agricultura, ya que impiden a los cultivos desarrollar su máximo potencial genético. El estrés hídrico generalmente inhibe el crecimiento celular y las evidencias indirectas sugieren que existen señales de división celular y expansión relacionadas con las kinasas dependientes de ciclinas (CDPK) (Zhu, 2002). Las plantas sufren deshidratación o estrés hídrico, no sólo durante la sequía o las altas concentraciones de sales sino también durante condiciones de bajas temperaturas. Durante la exposición de las plantas a temperaturas de congelamiento la formación de hielo extracelular impone una fuerza deshidratadora a la solución no congelada intracelular. La formación de hielo lleva a una rápida concentración de los solutos extracelulares y el cambio de potencial químico y osmótico provoca que el agua líquida se mueva hacia fuera de la célula. Tanto la sequía como la salinidad afectan virtualmente cada aspecto de la fisiología de una planta y su metabolismo. Considerando la complejidad de las respuestas encontradas bajo estos estreses, no es sorprendente que una gran proporción del genoma esté sujeto a regulación, como lo demuestran algunos trabajos de microarreglos de ADN. Por ejemplo, en la levadura unicelular Saccharomyces cerevisiae, la tolerancia a estrés salino afecta aproximadamente al 8% de los genes de todo el genoma (Posas y col., 2000; Rep y col., 2000). Las respuestas adaptativas al estrés pueden clasificarse de la siguiente manera: a) El control de la homeostasis, que incluye homeostasis iónica y la osmótica. b)el control del daño y la reparación o detoxificación. c) El control del crecimiento. La señal de homeostasis regula negativamente la respuesta de detoxificación y estas dos inducen la tolerancia al estrés, que regula negativamente la inhibición del crecimiento provocada por la aparición de las condiciones ambientales adversas. La respuesta de las plantas a la alta salinidad se dispara cuando se produce un aumento intracelular de Na +. La señal de 360 PUEBLA, Andrea F.; DEL VISO, Florencia

276 estrés hídrico incluiría posiblemente un cambio de turgencia que provoca el cierre de los estomas, la expresión y/o activación de enzimas de síntesis de osmolitos y la de sistemas transportadores de éstos y de agua. Los genes involucrados en la homeostasis hídrica incluyen los genes de acuaporinas, los genes de enzimas de biosíntesis de osmolitos, de cotransportadores de sentido contrario («antiporters») de Na + /H + asociados a membrana plasmática para la extrusión de Na +, de antiporters de Na + /H + para la compartimentalización de Na + en la vacuola y de transportadores de K + con alta afinidad para la adquisición de K +. La señal de detoxificación se dispararía ante la desnaturalización proteica y la presencia de especies reactivas de oxígeno. La respuesta incluye la hidrólisis de fosfolípidos, cambios en la expresión de proteínas tipo LEA/dehidrinas, de chaperonas moleculares y proteasas que remueven las proteínas desnaturalizadas, así como la activación de enzimas responsables de la remoción de especies reactivas de oxígeno, de proteínas relacionadas con la ubiquitinación y de otras proteínas detoxificantes. 6 La vía SOS (Salt Overly Sensitive o sensible al exceso de salinidad) de tolerancia a la salinidad El estrés salino quiebra la homeostasis iónica de las plantas provocando un exceso tóxico de Na + en el citoplasma y una deficiencia de iones esenciales como el K +. El clonado y la caracterización bioquímica de varios genes y productos de genes SOS (Salt Overly Sensitive) ha permitido establecer recientemente una vía de señalización para la regulación de la homeostasis iónica y la tolerancia a la salinidad en Arabidopsis. Esta vía se dispara por un aumento intra o extracelular de Na + y provoca una señal citoplasmática de calcio que induce la expresión y cambios de actividad de transportadores de iones como el Na +, K + y H +. La vía contiene tres genes principales llamados SOS1, 2 y 3 (Zhu, 2000) (Fig. 3). El estrés salino provoca una señal citosólica de Ca 2+. Una proteína que se une a Ca 2+, codificada por SOS3 percibe presumiblemente esta señal y desencadena la respuesta. SOS3 interactúa y activa a SOS2, una serin-treonin kinasa y estas dos a su vez regulan la expresión y la actividad de SOS1, un efector de la tolerancia a la salinidad, que codifica un cotransportador de sentido contrario («antiporter») Na + /H + de la membrana plasmática. SOS3 es una proteína miristoilada, lo que facilita que ésta y sus proteínas asociadas (tipo SOS2) interactúen con la membrana, donde se encuentran ubicados sus transportadores blanco. SOS3 también parece interactuar con proteínas que median la inducción de la biosíntesis de ABA. SOS2 representa una nueva familia de proteín-kinasas sólo encontradas en plantas que contienen un dominio catalítico y otro regulatorio que interactúa con SOS3. SOS1 es un cotransportador de sentido contrario («antiporter») Na+/H+ de la membrana plasmática con una larga cola que estaría inmersa en el lado citoplasmático y que podría funcionar como sensor de los solutos que transporta. 7 El ácido abscísico (ABA) y la tolerancia a estrés El ABA posee muchas funciones durante el crecimiento y desarrollo de las plantas, pero la principal función es la de regular el balance de agua y la tolerancia a estrés osmótico. Los patrones de expresión de los genes inducibles por estreses abióticos son complejos y muchos de ellos son inducidos también por la aplicación exógena de ABA. Existen, sin embargo, algunos genes inducibles por estreses abióticos que no responden a esta hormona. Esto sugiere que entre la señal inicial de sequía, salinidad o estrés por frío y la expresión de genes específicos existen cascadas de señales de transducción dependientes e independientes de ABA. La acumulación de ABA inducida por estrés osmótico es una combinación de la activación de su síntesis y de la inhibición en su degradación. Aunque nada se sabe de la señalización entre la percepción del estrés y la inducción de los genes de biosíntesis, el conocimiento actual sugiere que están involucradas señales de Ca 2+ y cascadas de fosforilación de proteínas (Zhu, 2003). En girasol fue descripta una familia de factores de transcripción característicos de plan- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 361

277 tas que contienen un homeodominio «leucine-zipper» (cremallera de leucina) (Chan y González, 1994; Chan y col., 1998). Estas proteínas pueden unirse al ADN debido a la presencia de una secuencia altamente conservada, conocida como homeodominio, que se encuentra en muchos genes de eucariotas que se expresan durante el desarrollo (Valle y col., 1997). La familia de factores de transcripción descripta en girasol incluye proteínas involucradas en el desarrollo temprano de las plántulas y otras que participan en la respuesta a sequía. Hahb-4 es un gen de esta familia que mostró estar fuerte y reversiblemente inducido por estrés hídrico y por ABA. La región promotora de Hahb-4 contiene secuencias consenso presentes en elementos de respuesta a ABA (ABRE), sugiriendo que este gen funciona en la cascada de señalización que controla en girasol la respuesta al estrés hídrico mediada por ABA (Gago, 2002). Plantas de Arabidopsis transformadas con este gen mostraron un aumento importante en la tolerancia a estrés hídrico (Chan, comunicación personal). Estudios de la expresión de genes inducidos por frío en mutantes de Arabidopsis deficientes en ABA (aba) e insensibles a ABA (abi) demostraron que la expresión de genes de frío se encuentra mediada por vías dependientes e independientes de ABA (Ingam y Bartels, 1996; Shinozaki y Yamaguchi- Shinozaki, 1997). Los genes que contienen los elementos CRT/DRE estan relacionados con la vía independiente de ABA. Algunos de los genes que responden a bajas temperaturas revelaron la presencia de un elemento ABRE. Estos genes se expresan en respuesta a ABA, demostrando que las vías regulatorias de frío y las dependientes de ABA se cruzan en algún punto de la señal de transducción (Shinozaki y Yamaguchi- Shinozaki, 1997). 8 Plantas transgénicas tolerantes a estreses abióticos Tabla 1: Plantas transgénicas conteniendo genes de tolerancia a estreses abióticos (frío, sequía, salinidad) en etapa de experimentación o de pruebas experimentales a campo en países en vías de desarrollo. (fuente: Tolerancia a estreses abióticos Especie Países Bajas temperaturas Papa Bolivia Tomate China Trigo India Salinidad Arroz Bangladesh, Brasil, China, India, Pakistán, Tailandia Maíz China Sorgo China Tabaco Argentina Trigo Egipto Sequía Arroz China, Indonesia, Sudáfrica, Tailandia Caña de azúcar Indonesia Trigo Croacia En muchos países se investiga activamente la adquisición de tolerancia a factores ambientales adversos en especies agronómicamente importantes transformadas con genes que codifican para proteínas de tolerancia a estreses abióticos, muchas de las cuales ya se encuentran en etapa de experimentación a campo (Tabla 1). 9 Conclusiones finales Las investigaciones en el campo de la tolerancia a factores ambientales adversos tuvieron un desarrollo importante en la última década. Se identificaron genes y proteínas con roles en la tolerancia a frío, sequía y salinidad, se determinaron muchos de sus mecanismos de acción y se avanzó en el conocimiento de cómo se desencadenan y activan las respuestas de las células vegetales ante estos estreses y sus interrelaciones. Las nuevas tecnologías (micro y macroarreglos de ADN, transformación genética de plantas) prometen brindar nuevos descubrimientos, fundamentales para entender cómo las especies vegetales son capaces de adaptarse a un ambiente siempre cambiante. Lecturas Recomendadas ANCHORDOGUY T.J.; RUDOLPH A.S.; CARPENTER J.F. y CROWE J.H Modes of interaction of cryoprotectans with membrane phospholipids during freezing. Cryobilogy 24: BACHMAN M.; MATILE P. y KELLER F Metabolism of the raffinose family oligosaccharides in leaves of Ajuga reptans L. Plant Physiol. 105: PUEBLA, Andrea F.; DEL VISO, Florencia

278 BOHNERT H.J.; NELSON D.E. y JENSEN R.G Adaptations to environmental stress. Plant cell 7: CALDERÓN P. y PONTIS H.G Increase of sucrose synthase activity in wheat plants after a chilling shock. Plant Sci. 42: CATTIVELLI L.; BALDI P.; CROSATTI C.; DI FONZO N.; FACCIOLI P.; GROSSI M.; MASTRANGELO A.; PECCHIONI N. y STANCA M Chromosome regions and stress related sequences involved in resistance to abiotic stress in Triticeae Plant Molecular biology 48: CHAN R.L. y GONZÁLEZ D.H A cdna encoding an HD-Zip protein from sunflower. Plant Physiol 106: CHAN R.L.; GAGO G.M.; PALENA C.M. y GONZÁLEZ D.H Homeoboxes in plant development. Biochim. Biophys. Acta 1442: DUBCOVSKY J.; LIJAVETSKY D.; APPENDINO L. y TRANQUILLI G Comparative mapping of Triticum monoccocum genes controlling vernalization requirement. Thoer. Appl. Genet. 97: DUNN M.A.; HUGHES M.A.; ZANG L.; PEARCE R.S.; QUIGLEY A.S. y JACK P.S Nucleotide Sequence and molecular analysis of the low temperature induced gene, BLT4. Mol. Gen. Genet. 229(3): GAGO G.M.; ALMOGUERA C.; JORDANO J.; GONZALEZ D.H. y CHAN R.L Hahb-4, a homeobox-leucine zipper gene potentially involved in abscisic aciddependent responses to water stress in sunflower. Plant Cell Environ. 25: GALIBA G.; QUARRIE S.A:; SUTKA J.; MORGOUNOV A. y SNAPE J.W RFLP mapping of the vernalization (Vrn1) and frost resistance (Fr1) genes on chromosome 5A of wheat. Theor. Appl. Genet. 90: GIBSON S.; ARONDEL V.; IBA K. y SOMERVILLE C Cloning of a temperatura-regulated gene encoding a chloroplast amega-3 desaturase from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 106: GILMOUR S.J.; ARTUS N.N. y THOMASHOW M.F cdna sequence analysis and expression of two coldregulated genes of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 18: 13-21,. GUY C.L Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 41: HASEGAWA P.M.; BRESSAN R.A.; ZHU J.K. y BOHNERT H.J Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annu. Rev. Plant Mol. Plant Physiol. 51: HOLMBERG N. y BULOW L Improving stress tolerance in plants by gene transfer. Trends Plant Sci. 3: HONG S.W.; JON J.H.; KWAK J.M. y NAM H.G Identification of a receptor-like protein kinase gene rapidly induced by ABA, dehydration, high salt, and cold treatments in Arabidospsis thaliana. Plant Physiol. 113: HOUDE M.; DHINDSA R.S. y SARHAN F A molecular marker to select for freezing tolerance in Gramineae. Mol. Gen. Genet. 234: INGRAM J. y BARTELS D The molecular bases of dehydration tolerance in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: IIPRI Global Water Outlook to 2005: An Impending Crisis. International Food Policy and Research Institute, Washington DC, USA. KAWASAKI S.; BORCHERT C.; DEYHOLOS M.; WANG H.; BRAZILLE S.; KAWAI K.; GALBRAITH D. y BOHNERT H.J Gene expression profiles during the initial phase of salt estrés in rice. Plant Cell 13: KOMG L.; DONG J. y HART G.E Isolation, characterization and linkage mapping of Sorghum bicolor (L.) Moench DNA simple sequence repeats (SSRs). Theor. Appl. Genet. 101: KOORNNEEF M.; LÉON-KLOOSTERZIEL K.M.; SCHWARTZ S.H. y ZEEVAART J.A.D The genetic and molecular dissection of abscisic acid biosynthesis and signal transduction in Arabidopsis. Plant Physiol. Biochem. 36: LAW C.N.; WORLAND A.J. y GIORGI B The genetic control of ear emergence time by chromosomes 5A and 5D of wheat. Heredity 36: LEVITT J Responses of plants to environmental estréses. New York: Academic, 2 nd. Ed.. LIN F.; XU S.L.; NI W.M.; CHU Z.Q.; XU Z.H. y XUE H.W Identification of ABA-responsive genes in rice shoots via cdna macroarray. Cell Research 13(1): LIOTENBERG S.; NORTH H. y MARION-POLL A Molecular biology and regulation of abscisic acid biosynthesis in plants. Plant Physiol. Biochem. 37: LIU Q, KASUGA M, SAKUMA Y, ABE H, MIURA S, YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. y SHINOZAKI K Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/ AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperatureresponsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell 10: MUNNIK T.; IRVINE R.F. y MUSGRAVE A Phospholipid signaling in plants. Biochem. Biophys. Acta 1389: MURATA N. y LOS D.A Membrane fluidity and temperature perception. Plant Physiol. 115: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 363

279 NORDIN K.; HEINO P. y PALVA E.T Separate signal pathways regulate the expression of a low-temperatureinduced gene in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Mol. Boil. 21: OONO Y.; SEKI M.; NANJO T.; NARUSAKA M.; FUJITA M.; SATOH R.; SATOU M.; SAKURAI T.; ISHIDA J.; AKIYAMA K.; IIDA K.; MARUYAMA K.; SATOH S.; YAMAGUCHI- SHINOSAKI K. y SHINOSAKI K Monitoring expression profiles of Arabidopsis gene expression during rehydration process after dehydration using ca full-length cdna microarray. The Plant journal 34: ÖRVAR B.L.; SANGWAN V.; OMANN F. y DHINDSA R Early steps in cold sensing by plant cells: the role of actin cytoskeleton and membrane fluidity. Plant J. 23: OULLET F.; VAZQUEZ-TELLO A. y SARHAN F The wheat wcs120 promoter is cold-inducible in both monocotyledonous and dicotyledonous species. FEBS Lett. 423: PILON-SMITS E.A.H.; EBSKAMP M.J.N.; PAUL M.J.; JEUKEN M.J.W.; WEISBEEK P.J. y SMEEKENS C.M Improved performance of transgenic fructan-accumulating tobacco under drought stress. Plant Physiol. 107: PONTIS H.G. y DEL CAMPILLO E Fructans. En «Biochemistry of storage carbohydrates in green plants» ch. 5: , Academic Press. PUEBLA A.F.; SALERNO G.L. y PONTIS H.G Fructan metabolism in two species of Bromus submitted to chilling and water stress. New Phytologist 136 (1): PUEBLA A.F. 1999a. Estudios bioquímicos y moleculares del metabolismo de fructanos en Gramíneas nativas en relación con estreses ambientales. Tesis Doctoral., Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. PUEBLA A.F., HOPP H. E., PONTIS H. G. y SALERNO G.L. 1999b. Molecular studies on fructan metabolism in a native Patagonean Graminea Bromus pictus submitted to low temperature. Plant Physiol. 120 (suppl.): 503. SANDERS D.; BROWNLEE C. y HARPER J.F Communicating with calcium. Plant Cell 11: SANGWAN V.; FOULDS I.; SINGH J. y DHINDSA R Cold-activation of Brassica napus BN115 promoter is mediated by structural changes in membrane and cytoskeleton, and requires Ca 2+ influx. Plant J. 27: SANTOIANI C.S.; TOGNETTI J.A.; PONTIS H.G. y SALERNO G.L Sucrose and fructan metabolism in wheat roots at chilling temperatures. Physiol. Plant 87: SEKI M.; NARUSAKA M.; ABE H.; KASUGA M.; YAMAGUCHI-SHINOSAKI K.; CARNICI P.; HAYASHIZAKI Y. y SHINOSAKI K Monitoring the Expression Pattern of 1300 Arabidopsis Genes under Drought and Cold stress by using a Full-Length cdna microarray. The Plant Cell, 13: SEKI M.; NARUSAKA M.; ISHIDA J.; NANJO T.; FUJITA M.; OONO Y.; KAMIYA A.; NAKAJIMA M.; ENJU A.; SAKURAI T.; SATOU M.; AKIYAMA K.; TAJI T.; YAMAGUCHI- SHINOSAKI K.; CARNICI P.; KAWAI J.; HAYASHIZAKI Y. y SHINOSAKI K. 2002ª. Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought, cold and highsalinity stress using a full-length cdna microarray. The plant Journal 31(3): SEKI M.; ISHIDA J.; NARISAKA M.; FIJITA M.; NANJO T.; UMEZAWA T.; KAMIYA A.; NAKAJIMA M.; ENJU A.; SAKURAI T.; SATOU M.; AKIYAMA K.; YAMAGUCHI- SHINOSAKI K.; CARNICI P.; KAWAI J.; HAYASHIZAKI Y. y SHINOSAKI K b. Monitoring the expression pattern of around 7000 Arabidopsis genes under ABA treatments using a full-length cdna microarray. Funct. Integr. Genomics 2: STOCKINGER E.J.; GILMOUR S.J. y THOMASHOW M.F. Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domaincontaining transcriptional activator that binds to the C- repeat/dre, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit. P.N.A.S. 94: SHINOZAKI K. y YAMAGUCHI-SHINOZAKI Gene expression and signal transduction in water-stress response. Plant Physiol. 115: SHINOZAKI K. y YAMAGUCHI-SHINOZAKI K Molecular responses to drought and cold stress. Plant Biotechnology. STEPONKUS P.L Role of the plasma membrane in freezing injury and cold acclimation. Annu. Rev. Plant Physiol. 35: STEPONKUS P.L.; UEMURA M. y WEBB M.S A contrast of the cryostability of the plasma membarne of winter rye and spring oat two species that widely differ in their freezing tolerance and plasma membrane lipid composition. En Advances in Low-Temperature Biology, ed. P.L. Steponkus, 2: London, JAI Press. STEVENSON J.M.; PERERA I.Y.; HEILMAN I.; PERSSON S. y BOSS W.S Inositol signaling and plant growth. Trends Plant Sci. 5: STORLIE E.W.; ALLAN R.E. y WALKER-SIMMONS M.K Effect of the Vrn1-Fr1 interval on cold hardiness levels in near isogenic wheat lines. Crop Sci. 38: STRAUSS G. y HAUSER H Stabilization of lipid bilayer vesicles by sucrose during freezing. P.N.A.S. 83: SUTKA J. y VEISZ O Reversal of dominance in a gene on chromosome 5A controlling frost resistance in wheat. Genome 30: SUZUKI I.; LOS D.A.; KANESAKI Y.; MIKAMI K. y MURATA M The pathway for perception and transcription of low-temperature signals in Synechocystis. EMBO J. 19: TARAMINO G.; TARCHINI R.; FERRARIO S.; LEE M. y PE M.E Characterization and mapping of simple 364 PUEBLA, Andrea F.; DEL VISO, Florencia

280 sequence repeats (SSRs) in Sorghum bicolor. Theor. Appl. Genet. 95: THOMASHOW M.F Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: ZHU J.K Salt and drought stress signal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53: TOGNETTI J.A.; CALDERÓN P.L. y PONTIS H.G Fructan metabolism: reversal of cold acclimation. J. Plant Physiol. 134: TRANQUILLI G.E. y DUBCOVSKY J Epistatic interaction between vernalization genes Vrn-Am1 and Vrn-Am2 in diploid wheat. J. Hered. 91: TUNISTRA M.R.; GROTE E.M.; GOLDSBOUGH P.B. y EJETA G Genetic analysis of post-flowering drought tolerance and components of grain development in Sorghum bicolor (L.) Moench. Mol. Breed. 3: UEMURA M. y STEPONKUS P.L Effect of cold acclimation on membrane lipid composition and freezeinduced membrane destabilization. En Plant Cold hardiness. Molecular biology, Biochemistry and Physiology. New York: Plenum: VALLE EM, GONZÁLES DH, GAGO G. y CHAN RL Isolation and expression pattern of hahri, a homeoboxcontaining cdna from Helianthus annuus. Gene 196: WOLFRAIM L.A.; LANGIS R.; TYSON H. y DHINDSA R.S cdna sequence, expression and transcriptibility of a cold-acclimation-specific gene, cas18, of alfalfa (Medicago fulcata)cells. Plant Physiol. 1101: WU Y.; KUZMA J.; MARECHAL E.; GRAEFF R.; LEE H.C.; FOSTER R. y CHUA N.H Abscisic acid signaling through cyclic ADP-ribose in plants. Science 278: XIONG L. Y ZHU J.K Abiotic stress signal transduction in plants: Molecular and genetic perspectives. Physiol. Plant. 112: XU G.W.; MAGILL C.W.; SCHERTZ K.F. y HART G.E A RFLP linkage map of Sorghum bicolor (L.). Theor. Appl. Genet. 89: YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. y SHINOZAKI K Characterization of the expression of a desiccationresponsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana (L.) and the analysis of its promoter in transgenic plants. Mol. Gen. Genet. 236: YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. y SHINOZAKI K A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene involved in responsiveness to drought, low temperature, or highsalt stress. Plant Cell 6: ZHU J.K Genetic analysis of plant salt tolerance using Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 124: ZHU J.K Salt and drought stress signal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 53: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 365

281

282 VIII.- Capítulo 13 Aproximación biotecnológica integrada para un manejo sustentable del estrés biótico en frutilla Castagnaro, Atilio Pedro; Salazar, Sergio Miguel; Zembo, Juan Carlos Díaz Ricci, Juan Carlos Introducción La frutilla cultivada (Fragaria x ananassa: 2n=8x=56) es un poliploide con 56 cromosomas resultante de la hibridación interespecífica entre dos especies de frutillas silvestres, también octoploides. Una de estas frutillas es originaria del sur (F. chiloensis: 2n=8x=56) y la otra del norte de América (F. virginiana: 2n=8x=56). La x en el nombre científico hace referencia a su condición de híbrido. Se trata de un importante fruto que se consume en fresco o industrializado y que es muy apreciado en prácticamente todo el mundo. Su cultivo involucra dos actividades agronómicas bien diferenciadas: la producción de frutas y la viverística, las cuales generan una gran demanda de mano de obra (alrededor de 500 jornales /Ha /año), por lo cual en muchos países es considerado también como un cultivo social. Si bien se realiza mejoramiento genético en distintos lugares de Asia, Europa y Norte América, el mercado de variedades está dominado por empresas estadounidenses. En Argentina, a partir de 1996 comenzó a funcionar, en forma organizada, el Programa Nacional de Mejoramiento Genético de la Frutilla (Pro\Frutilla) a través de una iniciativa interinstitucional (sectores público y privado) e interdisciplinaria (combina el mejoramiento genético convencional con los métodos surgidos de la biotecnología molecular), que en 1999 representó a nuestro país en la exposición «Flanders Technology International- Technoland», en Gante, Bélgica. El objetivo general del Pro\Frutilla es obtener cultivares argentinos adaptados a por lo menos dos agroecosistemas o ambientes de selección (el subtropical de Lules en Tucumán y el templado del cinturón hortícola del Gran La Plata, en Buenos Aires), con resistencia incrementada a estrés de origen biótico que permita evolucionar hacia una agronomía menos reñida con la salud humana y ambiental (principalmente sin bromuro de metilo) y para que empresas viveristas locales puedan aprovechar las ventajas comparativas de exportación de plantines de genética nacional en contraestación con los países del hemisferio norte. Reconocimientos En este capítulo se describen en forma resumida los trabajos realizados y los logros obtenidos con este programa donde, además de los autores, participaron los siguientes investigadores (en orden alfabético): Marta Arias, Elsa Camadro, Nadia Chalfoun, Paula Filippone, Gabriela García, Hugo Lázaro, Cecilia Lemme, Alicia Inés Mamaní, Gustavo Martínez Zamora, Luis Mroginski, Marta Ontivero, Graciela Terada, Ursula Tonello y Gabriel Vellicce. 1 Mejoramiento genético El Pro\Frutilla se basa en un esquema de selección recurrente (Fig. 1) delimitado por tres niveles de domesticación: 1) Poblaciones Comerciales, representadas en la Figura 1; 2) Poblaciones Intermedias o Tampones, donde se intenta llevar a cabo hibridaciones interespecíficas; 3) Poblaciones Silvestres, en las cuales se realizan cruzamientos dentro de cada especie y/o nivel de ploidía. En una primera etapa, se realizaron recolecciones y se estableció un Banco de Germoplasma activo, constituido por genotipos de especies silvestres (Fragaria vesca: 2n=2x=14; F. chiloensis: 2n=8x=56; Duchesnea indica: serie poliploide 2n=8x y 10x=56 y 70, respectivamente) y de la cultivada F. x ananassa. Estudiando caracteres citogenéticos, morfológicos y anatómicos pudo identificarse una nueva especie silvestre, Potentilla tucumanensis (2n=2x=14), que es endémica del Noroeste Argentino y se encuentra en peligro de extinción. Esta especie fue clasificada de manera errónea a principios del siglo XX como Potentilla Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 367

283 En la actualidad, se dispone de dos genotipos promisorios en etapas avanzadas de evaluación y selección clonal, llamados 96/ Figura1. Esquema de selección recurrente seguido en las poblaciones comerciales (mayor nivel de domesticación) norvegica, especie decaploide típica de los países nórdicos. Paralelamente a la caracterización botánica, en el marco de las mencionadas Poblaciones Intermedias (2) y siguiendo un esquema dialélico incompleto, se realizaron 500 cruzamientos interespecíficos entre accesiones silvestres de Fragaria vesca, Duchesnea indica, Potentilla tucumanensis y 9 genotipos de la cultivada F. x ananassa. Este estudio permitió detectar barreras pre y poscigóticas de aislamiento reproductivo entre estas especies. A fin de conocer la naturaleza de las barreras, se investigó el crecimiento del tubo polínico en el pistilo utilizando microscopia de fluorescencia (Fig. 2) y se realizaron estudios histológicos de aquenios. Este conocimiento permitirá diseñar estrategias que posibiliten la transferencia de genes de interés agronómico desde los genotipos silvestres a los domesticados. Figura 2. Compatibilidad del cruzamiento. Incompatible: el grano permanece sin germinar en el estigma (izda.). Compatible: varios granos de polen crecen a través del estilo (centro). Medianamente compatible: Sólo unos pocos granos de polen atraviesan el estilo (dcha.). 6-5 y 96/6-6, donde el número anterior a la barra, indica el año de cruzamiento (en este caso 1996), el que le sigue indica la familia o cruza, en este caso cv. Chandler x cv. Oso Grande) y el último número es arbitrario y responde a un ordenamiento interno del programa. 2 Cultivo in vitro de meristemas, micropropagación y evaluación de la variación somaclonal Debido a que el cultivo de meristemas posibilitaría sanear la mayor parte de las virosis, no se ha profundizado demasiado en el estudio y caracterización de los virus que afectan a la frutilla y desde un punto de vista agronómico estas enfermedades no están dentro de los principales problemas del cultivo. Este mismo razonamiento podría aplicarse para la enfermedad sistémica (bacteriosis) provocada por Xanthomonas fragariae. Se estudiaron las condiciones de cultivo in vitro para sanear y multiplicar diferentes genotipos de frutilla, entre ellos el cultivar Camarosa, que es la variedad más cultivada en el mundo. A su vez y mediante caracteri- 368 CASTAGNARO, A.P.; SALAZAR, S.M.;ZEMBO J.C.;DÍAZ RICCI, J.C.

284 zación fenotípica y marcadores genotípicos del tipo RAPD (del inglés Randomly Amplified Polymorphic DNA), se investigó la eventual inducción de variación somaclonal en ciclos sucesivos de multiplicación de este cultivar. La tasa de multiplicación de las plantas in vitro fue evaluada utilizando dos formulaciones salinas en el medio de cultivo (N 30 K y MS) y diferentes concentraciones de cinetina (0,25, 0,5 y 0,75 mg/l). La mejor tasa de multiplicación se obtuvo en el medio N 30 K suplementado con 0,25 mg/l de cinetina, sin que se detectara variación somaclonal después de tres ciclos sucesivos multiplicación. Este resultado nos permitió proponer por primera vez el uso de un procedimiento para el saneamiento y la micropropagación comercial de la variedad Camarosa. 3 Interacción planta-patógeno A diferencia de otros productos agroalimentarios, las hortalizas se consumen mayoritariamente en fresco, lo que implica que no pueden llevar residuos de pesticidas. Por otro lado, la práctica agronómica deberá evolucionar, indefectiblemente, hacia nuevos sistemas productivos que minimicen la utilización de agroquímicos sintéticos. El problema principal del cultivo de la frutilla son las enfermedades fúngicas. El manejo de estas enfermedades, donde una de las más importantes es la antracnosis (Colletotrichum sp.), involucra el uso masivo de pesticidas contaminantes como el bromuro de metilo, que además de ser tóxico destruye la capa de ozono, y cuya eliminación ya fue pautada desde Naciones Unidas. En este contexto el Pro\Frutilla está llevando a cabo una investigación básica que permita desarrollar estrategias de biocontrol. Para ello: 1) En primer lugar, se aislaron los agentes etiológicos locales de las enfermedades más importantes (especies pertenecientes a los géneros: Colletotrichum, Botrytis, Micophaerella, Xanthomonas, etc.) y se optimizaron metodologías de infección controlada que posibilitaron la evaluación fenotípica certera de la resistencia/ susceptibilidad de los materiales fitotécnicos del Banco de Germoplasma del Pro\Frutilla. Figura 3. La previa inoculación con un patógeno avirulento desencadena una respuesta defensiva de protección cruzada contra el patógeno virulento (izda.). Planta control infectada con un patógeno virulento (dcha.). 2) Se caracterizaron los hongos patógenos del género Colletotrichum relacionados con la enfermedad de la antracnosis. Esto permitió detectar una respuesta sistémica de protección cruzada desencadenada por un patógeno avirulento, que además puede ser inducida por el microorganismo (patógeno) inactivado y/o por extractos del mismo, lo que puede tener tanto implicancias conceptuales como biotecnológicas (Fig. 3). Los estudios histopatológicos Tabla1: ESPECIE EC 50 (um) Bacterias Gram positivas Clavibacter michiganensis 0.07 Staphylus aureus 0.14 Enterococcum faescium CRL Bacillus subtilis 0.25 Listeria monocytogenes 0.28 Gram negativas Xanthomonas fragariae 0.06 Xanthomonas axonopodis pv citri 0.07 Pseudomona auruginosa 0.12 Pseudomona siringae pv. gladiolii 0.27 Erwinia carotovora 0.95 Salmonella newport 3.25 E.coli D Hongos Colletotrichum fragariae 8.92 Colletotricum acutatum 7.91 Colletotrichum gloeosporioides 9.37 EC 50 = concentración efectiva para el 50 % de inhibición en plantas que manifiestan la respuesta de defensa revelaron la presencia de cristales no característicos de la especie F. x ananassa, un incremento en la síntesis de almidón (activi- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 369

285 dad metabólica), un mayor número de cloroplastos y un engrosamiento de las paredes celulares, lo que contribuye a aumentar el espesor de la semilámina. Por otra parte, se purificaron y caracterizaron compuestos antimicrobianos preformados (fitoanticipinas, para diferenciarlos de las fitoalexinas, cuya formación en la planta es inducida por un microorganismo) que fueron llamados Fragarinas. Uno de éstos, llamado Fragarina 1, cuando es aplicado en forma exógena, desencadena además una respuesta defensiva en la planta. Esto implicaría que más allá de su efecto como antibiótico (Tabla 1), que permeabiliza la membrana plasmática, estaría de alguna manera participando en la señalización de la respuesta de defensa. Actualmente, se analiza la potencialidad de extractos o compuestos de este tipo como principios activos en la formulación de agroquímicos naturales de bajo impacto ambiental. 4 Marcadores moleculares Aprovechando la versatilidad de la técnica de RAPD lo primero que se planteó fue investigar la similitud genética entre las especies silvestres relacionadas con la frutilla cultivada y se desarrollaron los primeros marcadores moleculares específicos de especie, que permitieran la detección de híbridos interespecíficos putativos. Del mismo modo, pero usando electroforesis en geles de poliacrilamida de alta resolución, se generaron 37 marcadores genotípicos actualmente disponibles para la identificación inequívoca de las 8 principales variedades de frutilla cultivadas en la Argentina. Utilizando esta aproximación pudieron diferenciarse tres accesiones distintas del cultivar Pájaro, que habían sido multiplicadas en forma independiente, confirmando la importancia del análisis del ADN para evitar errores en la identificación de cultivares (Fig. 4a). Sobre la base de la información obtenida en los experimentos donde se evaluó la resistencia/ susceptibilidad de los genotipos del Banco de Germoplasma frente a diversos patógenos fúngicos, se diseñaron cruzamientos para obtener poblaciones segregantes que posibilitaran investigar el control genético de la resistencia. Así, para la principal enfermedad del cultivo, la antracnosis, se propuso un modelo basado en una interacción gen a gen en un fondo genético octoploide, que asume que la resistencia está determinada por diferentes variantes alélicas de un gen R, donde la susceptibilidad es parcialmente dominante sobre la resistencia y la respuesta defensiva sería modulada por la dosis alélica y por otros genes que interactuarían epistáticamente con el gen R. Mediante BSA (del inglés Bulked Segregant Analysis) se detectaron marcadores AFLP (del inglés Amplification Fragment Length Polymorphisms) ligados a la resistencia que pueden contribuir a hacer más eficiente la selección en el Pro\Frutilla (Fig. 4b). 5 Transgénesis Figura 4. Marcadores moleculares. A. Perfiles diferenciales de RAPD indican diversidad genética entre distintas accesiones de un mismo cultivar de frutilla. B. Marcador AFLP asociado a la resistencia a C. acutatum, presente en Progenitor (PR) e híbridos resistentes (HR) y ausente en progenitor (PS) e híbridos susceptibles (HS). En virtud de las ventajas que ofrece la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens, preliminarmente se desarrolló un protocolo de regeneración de brotes a partir de discos de hojas, con el que se conseguía que el 70% de los explantos cultivados regeneraran plantas de frutilla. Este sistema de regeneración fue utilizado para optimizar una metodología de transformación con la cepa de Agrobac-terium tumefaciens LBA 4404, portadora del plásmido binario pbi121, 370 CASTAGNARO, A.P.; SALAZAR, S.M.;ZEMBO J.C.;DÍAZ RICCI, J.C.

286 Figura 5. Transgénesis: A, Construcciones génicas portadoras de genes que codifican proteínas antifúngicas (quitinasa, glucanasa y Ap24). B, Hojas desprendidas de frutilla no transgénica (izda.) y transgénica resistente a Botrytis (dcha.). lográndose una eficiencia del 6,6 plantas transgénicas por cada 100 discos de hojas infectados con la bacteria. Basados en este procedimiento, se obtuvieron 16 líneas transgénicas de frutilla cv Pájaro, que expresaban uno o una combinación de dos de los siguientes genes heterólogos (Fig. 5a) que codifican proteínas antifúngicas del grupo de las PR (proteínas relacionadas con la patogénesis vegetal): ch5b (codifica para una quitinasa de Phaseolus vulgaris), gln2 (codifica para una glucanasa de Nicotiana tabacum) y ap24 (codifica para una proteína del tipo de las taumatinas de Nicotiana tabacum). Solamente dos de estas líneas transgénicas, ambas portadoras de una copia simple del gen ch5b, mostraron resistencia incrementada a la enfermedad del moho gris (causada por Botrytis cinerea, de gran incidencia en agrosistemas subtropicales), aunque ninguna de las 16 evidenció cambios en su comportamiento frente a Colletotrichum acutatum, una de las especies más agresivas causante de la antracnosis. De este modo, queda demostrada la utilidad del gen ch5b para introducir resistencia a Botrytis en frutilla (Fig. 5b), un patógeno para el cual todavía no se han encontrado fuentes de resistencia genética en la especie F. x ananassa. 6 Caracterización molecular de genes de interés Actualmente se está aprovechando el conocimiento que se tiene, tanto de los materiales fitotécnicos como de los sistemas de compatibilidad, incompatibilidad y de protección cruzada caracterizados, para aislar genes implicados en los mecanismos defensivos, siguiendo al menos dos aproximaciones distintas: i) Mediante la técnica de visualización de la expresión diferencial de ARNms y la construcción (y posterior análisis) de genotecas de ADNc por hibridación sustractiva. ii) El clonado y caracterización de análogos de genes de resistencia (RGA). En el primer caso (i), se clonaron numerosos fragmentos de ADNc que codifican proteínas relacionadas con la defensa vegetal como quitinasas de tipo III o PR 8, proteínas quinasas con un dominio de unión a calcio, reguladores transcripcionales con dominios homeóticos, miembros de la familia de las enoil-coa-hidratasa /isomerasa, etc. De estos genes que están siendo analizados al momento de escribir este capítulo, se destaca uno que presenta una alta homología con una glutation S tranferasa (GST) de zapallo (Cucurbita maxima). Esta familia génica que actúa en la detoxificación de compuestos altamente oxidantes (especies reactivas de oxígeno) generados durante estrés tanto biótico como abiótico, en Arabidopsis presenta miembros que sólo se expresan en interacciones planta /patógeno de tipo incompatibles (cuando no se produce enfermedad). Respecto de la segunda aproximación (ii), se utilizaron oligonucleótidos cebadores degenerados diseñados a partir de secuencias conservadas de la región NBS (del inglés «Nucleotide Binding Site») de genes de resistencia (R) clonados de otras plantas, para amplificar por PCR, análogos de genes de resistencia en genotipos silvestres y cultivados de frutilla. Se identificaron al menos siete familias distintas de RGAs, de las cuales la mayoría pertenecía a genes R de tipo TIR (del inglés «Toll Interleukin Receptor»), similares a los ya caracterizados en Arabidopsis, tabaco y lino. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 371

287 7 Conclusiones En general, se podría decir que el caso del Pro\Frutilla es un claro ejemplo de complementación, interacción, integración y coordinación, entre el mejoramiento genético convencional y la biotecnología molecular, para buscar soluciones a problemas de estrés biótico asociados a un cultivo de interés comercial, en un marco de sustentabilidad y competitividad agronómica. 8 Lecturas Recomendadas ARIAS M, CAMADRO E, DÍAZ RICCI JC AND CASTAGNARO A. (2003). Breeding barriers between the cultivated strawberry, Fragaria x ananassa, and related wild germplasm. Euphytica 136: CASTAGNARO A, DIAZ RICCI J, ARIAS M AND ALBORNOZ P. (1998). A new Southern Hemisphere species of Potentilla (Rosaceae). Novon 8: LIANG P and PARDEE AB. (1992). Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of polymerase chain reaction. Science 257: MÓNACO ME, SALAZAR SM, APREA A, DÍAZ RICCI JC, ZEMBO JC and CASTAGNARO A. (2000). First Report of Colletotrichum gloeosporioides on Strawberry in Northwestern Argentina. Plant Disease 84(5) :559. ONTIVERO M, ARIAS M, DÍAZ RICCI J, BABOT J, and CASTAGNARO A. (2000). Analysis of genetic similarities among species of Fragaria, Potentilla and Duchesnea found in northwest of Argentina by using morphological, anatomical and molecular characters. Canadian Journal of Botany 78: RAMALLO JC, PLOPER LD, ONTIVERO M, FILIPPONE MP, CASTAGNARO A and DÍAZ RICCI J. (2000). First Report of Colletotrichum acutatum on Strawberry in Northwestern Argentina. Plant Disease 84(6): 706. VELLICCE G, COLL Y, CASTAGNARO A and DÍAZ RICCI J. (2003). Transformation of a strawberry cultivar using a modified regeneration medium. HortScience 38(2): DATTA SK and MUTHUKRISHNAN S. Eds. Pathogenesisrelated proteins in plants. CRC Press. 291pp. DIATCHENKO L, LAU YC, CAMPBELL AP, CHENCHIK A, MOQADAM F, HUANG B, LUKYANOV S, LUKYANOV K, GURSKAYA N, SVERDLOV ED and SIEBERT PD. (1996). Suppression Subtractive Hybridization: A Method for Generating Differentially Regulated or Tissue-Specific cdna Probes and Libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 93: DIXON DP, LAPTHORN A and EDWARDS R. (2002). Plant glutathione transferases. Genome Biology 3: reviews FILIPPONE MP, DIAZ RICCI JC, CASTAGNARO A and FARIAS RN. (2001). Effect of Fragarin on the Cytoplasmic Membrane of the Phythopathogen Clavibacter michiganensis. Molecular Plant-Microbe Interactions 14: FILIPPONE MP; DIAZ RICCI J; MAMANÍ DE MARCHESE A; FARÍAS RN and CASTAGNARO A. (1999). Isolation and purification of a 316 Da preformed compound from strawberry (Fragaria ananassa) leaves active against plant pathogens. FEBS Letters 459: GARCÍA MG, ONTIVERO M, DÍAZ RICCI JC and CASTAGNARO A. (2002). Morphological traits and high resolution RAPD markers for the identification of the main strawberry varieties cultivated in Argentina. Plant Breeding 121: LEISTER D, BALLVORA A, SALAMINI F, and GEBHARDT C (1996) A PCR-based approach for isolating pathogen resistance genes from potato with potential for wide application in plants. Nat. Genet. 14: CASTAGNARO, A.P.; SALAZAR, S.M.;ZEMBO J.C.;DÍAZ RICCI, J.C.

288 VIII.-Capítulo 2 Mejoramiento de Plantas Forrajeras en la Era Genómica Spangenberg, Germán 1 Introducción La agricultura de pastizales depende en gran medida de la disponibilidad de fuentes adecuadas de forraje como base primaria para la alimentación del ganado. En la mayoría de las regiones agrícolas del planeta la producción de forraje es un sistema de baja inversión donde el mejoramiento genético de plantas es la forma más económica de aportar tecnología de avanzada a los productores. El mejoramiento convencional se basa en el uso de la variación genética natural existente entre ecotipos o aquella creada a través de recombinación sexual. La biotecnología permite generar nueva variabilidad y utilizar de manera más eficiente la variabilidad genética existente. Esto incrementa la fuente de genes útiles para el desarrollo de nuevos cultivares, acelerando los programas de mejoramiento genético. En los últimos años se han desarrollado numerosas técnicas biotecnológicas y moleculares para el mejoramiento de gramíneas y leguminosas forrajeras (Spangenberg 1999; Forster et al. 2000). Entre estas técnicas cabe mencionar el establecimiento de sistemas eficientes de regeneración de plantas a partir de células competentes para la transformación genética, la combinación total o parcial de genomas por hibridación somática y cibridación a través de la fusión de protoplastos, la producción de plantas forrajeras transgénicas utilizando Agrobacterium y biolística, y el establecimiento de sistemas altamente informativos de marcadores moleculares codominantes para ser utilizados en el proceso de selección y en el desarrollo de mapas genéticos. En este capítulo se describen las aplicaciones actuales y futuras y el impacto de la biotecnología en el mejoramiento de especies forrajeras. 2 Transgénesis La tecnología génica y la obtención de plantas transgénicas brindan la posibilidad de generar variación genética cuando esta es inexistente o tiene una heredabilidad muy baja. En la actualidad se dispone de metodologías eficientes para la transformación de forrajeras, ya sean gramíneas o leguminosas (Fig. 1, ver pág.9), estando en la etapa de evaluación a campo las primeras plantas forrajeras transgénicas con caracteres simples modificados. Si bien algunos aspectos de la genética, fisiología y bioquímica de muchos procesos vegetales complejos no han sido aún completamente dilucidados -lo cual podría demorar algunas de las aplicaciones de la transgénesis en el mejoramiento vegetal- la tecnología génica es una poderosa herramienta para ampliar los conocimientos en genética molecular. En consecuencia, las aplicaciones de la transgénesis en el mejoramiento de especies forrajeras están orientadas hacia el desarrollo de eventos de transformación con variación genética única y a la disección genética de vías metabólicas y procesos de desarrollo relevantes para la producción de forrajes. Los mejores candidatos en cuanto a caracteres para la aplicación de transgénesis en plantas forrajeras son: calidad del forraje, resistencia a plagas y enfermedades, tolerancia a estreses abióticos y la manipulación del crecimiento y desarrollo. 2.1 Calidad del forraje El mejoramiento molecular basado en transgénesis para sortear limitaciones en la calidad del forraje está dirigido al tratamiento de los subcaracteres involucrados, a saber: digestibilidad de la materia seca, contenido de carbohidratos solubles, contenido de proteínas, metabolitos secundarios, alcaloides, etc. El enfoque molecular puede incluir la modificación del perfil de ligninas para mejorar la digestibilidad de la materia seca, la manipulación genética del contenido de fructanos para incrementar el contenido de carbohidratos no estructurales, de la síntesis de taninos condensados para desarrollar forrajeras libres de meteorismo y la expresión de proteínas resistentes al rumen («rumen by-pass») para mejorar el aporte de proteínas y aminoácidos esenciales. La mayoría de los parámetros de calidad están aso- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 267

289 ciados con vías metabólicas o con la producción de proteínas específicas. La tecnología génica permite identificar las proteínas involucradas y las enzimas clave a ser manipuladas, el aislamiento de los genes correspondientes y la manipulación de su expresión en plantas transgénicas Manipulación de la biosíntesis de lignina El principal objetivo tendiente mejorar el valor nutritivo de las gramíneas forrajeras para la industria lechera es el incremento de la digestibilidad de la materia seca, la cual declina marcadamente (> 10%) a medida que estas crecen y maduran, reduciendo el valor nutritivo del forraje. Dado que la heredabilidad de este caracter es baja y el mismo está controlado por un gran número de genes, el potencial para un mejoramiento rápido por métodos tradicionales es reducido. Se calcula que pequeños incrementos en la digestibilidad tendrán un efecto significativo en la calidad del forraje y concomitantemente, en la producción animal. Incrementos del 1% en la digestibilidad de la materia seca in vitro conducen a incrementos promedio del 3,2% en ganancia media de peso vivo. El principal factor involucrado en la disminución de la digestibilidad de los tejidos a medida que maduran es la lignificación de las paredes celulares. Los efectos negativos de la lignina sobre la digestibilidad dependen de su contenido, composición de monómeros y grupos funcionales y del grado de entrecruzamiento con los polisacáridos de la pared celular. La lignificación es un proceso altamente coordinado y regulado por un conjunto de eventos metabólicos que resultan en la biosíntesis de precursores de la lignina (monolignoles). Una de las estrategias exploradas para mejorar la digestibilidad de la lignina es la regulación negativa, en sentido o anti-sentido, de las enzimas involucradas en la biosíntesis de monolignoles en plantas transgénicas. Las principales enzimas blanco para la aplicación de esta tecnología son la O-metiltransferasa del ácido cafeico (COMT), la 4-cumarato: CoA ligasa (4CL), cinamoil CoA reductasa (CCR) y cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD)(Fig. 2 A). Las investigaciones realizadas utilizando plantas modelo como tabaco y álamo demostraron que la regulación negativa de la expresión de COMT, CAD y 4CL conduce a una alteración en la composición de la lignina o a una disminución de su contenido con incrementos significativos en la digestibilidad de la materia seca. En algunos de estos casos la lignina resultó más fácil de extraer químicamente, en otros esta tecnología trajo aparejadas alteraciones en el desarrollo de la planta, como reducido tamaño y colapso de las células del xilema. No obstante ello, estos resultados indican que la introducción de genes de esta vía metabólica en sentido o antisentido permite mejorar la digestibilidad de la materia seca sin alterar el desarrollo normal de la planta. Los efectos observados en plantas con regulación negativa de alguna de estas enzimas son similares a aquellos encontrados en la naturaleza en un tipo particular de mutantes de maíz llamados «brown midrib» (bmr), cuyos genes codifican para enzimas menos activas. El enfoque transgénico brinda la posibilidad de obtener plantas con ligninas diferentes, logrando una mayor variedad de fenotipos que la existente en la naturaleza, a través de la regulación negativa de varias enzimas y a la utilización de promotores específicos. Estudios tendientes a mejorar la calidad del forraje por esta tecnología están siendo explorados en leguminosas como Stylosanthes humilis y Medicago sativa y gramíneas como Lolium perenne y Festuca arundinacea. Se cuenta con los genes (ADNc y clones genómicos) que codifican para COMT, 4CL, CCR y CAD de L. perenne. Estos han sido aislados, secuenciados, caracterizados y utilizados para la disección genética de esta vía biosintética en gramíneas (Fig.2 A). Los genes correspondientes han sido mapeados en raigrás perenne (Fig. 2 B). A fin de producir cultivares con mayor digestibilidad, aptos para el mercado, es necesario contar con varios eventos de transformación con regulación negativa para enzimas individuales o múltiples enzimas involucradas en el metabolismo de los monolignoles, realizar ensayos a campo de estas plantas, evaluando particularmente el 268 SPANGENBERG, Germán

290 vigor, la tolerancia a estreses y por último llevar a cabo la hibridación y selección para obtener germoplasma elite Manipulación del metabolismo de fructanos PAL ácido cinámico TAL ácido L-tirosina p-cumárico PAL LG2 LpCAD2.2 LpCAD1 C4H nuciones en la digestibilidad durante el verano, debido a que estos carbohidratos parecen contrarrestar las disminuciones en digestibilidad debidas a lignificación, favoreciendo además la asimilación del forraje y de proteínas en el rumen y, concomitantemen-te, conduciendo a incrementos en el peso vivo. La síntesis de fructosa en gramíneas involucra la acción concertada de al menos tres enzimas: sacarosa:sacarosa 1- fructosil-transferasa (1-SST), fructano: fructano 1-fructosiltransferasa (1-FFT) y sacarosa: fructano 6- fructosiltransferasa (6-SFT) que sintetizan la mezcla más compleja de fructa-nos ligados que se encuentra en pastos y cereales. Varios de los genes involucrados en esta vía metabólica han sido aislados y caracterizados, como el 6-SFT de cebada, el 6G-FFT de cebolla y el 1-SST de alcaucil. Su introducción en plantas desprovistas de fruc- L-fenilalanine p-cumaroil- CoA C3H p-cumaraldehído ácido cafeico cafeoil- CoA OMT ácido F5H ferúlico feruloil- CoA alcohol p-cumarílico alcohol coniferílico Alcohol sinapílicol (H) (G) (S) Figura 2: A) Disección de la vía metabólica de la biosíntesis de monolignoles. Las enzimas son: PAL = fenilalanina amonio liasa, C4H = 4-cumarato-3-hidroxilasa, COMT = O-metil transferasa del ácido cafeico, F5H = ferulato-5-hidroxilasa, 4CL = hidroxicinamato:coa ligasa, CC3H = cumaroil CoA hidroxilasa, CCOMT = Cafeoil CoA 3- O-metil transferasa, CCR = cinamoil CoA reductasa, CAD = cinamil alcohol deshidrogenasa. Las flechas punteadas indican reacciones que no han sido experimentalmente verificadas. B) Mapeo de los genes correspondientes a la vía en los grupos de ligamento LG2 y LG7 de raigrás perenne. 5-hidroxi- Á ácido ferúlico coniferaldehyde 5-hidroxiconiferaldehído OMT ácido sinápico 4CL 4CL 4CL 4CL 4CL CCoA-3H CCoA-OMT 5-hydroxyferuloyl-CoA sinapoil- CoA CCR CCR CCR CCR sinapaldehído CAD CAD CAD e41t50240, Xcdo1417 Xbcd1823 e33t62340 Xbcd135, Xc600.1 e33t62620 Xpsr540.1 e40t50334 e40t49173, Xcdo36 Xpsr546 Xpsr1316 Xc472 Xr738 Xc556, Xc498, Xpsr10 (Gli-2) Xc847? LAC PER LIGNINA LpCAD2.1 LpOMT1 LpCCR1 LG7 CCoA-OMT Xc30.1, Xbcd147 e41t50144 e33t50120 Xpsr154, Xpsr690 e33t62760 e38t50244 e41t cm A B Los fructanos son moléculas de polifructosa producidas por varias especies de gramíneas para las cuales constituyen la principal forma de almacenamiento de carbohidratos solubles. Observaciones realizadas en líneas de raigrás que almacenan concentraciones elevadas de carbohidratos solubles indicaron que estas no sufren dismi- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 269

291 tanos nativos conduce a la acumulación de oligofructanos, y en plantas que los producen, a la acumulación de nuevas variedades de los mismos. La introducción de un gen microbiano para la fructosiltransferasa (gen SacB) de Bacilus subtilis en plantas de tabaco y papa que carecen de fructanos y acumulan almidón condujo a la acumulación de cantidades considerables de fructanos de elevado peso molecular, del tipo de los levanos, que les confierieron un mejor rendimiento en situaciones de estrés. Esto demuestra que la sacarosa, el sustrato para la fructosiltransferasa, puede ser redireccionada en especies que no acumulan fructanos. La manipulación de la biosíntesis de fructanos en plantas transgénicas para mejorar la calidad del forraje y la tolerancia a estreses abióticos está siendo explorada en leguminosas como Trifolium repens y Medicago sativa y gramíneas como Lolium perenne y Festuca arundinacea. En trabajos previos se obtuvieron plantas de L. multiflorum con alteraciones en el metabolismo de fructanos por la introducción de genes quiméricos de levansucrasa bacteriana. Actualmente se dispone de ADNc de genes de homólogos de la fructosiltransferasa de raigrás perenne. Estos han sido aislados, caracterizados y utilizados para la disección genética de la biosíntesis de fructanos en gramíneas transgénicas. También se han aislado y caracterizado otros genes de la vía que han sido introducidos y expresados en leguminosas y gramíneas. La disección molecular de la biosíntesis de fructanos en forrajeras clave incrementará nuestro conocimiento del metabolismo de los fructanos y de la distribución de los carbohidratos en gramíneas, aportando información acerca de su rol funcional en la tolerancia al frío y la sequía. Este conocimiento es clave para el diseño de experimentos tendientes a la obtención de plantas transgénicas con mejor calidad de forraje y tolerancia a estreses abióticos Expresión transgénica de proteínas rumen by-pass Los aminoácidos azufrados metionina y cisteína son los más limitantes en la nutrición animal. Estos influyen en el crecimiento de la lana de las ovejas y su aporte es reducido en condiciones naturales de pastoreo. A esto se suma el problema de la fermentación en el rumen, ya que la microflora degrada las proteínas y en algunas circunstancias resintetiza proteínas de menor valor nutritivo. Los suplementos postruminales de metionina y cisteína resultan en incrementos del 16 al 130% en la tasa de crecimiento de la lana. Estos efectos positivos también se han observado en bovinos, donde han redundado en una mayor producción de leche y una mayor tasa de crecimiento en animales para carne. Por lo tanto la ingestión de forrajeras que contengan proteínas ricas en aminoácidos azufrados, relativamente estables en el rumen, incrementará el aporte de aminoácidos esenciales para la nutrición de los rumiantes, conduciendo a una mayor producción animal, particularmente en lo que a lana se refiere. Se ha informado la obtención de plantas forrajeras transgénicas que expresan genes que codifican para diferentes proteínas ricas en aminoácidos azufrados, resistentes a la acción del rumen, como la ovoalbúmina de gallina y la albúmina de arveja y de semilla de girasol. Como ejemplo puede citarse el caso de plantas transgénicas de Festuca arundinacea (Festuca alta) que expresan genes quiméricos constituídos por secuencias de ADNc de la albúmina de girasol (SFA8) con la señal KDEL del retículo endoplásmico bajo el control de diferentes promotores. Estas plantas expresan el transcripto esperado y acumulan la proteína SFA8 a niveles superiores al 0,2% del total de proteína soluble. Desde el punto de vista nutricional los valores obtenidos aún están lejos del óptimo, que deberá ser del 2 al 5 % del total de proteína soluble. Es crucial, por lo tanto, desarrollar estrategias que permitan alcanzar estos niveles a fin de explotar el máximo potencial de la técnica Manipulación de la biosíntesis de taninos condensados Los taninos condensados (proantocianas) son compuestos poliméricos derivados del metabolismo fenilpropanoide, sintetizados por la vía metabólica de los flavonoides. Desde el punto de vista agronómico son importantes en las leguminosas forrajeras donde pueden considerarse beneficiosos o per- 270 SPANGENBERG, Germán

292 judiciales de acuerdo a los niveles encontrados en la planta. Niveles de taninos condensados superiores al 4-5% del peso seco son perjudiciales, actuando como factores antinutritivos y generando rechazo por parte del animal. En cantidades moderadas (1-3%) mejoran la calidad del forraje, ya que reducen el meteorismo («empaste») por disrupción de la espuma causada por las proteínas en el rumen, disminuyen la pérdida de proteínas debidas a desaminación microbiana y reduciendo la carga de parásitos en el animal. Las estrategias moleculares utilizadas para la manipulación de la biosíntesis de taninos se han orientado hacia la introducción de taninos condensados en alfalfa y trébol blanco y a su reducción en leguminosas que tienen altos contenidos (ver Morris y Robbins 1997 y Gruber et al., 2000). Estas se basan en la disponibilidad de genes involucrados en la biosíntesis de antocianas, que afectan las etapas comunes en la biosíntesis de flavonoides y la suposición de que estos funcionarán en la biosíntesis de taninos. El estudio de mutantes de la vía metabólica de los flavonoides en Arabidopsis ha proporcionado abundante información acerca de la identidad de las enzimas involucradas en la síntesis de taninos en esta especie. Esto permitió el clonado, entre otros, de los genes CHS, CHI, F3H y DFR. Se identificó y clonó también el gen BAN (BANYULS), que parece ser específico de la vía de biosíntesis de los taninos. Se ha intentado la regulación negativa o positiva de enzimas clave en la biosíntesis, como es el caso de chalcona sintetasa (CHS) y leucoantocianina-4 reductasa (LAR) respectivamente, o la activación de la ruta biosintética mediante la expresión de genes reguladores apropiados que gobiernen la vía a través de un accionar pleiotrópico (con efectos a varios niveles fenotípicos). El análisis de los promotores de algunos genes estructurales de esta vía demostró la presencia de motivos de secuencia específicos para la interacción con factores de transcripción de tipo MYB, bzip y bhlh. Un ejemplo de esto lo constituye la transformación de plantas de Lotus corniculatus con el gen regulatorio Sn de maíz, que resultó en una disminución del contenido de taninos en hojas, conjuntamente con un aumento del nivel de los mismos en raíz. El pastoreo directo de alfalfa presenta el riego de causar meteorismo en los rumiantes que la consumen debido a la ausencia de taninos condensados en hojas y tallos. Sin embargo, la presencia de estos flavonoides en las semillas demuestra que esta especie contiene todos los genes necesarios para la síntesis de taninos condensados. La identificación y aislamiento de los genes involucrados en la biosíntesis de taninos en semillas de alfalfa permitirían manipular su expresión en hojas. Candidatos adecuados podrían ser los genes de leucoantocianina-4 reductasa (LAR) y de CHS. 2.2 Resistencia a plagas y enfermedades Los patógenos y las plagas pueden disminuir considerablemente la producción, la persistencia, el valor nutritivo y la palatabilidad de las plantas forrajeras. En los últimos diez años se han desarrollado varias estrategias para manipular la resistencia a los mismos. Estas incluyen la expresión de quitinasas, glucanasas, defensinas, fitoalexinas, proteínas inactivadoras del ribosoma, proteínas de la cápside viral, replicasa viral, proteína del movimiento viral, toxinas Bt, inhibidores de proteasas e inhibidores de α-amilasa Transgénesis para incrementar la resistencia a enfermedades fúngicas El ataque de hongos a las hojas y sistemas radicales de las plantas provocan daños que resultan en un pobre establecimiento, disminución en el rendimiento y calidad y una limitada persistencia. La expresión constitutiva en plantas transgénicas -específica de órgano o inducida por el patógeno- de genes que codifican para proteínas antifúngicas (AFPs), puede conferir nuevas formas de resistencia a enfermedades fúngicas. Estas estrategias, utilizando genes que actúan individual o concertadamente, se han intentado principalmente en leguminosas, como alfalfa y trébol blanco. Como ejemplo puede citarse la obtención de plantas de alfalfa que expresan una quitinasa I de arroz, que podría hacerlas resistentes al ataque de Rhizoctonia solani y Sclerotium rolfsii. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 271

293 Hongos como Phytophthora clandestina, Kabatiella caulivora, Rhizoctonia solani y Fusarium spp., que atacan a varias especies de tréboles, donde no existen fuentes de resistencia natural, provocan cuantiosas pérdidas económicas en Australia. Se han identificado cuatro proteínas antifúngicas diferentes que en ensayos in vitro demostraron ser efectivas contra estos patógenos y se han utilizado los correspondientes genes quiméricos que las expresan para producir plantas fenotípicamente normales de trébol subterráneo. Mientras se trata de determinar la resistencia lograda utilizando estos genes AFPs de manera individual también se intenta «piramidizar» diferentes transgenes a fin de brindar una mayor protección contra un amplio espectro de hongos patógenos Transgénesis para incrementar la resistencia a enfermedades virales Virus tales como el del mosaico de la alfalfa (alfamovirus,amv), el del mosaico del trébol blanco (potexvirus,wcmv) y el del amarillamiento de las nervaduras (potyvirus,cyvv) afectan negativamente el crecimiento y desarrollo de las leguminosas. Cada uno de ellos infecta individualmente a un gran número de especies distribuidas por todo el mundo, causando pérdidas significativas en leguminosas utilizadas para distintos fines. El control de estos tres virus podría incrementar la rentabilidad de las industrias rurales australianas en más de 860 millones de dólares. La mayoría de los métodos clásicos utilizados para prevenir las infecciones virales son laboriosos y económicamente inviables. Se han identificado fuentes potenciales de tolerancia o resistencia en alfalfa y en unas pocas especies de Trifolium, pero no existe una resistencia natural a estos virus que sea transferible, efectiva y durable que pueda ser incorporada a cultivares de leguminosas forrajeras. La tecnología génica es una opción atractiva para lograr este objetivo, ya que permite sortear barreras interespecíficas, desarrollar resistencias multigénicas y manipular niveles y sitios de expresión. La transgénesis se ha usado exitosamente para desarrollar resistencia efectiva y durable en un amplio rango de especies vegetales. En este sentido se han utilizado resistencias derivadas de distintos patógenos para la obtención de leguminosas transgénicas con resistencia a AMV, WCMV y CYVV. La estrategia utilizada fue la de expresión de proteínas de la cápside viral u otras propias del patógeno como versiones mutadas de distintas proteínas. (ver VIII.4). En las gramíneas forrajeras dos virus que se encuentran con frecuencia son el del enanismo y amarillamiento de la cebada (BIDV) y el del mosaico del raigrás (RMV). Estos provocan disminuciones en el rendimiento del raigrás de hasta un 24% (BIDV) y de un 5 al 50% (RMV). La infección con RMV también reduce la competitividad del raigrás perenne como resultado de un mal establecimiento y una reducida persistencia Transgénesis para incrementar la resistencia a plagas Las plagas pueden dañar a las plantas directamente, por consumo del follaje y raíces o indirectamente, por transmisión de patógenos a estas durante su accionar sobre la planta. En pasturas infectadas por densas poblaciones de insectos plaga se producen disminuciones en la producción de materia seca que van del 20 al 40%. Varios insectos como Wiseana spp, Costelytra zealandica, Teleogryllus commodus, Sminthurus viridis, Sitona spp, Coleophora spp, Inopus rubriceps y Acyrthosiphon spp pueden causar daños significativos a leguminosas y gramíneas. A fin de incrementar la resistencia a los mismos se han utilizado distintos enfoques transgénicos. Uno de ellos es la utilización de la proteína cristalina e inhibidores de proteasas de Bacillus thuringiensis (Bt). Para una revisión del tema pueden consultarse a Voisey et al. (1994), Strizhov et al. (1996) y Voisey et al. (2000). Como ejemplo cabe citar la obtención de plantas de trébol blanco que expresan un gen quimérico Bt cry1ba modificado y acumulan en las hojas la delta-endotoxina Cry1Ba a niveles del 0,1% de proteína soluble. La alimentación de larvas de Wiseana con hojas de estas plantas promueve una inhibición en la ingesta, reducción en el crecimien- 272 SPANGENBERG, Germán

294 to de la larva y una mayor mortalidad de estas cuando se la compara en la misma situación utilizando plantas control. Otro ejemplo lo constituye la utilización de inhibidores de proteasas, tales como el inhibidor de tripsina pancreática bovina o aprotinina en trébol blanco, donde la expresión en hoja de aprotinina a niveles de 0,07% de proteína soluble reduce el ataque por las larvas de Wiseana. Otra estrategia para proteger contra insectos plaga sería la transformación indirecta en gramíneas, utilizando un endófito (microorganismo que vive y se desarrolla dentro de los tejidos de la planta) transformado, como Neotyphodium. Esto permitiría obtener cepas del endófito seguras para los rumiantes que las consuman, que expresen y secreten proteínas insecticidas tales como toxinas Bt e inhibidores de proteasas que protejan a las gramíneas forrajeras de las plagas. 2.3 Crecimiento y desarrollo Manipulación de alérgenos del polen La fiebre del heno y el asma alérgico estacional debido al polen de las gramíneas son enfermedades ambientales que afectan hasta el 25% de la población en climas templado-fríos. El polen de raigrás es uno de los más abundantes en estas regiones, siendo el principal alérgeno para el 49-67% de los pacientes alérgicos. Este polen contiene por lo menos 4 clases principales de proteínas alergénicas, cada una de las cuales está constituída por múltiples isoformas inmunológicamente indistinguibles que involucran 17 alérgenos que tienen un tamaño que va de 12 a 89 kda. Al menos una proteína de cada una de estas clases ha sido aislada y caracterizada en detalle. Se han aislado clones de ADNc para el principal alérgeno del raigras Lolp1, Lolp2 y Lolp5. En 1997 se obtuvieron las primeras plantas transgénicas de raigrás perenne (Lolium perenne) y de raigrás Italiano (Lolium multiflorum) que llevan genes para Lolp1 y Lolp2 en antisentido, bajo el control de un promotor específico del polen a fin de regular negativamente los alérgenos del mismo. Estas plantas permitirán estudiar el rol funcional in planta de estos alérgenos y permitirán explorar el potencial para la obtención de cultivares de raigrás hipoalergénico. Más recientemente se obtuvieron plantas de raigrás anual (Lolium rigidum) que portan en antisentido un gen quimérico Lolp Manipulación de cambio de fase y floración La disminución del valor nutritivo en algunas forrajeras perennes se encuentra asociada con el comienzo del crecimiento de las cañas florales, la floración y la senescencia. La calidad del forraje podría mejorarse, por lo tanto, inhibiendo la producción de cañas florales, que son poco digeribles, o retardando la senescencia. Se han informado modificaciones en el tiempo de floración en plantas transgénicas a través de la regulación de la expresión de genes involucrados en la iniciación del meristema floral. La expresión constitutiva de genes de Arabidopsis thaliana como LEAFY o APETALA1 conducen a un desarrollo precoz, como se ha observado en plantas transgénicas de álamo. En A. thaliana, mutaciones en uno o más de los genes involucrados en la determinación de identidad del meristema floral conducen a un desarrollo floral incompleto o nulo. Esto ha llevado a pensar en la posibilidad de controlar o inhibir la floración en forrajeras transgénicas regulando negativamente la expresión de este tipo de genes, tales como los ortólogos (genes que tienen la misma estructura y función y un origen común) de LEAFY o APETALA1. Otro blanco para la manipulación del desarrollo reproductivo en forrajeras es el gen INDETERMINATE1 (ID1). Este gen desempeña un rol importante en el control de la iniciación floral y en el mantenimiento de un estado floral determinado en maíz. Su mutación es la única conocida en monocotiledóneas que bloquea específica y severamente la transición hacia un crecimiento reproductivo. Recientemente fue aislado y caracterizado un ADNc de plantas de raigrás perenne homólogo de este gen. Se espera que la inhibición de la transición de un estado vegetativo a la formación de cañas florales e inflorescencias en gramíneas incremente la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 273

295 calidad del forraje y, en consecuencia también disminuya la cantidad de alergenos del polen. La inhibición o el control de la floración en forrajeras transgénicas a través de la supresión antisentido de ortólogos de ID1 o LEAFY y APETALA1 podría conducir a incrementos en la calidad y a una mejora en los patrones de crecimiento estacional. Por otro lado, representaría una vía para la contención de transgenes. Para la producción de semilla este bloqueo de la floración debería ser revertido. Una posibilidad para lograr este fin sería la utilización de un promotor inducible por cobre, por ejemplo, que controlara la supresión de ortólogos de estos genes. Se han utilizado diferentes enfoques para la manipulación del desarrollo reproductivo que podrían conducir a un bloqueo de la floración, al desarrollo de la apomixis (tipo de reproducción agámica común en ciertas especies de gramíneas, ver VIII.3) y a la androesterilidad (esterilidad de la parte masculina de la planta), que además posibilitarían el mantenimiento de los transgenes. Esto es de particular importancia para forrajeras transgénicas de polinización abierta, mediada por el viento, ya que la dispersión del polen es un factor importante en la evaluación de riesgo de las gramíneas genéticamente modificadas Manipulación de la senescencia Se ha observado en plantas transgénicas que la producción autorregulada de citocininas conduce a la inhibición de la senescencia foliar (envejecimiento de la hoja que culmina en la muerte de la misma). Este sistema se basa en la utilización de un promotor específico de senescencia de A. thaliana, el SAG12, que controla la expresión transgénica de un gen para la isopentenil transferasa (ipt) de Agrobacterium tumefaciens, que cataliza un paso en la biosíntesis de citocininas. Las plantas que expresan este gen presentan un retraso en la senescencia foliar y no presentan anomalías de ningún tipo. En trébol blanco genes análogos de ipt quiméricos, bajo el control de promotores regulados por desarrollo, asociados a senescencia, provocan un retardo significativos en la senescencia y su aspecto es completamente normal. 2.4 Agricultura molecular Las plantas transgénicas pueden ser utilizadas para expresar proteínas recombinantes heterólogas, siendo esta una alternativa atractiva para la producción de biomoléculas en reemplazo de los sistemas microbianos. La perennidad, la producción potencial de biomasa, la capacidad de fijar el nitrógeno biológico y la habilidad para crecer en áreas marginales que poseen las forrajeras, en particular las leguminosas, las hace atractivas para este fin. La disponibilidad de tecnologías que permitan elevados niveles de expresión y contención de los transgenes permitirían utilizar a las forrajeras como biorreactores para la obtención de enzimas industriales, productos farmacéuticos, vacunas, anticuerpos y plásticos biodegradables. La alfalfa tiene ciertas características que la convierten en un interesante biorreactor. Entre ellas se destacan la perennidad y la capacidad de producir dos ó tres cosechas en el año, existiendo además la tecnología adecuada para extraer las proteínas de interés dejando un residuo utilizable para la alimentación del ganado. Se han desarrollado y evaluado plantas de alfalfa transgénicas productoras de enzimas microbianas involucradas en la degradación industrial de lignina y celulosa, entre otros. Este cultivo también ha sido utilizado para la producción de polímeros biodegradables como el polihidroxibutirato (PHB) mediante la introducción de tres genes de Ralstonia eutropha. 2.5 Evaluación a campo de plantas forrajeras transgénicas A fin de determinar la estabilidad en la expresión de los transgenes, evaluar los nuevos fenotipos e identificar los eventos de transformación adecuados para el desarrollo de germoplasma y cultivares transgénicos es necesario realizar ensayos de campo planificados, en principio en pequeña escala. Solo después de haber realizado estas evaluaciones se pueden integrar estos materiales en programas de mejoramiento molecular para el desarrollo de cultivares 274 SPANGENBERG, Germán

296 transgénicos. Un ejemplo ilustrativo de un diseño para ensayos de campo en escala reducida es el de plantas transgénicas de trébol blanco inmunes al virus del mosaico de la alfalfa. En este ensayo se tuvieron en cuenta importantes características de bioseguridad, como por ejemplo la presencia de una zona de dos hectáreas sembradas con leguminosas forrajeras que se sabe que no se cruzan con el trébol blanco. El uso de leguminosas forrajeras como el trébol rojo, trébol de Persia y alfalfa en esta zona «buffer», sembradas en bandas alternadas, asegura que haya un elevado número de leguminosas no transgénicas floreciendo en el ensayo en el período crítico en que están floreciendo las plantas transgénicas motivo del experimento. Las dimensiones de esta zona «buffer» Figura 1: Transformación de trébol blanco para resistencia virus. A-H) Sistema prolífico de regeneración de plantas resistentes al virus del mosaico de la alfalfa (AMV) y al virus del mosaico del trébol blanco (WCMV) a partir de explantos cotiledonales. La transformación se llevó a cabo utilizando Agrobacterium tumefaciens, utilizando npt2 como marcador de selección. I) T-ADN del vector binario conteniendo el gen quimérico npt2 y el gen de la proteína de la cápside del wcmv 4 (wcmv 4 ) J) Análisis por PCR para la identificación preliminar de las plantas transformadas utilizando cebadores (primers) para el gen npt2. K) Idem anterior pero utilizando cebadores para el gen wcmv. L) Análisis por el método de Southern utilizando el gen wcmv 4 como sonda. M) Análisis por el método de Northern de plantas transgénicas de trébol blanco expresando el gen quimérico wcmv 4. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 275

297 Figura 3: A) Esquema de la liberación a campo, a pequeña escala, de plantas transgénicas de trébol blanco inmunes a AMV. B) Estrategia para el desarrollo de germoplasma elite transgénico de trébol blanco inmune a AMV, basada en la utilización de PCR cuantitativa para detectar las plantas homocigotas para los transgenes (npt2 y AMV4). fueron diseñadas teniendo en cuenta consideraciones tales como la conducta de las abejas como polinizadoras del trébol blanco, la dispersión del polen, y determinaciones de flujo génico utilizando un gen marcador de fácil trazabilidad, denominado Feathermark. A fin de determinar el flujo génico, dos hileras de trébol blanco no transgénico se incluyeron en el diseño rodeando el perímetro del ensayo y las parcelas centrales con las plantas transgénicas. Las semi- llas cosechadas de las plantas de trébol blanco no transgénico de estas dos hileras se analizaron utilizando una combinación de resistencia a antibiótico (resistencia a G418 mediada por un gen npt2 ubicado en el ADN- T integrado en el genoma de las plantas transgénicas) y PCR para detectar la presencia del gen marcador de selección. Los resultados de este análisis confirmaron que este diseño de campo es adecuado para la evaluación de plantas transgénicas (Fig. 3 A). 276 SPANGENBERG, Germán

298 2.6 Integración de plantas forrajeras transgénicas en programas de mejoramiento y desarrollo de cultivares transgénicos Los ejemplos citados más arriba acerca del desarrollo de una serie de eventos de transformación en leguminosas y gramíneas forrajeras constituyen una prueba fehaciente de la funcionalidad de esta tecnología. El desafío actual es utilizar esta tecnología y las herramientas moleculares actuales para transferir genes valiosos de manera múltiple o individual a fin de obtener nueva variabilidad genética y nuevo germoplasma transgénico élite e incorporar eficientemente estos factores en programas de mejoramiento para la obtención de cultivares. Se han desarrollado estrategias eficientes para la introgresión de transgenes en parentales élite para la obtención subsecuente de cultivares sintéticos (polihíbridos), asegurando la expresión estable y uniforme del transgén en todas las plantas de la población (Fig. 3B). En la Fig. 3B se muestra la estrategia utilizada para la obtención de plantas de trébol blanco elite inmunes a AMV, homocigotas para los transgenes. Involucra cruzas iniciales de los eventos de transformación elegidos luego de su evaluación a campo con plantas elite no transgénicas (Estadío 1); selección por resistencia a antibiótico de la progenie que lleva el transgen y está ligado al gen marcador npt2, o análisis por PCR, seguido por cruzas dialélicas entre la progenie T 1 (Estadío 2). Identificación por PCR cuantitativa o cruza de prueba de las plantas T 2 que son homocigotas para los transgenes (Estadío 3). Las plantas élite de trébol blanco homocigóticas para los transgenes son entonces sembradas para su selección en un criadero junto con líneas parentales élite no transgénicas. De esta manera se identificarán los nuevos parentales de los cultivares sintéticos transgénicos experimentales, que posteriormente serán evaluados en distintos ambientes. 3 Genómica El mejoramiento de la plantas forrajeras ha entrado en la era genómica, lo cual significa que se cuenta con gran cantidad de nuevas herramientas y tecnologías para el descubrimiento de genes y para el análisis global de los genomas. Todo esto aportará información acerca de todos los aspectos del crecimiento vegetal, desarrollo, diferenciación y respuestas a estreses bióticos y abióticos, revolucionando el mejoramiento vegetal y la producción. Cientos de miles de etiquetas de secuencias expresadas (ESTs) han sido el punto de partida para dilucidar la función de miles de genes vegetales y se han creado bases de datos de las mismas provenientes de los principales cultivos. Esto posibilitará la identificación, caracterización funcional y uso de genes valiosos para los sistemas de producción de forraje. 3.1 Descubrimiento de genes y micromatrices (microarrays) para el análisis de la expresión de genes en plantas forrajeras Las especies modelo para las cuales se han encarado proyectos de genómica basados fundamentalmente en el descubrimiento de ESTs son Lotus japonicus y Medicago truncatula. Aproximadamente ESTs de la última han sido generados por consorcios internacionales financiados por el French Centre National de Sequencage, la International Human Frontier Science Program Organization, la Samuel Roberts Noble Foundation, Stanford University, el US National Science Foundation Plant Genome Program y el US Deparment of Energy Biosciences Program. Un programa asociado entre Agriculture Victoria-DNRE (Australia) y AgResearch Limited (Nueva Zelanda) generó aproximadamente ESTs de cultivos forrajeros clave para la agricultura de clima templado, como son el raigrás perenne (L. perenne) y el trébol blanco (T. repens). Para ello se secuenciaron a gran escala clones seleccionados al azar de genotecas de ADNc que representaban un amplio rango de órganos, estados de desarrollo y tratamientos experimentales. Fueron generadas, secuencias de ADN de raigrás perenne, analizadas por búsqueda de BLAST (Ver VII-3) y categorizadas funcionalmente. Dentro de este programa se realizaron micromatrices de ADNc de alta densidad (con gotas/arreglo) para su utilización en la identificación de secuencias de tréboles y raigrases (Fig. 4, ver pág. 13). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 277

299 Dentro de las aplicaciones de estos micromatrices basados en ESTs de plantas forrajeras se encuentra la fenotipificación molecular. Esto comprende el análisis de patrones de expresión global o patrones de expresión específicos utilizando hibridación con sondas complejas de genotipos contrastantes o poblaciones y ambientes contrastantes. Todo esto puede utilizarse para integrar los datos de micromatrices con aquellos de selección fenotípica convencional. El análisis comparativo de secuencias y datos de micromatrices de raigrás y tréboles con aquellos de Arabidopsis y arroz, conjuntamente con los programas de descubrimiento de ESTs en M. truncatula, aportarán información acerca de los aspectos conservados y divergentes en la organización y función del genoma gramíneas y leguminosas. 3.2 Simbio y patogenómica Las leguminosas y gramíneas ofrecen la posibilidad de estudiar a nivel genómico interacciones de distinto tipo, como por ejemplo planta-patógeno, simbiosis leguminosa/bacteria fijadora de nitrógeno, asociaciones leguminosa/microrriza y endosimbiosis gramínea/endófito. La información obtenida en estos estudios será de gran valor para desarrollar resistencia a patógenos y mejorar las asociaciones beneficiosas en las forrajeras. El trabajo de descubrimiento de genes en M. truncatula está orientado a estudiar la respuesta de la planta ante los patógenos y a caracterizar diferentes sistemas patogénicos que incluyen patógenos fúngicos tales como Colletotrichum trifolii y Phytophthora medicaginis y patógenos bacterianos como Xylella fastidiosa y Xanthomonas alfalfae. Para mediados del 2000 el US M. truncatula Functional Genomics Project generó secuencias de DNA que incluían ESTs de hojas infectadas con Colletotrichum, ESTs de hojas infectadas con Phytophthora, ESTs de micorrizas de raíz y aproximadamente secuencias de raíz en diferentes tiempos después de la inoculación con Sinorhizobium meliloti y de nódulos maduros y senescentes. Existe un proyecto de genómica funcional integrado tendiente a dilucidar los eventos conducentes a la nodulación en las leguminosas utilizando L. japonicus como modelo. Este proceso de nodulación involucra la interacción compleja entre genes bacterianos y sus productos con procesos de desarrollo en la planta que involucran percepción y transmisión de señales y morfogénesis. El objetivo es comprender mecanismos genéticos de la planta involucrados en esta simbiosis a fin de mejorar las asociaciones naturales beneficiosas para la agricultura y el ambiente. Este y otros recursos genéticos de M. truncatula y L. japonicus contribuirán significativamente a conocer y comprender las respuestas a patógenos y estrés y las interacciones de la rizósfera con las leguminosas forrajeras. Agriculture Victioria-DNRE también ha encarado un programa de genómica de endófitos de gramíneas focalizado en el descubrimiento de genes gramínea-endófito en la asociación Festuca arundinacea/ Neotyphodium coenophialum. A través de este programa se han generado aproximadamente secuencias del hongo que se analizaron por búsqueda de BLAST y se caracterizaron funcionalmente. El principal interés está dirigido al descubrimiento de genes involucrados en la colonización del huésped, en el aporte de nutrientes para el hongo endofítico y en la biosíntesis de metabolitos secundarios activos de pirrolopirazina y pirrolizidina (los repelentes de insectos peramina y N-formilolina respectivamente) y su regulación. Este proyecto también aportará información acerca de la interacción endófito-huésped así como de los mecanismos fisiológicos conducentes a un incremento en el vigor de la planta y a una mayor tolerancia a estreses. Estas herramientas genómicas y el conocimiento generado posibilitarán el desarrollo de tecnologías para manipular las asociaciones gramínea-endófito a fin de incrementar el rendimiento de la planta, mejorar la tolerancia a estreses bióticos y abióticos y alterar la especificidad endófitohuésped a fin de beneficiar a las industrias semilleras de pasto para césped y forrajes. En otro proyecto similar se ha tratado de aislar y caracterizar genes involucrados en la biosíntesis de indol-diterpenos y ergopeptinas responsables de la toxicosis animal en la asociación Lolium perenne-n. Lolii. La pro- 278 SPANGENBERG, Germán

300 Figura 4: A) Perfiles de expresión a través de micromatrices de ADN utilizando dos colorantes fluorescentes (Cy5 y Cy3) para marcar dos muestras de RNA total provenientes de distintas situaciones de crecimiento o desarrollo, por ejemplo plantas creciendo en luz (Cy3) y plantas creciendo en oscuridad (Cy5). Luego de la hibridación, los puntos marcados en verde indican los genes que se encuentran regulados positivamente cuando las plantas se encuentran en condiciones de luz, aquellos marcados en rojo corresponden a los regulados positivamente cuando se hallan en oscuridad y los que están en amarillo corresponderían a aquellos genes que están regulados positivamente en ambas situaciones. C) Micromatrices de ADNc de trébol blanco utilizando RNA de hojas y raíz. Confirmación por Northern de la expresión de los genes para la dihidroflavonol reductasa y una proteína embriónica. tección de los meristemas de Lolium de un exceso de herbivoría es vital para el éxito reproductivo y la distribución de esta y otras especies de gramíneas. El desarrollo de asociaciones simbióticas entre gramíneas y endófitos del grupo Epichloë/Neotyphodium representa una forma única de protección donde los genomas del huésped y el simbionte han co-evolucionado para beneficio mutuo. El hongo le aporta protección al huésped a través de la producción de metabolitos bioprotectores en retribución por los nutrientes para su crecimiento. Estos compuestos son tóxicos para los mamíferos. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 279

301 .B) Análisis de la imágen de micromatrices de etiquetas expresadas de ADN (ESTs) (ImaGene Software).D) Perfiles de expresión de genes de raigrás, comparando genes que se expresan en tallo y raíz. El clonado de los genes de estas vías metabólicas es un objetivo importante ya que se conoce poco acerca de la enzimología, de la biosíntesis de toxinas y de las condiciones para la síntesis endofítica de estos metabolitos ex planta. En este sentido se han logrado avances al clonar un conjunto de genes responsables de la síntesis de ergopeptina y ergotamina de Claviceps purpurea y de paxilina, un indol-diterpeno estrechamente relacionado al lolitremo B de Penicillum paxilli. 3.3 Xeno-genómica La genómica comparativa basada en el análisis de ESTs de varias plantas tolerantes a estreses abióticos permitirá la identificación de redes de genes asociados con estreses ambientales tales como alta salinidad, sequía y bajas temperaturas, así como la determinación de vías bioquímicas conserva-das.b) Análisis de la imágen de micromatrices de etiquetas expresadas de ADN (ESTs) (ImaGene Software). involucradas en las respuestas a estreses. La investigación genómica utilizando especies vegetales exóticas, conocida como xenogenómica, incluye el descubrimiento de genes a través del secuenciado de ESTs a gran escala y el análisis de la expresión global de genes con micromatrices basados en las mismas. Esto posibilitará la obtención de genes clave y variantes de genes de plantas tolerantes a estreses abióticos extremos, muchos de ellos nuevos, y la determinación de sus patrones de expresión en respuesta a estreses abióticos específicos. Un programa de xenogenómica llevado a cabo por Agriculture Victioria-DNRE se encuentra abocado a seleccionar gramíneas y leguminosas australianas nativas y exóticas, adaptadas a estreses ambientales extremos. En este marco se están aislando y caracterizando aquellos genes que permiten a estas especies tolerar estreses abióticos como sequía, salinidad y suelos de baja fertilidad. Entre las especies estudiadas se incluyen gramíneas australianas nativas, tales como las halotolerantes Agrostis adamsonii y A. robusta y la especie tolerante a aluminio Microlaena stipoides. También incluye especies exóticas como Deschampsia antarctica, una de las dos únicas plantas vasculares nativas de la Antártida. Estos descubrimientos facilitarán el desarrollo de estrategias efectivas de mejoramiento molecular que permitirán incrementar la tolerancia a estreses abióticos en forrajeras y otros cultivos. 280 SPANGENBERG, Germán

302 4 Resumen y conclusiones En los últimos años se ha realizado un considerable progreso en el establecimiento de las metodologías requeridas para el mejoramiento molecular de plantas forrajeras. Numerosas estrategias biotecnológicas están siendo consideradas en relación al mejoramiento de la calidad nutritiva a través de la alteración de la biosíntesis de lignina, carbohidratos solubles y protoantocianas y de la expresión regulada de proteínas ricas en aminoácidos esenciales, resistentes al rumen. También se pretende incrementar la resistencia a patógenos y plagas, manipular el crecimiento y desarrollo a fin de incrementar la persistencia y demorar la senescencia, impedir la floración y regular negativamente los alérgenos del polen. Las primeras plantas forrajeras transgénicas han sido evaluadas a campo y eventos de transformación seleccionados se han utilizado para el desarrollo de cultivares. Las herramientas genómicas permitirán comprender mejor la genética, fisiología y bioquímica de varios procesos vegetales complejos y acelerar la aplicación de estrategias de tecnología génica para el mejoramiento de plantas forrajeras. La aplicación de herramientas y metodologías moleculares para el mejoramiento de estas especies reemplazará en gran medida la selección empírica basada en el fenotipo por otra más directa y predecible, basada en el genotipo. Sin embargo, estas estrategias son promisorias solamente cuando se las considera dentro de un programa de mejoramiento. Los programas más exitosos serán aquellos que incluyan un equipo multidisciplinario conformado por mejoradores, biólogos moleculares y celulares, bioquímicos, patólogos, agrónomos, expertos en nutrición animal y que adopten las nuevas tecnologías génicas, de genómica funcional, bioinformática y de fenotipificación y que las apliquen de manera apropiada para resolver problemas específicos. El esfuerzo de tales equipos integrados será crítico para el desarrollo de cultivares destinados al mercado y para el desarrollo de plantas forrajeras destinadas a otros usos. La genómica vegetal tendrá un rol vital al acelerar la aplicación de la biotecnología para la agricultura de forrajes y pastizales. La investigación genómica en las plantas forrajeras permitirá el desarrollo de tecnologías que van más allá de los sistemas de producción de forrajes, incrementando significativamente el valor de las semillas y de los productos agrícolas. Infinidad de genes vegetales serán un recurso invalorable para ser insertados en muchas plantas de cultivo utilizando tecnología génica y para ser utilizados como marcadores en selección asistida. Esto incrementará la eficiencia y la eficacia de los programas de mejoramiento vegetal. 5 Lecturas Recomendadas ALLEN, P.G Insect pests of pasture in perspective. In: Wheeler J.L., Pearson C.J. and Robards G.E. (eds) Temperate pastures: their production, use and management. Aust Wool Corp/CSIRO, Canberra, pp AUSTIN-PHILLIPS, S. and ZIEGELHOFFER, T The production of value-added proteins in transgenic alfalfa. In: Spangenberg G. (ed.) Molecular breeding of forage crops. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Chapter 18 (in press). BARNES, R.F. and BAYLOR, J.E Forages in a changing world. In: Barnes R.F.,Miller D.A. and Nelson C.J. (eds.) Forages, Vol 1. An introduction to grassland Agriculture, 5th edn. Iowa State University Press, Ames, Iowa. pp BEACHY, R.N Mechanisms and applications of pathogen-derived resistance in transgenic plants. Plant Cell, 8, BOUDET, A.M. and GRIMA-PETTENATI, J Lignin genetic engineering. Mol. Breed., 2, BOUDET, A.M.; GOFFNER D.P. and GRIMA- PETTENATI, J Lignins and lignification: recent biochemical and biotechnological developments. CR Acad. Sc.i Paris, [Sci. Vie /Life Sci.] 319, BOWMAN, J.L.; ALVAREZ, J.; WEIGEL, D.; MEYEROWITZ, E.M. and SMYTH, D.R Control of flower development in Arabidopsis thaliana by APETALA1 and interacting genes. Development 119, BURGESS, E.P.J. and GATEHOUSE, A.M.R Engineering for insect pest resistance. In: McKersie B.D. and Brown D.C.W. (eds.) Biotechnology and the improvement of forage legumes. Biotechnology in Agriculture Series, No. 17. CAB International, New York, pp CASLER, M.D. and KAEPPLER, H.F Molecular breeding for herbage quality in forage crops. In: Spangenberg G. (ed.) Molecular breeding of forage crops. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Chapter 10 (in press). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 281

303 COOK, D.R Medicago truncatula a model in the making! Current Opinion in Plant Biology, 2, CUSHMAN, J.C. and BOHNERT, H.J Genomic approaches to plant stress tolerance. Current Opinion in Plant Biology, 3, EAST, R. and POTTINGER, R.P The cost of pasture pests. New Zealand Agricultural Science, 18, FORSTER, R.L.S.; BECK, D.L. and LOUGH, T.J Engineering for resistance to virus diseases. In: McKersie B.D. and Brown D.C.W. (eds.) Biotechnology and the improvement of forage legumes. Biotechnology in Agriculture Series, No. 17. CAB International, New York, pp FORSTER, J. W. and SPANGENBERG, G Forage and turf grass biotechnology: principles, methods and prospects. In: Setlow J.K. (ed.) Genetic Engineering: Principles and Methods, Volume 21. Kluwer Academic/ Plenum Publishers, New York, pp FORSTER, J.W.; JONES, E.S.; KOELLIKER, R.; DRAYTON, M.C.; DUMSDAY, J.L..; DUPAL, M.P.; GUTHRIDGE, K.M.; MAHONEY, N.L.; VAN ZIJLL DE JONG, E. and SMITH, K Development and implementation of molecular markers for forage crop improvement. In: Spangenberg G. (ed.) Molecular breeding of forage crops. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Chapter 6 (in press). GODDIJN, O.J.M. and PEN, J Plants as bioreactors. TIBTECH, 13, GRESSHOFF, P.M.; MEN, A.E.; MAGUIRE, T.; GRIMMOND, S.; LOHAR, D.; AYANRU, S.; MEKSEM, K.; LIGHTFOOT, D. and STILLER, J An integrated functional genomics and genetics approach for the plant s function in symbiotic nodulation. In: Spangenberg G. (ed.) Molecular breeding of forage crops. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Chapter 17 (in press). GRUBER, M.Y.; RAY, H. and BLATHUT-BEATTY, L Genetic manipulation of condensed tannin synthesis in forage crops. In: Spangenberg G. (ed.) Molecular breeding of forage crops. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Chapter 11 (in press). MCKERSIE, B.D Improving forage production systems using biotechnology. In: McKersie B.D. and Brown D.C.W. (eds.) Biotechnology and the improvement of forage legumes. Biotechnology in Agriculture Series, No. 17. CAB International, Wallingford, pp MCMAHON, L.R.; MCALLISTER, T.A.; BERG, B.P.; MAYAK, W.; ACHARYA, S.N.; POPP, J.D.; COULMAN, B.E.; WANG, Y. and CHENG, K.J A review of the effects of condensed tannins on ruminal fermentation and bloat in grazing cattle. Can. J. Plant Sci., (in press). RICHMOND, T. and SOMERVILLE, S Chasing the dream: plant EST microarrays. Current Opinion in Plant Biology, 3, ROGERS, G.E Improvement of wool production through genetic engineering. TIBTECH, 8, SCOTT, D.B Molecular interactions between Lolium grasses and their fungal symbionts. In: Spangenberg G. (ed.) Molecular breeding of forage crops. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Chapter 16 (in press). SPANGENBERG, G Application of biotechnology in pasture plant improvement. In: Utilization of transgenic plants and genome analysis in forage crops, National Grassland Research Institute Working Report 1998-No pp TABE, L.M.; WARDLEY-RICHARDSON, T.; CERIOTTI, A.; ARYAN, A.; MCNABB, W.; MOORE, A. and HIGGINS, T.J.V A biotechnological approach to improving the nutritive value of alfalfa. J. Anim. Sci., 73, VOISEY, C.R.; DUDAS, B.; BIGGS, R.; BURGESS, E.P.J.; WIGLEY, P.J.; MCGREGOR, P.G.; LOUGH, T.J.; BECK, D.L.; FORSTER, R.L.S. and WHITE, D.W.R Transgenic pest and disease resistant white clover plants. In: Spangenberg G. (ed.) Molecular breeding of forage crops. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Chapter 14 (in press). HIGGINS, T.J.; O BRIEN, P.A.; SPENCER, D.; SCHROEDER, H.E.; DOVE, H. and FREER, M Potential of transgenic plants for improved amino acid supply for wool growth. In: Rogers G.E., Reis P.J., Ward K.A. and Marshall R.C. (eds.) The biology of wool and hair. Chapman and Hall, London. pp KALLA, R.; CHU, P. and SPANGENBERG, G. 2000ª. Molecular breeding of forage legumes for virus resistance. In: Spangenberg G. (ed.) Molecular breeding of forage crops. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Chapter 13 (in press). KNOX, B. and SUPHIOGLU, C Environmental and molecular biology of pollen allergens. Trends Plant Sci., 1,

304 VIII.-Capítulo 3 Manipulación de la Apomixis y su Aplicación en la Agricultura Ortiz, Juan Pablo A.; Pessino, Silvina C.; Quarin, Camilo L. 1 Qué es la apomixis? Algunas plantas con flores presentan un modo asexual de reproducción llamado apomixis. Éste consiste en la formación de semillas que contienen embriones genéticamente idénticos a la planta madre, generados sin que intervengan los procesos de meiosis y fecundación. La apomixis fue descripta por primera vez en 1841 en la planta australiana Alchornea ilicifolia por J. Smith. Cuando un ejemplar femenino de esta especie dioica fue llevado a los Kew Gardens de Londres desde Asia, la planta aislada floreció y produjo semillas en abundancia, poniendo al carácter en evidencia. Paradójicamente, los primeros experimentos con plantas apomícticas fueron realizados en forma involuntaria por Gregor Mendel, quien utilizó cruzas entre especies del género Hieracium para intentar confirmar los resultados obtenidos en sus famosos estudios sobre la herencia de las arvejas de jardín. Mendel atribuyó erróneamente a una supuesta «frecuente autopolinización» la falta de segregación observada. Hoy sabemos que muchas especies de este género son apomícticas. Se considera que la apomixis ha evolucionado como un sistema de reproducción alternativo a la sexualidad a través de la reformulación de sus programas de desarrollo. Por lo tanto, para comprender su funcionamiento es necesario compararlo con el de la reproducción sexual. La sexualidad en las angiospermas comprende la alternancia cíclica entre los estados de esporófíto (la planta misma, 2n) y gametófito (el grano de polen y el saco embrionario, n). La meiosis que ocurre en las flores posibilita la recombinación y reducción del contenido genético y da lugar a la formación de las esporas femeninas (megásporas) en el ovario y masculinas (micrósporas) en las anteras. La megasporogénesis genera cuatro células haploides, tres de las cuales degeneran. La restante constituye la megáspora funcional, que por el proceso de megagametogénesis desarrolla un megagametófito conocido como «saco embrionario». El tipo de saco embrionario más común entre las angiospermas (conocido como Polygonum) está formado por 8 núcleos haploides (n) contenidos en siete células, a saber: la ovocélula, dos sinérgidas, una célula central binucleada, y tres antípodas. Por otra parte, las micrósporas desarrollan los granos de polen mediante un proceso de microgametogénesis. El polen maduro está típicamente integrado por tres células haploides (n), dos de las cuales constituyen los gametos masculinos. La otra tiene una función relacionada con el crecimiento del tubo polínico. La formación de la semilla requiere previamente de un proceso de doble fecundación: un gameto masculino (n) se fusiona con la ovocélula (n) para originar al cigoto (2n). A partir de este cigoto se desarrolla el embrión. La célula central del saco embrionario con sus dos núcleos (n + n) se fusiona con el otro gameto masculino para originar el endospermo. Así, la fusión de dos gametos haploides únicos derivados de la distribución al azar del material genético durante las meiosis masculina y femenina resulta en la generación de progenies genéticamente diversas. En resumen, en la reproducción sexual la meiosis produce la recombinación génica de los caracteres de ambos progenitores y genera gametos haploides. La fecundación fusiona de manera aleatoria un gameto masculino con uno femenino para originar un nuevo individuo con una constitución genética única. La apomixis elude la ruta sexual evitando la reducción meiótica y la fecundación. El óvulo desarrolla una semilla cuyo embrión contiene exactamente el mismo genotipo que la planta que lo origina. Por lo tanto este carácter (también llamado agamospermia) ha sido definido como reproducción asexual a través de semillas. Fue descripto en más de 400 especies de plantas pertenecientes a 35 familias diferentes, entre las que se destacan las Gramíneas, las Compuestas, las Rosáceas y las Rutáceas. Presenta formas diferentes y parece haber surgido varias veces Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 283

305 en forma independiente durante la evolución. Brevemente, los embriones apomícticos pueden formarse a través de una ruta esporofítica o gametofítica. En la primera, también llamada embrionía adventicia, los embriones surgen directamente de una célula somática de la nucela o de los tegumentos del óvulo. Comúnmente se forman embriones múltiples a partir de células nucelares (esporofíticas) que comparten el óvulo junto con el embrión de origen sexual y utilizan su endospermo para desarrollarse. Esta forma de apomixis aparece comúnmente en los cítricos, los cuales se convirtieron en un sistema modelo para estudiar el proceso. En la apomixis gametofítica se forman siempre sacos embrionarios que difieren en algunos aspectos del gametófito femenino haploide (n) generado a partir de la megáspora funcional. Su principal diferencia es precisamente el hecho de ser diploides (2n) ya que los núcleos que los conforman no han pasado por el proceso meiótico y por lo tanto no han reducido su contenido de ADN. Por eso se dice que estos sacos embrionarios o megagametófitos surgen por un proceso de apomeiosis (apo: prefijo griego de significación negativa). De acuerdo con el origen de la célula que genera al saco embrionario y al embrión, la apomixis gametofítica puede ser clasificada como: diplosporía, cuando el saco embrionario se origina a partir de la célula madre de la megáspora misma ya sea por mitosis o luego de una falla en la meiosis o aposporía, cuando el saco embrionario se origina directamente por mitosis a partir de una célula somática, usualmente una célula de la nucela. Los sacos embrionarios, sean éstos apospóricos o diplospóricos, contienen un gameto femenino 2n, la ovocélula, a partir de la cual se desarrolla directamente el embrión por partenogénesis sin que exista fecundación. Así, mientras en el proceso sexual la reducción meiótica se complementa con la fecundación que restaura el nivel de ploidía 2n, en la apomixis gametofítica la ausencia de reducción se complementa con la partenogénesis. La apomixis gametofítica fue estudiada más profundamente que la apomixis esporofítica, principalmente por Meiosis Célula madre de la megáspora Mitosis o meiosis modificada Mitosis Megasporas haploides (n) Esporofito (2n) Células somáticas Endosperma Embrión Mitosis somática Mitosis División Mitosis Megagametofito no reducido (2n) autónoma o fecundación Mitosis sin fecundación Doble fecundación Megagametofito reducido (n) Grano de polen Figura 1: La rutas biológicas de la reproducción sexual y apomíctica. Durante la sexualidad una célula de la nucela del óvulo se diferencia como célula madre de la megáspora y luego de sufrir un proceso de meiosis da origen a cuatro megásporas haploides. Tres de estas megásporas degeneran y la cuarta da origen a la formación de un saco embrionario luego de una serie de mitosis, donde todos los núcleos celulares están reducidos (n). La ovocélula y los núcleos polares del saco son fecundados por los núcleos generativos del polen para generar el cigoto y el núcleo primario del endosperma, respectivamente. El cigoto da origen al embrión a través de sucesivas mitosis. La apomixis consiste en la formación de un embrión a partir de una célula no reducida (que no ha sufrido mitosis). En algunos casos hay formación de un megagametofito con células no reducidas, cuya ovocélula (2n) genera un embrión por partenogénesis (apomixis gametofítica). En otros casos el embrión es generado directamente a partir de una célula de la nucela en un proceso similar a la embriogénesis somática (embrionía adventicia). 284 ORTIZ, J.P.A.; PESSINO, S.C.; QUARIN, C.L.

306 ser el tipo presente en las gramíneas, donde muchas especies con valor agronómico presentan este modo de reproducción. Un esquema de las diferentes rutas posibles que puede tomar la apomixis se muestra en la Figura 1. Recordemos que en las angiospermas existe una doble fecundación. En la apomixis gametofítica la partenogénesis excluye uno de los procesos de la doble fecundación: la unión de los gametos masculinos con los femeninos. Sin embargo no necesariamente se anula la fecundación de los núcleos polares. Aunque en algunos casos el endospermo puede desarrollarse en forma autónoma (sin la unión de un gameto masculino con los núcleos polares del saco embrionario apospórico o diplospórico) en muchas especies apomícticas, como en la mayoría de las gramíneas tropicales, es necesario que un gameto masculino se fusione con el o los núcleos polares de la célula central del saco embrionario para formar el endospermo. A este proceso se lo llama pseudogamia. Los sacos embrionarios diplospóricos conservan la típica estructura de los sacos embrionarios de origen meiótico, generalmente con siete células y ocho núcleos. Sin embargo, en la aposporia por lo general tienen una constitución distinta y muy variable, tanto en taxones diferentes como dentro de un mismo taxón. Por ejemplo, en gramíneas tropicales o subtropicales, el saco apospórico se forma por dos mitosis consecutivas, con permanencia de los cuatro núcleos en un solo polo celular. Así se organiza un megagametófito con una ovocélula flanqueada por dos sinérgidas y una célula central uninucleada y extensamente vacuolizada. Esta estructura de saco apospórico fue descripta por primera vez para Panicum maximum y por esa razón a los megagametófitos con esta morfología se los conoce como sacos apospóricos de tipo Panicum. Sin embargo, en las especies apospóricas de Paspalum, un género también perteneciente a la tribu Paníceas igual que Panicum, existe una característica en la constitución de los sacos apospóricos que los diferencia netamente del tipo Panicum: en Paspalum los sacos generalmente tienen una célula central con dos núcleos polares y a veces tres. Esta característica es importante porque debido a la pseudogamia, a veces la relación genómica materna/paterna del endospermo es distinta en Esporogénesis Gametogénesis n 2n Meiosis Mitosis n Célula madre de la megáspora Meiosis modificada Mitosis (tipo Antennaria) 2n Mitosis (tipo Taraxacum) 2n 2n Mitosis (tipo Paspalum) 2n Células nucelares Sexualidad Diplosporía Aposporía Esporófito Gametófito Figura 2: Distintos tipos de sacos embrionarios formados durante los procesos de sexualidad y de apomixis gametofítica. En la sexualidad, la célula madre de la megáspora realiza un proceso de meiosis y genera cuatro megásporas haploides, tres de las cuales degeneran. La cuarta megáspora lleva a cabo una serie de tres divisiones mitóticas para formar un saco embrionario reducido y octanucleado. En el proceso de apomixis diplospórica la célula madre de la megáspora realiza una serie de mitosis para generar un saco embrionario no reducido y octanucleado (tipo Antennaria) o inicia un proceso de meiosis que falla para generar un saco embrionario no reducido y octanucleado (tipo Taraxacum). En la apomixis apospórica células de la nucela cercanas a la célula madre de la megáspora realizan varias mitosis consecutivas para generar un saco embrionario no reducido que puede ser pentanucleado (tipo Paspalum) y cuya característica más notable es la ausencia de antípodas. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 285

307 las plantas sexuales y en las apospóricas. En las sexuales, hay una relación 2/1 materno/ paterno (madre n + n; padre n), mientras que en las apospóricas esa relación es generalmente 4/1 (madre 2n + 2n; padre n). En Panicum la relación es 2/1 tanto en las sexuales como en las apospóricas (n + n/n en las sexuales y 2n/n en las apospóricas) (Fig. 2). 2 Otros aspectos substanciales del carácter apomixis Hay varias características particulares de este modo de reproducción que merecen ser remarcadas. Por una parte la apomixis usualmente no altera la formación del microgametófito y la meiosis ocurre normalmente en las anteras generando polen perfectamente viable y reducido. Además, apomixis y sexualidad no son procesos mutuamente excluyentes ya que pueden aparecer simultáneamente sacos reducidos (meióticos) y no reducidos (provenientes de apomixis) en una misma planta, en una misma inflorescencia y aún en un mismo óvulo (Fig. 3). Una planta apomíctica capaz de generar al menos una parte de su progenie por medios sexuales se conoce como facultativa. Por lo tanto, en los genotipos apomícticos facultativos las progenies segregan como clases maternas (2n + 0) y no-maternas o aberrantes. Hay tres tipos diferentes de individuos aberrantes que pueden encontrarse en la progenie de una planta apomíctica: 1) híbridos BIII (2n + n) que resultan de la fecundación de una ovocélula no reducida, 2) híbridos BII (n + n) que resultan de la fecundación de una ovocélula reducida y 3) haploides (n + 0) generados por partenogénesis a partir de una célula huevo reducida. Por otra parte, la apomixis gametofítica se relaciona siempre con la poliploidía. En general aparece en especies que presentan razas de bajos niveles de ploidía (usualmente diploides) que se reproducen por sexualidad y otras de mayor nivel de ploidía (por ejemplo tri, tetra o pentaploides) que se reproducen por apomixis. Estos complejos integrados por individuos sexuales y apomícticos de distinto nivel de ploidía se conocen como «complejos agámicos» y se consideran estructuras reproductivas complejas y evolucionadas donde la sexualidad permite la generación de nuevos genotipos y la apomixis la propagación clonal muy eficiente de las combinaciones genéticas superiores. Existen evidencias que sugieren que la diversidad generada a niveles menores de ploidía puede ser impulsada hacia los niveles Figura 3: Microfotografías de secciones de óvulos de razas tetraploides de Paspalum notatum. A: óvulo conteniendo un saco embrionario meiótico (las dos sinérgidas y algunas de las antípodas no se observan porque están en una sección adyacente del corte del óvulo). B: óvulo conteniendo dos sacos embrionarios apospóricos. Referencias: a, antípodas; e, célula huevo, p, núcleos polares; barra = 30 micras 286 ORTIZ, J.P.A.; PESSINO, S.C.; QUARIN, C.L.

308 poliploides por medio de eventos sucesivos de hibridización 2n + n. 3 Mejoramiento genético de especies naturalmente apomícticas Algunas especies apomícticas tienen un valor agronómico muy importante, como es el caso de varias gramíneas forrajeras, los citrus, el mango y las fresas. Hasta el presente, sólo se dispone de programas de mejoramiento avanzados en algunas gramíneas forrajeras entre las que se encuentran especies de los géneros Brachiaria, Cenchrus, Eragrostis, Panicum, Paspalum, Pennisetum y Poa. En principio, las plantas apomícticas facultativas pueden ser mejoradas por metodologías de cruzamiento convencionales, ya que producen al menos algunos sacos embrionarios meióticos que posibilitan la hibridación y selección. En cambio en los apomícticos obligados, que se reproducen completamente o casi completamente en forma clonal, la hibridación y el análisis de segregación son impracticables. Las progenies de tales plantas exhiben siempre el fenotipo materno o pueden ocasionalmente aparecer variantes que probablemente surjan de mutaciones más que de segregación sexual. Por ello, la disponibilidad de individuos sexuales o con algún grado de sexualidad (apomícticos facultativos) es un requisito fundamental para el mejoramiento de estas especies. Estos individuos presentan un cierto grado de variabilidad como para aumentar las posibilidades de supervivencia de la especie frente a cambios ambientales y aportan asimismo germoplasma útil para el mejoramiento. Uno de los principales requisitos para llevar adelante un programa de mejoramiento de una especie apomíctica es la colección de germoplasma diverso desde las fuentes de origen para ampliar la base genética disponible e identificar introducciones sexuales o altamente sexuales (apomícticas facultativas con alta expresión de sexualidad). La evaluación de especies relacionadas es también una alternativa importante cuando no se dispone de plantas sexuales de la especie de interés. Ejemplos de cruzamientos interespecíficos e incluso intergenéricos empleados como punto de partida en programas de mejoramiento se encuentran en Brachiaria, Zea x Tripsacum y Pennisetum, entre otros. El adecuado conocimiento de la biología, citología y modo de reproducción de los materiales disponibles es asimismo un requisito fundamental para cualquier estrategia de mejoramiento. Como se verá mas adelante, los estudios realizados para determinar la base genética de la apomixis en varias especies de gramíneas indican que el carácter presenta un tipo de herencia simple, haciendo posible entonces su manipulación en programas de mejoramiento una vez que son detectados individuos sexuales o apomícticos facultativos. En estos casos los genotipos apomícticos obligados con características deseables pueden ser usados como dadores de polen. Debido a que los gametos masculinos son completamente normales (reducidos) y que la mayoría de las especies apomícticas son altamente heterocigotas, los cruzamientos entre individuos sexuales (utilizados como progenitores femeninos) y apomícticos (empleados como dadores de polen) pueden conducir a la generación de progenies F 1 variables donde es posible seleccionar. Hay que tener en cuenta que si bien son necesarios individuos sexuales o con adecuada expresión de sexualidad para realizar las cruzas, en el momento de la selección habrá que usar el criterio contrario, es decir, seleccionar por un alto grado de expresión de la apomixis. Esto conducirá a la obtención de variedades estables. El objetivo final de un programa de mejoramiento de una especie apomíctica en el cual ha sido posible obtener recombinación genética es la identificación en la población segregante de los genotipos superiores, con reproducción completamente (o casi completamente) apomíctica que puedan ser transformados en cultivares mediante su multiplicación por semillas. El camino no es sencillo porque en cada generación es necesario distinguir en la progenie, cuáles son los individuos generados por sexualidad y cuales por apomixis. Dentro de los generados por sexualidad, habrá que seleccionar los que al mismo tiempo posean las mejores características agronómicas y presenten un alto grado de expresión de la apomixis. Otro aspecto a tener en cuenta es el nivel de ploidía de los progenitores que serán empleados en los cruzamientos. Los primeros estudios de hibridación indicaron la necesidad de realizar cruzas Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 287

309 entre especies sexuales y apomícticas con el mismo nivel de ploidía ya que varios intentos realizados entre diploides sexuales y poliploides (en general tetraploides) apomícticos condujeron a la generación de progenies estériles. En las gramíneas tropicales y subtropicales se ha hecho un buen uso del carácter en el mejoramiento, especialmente en la domesticación de algunas especies. Dos grandes líneas de trabajo han sido llevadas adelante en estos programas: 1) la selección de los mejores genotipos naturales partiendo de una amplia colección de germoplasma y estudiando características como la productividad de materia seca, calidad, adaptabilidad al cultivo y a distintas condiciones ambientales, capacidad de producción de semilla y persistencia al pastoreo. Esta selección puede llevarse a cabo entre diferentes especies o dentro de la misma especie, considerando cuáles son los mejores genotipos entre distintas poblaciones apomícticas disponibles. Hay numerosos ejemplos de cultivares de pastos forrajeros apomícticos que se mejoraron usando este tipo de selección. Así se obtuvieron todas las variedades apomícticas cultivadas de Paspalum, Brachiaria, Panicum, Themeda y Melinis. Tomando como ejemplo a Paspalum, en primer lugar se seleccionaron algunas especies como P. notatum (apomíctico, 4X), P. dilatatum (apomíctico, 5X), P. plicatulum, P. atratum, y luego se eligieron algunos ecotipos por sus cualidades agronómicas y su adaptabilidad al cultivo. En el sur de los Estados Unidos se han popularizado algunas variedades tetraploides apomícticas de P. notatum (Argentine, Paraguay, Wilmington, Tifton 7 y otras). También se cultivan algunas variedades apomícticas de Dallisgrass (P. dilatatum) seleccionadas de la misma manera. En nuestro país se cultivaron durante mucho tiempo dos variedades apomícticas de P. guenoarum: el Pasto Rojas y el Pasto Ramírez, seleccionadas por este mismo método en Paraguay. Recientemente se han inscripto otras dos variedades que han sido seleccionadas en la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional del Nordeste: el Pasto Cambá (P. atratum) y el Pasto Chané (P. guenoarum); 2) la segunda posibilidad de mejoramiento (en la que aún se ha avanzado poco) consiste en realizar cruzamiento con genotipos sexuales poliploides naturales, que son muy raros. Un buen ejemplo de esto es son las variedades Nueces y Llano de Buffelgrass (Pennisetum ciliaris) desarrolladas en USA en la década del 70 a partir de cruzamientos entre una rara planta tetraploide sexual (natural) con plantas apomícticas tetraploides (que son las comunes en esta especie). También se han conseguido obtener plantas tetraploides sexuales por duplicación cromosómica de una planta sexual diploide. Mediante este tipo de tratamientos se han generado tetraploides sexuales en B. ruziziensis y P simplex, P. notatum y P. hexastachium. La disponibilidad de estas plantas, además de facilitar los planes de cruzamientos, permitió la realización de estudios detallados de la herencia del carácter apomixis en ambos géneros. Actualmente se están llevando a cabo programas de mejoramiento que utilizan esta estrategia para Paspalum y Brachiaria, aunque aún no se ha inscripto ninguna variedad nueva. 4 Usos potenciales de la apomixis en el mejoramiento de plantas naturalmente sexuales La ausencia de recombinación durante la megagametogénesis y de fecundación de la ovocélula por un gameto masculino posibilita la generación de embriones que presentan una constitución genética idéntica a la de la planta madre. La apomixis es un carácter utilizable en el mejoramiento de plantas y la producción de alimentos, ya que puede ser percibida como una herramienta ventajosa para la estabilización de genotipos superiores y la fijación combinaciones híbridas. En teoría cualquier combinación genética que lleve los factores determinantes de la apomixis podría ser mantenida y multiplicada como una réplica exacta por innumerables generaciones vía semillas. La perspectiva de clonar genotipos superiores híbridos podría representar una ayuda importante para los productores agropecuarios de los países en desarrollo, permitiéndoles sostener altos rendimientos año tras año usando parte de las semillas cosechadas sin pérdidas en la producción debidas a la segregación. Entre otras ventajas, la expresión de la apomixis reduciría al mínimo el aislamiento físico reque- 288 ORTIZ, J.P.A.; PESSINO, S.C.; QUARIN, C.L.

310 rido para preservar líneas genéticas homocigotas. Podrían ser obtenidos y propagados fácilmente nuevos híbridos interespecíficos e intergenéricos, permitiendo el desarrollo de genotipos mejor adaptados a los distintos ambientes. Asimismo podría facilitarse el uso de transformantes considerando que una planta transgénica apomíctica fijaría inmediatamente el nuevo carácter y se convertiría en un cultivar luego de su multiplicación. 5 El control genético de la apomixis La apomixis es un carácter heredable, pero su control genético no fue aún completamente esclarecido. Tradicionalmente se consideró que sus determinantes básicos podrían haberse originado por mutación y que la mayoría de los otros genes involucrados son similares a los de la sexualidad. A pesar de su amplia distribución en las angiospermas, el carácter no es muy común en los cultivos mayores o en sistemas modelos. Esta condición forzó a que los estudios en este campo deban ser realizados en especies silvestres que son poliploides, altamente heterocigotas y con una pobre caracterización genética. La disección de las bases genéticas del carácter es por lo tanto dificultosa y compleja. Los estudios de herencia sólo son posibles si pueden cruzarse progenitores completamente sexuales y apomíc-ticos y la progenie F 1 segregante puede ser examinada por métodos citoembriológicos. Alternativamente, el análisis de progenies usando marcadores moleculares, puede ser empleado como un indicador de la tasa de plantas con genotipo materno formadas por cada uno de los híbridos F 1. En las cruzas de este tipo (que pueden ser intra o interes-pecíficas) se utiliza un poliploide sexual natural o generado artificialmente como planta madre, mientras que un genotipo apomíctico contribuye como dador de polen. Los diferentes estudios desarrollados en las gramíneas coinciden en señalar que tanto la aposporía como la diplosporía parecen estar controladas por un único locus en donde un gen mayor dominante o un grupo de genes ligados y coadaptados, que funcionan como una sola unidad genética a causa de una fuerte supresión de la recombinación, son los responsables de la expresión del carácter. El modelo genético más simple propuesto para especies tetraploides de Panicum y Brachiaria, supone que la constitución genética de las plantas sexuales sería del tipo nuliplexo (aaaa) mientras que los individuos apomícticos serían uniplexos (Aaaa), siendo A el alelo dominante responsable de la apomixis. Los cruzamientos de individuos de este tipo generan progenies F 1 que segregan en una relación 1:1 (sexuales vs. apomícticos). Sin embargo, en este modelo existen ciertas cuestiones que no han sido resueltas. Por ejemplo en el caso de Panicum maximum (que es una especie apomíctica facultativa) si bien se postula que las plantas apomícticas son uniplexas (Aaaa) hasta ahora no se han encontrado en la naturaleza plantas completamente sexuales (aaaa). Esta situación se repite en otras especies apomícticas. Tampoco se puede explicar el hecho de que siempre que se utilizó como polinizador a una planta apomíctica ésta resultó ser un genotipo Aaaa. Cómo es posible que el genotipo uniplexo Figura 4: Los estudios con marcadores moleculares permiten la localización del locus que controla la apomixis. A la izquierda se muestra un gel de AFLP obtenido durante la construcción del mapa genético de Paspalum notatum. A la derecha vemos la región genómica que contiene al locus responsable de la apomixis (apolocus) definida por marcadores moleculares, varios de los cuales segregan completamente ligados al apo-locus y evidencian una fuerte restricción de la recombinación (tomado de Martínez et al 2003). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 289

311 sea el único existente en las poblaciones apomíc-ticas, cuando la especie no es completamente apomíctica?. El modelo tampoco es aplicable a otras especies como las incluidas en el género Paspalum, en donde la región genómica involucrada parece estar asociada con algún factor letal que afecta parte de los gametos masculinos (Fig. 4). 6 Transferencia del carácter apomixis a especies de interés agronómico Aunque desde el punto de vista del mejoramiento genético la apomixis puede considerarse como un sistema que restringe la recombinación genética, esta forma de reproducción constituye una herramienta única para desarrollar cultivares superiores y preservar combinaciones híbridas indefinidamente. Por ello la transferencia del carácter a las especies cultivadas ha sido perseguida desde hace tiempo. Básicamente se consideran tres grupos generales de procedimientos para la transferencia potencial de la apomixis a especies sexuales: i) hibridización clásica entre una planta sexual y un pariente apomíctico natural; ii) iniciación de la expresión de la apomixis por experimentos de bloqueo de genes (mutantes T, etiquetado transposicional, mutagénesis); iii) transformación de cultivares sexuales con genes que controlan la expresión del carácter. Las dos primeras aproximaciones ya fueron intentadas, aunque los proyectos no han sido exitosos hasta el momento, mientras que la tercera opción todavía continúa siendo hipotética. Los primeros experimentos dirigidos a introducir la apomixis a través de cruzamientos fueron realizadas cerca de 40 años atrás por D. F. Petrov, quien realizó hibridaciones entre maíz y razas tetraploides de Tripsacum dactiloydes (una especie diplospórica también perteneciente a la tribu de la Andropogóneas igual que el maíz). Posteriormente otros grupos de investigación produjeron híbridos interespecíficos de maíz- Tripsacum que se reproducen por apomixis. Sin embargo, como los genotipos obtenidos luego de una serie de retrocruzas con maíz son completamente macho-estériles, el progreso en la recuperación del genoma de esta especie está fuertemente asociado con la posibilidad de generar híbridos con algún grado de reproducción sexual (apomícticos facultativos). La imposibilidad de generar este tipo de individuos es la principal dificultad que enfrenta este sistema. Una dificultad adicional es el fuerte requerimiento de una relación 2:1 en el número de genomas haploides maternos y paternos que contribuyen a la formación del endospermo en maíz. Estos problemas han demorado el progreso de la introducción de la apomixis en maíz en los últimos años. La transferencia de la apomixis al mijo perla (Pennisetum glaucum) desde P. squamulatum por un programa de mejoramiento iniciado al final de los 70 es considerado el más avanzado de su clase. En este esquema las retrocruzas con Pennisetum glaucum han avanzado hasta la generación BC 7, mediante la selección de grandes progenies para identificar individuos apomícticos parcialmente macho fértiles. Estas plantas son morfológicamente muy parecidas al mijo perla, aunque producen un bajo número de semillas viables. Este hecho estaría vinculado a la formación del endospermo y es un inconveniente que aún resta resolver. En resumen, la factibilidad de la transferencia está aún por demostrarse. Los principales obstáculos son: equilibrar el balance endospérmico y lograr la expresión de la apomixis a nivel diploide. Aquí se debería lograr, seguramente a través de un esfuerzo multidiciplinario internacional, un conocimiento profundo de la relación entre la expresión de la apomixis y la poliploidía, especialmente de la autopoliploidía. En gramíneas de la subfamilia Panicoideas (Paspalum, Panicum, Tripsacum, Brachiaria, Melinis y otras) es posible que el sistema apomíctico difiera del que existe en Pooideas (Poa, Elymus y otras). Son necesarios conocimientos básicos más profundos de la embriología de especies silvestres con sistemas apomícticos, para determinar qué género o qué especie son los más adecuados como fuente para obtener los genes que podrían utilizarse hipotéticas transformaciones genéticas que permitan usar la apomixis en los cereales. Los intentos para generar mutantes apomícticas inactivando genes de la sexualidad por etiquetado transposicional o mutagénesis no han tenido éxito aún en re- 290 ORTIZ, J.P.A.; PESSINO, S.C.; QUARIN, C.L.

312 crear el carácter pero permitieron la identificación de varios genes involucrados en el control de etapas particulares de su desarrollo, como la proliferación del endospermo en ausencia de fertilización. La transformación genética de cultivares sexuales con genes que controlan el inicio del carácter es aún hipotética, ya que la identificación de esos genes no se ha logrado. 7 Caracterización molecular de la apomixis En los últimos años la tecnología de marcadores moleculares y los procedimientos de biología molecular han generado una cantidad considerable de conocimientos nuevos sobre las bases moleculares de la apomixis que pueden ser útiles para el futuro aislamiento del/los genes que controlan el carácter. Han sido identificados varios marcadores que cosegregan con la apomixis en distintos géneros de gramíneas como Tripsacum, Pennisetum, Brachiaria y Paspalum. Estos marcadores ligados al carácter pueden emplearse en el estudio de la transmisión del mismo en los programas de mejoramiento de especies apomícticas y eventualmente intentar cualquiera de las estrategias de clonado basadas en el mapeo genético para aislar el/los disparadores del fenómeno. El análisis molecular posibilitó la identificación de una región genómica específica de la aposporía (ASGR) en Pennisetum squamulantum que está ausente en individuos sexuales y donde la recombinación está severamente restringida. En Tripsacum dactyloides, Paspalum simplex y Paspalum notatum se detectaron regiones similares en donde numerosos marcadores aparecen completamente ligados al carácter (ver figura 4). La ausencia de recombinación bien podría estar asociada a una estrategia para evitar la dispersión de los factores que necesitan cosegregar estrictamente para determinar la apomixis. La existencia de una región ASGR de baja recombinación puede enmascarar la presencia de varios genes que gobiernan al carácter, haciéndolos aparecer y funcionar como una sola unidad genética. Una caracterización molecular detallada de este segmento cromosómico revelará en el futuro la variedad y el número de genes involucrados. Dado que varios elementos diferencian a la apomixis de la sexualidad (apomeiosis, partenogénesis, pseudogamia y a veces desarrollo autónomo del endospermo) la cuestión de si la apomixis es consecuencia de la expresión de un solo gen mayor o de un grupo de factores ligados y coadaptados es uno de los problemas a resolver en el futuro cercano. Varios trabajos recientes enfocados en estudios de expresión han informado el aislamiento de transcriptos de mrna específicos del desarrollo apomíctico en varias gramíneas La mayoría de los transcriptos aislados hasta el momento no muestran similitudes con genes de función conocida. En Paspalum notatum se identificó una familia génica de expresión aumentada en flores de plantas apospóricas cuyo producto proteico presenta sitios de control por el complejo de cdc2 ciclinas típicos de proteínas del citoesqueleto. Asimismo, por comparaciones de los perfiles proteicos en geles de dos dimensiones se identificó una a tubulina característica de líneas partenogenéticas. Análisis de expresión de este tipo pueden conducir en el futuro a la identificación y el clonado de genes involucrados en las primeras etapas del desarrollo apomíctico y al eventualmente al aislamiento del disparador mismo de la apomixis. 8 Perspectivas A pesar de que aún necesitan ser respondidas numerosas cuestiones sobre la acción de genes, la función y la regulación de la apomixis, se vislumbra para el futuro un escenario promisorio. Nuestro entendimiento de las bases moleculares de la apomixis se ha incrementado a causa del desarrollo de técnicas poderosas de biología molecular y al creciente interés en el tema despertado en las instituciones científicas e investigadores. Por otra parte, con el advenimiento del análisis genómico a gran escala se dispone de nuevas herramientas para el descubrimiento de genes y los análisis de expresión. Los resultados obtenidos hasta ahora han contribuido al mejoramiento de las especies apomícticas, muchas de las cuales son recursos naturales importantes y al uso de las ventajas intrínsecas de este modo de reproduc- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 291

313 ción en la generación de variedades mejoradas, como es el caso de las gramíneas forrajeras tropicales y subtropicales. Es de esperar que en los próximos años el conocimiento de las bases genéticas y moleculares del carácter se incremente considerablemente. Esto hará posible la comprensión del mecanismo biológico responsable de la apomixis, así como su transferencia a las especies de gran cultivo. Para esto se requerirá un fuerte apoyo financiero a los estudios básicos sobre el tema. Por otra parte, dado que la problemática del carácter es muy compleja será indispensable fortalecer la cooperación internacional ya existente para mantener un espacio de discusión y de intercambio de materiales e información. 9 Lecturas recomendadas ASKER, S.E. and JERLING, L. (1992). Apomixis in plants. CRC Press, London. DO VALLE, C.B. and MILES, J.W. (2001) Breeding of apomictic species. In: SavidanY, Carman JG and Dresselhaus T (eds.) The flowering of apomixis: from mechanisms to genetic engineering. Mexico DF. CIMMYT, IRD, European Commission DG VI (FAIR). pp KOLTUNOV, A.M. (1993). Apomixis: embryo sacs and embryos formed without meiosis or fertilization in ovules The Plant Cell 5: KOLTUNOW, A.M.; BICKNELL, R.A. and CHAUDHURY, A.M. (1995) Apomixis: molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilisation. Plant Physiol. 108: MARTÍNEZ, E. J.; HOPP, E.; STEIN, J.; ORTIZ, J.P. y QUARÍN, C.L. (2003) Genetic characterization of apospory in tetraploid Paspalum notatum based on the identification of linked molecular markers. Molecular Breeding 12: NOGLER, G.A. (1984) Gametophytic Apomixis. In: Johri BM (ed) Embryology of Angiosperms. Springer-Verlag, Berlin. PESSINO, S.C.; ORTIZ, J.P.A.; HAYWARD, M.D. and QUARÍN, C.L. (1999). The molecular genetics of gametophytic apomixis. Hereditas 130: SAVIDAN, Y. (2000) Apomixis: Genetics and Breeding. In: Plant Preeding Reviews, volume 18. J. Janick (Ed.). John Wiley & Sons, Inc. London. VIELLE-CALZADA, J.P.; CRANE, C.F.; STELLY, D.M. (1996a) Apomixis: The Asexual Revolution. Science 274: GRIMANELLI, D.; LEBLANC, O.; PEROTTI, E. and GROSSNIKLAUS, U. (2001) Developmental genetics of gametophytic apomixis. Trends in Genetics 17: ORTIZ, J.P.A.; PESSINO, S.C.; QUARIN, C.L.

314 VIII.-Capítulo 4 Técnicas de ingeniería genética para conferir resistencia a virus en plantas del Vas, M.; Distéfano, A.J.; Vazquez Rovere, C.; Hopp, H.E. 1 Introducción Las enfermedades de las plantas causan la pérdida de aproximadamente el 15% de la producción agrícola mundial. En particular, las infecciones virales producen perjuicios económicos significativos de manera directa, a través de una disminución del rendimiento por efecto de la enfermedad e indirecta, a través de un incremento en los costos debido a la utilización de semilla libre de virus (por ejemplo, en plantas de propagación clonal como papa, ajo y batata). Por otro lado, la exportación de ciertos productos se ve restringida debido a las limitaciones internacionales impuestas a la exportación de materiales fuera de la calidad y tolerancia fitosanitaria permitidas. Clásicamente, las enfermedades virales en plantas se controlan mediante distintas estrategias como el mejoramiento genético, el uso de semillas libres de virus, la rotación de cultivos y la técnica de protección cruzada (que se describe brevemente más adelante). A partir de 1983, cuando Fraley y col. obtuvieron plantas de tabaco y petunia transgénicas, se publicó un gran número de trabajos detallando la transferencia de genes foráneos a una cantidad creciente de especies de plantas. La ingeniería genética permite incorporar en las plantas nuevos caracteres de interés agrícola en forma horizontal, evitando así el traspaso de caracteres indeseables. De esta forma, la variedad transgénica adquiere un carácter nuevo al tiempo que mantiene intactos el fondo genético y el potencial productivo original, lo que permite encarar el mejoramiento rápido de cultivares ya utilizados por el agricultor. Los transgenes introducidos pueden provenir de otras variedades de la misma especie vegetal, de plantas de otras especies sexualmente incompatibles e incluso de organismos pertenecientes a otros reinos incluyendo animales y microorganismos. En sentido amplio existen dos formas de modificar plantas por ingeniería genética de manera de conferirles resistencia al virus: desencadenar resistencia mediante la expresión de secuencias genómicas derivadas del propio virus al que se desea combatir (llamada resistencia derivada del patógeno o PDR) o desencadenar resistencia mediante la expresión de genes no-virales que poseen actividad antiviral. 2 Resistencia a virus conferida por genes virales La prevención del desarrollo de enfermedades virales utilizando genes derivados del patógeno fue propuesta por primera vez a comienzos del siglo XX, cuando se demostró que las plantas de tabaco podían ser protegidas frente a la infección con una cepa severa del virus del mosaico del tabaco (Tobacco mosaic virus o TMV) si, previamente, se las había inoculado con una cepa menos virulenta del mismo virus (McKinney, 1929). Este tipo de estrategia, comúnmente denominada «protección cruzada», ha sido empleada para varios cultivos de importancia económica, incluyendo tomate, papaya, cítricos, etc. (Gadani y col., 1990). En 1985, Sanford y Johnston propusieron que la expresión de ciertos genes del patógeno en un hospedante alteraría el balance normal de los componentes virales y predijeron que esto conduciría al impedimento de la replicación o del movimiento del virus dentro de la planta más allá de la primera célula infectada (Sanford & Johnston, 1985). Las primeras plantas transgénicas con resistencia a virus se obtuvieron en 1986 mediante la expresión del gen que codifica para la cápside del TMV (Abel y col., 1986). Utilizando esta estrategia se logró obtener plantas resistentes a virus pertenecientes a casi todos los géneros de virus de plantas, principalmente en tobamo-, potex- y alfamovirus (Tabla 1). En general, las plantas protegidas muestran un retardo temporal del desarrollo de síntomas, una atenuación en la sintomatología característica de cada virus en parti- 293

315 Tabla 1: Ejemplos de resistencia a virus mediante la expresión de la proteína de cápside (CP) o nucleocápside (Gen N) viral en plantas transgénicas. Géneros de virus transgén Virus Especies vegetales Tobamovirus CP TMV; ToMV; AIMV tabaco; tomate Potexvirus CP PVX; CyMV; WCIMV tabaco Potyvirus CP PVY; TEV; PRV; PPV PPV; MDMV; SMV; WMV II; ZYMV tabaco; papa; papaya; maíz Carlavirus CP PVS tabaco; papa Luteovirus CP PLRV papa Comovirus CP SLRSV tabaco Nepovirus CP ArMV tabaco Tobravirus CP TRV tabaco Ilavirus CP TSV tabaco Geminivirus CP TYLCV tomate Tospovirus Gen N TSWV; INSV; TCSV; GRSV tabaco Los acrónimos utilizados (en orden alfabético) son: AIMV: Alfalfa mosaic virus; ArMV: Arabis mosaic virus; CMV: Cucumber mosaic virus; CyMV: Cymbidium mosaic virus; GRSV: Groundnut ringspot virus; INSV: Impatiens necrotic spot virus; MDMV: Maize dwarf mosaic virus; PLRV: Potato leaf roll virus; PPV: Plum pox virus; PRV: Papaya ringspot virus; PVS: Potato virus; PVX: Potato virus X; PVY: Potato virus Y; SMV: Soybean mosaic virus; SSLRSV: Strawberry latent ringspot virus; TCSV: Tomato chlorotic spot virus; TEV: Tobacco etch virus; TMV: Tobacco mosaic virus; ToMV: Tomato mosaic virus; TRV: Tobacco rattle virus; TSV: Tobacco streak virus; TSWV: Tomato spotted wilt virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; WClMV: White clover mosaic virus; WMV II: Watermelon mosaic virus II; ZYMV: Zucchini yellow mosaic virus. cular, una menor cantidad de sitios de infección y un menor título viral. Se demostró que hay una correlación entre la resistencia y el nivel de expresión de la proteína de la cápside, que la protección actúa en el plano celular y es superada por altas dosis de inóculo (viriones). En algunos casos es superada por inoculación con ARN viral. La protección es más efectiva para el virus homólogo al que dio origen al transgén. Sin embargo, abarca también a virus y cepas relacionadas aunque la eficiencia se va reduciendo a medida que la relación filogenética se hace más lejana. Además, se logró obtener resistencia a virus mediante la expresión de otras proteínas virales tales como las proteínas responsables de la multiplicación viral (por ejemplo ARN polimerasas dependientes de ARN) y las proteínas responsables del movimiento viral de célula a célula disfuncionales. Estas estrategias no se detallarán debido a que actualmente hay evidencias de que en varios casos su efectividad se debe a la inducción del mecanismo de resistencia mediada por ARN que se describe a continuación. En 1992 se demostró, por primera vez, que se podía obtener resistencia a virus mediante la expresión de un ARNm de cápside viral no traducible, es decir, no era necesaria la expresión de la proteína codificada por el transgén (Lindbo & Dougherty, 1992). A partir de entonces se publicaron numerosos trabajos profundizando la caracterización de este tipo de resistencia a virus, llamada en sentido amplio «resistencia mediada por ARN». Las plantas que muestran este tipo de resistencia presentan un fenotipo de inmunidad que se caracteriza porque no hay replicación viral detectable, no hay diseminación viral dentro de la planta y no hay síntomas debido a la enfermedad, o un fenotipo de recuperación que se caracteriza por una infección inicial (con producción de síntomas) que es seguida por un crecimiento posterior resistente a la infección y asin-tomático. En cualquiera de los dos casos, las plantas son solamente resistentes a la infección producida por virus mucho más estrechamente relacionados con el virus que dio origen al transgén que en el caso de protección mediada por cápside. El análisis de estas plantas en el plano molecular demostró que en general contienen copias múltiples del transgén y que si bien presentan un alto nivel de transcripción en el núcleo, los niveles estables del ARNm del transgén en el citoplasma son muy bajos. Usualmente se ob- 294

316 serva además metilación de la región codificante del transgén. 2.1 Mecanismo de protección debida a la expresión de la proteína de cápside viral (CP) Como se mencionó, las primeras plantas transgénicas con resistencia a virus se obtuvieron mediante la expresión del gen que codifica para la cápside del TMV. Estas plantas resultaron resistentes a la inoculación con partículas virales de TMV pero la resistencia era sobrepasada si se las inoculaba con ARN viral infectivo. Se postuló entonces que la protección se debía a la inhibición del desnudamiento viral en las células infectadas inicialmente. Varias líneas de evidencia apoyan esta hipótesis. Por ejemplo si se inoculan protoplastos derivados de plantas transgénicas que expresan la CP de TMV o plantas no transformadas con pseudoviriones (partículas formadas por la CP viral que contienen en su interior un ARNm no viral) de TMV que contienen ARNm que codifica para la enzima indicadora glucuronidasa (GUS), se observa que hay una marcada disminución de la actividad GUS en los protoplastos derivados de las plantas transgénicas. Esto se debe probablemente a la falla en el desnudamiento de los viriones (Osbourn y col., 1989). Más adelante se demostró que las proteínas de cápside mutagenizadas para anular la habilidad de autoagregarse no son capaces de conferir protección frente a TMV, y que las proteínas mutantes capaces de interactuar entre ellas con afinidad más alta conferían mayor protección que la proteína de cápside salvaje. Es decir que se estableció una relación directa entre el nivel de agregación de la proteína de cápside y el nivel de protección frente a TMV (Bendahmane y col., 1997). Si bien estos trabajos apoyan la hipótesis de que en las plantas transgénicas para CP hay una inhibición en una etapa temprana de la infección, no se puede descartar que, además, la expresión de proteína de cápside impida o modifique etapas más tardías de la infección. Si se injerta una porción de planta transgénica que muestra protección mediada por cápside entre una base y un ápice no transgénicos y se inocula la planta injertada en la base no transgénica, se observa que el virus no puede moverse hacia el ápice, es decir que no puede atravesar la zona transgénica protegida (Wisniewski y col., 1990). Sin embargo, la supresión del movimiento vascular involucra también el empaquetamiento y desnudamiento viral, y cabe la posibilidad de que la supresión del movimiento vascular sea una consecuencia secundaria de la inhibición del desnudamiento viral en las plantas expresando proteína de cápside. Otro caso muy estudiado es el del virus PVX de la papa. Las plantas transgénicas para la cápside de PVX resultan protegidas ante la inoculación con virus o con ARN viral (Hemenway y col., 1988). Se postula que la proteína de cápside se une al origen de ensamblado localizado en el extremo 5 del ARN viral, suprimiendo de esta manera la traducción de la replicasa viral (cuyo gen está localizado en el mismo extremo). También es posible que inhiba el movimiento de PVX de célula a célula, ya que la proteína de cápside es un cofactor esencial de la traslocación sistémica (Chapman y col., 1992). Como se desprende de los dos ejemplos descriptos, el mecanismo de protección mediado por la proteína de cápside no es único, y es particular para cada sistema virus-planta. 2.2 Mecanismo de protección debida al desencadenamiento de resistencia mediada por ARN Es conocido que distintos eventos de transformación obtenidos con la misma construcción genética pueden dar lugar a una variada gama de expresión del gen de interés (efecto de posición). Hay muchos ejemplos en los que la característica que uno desea expresar no se expresa o su expresión desaparece a lo largo de las distintas generaciones. Esta pérdida de la característica deseada (pero no del transgén correspondiente) se denomina silenciamiento génico y el primer ejemplo se describió en petunias para el gen de la chalcona sintetasa (Napoli y col., 1990). Dependiendo del nivel de acción en el cual ocurre el silenciamiento génico, se pueden distinguir el silenciamiento transcripcional (TGS) y el silenciamiento postranscripcional de genes (PTGS). El TGS se 295

317 manifiesta por una falta de expresión del gen en cuestión debido a la metilación de la región promotora, lo cual impide la normal transcripción del gen. Este tipo de silenciamiento se hereda meióticamente y se desencadena por interacción entre varias copias de un transgén que tienen homología en sus regiones promotoras. El PTGS se manifiesta por una supresión del efecto del gen en cuestión ocasionado por una degradación inducible y específica del ARNm transcripto. Para desencadenar este tipo de mecanismo se requiere de homología en la región transcripcional entre los genes que interactúan y puede estar acompañado de metilación de la secuencia de ADN codificante. Este mecanismo de degradación de ARN específico de secuencia evolucionó como un mecanismo de defensa antiviral en plantas. Si bien se describió por primera vez en plantas, se lo ha encontrado también en hongos (donde se denomina «quelling») y animales como nematodos, moscas o mamíferos (donde se lo denomina interferencia mediada por ARN). El PTGS puede ser desencadenado eficientemente por transgenes nucleares que dan lugar a transcriptos con estructura de ARN de doble cadena (ARNdc) o que expresan altos niveles o niveles aberrantes de transcriptos. En plantas también puede ser desencadenado por la replicación de virus que generalmente produce intermediarios replicativos de ARNdc. Una vez desencadenado el proceso, los intermediarios que contienen ARNdc son reconocidos por una nucleasa específica de ARNdc que los procesa en fragmentos de ARNs pequeños (llamados pequeños interferentes -«small interfering»- ARNs o ARNsi) de ambas polaridades y de 21 a 25 nucleótidos de longitud (Hamilton & Baulcombe, 1999). A su vez, se postula que Figura 1: Mecanismo propuesto para la iniciación, diseminación de la señal móvil y degradación del ARNm blanco durante el proceso de silenciamiento génico postranscipcional (PTGS) dentro de una planta. RdRP: ARN polimerasa dependiente de ARN. 296

318 los ARNsi actúan como guías para dirigir la maquinaria de degradación de ARN contra todo aquel ARN con homología a la secuencia desencadenante. Un aspecto a destacar es que el silenciamiento mediado por ARN es desencadenado localmente y luego transmitido a toda la planta vía una señal de silencia-miento móvil (Palauqui y col., 1997, Voinnet & Baulcombe, 1997). Si bien se desconoce por el momento la naturaleza de la señal, se postula que ésta contiene un componente de ácido nucleico que explicaría la especificidad de secuencia del mecanismo de degradación y un componente proteico. Asimismo, por prospección genética de mutantes de Arabidopsis se han identificado numerosos genes que codifican para una serie de factores que intervienen en el proceso de PTGS, como por ejemplo ARN polimerasas dependientes de ARN que sintetizan ARNdc, proteínas que forman parte de los complejos de degradación del ARN blanco, etc. Las plantas mutantes para estos genes no son capaces de desencadenar PTGS. Recientemente se han publicado numerosas recopilaciones del tema (Vázquez Rovere y col., 2002, Voinnet, 2001, Waterhouse y col., 2001). En la Figura 1 se esquematiza el mecanismo subyacente al PTGS. Dado que el PTGS es un mecanismo de defensa antiviral en plantas, resulta esperable que se haya seleccionado en los virus de plantas la capacidad de contrarrestar a este mecanismo. Congruentemente con esta especulación, se encontró que varios virus de plantas codifican para proteínas supresoras del PTGS (Anandalakshmi y col., 1998, Beclin y col., 1998, Brigneti y col., 1998). Luego de una búsqueda exhaustiva de supresores de silenciamiento en una gran cantidad de virus de plantas, Voinnet y col., concluyeron que prácticamente todos los virus llevan supresores de silenciamiento, que los genes que los codifican tienen secuencias y origen evolutivo diversos, y que los distintos supresores actúan inhibiendo el silenciamiento a distintos niveles (Voinnet y col., 1999). Algunos, como la proteína HC-Pro codificada por los potyvirus previenen la acumulación de los ARNsi, pero no eliminan la señal móvil que propaga el silenciamiento (Llave y col., 2000). Otros supresores, como la proteína p25 del virus PVX interfieren con la señal de propagación sistémica (Voinnet y col., 2000), y finalmente otros, como el codificado por el virus del achaparramiento del tomate (Tomato bushy stunt virus o TBSV), suprimen el silenciamiento sólo en las nervaduras (Voinnet y col., 1999). Incluso se han encontrado en virus animales supresores de silenciamiento que son funcionales en plantas (Li y col., 2002). Es interesante destacar que varios de los supresores de silenciamiento virales descriptos habían sido previamente caracterizados como proteínas responsables de la sintomatología, del movimiento viral y/ o del fenómeno de sinergismo en la virulencia combinada de dos o más virus. La posibilidad de la supresión del silenciamiento por parte de un virus que coexista con las plantas transgénicas protegidas por el mecanismo de silenciamiento génico debe ser tomada en cuenta ya que la infección de una planta silenciada con un virus heterólogo que lleva un supresor de silenciamiento puede dar lugar a la reversión del silenciamiento tornándola susceptible a la infección viral (Beclin y col., 1998). Resulta importante entonces estudiar qué virus coinfectan un mismo hospedador en condiciones naturales y en lo posible utilizar plantas transgénicas con resistencia a ambos virus. Un aspecto interesante a recalcar es que, debido a que el mecanismo de PTGS implica una muy baja acumulación del ARN derivado del transgén y una nula acumulación de proteínas, la estrategia de obtener resistencia a virus mediante el desencadenamiento de este fenómeno en plantas transgénicas es más atractiva desde el punto de vista de la evaluación de riesgos en cuanto a la bioseguridad de estos organismos genéticamente modificados u OGMs, que la sobreexpresión de genes que interfieran con el ciclo de multiplicación viral, como es el caso de la cápside u otras proteínas virales. Esto se debe a que la baja acumulación de ARN transgénico minimiza las posibilidades de una potencial recombinación homóloga con ARN de origen viral infectante. Por otro lado, la ausencia de la proteína codificada por el transgén minimiza drásticamente el análisis de riesgo alimentario del OGM y evita el riesgo de transcapsidación (la encapsidación del material genético de otros virus) en el caso 297

319 en que el transgén codifique para la proteína de cápside viral funcional. 3 Resistencia a virus conferida por genes no virales Además de la resistencia derivada del patógeno (PDR), en los últimos años se han explorado estrategias alternativas para la obtención de plantas transgénicas con resistencia a enfermedades virales. Entre ellas se destaca el uso de inhibidores naturales y específicos de la replicación viral como la proteína antiviral «pokeweed» (PAP), la expresión de anticuerpos en plantas o «plantibodies», la expresión antisentido de genes de plantas esenciales para el ciclo de vida viral y la expresión de la enzima oligoadenilato sintetasa de mamíferos en plantas (Truve y col., 1993). A continuación se describirán brevemente las dos primeras estrategias debido a que son las consideradas más promisorias. 3.1 Expresión de proteínas antivirales de origen vegetal Las proteínas antivirales de la planta Phytolacca americana (llamada «pokeweed» en inglés) (PAP) conforman uno de los grupos más importantes de proteínas usadas como inhibidores naturales de la replicación viral. Las proteínas PAP inactivan los ribosomas (pertenecen a la familia de las RIP o proteínas inactivadoras de ribosomas) y su aplicación exógena protege a plantas heterólogas de infecciones virales. Se demostró que la expresión de esta proteína en plantas de papa y tabaco transgénicas las protegía frente a una variedad de viruses, sea que éstos fueran inoculados mecánicamente o por áfidos vectores (Lodge y col., 1993). El estudio de esta resistencia demostró que la proteína PAP inhibía un paso temprano de la infección. Estas proteínas son potencialmente tóxicas para la planta huésped (Wang & Tumer, 2000). En los últimos años se encontraron o rediseñaron variantes menos tóxicas o no tóxicas de estas proteínas las que, expresadas en plantas transgénicas, confieren resistencia a virus sin producir el efecto de la inactivación de los ribosomas (Wang y col., 1998, Zoubenko y col., 2000). Por otro lado, se estudió la actividad antiviral de la proteína IRIP (proteína RIP obtenida de bulbos de iris) en plantas transgénicas de tabaco. Esta proteína es una ARN-N-glicosidasa y su expresión en plantas transgénicas no produjo cambios fenotípicos observándose una reducción significativa de las lesiones producidas por el virus TMV con respecto a las plantas control (Desmyter y col., 2003). Tabla 2: Plantas transgénicas con resistencia a virus autorizadas para su comercialización. (fuente AGBios: 298

320 Tabla 3: Plantas transgénicas con resistencia a virus en etapas avanzadas de experimentación en laboratorio (e) o de pruebas piloto a campo (c) en países en vías de desarrollo (fuente: FAO.Bio.Dec inventory_admin/dep/default.asp). Cultivo Virus País moscada ú Los acrónimos utilizados fueron: BGMV: Bean golden yellow mosaic virus; BYDV: Barley yellow dwarf virus; CLCV: Cotton leaf curl virus; CMV: Cucumber mosaic cucumovirus; CPsV: Citrus psorosis virus; CVBMV: Chilli vein-banding mottle virus; MSV: Maize streak virus; PAMV: Potato aucuba mosaic virus; PLRV: Potato leafroll luteovirus; PMV: Papaya mosaic virus; PRSV: Papaya ringspot virus; PStV: Peanut stripe virus; PVX: Potato virus X; PVY: Potato virus Y; RDV: Rice dwarf virus; RRSV: Rice ragged stunt virus; SCMV: Sugarcane mosaic virus; SMV2: Soybean mosaic virus; SPMFV: Sweet potato feathery mottle virus; TMV: Tabaco mosaic virus; TSWV: Tomato spotted wilt virus; TuMV: Turnip mosaic virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; ZAMV: Zantedeschia mosaic potyvirus. ZYMV: Zuchini yellow mosaic potyvirus. 299

321 La ventaja de expresar proteínas de tipo PAP en plantas transgénicas es que se logra resistencia a un amplio espectro de virus mediante la expresión de un único gen a diferencia de los métodos descriptos previamente que son específicos para un tipo de virus o virus cercanamente relacionados. 3.2 Expresión de anticuerpos en plantas transgénicas Una estrategia alternativa que se comenzó a utilizar en los últimos años es la expresión de anticuerpos completos o fragmentos de los mismos en plantas transgé-nicas para obtener resistencia a virus. En 1993 se demostró que la expresión constitutiva de un anticuerpo de cadena única (scfv) dirigido contra la proteína de cápside del virus del moteado crujiente de la achicoria (Artichoke mottled crinkle virus) causaba una reducción en la susceptibilidad al virus, que se ponía de manifiesto por una baja en la incidencia de la infección y un retraso en la aparición de los síntomas (Tavladoraki y col., 1993). En 1996 se expresó un anticuerpo monoclonal de cadena única (scfv) contra la proteína de cápside del virus de la vena necrótica amarillenta de la remolacha (Beet necrotic yellow vein virus) en Nicotiana benthamiana (Fecker y col., 1996) y en el 2000, Schillberg y col. mostraron que la expresión de la cadena Fv contra la proteína de cápside del virus TMV en la membrana plasmática de plantas de tabaco transgénicas confería resistencia al virus (Schillberg y col., 2000). Hasta el momento se desconoce el mecanismo por el cual la expresión de anticuerpos o fragmentos de los mismos confiere resistencia a virus, pero se demostró que para que la estrategia sea efectiva es indispensable lograr altos niveles de expresión y que los anticuerpos se expresen en el compartimento celular donde ocurre la replicación viral para que ésta sea inhibida en forma efectiva. Por último, los anticuerpos deben seleccionarse correctamente para que bloqueen los pasos cruciales en la replicación o transmisión del virus. En los últimos años se han desarrollado protocolos sencillos para mejorar los anticuerpos a utilizar, que incluyen la selección de anticuerpos monoclonales usando las tecnologías de hibridoma y construcción de genotecas utilizando la técnica de exhibición de epitopes en bacteriófagos o «phage display» (Schillberg y col., 2001). Es importante destacar que los anticuerpos monoclonales que reconocen a la polimerasa viral o alguna otra proteína viral con actividad catalítica, son más promisorios que los que reconocen proteínas estructurales como es el caso de la cápside viral. Por lo tanto, la expresión de anticuerpos dirigidos contra proteínas virales esenciales podría proveer una alternativa interesante para obtener resistencia a virus. 4 Plantas transgénicas con resistencia a virus cultivadas comercialmente o en etapas avanzadas de experimentación En los últimos años se ha autorizado el cultivo comercial y consumo de una variedad de plantas transgénicas con resistencia a virus basada en alguno de los mecanismos descriptos (Tabla 2). Existe otro grupo muy importante de plantas transgénicas con resistencia a virus que se encuentran en etapas avanzadas de experimentación o de pruebas piloto a campo. Es interesante constatar que los países en vías de desarrollo han adoptado esta tecnología y trabajan activamente en la obtención de plantas de cultivos de interés local con resistencia a virus (Tabla 3). 5 Lecturas Recomendadas ABEL, P. P., NELSON, R. S., DE, B., HOFFMANN, N., ROGERS, S. G., FRALEY, R. T. & BEACHY, R. N. (1986). Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science 232, ANANDALAKSHMI, R., PRUSS, G. J., GE, X., MARATHE, R., MALLORY, A. C., SMITH, T. H. & VANCE, V. B. (1998). A viral suppressor of gene silencing in plants. Proc Natl Acad Sci U S A 95, BECLIN, C., BERTHOME, R., PALAUQUI, J. C., TEPFER, M. & VAUCHERET, H. (1998). Infection of tobacco or Arabidopsis plants by CMV counteracts systemic posttranscriptional silencing of nonviral (trans)genes. Virology 252, BENDAHMANE, M., FITCHEN, J. H., ZHANG, G. & BEACHY, R. N. (1997). Studies of coat protein-mediated resistance to tobacco mosaic tobamovirus: correlation between assembly of mutant coat proteins and resistance. J Virol 71,

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324 VIII-Capítulo 5 Obtención de plantas libres de virus Conci, Vilma C. 1 Eliminación de virus Los virus de plantas son responsables de importantes pérdidas en los rendimientos, llegando en algunos casos a ser limitantes para el cultivo. La mayoría de los virus no se transmiten por semilla, por lo tanto, las especies que se multiplican por esta vía tienen la posibilidad de liberarse de ellos en forma natural. Por otra parte, cuando las especies que se propagan exclusivamente en forma agámica son infectadas sistémicamente por virus ellos son transmitidos, con alta eficiencia, desde la planta madre a la descendencia. Esta situación. que es normal en especies que se multiplican por bulbos, tubérculos, esquejes o estacas permite que la infección continúe de generación en generación y se disemine a diferentes regiones a través del comercio de estos propágulos. Ejemplo de ello son ajo, frutilla, frutales de carozo o pepita, yuca, papa, batata y numerosas especies ornamentales. En estos casos, la obtención y multiplicación de plantas libres de virus por medios artificiales juega un papel importante para mejorar la producción y calidad de estas especies. Existen numerosos ejemplos respecto a los beneficios obtenidos como consecuencia del empleo de plantas libres de virus, no sólo por los incrementos en la producción sino que además ha permitido la recuperación de áreas de cultivo que habían sido prácticamente abandonadas. Una larga lista de especies han sido liberadas de virus a través de la regeneración de plantas in vitro. El sistema más frecuentemente utilizado y con mayores éxitos es el cultivo de meristema, suplementado en muchos casos por tratamientos de termoterapia o quimioterapia. 1.2 Cultivo de meristemas Esta técnica consiste en aislar el meristema y sembrarlo en un medio de cultivo adecuado que posibilite el desarrollo de una planta completa. El término cultivo de meristema, por lo general, no es correctamente empleado, ya que en la mayoría de los casos se siembra el domo meristemático acompañado por uno o dos primordios foliares. El domo es una estructura de menos de 0,1 mm de diámetro muy difícil de extraer con éxito en forma aislada, y de la cual resulta con frecuencia complicado obtener plantas completas. Para ello es necesario un medio de cultivo con una concentración de nutrientes muy equilibrada y condiciones ambientales muy estrictas. Por consiguiente los resultados en ese sentido han sido muy pobres. Por esta razón, en la mayoría de los casos, se utiliza el domo acompañado de uno ó más primordios foliares. Tal vez lo más aconsejable sería utilizar el término cultivo de «yema», o «brote», o «tallo». A pesar de ello, en este capítulo utilizaremos la denominación cultivo de meristema por ser esta la terminología más difundida, aunque no sea estrictamente correcta. En general se considera que las plantas provenientes del cultivo de meristema son idénticas u homólogas a la planta madre de donde se extrajo el explanto. Por el contrario, las plantas derivadas de otros tejidos como callos, nucela, primordios florales o protoplastos, usualmente presentan distintos grados de variabilidad. Esto último no es deseable para la producción de plantas libres de virus, donde el objetivo que se persigue es mejorar la sanidad de la planta pero conservar el resto de sus características agronómicas. Sin embargo, es importante aclarar que han sido señaladas ciertas mutaciones en plantas provenientes de cultivo de meristema, pero con mucha menos frecuencia y menos importantes que las detectadas con otros sistemas de obtención de plantas in vitro. El cultivo de meristema ha sido utilizado con éxito para distintos objetivos, entre ellos los más frecuentes son la rápida clonación de material deseable (micropropagación), conservación de germoplasma a baja temperatura o criopreservación y para la obtención de plantas libres de patógenos sistémicos, entre ellos los virus, que son el objetivo de este capítulo. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 303

325 2 Distribución de los virus en la planta Los virus en la planta no están uniformemente distribuídos. En las infecciones sistémicas algunos están limitados al floema o a pocas células parenquimáticas adyacentes; otros involucran a todas, o casi todas, las células de la planta. Existen otros virus que dejan sectores de tejidos sin infectar y sólo unos pocos invaden los nuevos tejidos meristemáticos. Los meristemas suelen tener pocos o ningún virus. Las razones para que ello ocurra no están esclarecidas completamente pero se mencionan como posibles las siguientes: 1.- Sistema vascular poco diferenciado. Los virus son rápidamente transportados a lo largo de toda la planta por el floema y así se distribuyen sistémicamente. Los meristemas no tienen tejido vascular formado, por lo tanto, el avance es solamente a través del movimiento célula a célula. Se comprobó que el Tobacco mosaic virus (TMV) y el Potato virus X (PVX) avanzan 1 a 8 cm/h por el tejido vascular y 5 a 15 µ/h de célula a célula. Por esta razón se supone que las células meristemáticas no están completamente invadidas por virus cuando están en activo crecimiento. 2.- Elevada actividad metabólica. Presumiblemente es más difícil para un virus invadir células con elevada actividad metabólica, como es el caso de las células meristemáticas, donde tiene lugar una activa mitosis. 3.- Elevadas concentraciones de auxinas. Se ha observado que elevadas concentraciones de 2,4-D en el medio de cultivo inhiben la multiplicación de los virus. Por lo tanto se puede suponer que las altas concentraciones de auxinas endógenas existentes en los ápices meristemáticos pueden producir un efecto similar. 3 Meristema apical El meristema apical incluye las células meristemáticas iniciales y sus derivadas inmediatas del ápice de la raíz o del brote. El número de células iniciales es variable y pueden presentarse en una o más filas. Dentro del meristema apical se distinguen dos zonas de tejido: la túnica, que consta de una o más capas periféricas de células, y el cuerpo, masa celular rodeada por la túnica. La demarcación entre ambas zonas se deduce de las diferencias en la división de las células. Las capas de la túnica presentan predominantemente divisiones anticlinales, es decir, experimentan un crecimiento en superficie. Las células del cuerpo se dividen según varios planos y la masa crece en volumen. El concepto de túnica-cuerpo fue desarrollado refiriéndose a las angiospermas pero resulta poco apropiado para la caracterización del meristema apical de las gimnospermas. En este grupo se presentan comúnmente varias zonas de crecimiento derivadas de un grupo de células iniciales superficiales. El diámetro de los ápices oscila entre 90µ en algunas angiospermas a 3,5mm en el caso de Cyca revoluta. La forma y el tamaño del ápice cambian notoriamente durante el desarrollo de la planta. Las hojas se inician mediante divisiones periclinales de un pequeño grupo de células situadas al lado del meristema y su situación en relación al meristema apical varía en las diferentes especies (Fig. 1). Primordios foliares Nudos Figura 1: Esquema ilustrativo de la iniciación de la hoja en el ápice del brote de dicotiledónea de hojas opuestas (Esau, 1959). 4 Factores que pueden afectar la producción de plantas libres de virus Varios factores pueden afectar el buen desarrollo in vitro de una planta a partir de un meristema: el medio de cultivo empleado, el estado fisiológico del explanto, la concentración de hormonas endógenas del 304 CONCI, Vilma C.

326 explanto, las contaminaciones internas o externas producidas durante el desarrollo del cultivo, el tamaño y localización del explanto, etc. Mencionaremos aquí algunas consideraciones haciendo especial referencia a aquellas que afectan la obtención de plantas libres de virus. - Localización del explanto: frecuentemente se utilizan meristemas apicales y axilares con buenos resultados. Sin embargo es aconsejable el uso de yemas terminales ya que tienen un mayor crecimiento potencial que las yemas laterales. En general, los meristemas más jóvenes se desarrollan mejor que los viejos y producen mayores cantidades de plantas libres de virus que las yemas laterales, probablemente porque tienen un crecimiento más activo que las axilares. No obstante, también es posible la obtención de plantas sanas a partir de yemas axilares. - Estación o momento de la extracción: los meristemas en activo crecimiento son los más recomendados por su alto potencial de desarrollo, situación que favorece las posibilidades de obtener plantas libres de virus. Para especies vegetales con períodos de dormancia definidos los mejores resultados se obtienen cuando los meristemas están despiertos y comienzan a brotar. En el caso de ser necesario se recomienda despertar el material. Los tratamientos más usados consisten en someterlo a períodos de frío (variable según la especie) y/o el uso de ácido giberélico. - Tamaño del explanto utilizado: el meristema tiene una serie de requerimientos nutricionales para cumplir sus funciones de autoperpetuación y de generar células para formar tejidos definidos. Por lo tanto, al ser retirado de la planta debe ser sembrado en un medio de cultivo apropiado, así rápidamente desarrolla en una planta completa. Cuanto más pequeño sea el meristema (explanto) más difícil será encontrar el medio de cultivo adecuado que permita un buen desarrollo. Se ha observado que sembrar sólo el domo meristemático, en general no da buenos resultados. En la mayoría de los casos no se desarrolla una planta, sólo produce callo que luego puede, o no, regenerar plantas. Como se mencionó anteriormente, la diferenciación a partir de callo implica un incremento en la posibilidad de aparición de mutaciones y de variabilidad no deseada cuando se intenta obtener plantas genéticamente iguales a las donantes de explantos. Por esta razón generalmente se cultiva el domo, con uno o dos primordios foliares, a partir del cual se obtiene con frecuencia una planta completa. El tamaño del explanto, así como el número de primordios que deba poseer, dependerá, en cada caso, del objetivo que se persiga, la especie vegetal que se trate y el o los virus involucrados. En términos generales, cuanto más grande sea el explanto, mayor será la posibilidad de regenerar plantas, pero menor la posibilidad de obtener plantas libres de virus. Si por el contrario se parte de plantas ya saneadas, o lo que se desea es sólo la multiplicación del material in vitro, se podrán usar yemas o brotes de mayor tamaño y asegurar así el desarrollo de una planta sin mayores requerimientos nutricionales. Existe un gradiente de incremento en la concentración de virus desde el domo meristemático hacia los sucesivos primordios foliares coincidiendo con el grado de diferenciación. Esto significa que la probabilidad de obtener plantas libres de virus es inversamente proporcional al tamaño del explanto utilizado. Explantos de entre 0,2 y 0,5 mm son los que más frecuentemente producen plantas libres de virus. También se han informado, sin embargo, buenos resultados con el empleo de meristemas más grandes. El tamaño recomendado es variable y depende del hospedante, de tratamientos previos (termoterapia, quimioterapia, etc.) y del (o los) virus involucrados. En algunos casos no sólo es importante considerar la especie hospedante sino también el cultivar, ya que se han detectado notables diferencias entre ellos. Por otra parte, es probable que el tamaño del meristema por si solo no sea el factor que determina el éxito en la obtención de plantas libres de virus. Se han detectado numerosos virus en meristemas apicales de 0,1-0,5mm en diferentes especies (clavel, poroto, tabaco, tomate, petunia, papa, etc.). Sin embargo se ha logrado la obtención de plantas sanas con explantos de esos tamaños o Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 305

327 mayores, por lo que se podría suponer que la eliminación de virus ocurre también durante el proceso de cultivo in vitro o por alguna otra razón no aclarada todavía. 5 Desarrollo del cultivo El primer paso es la extracción del meristema o explanto. Para ello se corta una porción de tejido de aproximadamente 1cm que incluye el meristema y se desinfecta. Esto frecuentemente se realiza mediante la inmersión en alcohol seguida de inmersión en hipoclorito de sodio o calcio. Luego en la cámara de flujo laminar y con la ayuda de instrumental estéril y bajo microscopio estereoscópico se procede a la escisión del explanto. Una vez extraído se coloca en un medio de cultivo adecuado en el cual es mantenido, para su desarrollo, bajo condiciones apropiadas de luz, temperatura y humedad. - Fase I: Etapa de iniciación: el objetivo de esta primera etapa es iniciar el desarrollo del explanto cultivado en forma aséptica. En general ocurre primero un aumento del tamaño y luego el tejido puede ir adquiriendo lentamente pigmentación verde. Posteriormente irán desarrollándose brotes o plantas completas a partir de las cuales pueden obtenerse yemas axilares. - Fase II: Etapa de multiplicación: en esta etapa el objetivo es la multiplicación activa del explanto para la producción de numerosas plantas a partir de una, constituyendo así un clon proveniente de un solo meristema, denominado en este caso «mericlon». La multiplicación o micropropagación puede efectuarse por proliferación de brotes axilares, brotes adventicios, formación de embriones somáticos, etc., tratando siempre de evitar la formación de callo como paso previo a la diferenciación. La etapa de multiplicación puede involucrar varios repiques del material a medio de cultivo fresco. Se ha visto con frecuencia que la tasa de multiplicación varía con el tiempo de permanencia del explanto en el medio de cultivo. Es frecuente que después de 2 o más subcultivos aumente el número de yemas que se producen a partir de un explanto. Sin embargo no es aconsejable mantener el material indefinidamente en esta etapa, ya que se ha observado un aumento de la variabilidad cuando las plantas son mantenidas por largos períodos en estas condiciones. En general, se considera que subcultivos es lo máximo que debería mantenerse el material en esta etapa. - Fase III: Etapa de acondicionamiento para el transplante a tierra: frecuentemente las plantas desarrolladas in vitro no poseen raíces o, si las tienen, muchas veces no son funcionales. En general tienen malas conexiones vasculares entre la raíz y el tallo. A nivel foliar puede estar alterada la producción de clorofila. Los estomas no funcionan o lo hacen muy lentamente y la capa de cera epicuticular es muy reducida. La formación de raíces adventicias es relativamente fácil de conseguir en plantas herbáceas, y dificultosa en leñosas. Existe una etapa de inducción de raíces, de iniciación del crecimiento y de elongación de las mismas. En esta fase del crecimiento se suele incrementar la intensidad de luz para favorecer la rusticación de las plantas pero hay que tratar de que la misma no afecte a las raíces. Esto puede mejorarse cubriendo la base de los tubos con papel de aluminio o usando 0,3% de carbón activado en el medio de cultivo para proporcionar sombra a las raíces. Las plantas que se propagan por bulbos, tubérculos, rizomas, etc., pueden ser inducidas a formarlos in vitro para mejorar la eficiencia en el transplante, ya que éstos pueden ser cosechados del tubo de ensayo y sembrados directamente en tierra sin mayores dificultades. -Transplante: en el momento del transplante es importante no dañar las raíces. Es necesario lavarlas cuidadosamente para retirar los restos de agar, debido a que los medios de cultivo ofrecen un buen sustrato para el desarrollo de hongos y bacterias que pueden afectar el desarrollo de la planta en el suelo. El mayor problema en esta etapa es la deshidratación debida a algunas características anatómicas que presentan las plantas creciendo in vitro (reducida cera epicuticular, lentitud de movimiento estomático, abun- 306 CONCI, Vilma C.

328 dantes espacios intercelulares, dificultades en la conexiones entre el tallo y la raíz). Conviene transferir las plantas a macetas y mantenerlas con alta humedad relativa durante los primeros 15 días. Se han observado buenos resultados con el uso de rocío artificial o neblina. Otra práctica frecuente es cubrir las plantas con polietileno o recipientes de vidrio transparente, a modo de cámara húmeda, y descubrirlas progresivamente hasta destaparlas completamente al cabo de 3 ó 4 semanas. 6 Multiplicación del material libre de virus ex vitro Las plantas libres de virus deben ser multiplicadas bajo condiciones controladas para evitar su recontaminación. Una vez rusticadas y adaptadas nuevamente a las condiciones ex vitro ellas pueden ser multiplicadas bajo jaulas antivectores todo el tiempo que se considere necesario. En esta etapa es importante evitar que las plantas se reinfecten. Es recomendable la esterilización del suelo para evitar la contaminación con nematodes y hongos, que en algunos casos son transmisores de virus. Las jaulas deben estar revestidas de una malla muy fina para evitar la entrada de los vectores. Es recomendable, para evitar la entrada de los vectores, utilizar una doble puerta que permita abrir una de las hojas y recién cuando está cerrada, abrir la otra. Periódicamente la malla debe ser controlada para detectar inmediatamente la presencia de roturas que dejen expuestas a las plantas. A pesar de estos cuidados, es recomendable aplicar insecticidas y mantener libre de malezas dentro y fuera de la jaula, ya que las mismas pueden actuar como reservorios de vectores. Si bien la sanidad del material introducido a las jaulas debe ser previamente controlada, es conveniente, en esta etapa, repetir los análisis para detectar rápidamente la presencia de una infección a fin de eliminarla antes de que se propague. En estas condiciones es posible mantener como «plantas madres», por mucho tiempo, un stock de material libre de virus a partir del cual se pueden hacer las sucesivas multiplicaciones. La etapa de multiplicación masiva, o a gran escala, se realiza a campo en áreas aisladas de focos de contaminación. Esta etapa se extiende todo el tiempo necesario hasta la obtención del número requerido de individuos para realizar la producción a nivel comercial. Si el área protegida está lo suficientemente alejada de plantas infectadas y se evita el acceso de los vectores, es posible mantener las plantas libres de virus por muchos ciclos de cultivo. Son fundamentales los análisis periódicos que permitan llevar un registro del estado sanitario del material. 7 Algunas alternativas para mejorar la eficiencia en la producción de plantas libres de virus - Termoterapia: es la técnica más antigua utilizada para la liberación de patógenos en plantas. No obstante, es difícil la obtención de plantas libres de virus con el empleo de altas temperaturas solamente. Mantener las plantas enfermas por períodos prolongados en termoterapia disminuye la concentración de virus, pero al llevar las plantas nuevamente a condiciones normales, en poco tiempo recuperan la concentración original. Una práctica muy usada es la combinación de la termoterapia y el cultivo de meristemas. Esto implica mantener las plantas en termoterapia por un período variable de tiempo y temperatura (generalmente entre 34 y 38 C desde una a varias semanas), luego se realiza la extracción del meristema, se siembra en el medio de cultivo y se continúa con los pasos convencionales para su desarrollo. Esta práctica no es efectiva para todos los virus por igual, depende del virus y del hospedante. Se ha observado que un mismo virus en distintas especies se inactiva en forma diferente. Generalmente, esta práctica ha resultado más efectiva en virus de partículas alargadas, y menos eficiente para virus poliédricos. Podría suponerse que cuanto más largo es el tratamiento de calor, resulta más efectivo; sin embargo, no siempre es así. En crisantemo y en ajo se ha mencionado, por ejemplo, que tratamientos de días pueden ser efectivos para la liberación de algunos virus; en cambio, tratamientos más prolongados no siempre producen mayor porcentaje de plantas sanas. Estos tratamien- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 307

329 tos prolongados, por otra parte, dificultan la implantación in vitro del tejido, lo cual se traduce en un número más reducido de plantas obtenidas. En algunos casos las bajas temperaturas (5 C) seguidas del cultivo de meristemas fueron utilizadas con éxito para la eliminación de virus. Esta práctica fue aplicada principalmente en el caso de viroides, los cuales se desarrollan bien con altas temperaturas. - Quimioterapia: el uso de antivirales sería la solución definitiva para estas enfermedades; sin embargo, hasta ahora no se ha encontrado un producto que por sí solo cumpla esta función. Algunas sustancias químicas ocasionan una disminución en la concentración de virus existentes en la planta y atenúan, o suprimen, los síntomas típicos de los virus, pero, una vez suspendido el tratamiento se recupera la concentración original. Han sido evaluadas diferentes sustancias pero la más utilizada es el Ribavirin o Virazole (1-β-Dribofuranosyl-1, 2, 4 triazole 3- carboxamide). Un modo adecuado de emplear los antivirales es combinándolos con el cultivo de meristemas. También han sido aplicados directamente a los meristemas in vitro. En este caso, el antiviral es colocado en medio del cultivo en concentraciones variables, que van desde 10 a 50 mg/l, y en algunos casos hasta 100 mg/l. Las plantas son mantenidas bajo la acción del antiviral por largos períodos que incluyen varios subcultivos. Un problema importante con el Virasole es su fitotoxicidad, que a su vez depende de la dosis empleada y de la especie de planta utilizada. El éxito del proceso en muchos casos requiere de varios meses de tratamiento y la fitotoxicidad del antiviral constituye una dificultad. También se han obtenido plantas libres de virus a partir de callos a los que previamente se les aplicó Virasole, aunque esta práctica no ha sido eficiente en todos los casos. - Electroterapia: el método consiste en aplicar corriente eléctrica a yemas por un período variable de tiempo para obtener plantas libres de patógenos. Se menciona que la aplicación de electricidad produce degradación de las partículas y pérdida de infectividad. Esta técnica ha sido citada para liberar del mosaico al almendro cv Caetanuccia. Para ello los brotes fueron sometidos a 500V por tiempos variables y luego injertados sobre pies sanos (obtenidos por semilla). Se señaló que con 5 minutos de tratamiento los resultados fueron buenos y con 20 minutos se obtuvo completa inactivación. El método también ha sido empleado para eliminar bacterias de caña de azúcar, Potato leaf roll virus de papa, Dasheen mosaic virus de araceas y Banana streak virus de banana, entre otras, aplicando 5-30V a las yemas por un período de 5 minutos. En este caso se obtuvo una eficiencia del 3 al 60%, dependiendo del cultivar y el patógeno. - Cultivo de domos proveniente del disco basal (stem-disc dome culture): el procedimiento consiste en la obtención de plantas libres de virus a partir del cultivo de estructuras con forma de domo, diferenciadas a partir del cultivo del disco basal de dientes de ajo. Se ha informado la diferenciación de brotes a partir del cultivo del disco basal de dientes de ajo en 1 mes de cultivo. Este método fue designado por los autores (Ayabe y Sumi, 1998) como cultivo del disco basal ( stem-disc culture ). Una modificación posterior de esta técnica consiste en la extracción de las estructuras con forma de domo y su posterior cultivo en un medio adecuado para la obtención de plantas. - Microinjerto de ápices caulinares in vitro para obtención de plantas de naranjo libres de virus: consiste en extraer el ápice caulinar de la variedad a injertar, constituído por el domo apical y primordios foliares, y luego sembrarlo sobre la superficie decapitada del epicótilo de una plántula de 2 semanas de edad (patrón) proveniente de semilla crecida in vitro. Ver VIII-7 (plantas cítricas libres de enfermedades) 8 Análisis de las plantas obtenidas o indexing De lo expuesto previamente surge que existen varias alternativas para obtener plantas libres de virus a partir del cultivo de meristemas. Si bien existen algunos 308 CONCI, Vilma C.

330 lineamientos, o consideraciones generales para tener más probabilidades de éxito, no hay proceso que ofrezca total seguridad. La etapa decisiva en este sistema es el análisis que permite comprobar si realmente se ha producido la total erradicación de los virus. En la bibliografía se señalan distintos porcentajes de éxito en el proceso. Esto significa que empleando el mismo protocolo, en el mismo momento, con el mismo material, se consiguen plantas sanas y plantas que aún permanecen infectadas. Por lo tanto, la única forma de separar las plantas sanas de las enfermas es un análisis que permita distinguirlas para luego multiplicar solo aquellas que fueron liberadas de los virus. El éxito de un programa de producción de plantas libres de virus no depende de la obtención de un alto porcentaje de plantas sanas en al primera etapa, sino en la obtención de al menos unas pocas plantas madres realmente libres de patógenos. Si el número es escaso pueden ser multiplicadas por diferentes sistemas, pero si alguna de ellas está contaminada, todo el trabajo será inútil, porque al final, después de las multiplicaciones a campo, lo más probable es que tengamos todas las plantas enfermas. Las plantas deben ser analizadas una por una para hacer una buena selección de «plantas madres» a partir de las cuales se iniciarán los procesos de multiplicación del material. Es recomendable hacerle más de un análisis para asegurar su sanidad, es preferible que sea en etapas diferentes a lo largo del proceso, y en lo posible por técnicas distintas. Para realizar un análisis confiable hay que tener en cuenta varios factores que son específicos para cada combinación planta-patógeno. Es importante el empleo de sistemas de alta sensibilidad que nos permitan detectar los virus aun en bajas concentraciones; sin embargo, no existe un sistema que sea infalible, siempre hay un límite de concentración por debajo del cual el virus no puede ser detectado. Para evitar errores en este sentido es recomendable tener en cuenta algunos factores. Como ya se ha mencionado, la concentración de virus no es igual en todas las partes de una planta; por lo tanto, si queremos hacer un análisis confiable hay que establecer qué tejidos y órganos son los que concentran más el patógeno y realizar la prueba a partir de ellos. Del mismo modo también se ha comprobado que existen fluctuaciones a lo largo del ciclo de cultivo; por lo tanto, es conveniente realizar el análisis cuando la concentración de virus es mayor. Esto es importante cuando se prueba el material a campo. La elección de la técnica de análisis dependerá del patógeno que se desea eliminar y de las posibilidades para realizarla. Cuanto más temprano se descarten las plantas contaminadas más seguro será el sistema. Una planta infectada siempre es un foco de contaminación. Por más cuidados que se tengan siempre se corren riesgos. Cuando las plantas están in vitro, en general, la concentración de virus es muy baja, probablemente debido a las condiciones de cultivo, la concentración de hormonas en el medio, u otros factores no bien establecidos. Sin embargo, es recomendable hacer un análisis riguroso antes de empezar con la micropropagación para hacer el primer descarte de individuos enfermos. Frecuentemente se menciona en esta etapa el empleo de la técnica inmunoenzimática de doble sándwich de anticuerpos (DAS-ELISA). Esta prueba se realiza en una placa de poliestireno con 96 celdillas en la cual se lleva a cabo una prueba por celdilla. En el primer paso cada celda es tapizada por el anticuerpo específico para el patógeno que se está analizando. Luego se coloca el extracto de la planta a probar. Si los virus están en el mismo serán atrapados por el anticuerpo previamente colocado. En el tercer paso se aplica un anticuerpo combinado con una enzima y en el último paso se coloca el sustrato específico para la enzima. Si el virus está presente en la muestra se produce el sándwich anticuerpo-virus-anticuerpo conjugado con la enzima, el sustrato es desdoblado y la reacción vira al color amarillo (respuesta positiva, planta enferma). (Fig. 2). Esta técnica tiene varias ventajas, ya que permite el análisis simultáneo de muchas muestras (96 celdillas por placa y se pueden hacer varias placas simultáneamente). Es relativamente fácil de usar y de bajo costo. Sin embargo, nuestra experiencia nos indica que esta prueba no es lo suficientemente sensible para detectar los virus en algunos casos. Muchas de las plantas in vitro que dan resul- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 309

331 tados negativos mediante DAS-ELISA resultan positivas cuando se prueban por otra técnica. Algunas variantes, como ELISA en membrana de nitrocelulosa o Dot Blot, han sido empleadas con resultados más satisfactorios; sin embargo, estas técnicas por sí solas permiten el escape de muchas plantas infectadas. Figura 3: Extracto vegetal conteniendo una mezcla de virus probado por ISEM-D con antisuero para Garlic virus A. Izq., partícula viral decorada con el antisuero utilizado. Der., partícula viral no decorada de una especie viral diferente. Mejores resultados se han obtenido con el empleo de técnicas que combinan la Figura 2: Placa de DAS-ELISA mostrando resultados positivos (celdillas oscuras) y negativos (celdillas claras). serología con la microscopia electrónica como son la inmunoelectromicroscopía con o sin decoración (ISEM o ISEM-D). En esta técnica se tapiza una grilla porta especimen con anticuerpo y luego se coloca sobre ella el extracto de la planta a probar. Si las partículas virales están presentes quedarán atrapadas al anticuerpo. Luego se contrasta y se observa por el microscopio electrónico (ME), donde se pueden ver las partículas de virus que han sido selectivamente atrapadas. Esto es lo que se llama ISEM. Si antes de contrastar se aplica otra vez el antisuero y éste es atrapado por las partículas virales las mismas se verán más oscuras al ME, decoradas (ISEM-D) y serán más fáciles de detectar (Fig. 3). Estas técnicas son altamente sensibles, permiten la observación directa del virus por lo cual no hay falsos positivos y no se requiere un antisuero de alta calidad para su desarrollo. El grave inconveniente con ellas es que no son de uso masivo, porque es engorroso analizar gran cantidad de muestras, y por otra parte, se requiere de un ME, que es un equipo altamente costoso. Las técnicas basadas en la detección de los ácidos nucleicos han mostrado un gran desarrollo y evolución en la última década, y son utilizadas con frecuencia debido a su alta sensibilidad y especificidad. El uso de sondas moleculares ha dado buenos resultados. Consiste en dar condiciones para que el ácido nucleico del patógeno, fijado sobre un soporte sólido (membrana de nylon), se una con un fragmento de ácido nucleico complementario, marcado con moléculas radioactivas, o con un antígeno que luego será reconocido por un anticuerpo específico que será detectado por colorimetría o fluorescencia. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus variantes son las técnicas de mayor sensibilidad con que se cuenta actualmente. Entre ellas se mencionan: PCR anidado, transcripción reversa (RT), inmuno captura (IC) PCR post. transcripción reversa (RT-PCR), entre otras. La PCR consiste en amplificar un fragmento del genoma del virus mediante la utilización de dos iniciadores que hibridan específicamente en el genoma del patógeno. La técnica permite producir, en corto tiempo, muchas copias del segmento del genoma comprendido entre los 2 iniciadores, de tal forma que luego es posible observarlo con facilidad en un gel (Fig. 4). Esto posibilita la detección de los virus, aun en bajísimas concentraciones. Esta técnica además puede ser combinada con la serología y ser realizada en placas como las de ELISA, lo que permite el análisis simultáneo de muchas plantas. Estas pruebas, si bien son altamente sensibles, no son aún de uso masivo porque tienen un costo muy elevado. Para obtener resultados en forma práctica y confiable es posible también la combi- 310 CONCI, Vilma C.

332 Figura 4: Fragmentos amplificados por IC-RT- PCR. Líneas 1-4, segmentos de 489pb correspondientes a Onion yellow dwarf virus; líneas 4-5, segmentos de 566pb correspondientes a Leek yellow stripe virus; línea 6, marcador de peso molecular. nación de varias pruebas, pudiendo, por ejemplo, aprovechar la practicidad del ELISA y la sensibilidad de las técnicas moleculares, o de ISEM u otras. En este caso, las plantas que resultan negativas para el test de ELISA pueden ser luego analizadas por una técnica más sensible y disminuir así el número de pruebas complicadas o costosas. Esto depende de la cantidad de plantas que ELISA sea capaz de detectar, porque si no es lo suficientemente sensible tendremos que repetir la prueba con todas, o casi todas las muestras. Como se mencionó anteriormente, la concentración de virus en las plantas in vitro en general es baja, por lo tanto, se corre el grave riesgo de considerar como sanas plantas que, en realidad, están infectadas. Por esta razón se hace casi obligatorio repetir los análisis cuando las plantas son transferidas al suelo. Es necesario dejar pasar cierto tiempo antes de hacer el análisis, para que si el virus está presente, tenga la posibilidad de incrementar su concentración y ser entonces fácilmente detectado. En esta etapa se utiliza con frecuencia el test de ELISA en cualquiera de sus variantes, que generalmente conduce a resultados confiables. En algunos casos el sistema que resulta más eficiente para hacer el indexing es el empleo de plantas indicadoras. El injerto es la forma más segura de transmitir un virus y esto es lo que se emplea como sistema de diagnóstico. Se realiza un injerto desde la planta que se desea probar a plantas que son susceptibles al virus (planta indicadora) y que desarrollan síntomas claros y evidentes de la presencia del patógeno. El inconveniente, en este tipo de análisis, es que hay que esperar que la planta obtenida in vitro sea transferida al suelo, luego que se desarrolle lo suficiente como para extraer una porción de tejido (hoja, yema, brote, etc., según el tipo de injerto). Se requiere además de un operador con habilidad para realizar el injerto con éxito y luego mantener las plantas injertadas en condiciones adecuadas hasta la aparición de los síntomas. En algunos casos, este tiempo puede ser muy prolongado. A pesar de los inconvenientes que se mencionan, para algunas especies este sigue siendo el método más seguro. Por ejemplo la frutilla, que es afectada por más de 20 enfermedades diferentes y que en muchos casos ni siquiera ha sido todavía caracterizado el agente causal, la transmisión del virus a plantas indicadoras resulta la prueba más efectiva. En este caso se injerta el folíolo medio de una hoja perteneciente a la planta que se desea probar en plantas indicadoras en las cuales los patógenos van a dar síntomas claros. Algunos virus se van a manifestar después de 2 ó 3 semanas de realizado el injerto; en otros casos, la bibliografía menciona que los síntomas aparecen entre los 6 y 12 meses. Con frecuencia, no es posible identificar que virus es el que está presente, pero es posible determinar si la planta está infectada. En vid, parte de los virus son analizados mediante ELISA. Pero otros son probados por injerto a plantas indicadoras. Algunos de los virus pueden ser detectados en pocas semanas, pero para el stem pitting/grooving sindrome, por ejemplo, es necesario esperar entre 8 y 12 meses. 9 Algunas consideraciones respecto a los análisis de virus En general, cuando se habla de las plantas liberadas de virus se emplean términos como «plantas libres de virus» «planta sana» o «saneada» sin que se defina qué virus fueron eliminados ni qué pruebas se emplearon para comprobar su eliminación. El concepto de plantas libres de virus debería estar acotado al, o a los virus, analizados. En el caso de plantas que son afectadas por un conjunto de virus diferentes sería necesario realizar un análisis independiente para cada uno de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 311

333 ellos y señalar el o los virus de los cuales ha sido liberada o probada. Por otra parte debe definirse la técnica de análisis empleada. Como se mencionó previamente pueden emplearse diferentes métodos de diagnóstico con distintos grados de sensibilidad. Así, por ejemplo, si se cuenta con un DAS-ELISA calibrado para detectar hasta 10 ng/ml y un RT-PCR que puede detectar 10 pg/ml y se analiza una planta con 50 pg/ml; la técnica de DAS-ELISA no va a detectar el patógeno y el resultado será negativo, mientras que el RT-PCR arrojará un resultado positivo. Todas las técnicas tienen un límite de sensibilidad por debajo del cual no son capaces de detectar la presencia del patógeno. Por consiguiente, dependiendo de la sensibilidad de la técnica que se use, el porcentaje de plantas supuestamente «libres de virus» puede variar. Lo correcto sería entonces hablar de plantas negativas a un virus probado mediante una técnica determinada. Por ejemplo, «plantas negativas a Onion yellow dwarf virus mediante DAS-ELISA», lo que no significa que realmente está libre de virus sino que la técnica no lo detectó. Por esa razón se aconseja evaluar las plantas en más de una oportunidad y repetir los análisis cuando las plantas están a campo, para darle al patógeno, si está presente, la posibilidad de multiplicarse. 10 Agradecimientos A los Ing. Agr. MSc Delia Docampo, Sergio Nome y al Dr. Luis Conci por la revisión del presente manuscrito; y a la Ing. Agr. Eva Cafrune por su colaboración en la búsqueda de información. 11 Lecturas Recomendadas AYABE, M. and SUMI, S Establishment of a novel tissue culture method, sem-disc culture, and is practical application to micropropagation of garlic (Allium sativum L.). Plant Cell Rep 17: AYABE, M. and SUMI, S A novel and efficient tissue culture method-»stem-disc dome culture»-for producing virus-free garlic (Allium sativum L.). Plant Cell Rep 20: ESAU, K Anatomía Vegetal. Ed. Omega Barcelona. FRACCIOLI, G. and MARANI, F Virus elimination by meristem tip culture and tip micrografting: in: A. Hadidi, R.K. Khetarpal, and H. Koganezawa. Plant virus deasease control. The American Phythopathology Society. St. Paul, Minnesota, USA. HERNANDEZ, R. et al, «Electrotheraphy» Technique eliminates viral and bacterial infection from plant shoottip cultures. INIVIT Santo Domingo, Cuba. HU, C. Y. and WANG, P. J Meristem shoot tip, and bud cultures (5): in: D. A. Evans, W.R. Sharp, P.V. Ammirato and Y. Yamada. Handbook of plant cell culture. Techniques for propagation and breeding. Vol 1 Collier Macmillan Publishers. London. KARTHA, K.K Meristem culture and cryopreservation-methods and applications: in: A. T. Thorpe. Plant tissue culture methods and applications in agriculture. Department of Biology, University of Calgary, Calgary, Alberta, Canada. KARTHA, K.K Elimination of virus: in I.K. Vasil. Cell culture and somatic cell genetics of plants. Academic Press, Inc. QUACQUARELLI, A., GALLITELLI, D., SAVINO, V., and PIAZZOLLA, P The use of electric current for obtaining mosaic-free almonds. Acta Phytopathologica Academiae Scientiarum Hungaricae, Vol, 15 (1-4): CONCI, Vilma C.

334 VIII.-Capítulo 6 Producción de plantas de ajo libres de virus Conci, Vilma C.; Cafrune, Eva E.; Lunello, Pablo; Nome; Sergio; Perotto, Cecilia 1 Introducción De los cultivos de Alliaceae, el ajo (Allium sativum L.) es considerado como una especie valiosa por muchas culturas diferentes. Además de su conocida utilización en el arte culinario, hoy es un producto apreciado por sus beneficios medicinales, especialmente en Europa y Asia. Algunos de sus productos derivados, poseen actividades biológicas tales como antibióticas, antiparasitario, reductores de riesgo de enfermedades cardiovasculares y como potenciales agentes anticancerígenos. El ajo es la principal hortaliza exportable de Argentina desde el punto de vista de la entrada de divisas, siendo este país el segundo exportador mundial después de China. Las exigencias cada vez mayores del mercado y la aparición permanente de nuevos competidores obligan a replantear las estrategias de producción nacional. Entre las enfermedades que afectan a este cultivo, los virus son los responsables de las mayores pérdidas (entre un 20 y 80% de disminución en el peso de los bulbos). Las infecciones son causadas por un complejo viral que incluye Potyvirus (Onion yellow dwarf virus, OYDV, y Leek yellow stripe virus, LYSV); Carlavirus (Garlic common latent virus, GCLV y Shallot lantent virus, SLV), y Allexivirus (Garlic virus-a, -B, -C, -D, -E, -X, GarV-A B C- D- E -X; Garlic mite-borne filamentous virus, GarMbFV). Este conjunto causa un mosaico que si bien no mata la planta produce una infección crónica. Debido a la exclusiva propagación agámica de esta especie, la totalidad de las plantas están infectadas por virus, por lo tanto es evidente la importancia que tiene la obtención de propágulo libre de virus como salida de control. En Argentina se ha detectado la presencia de OYDV y LYSV, GCLV, GarMbFV, GarV-C y otros Allexivirus todavía no caracterizados completamente. A modo de ejemplo se detalla a continuación un protocolo de producción de ajo libre de virus. 2 Procedimiento para la obtención de ajo libre de virus A) Termoterapia: en trabajos realizados en la Argentina se ensayaron tratamientos de termoterapia con agua y con aire caliente, antes de la extracción del meristema. Los mejores resultados se obtuvieron con aire caliente. Para ello dientes de ajo fueron sembrados en terrinas con una mezcla de tierra/ mantillo/arena (1/1/1) y mantenidos en una cámara a 36ºC. Cuando plantas de ajo Blanco fueron sometidas 60 días a 36 C y luego se hizo el cultivo de meristema, se regeneraron pocas plantas, pero las que se obtuvieron resultaron «libres de virus». Cuando se probaron 5 cultivares de ajo durante 40 días a 36 C se pudo observar valores de supervivencia del cultivo de meristema que variaron entre 40 y 82%, resultando «libres de virus» entre 30 y 100% de las plantas obtenidas, dependiendo del cultivar. Los controles en los cuales se obtuvieron plantas sólo por cultivo de meristema, sin termoterapia, el porcentaje de plantas desarrolladas varió entre 70 y 100%, y de ellas, en algunos cultivares, no se obtuvieron plantas «libres de virus» y en otros llegó hasta el 21%. Trabajos realizados posteriormente pusieron en evidencia que la posibilidad de liberar de virus por termoterapia es muy variable. En algunos monoclones de ajo Blanco y Colorado se observó que a pesar de ser sometidos a períodos prolongados (más de 60 días) a 36 C, no fue posible eliminar todos los virus integrantes del complejo; paralelamente, otros genotipos fueron «liberados de virus» sólo con el empleo del cultivo de meristema. B) Cultivo de meristema, primer análisis y micropropagación: para la extracción del meristema se corta un trozo de tejido en forma cúbica, incluyendo el disco basal donde está el meristema. Este se desinfecta mediante una inmersión en alcohol 70% y luego con hipoclorito de Na al 5 % durante min. Posteriormente, el trozo de tejido es colocado sobre papel estéril bajo una lupa estereoscópica dentro de una cámara de flu- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 313

335 jo laminar y con la ayuda de instrumental estéril se procede a la extracción del explanto constituido por el domo más 1 primordio foliar (0,3 mm aproximadamente). Luego de la escisión es rápidamente sembrado en medio de iniciación donde se desarrollará una planta completa (Fig. 1, A). Las plantas obtenidas son analizadas mediante ISEM- D con un antisuero producido a partir de plantas de ajo enfermas con la mezcla de virus que naturalmente infectan al cultivo. Aquellas plantas que resultan negativas a esta prueba son evaluadas con antisueros específicos para OYDV, LYSV, GCLV, SLV, GarMbFV y con un antisuero que detecta fundamentalmente una mezcla de diferentes Allexivirus. Las plantas negativas a todos ellos son transferidas a un medio de micropropagación. En este medio es posible una tasa de multiplicación de 1:2-1:8 dependiendo del cultivar (Fig. 1, B).. Esta tasa varía con el número de repiques en el medio de cultivo, siendo baja en los primeros y aumenta a partir del segundo o tercer repique, además se detectaron diferencias entre los distintos meristemas. Figura 1: Producción de ajo libres de virus. A: planta en medio de iniciación. B: micropropagación. C: bulbillos obtenidos in vitro (microbulbillos). D: planta transferida a tierra y mantenida en cámara húmeda. E: planta adaptada a las condiciones ex vitro. F: plantas en suelo bajo jaula antiáfidos. G: multiplicación a gran escala bajo jaula antiáfidos. H: bulbos de ajo libre de virus (arriba) e infectados (abajo). C) Rusticación y transplante a tierra bajo condiciones controladas: después de varios ciclos in vitro, muchas plantas bulbifican espontáneamente y otras deben ser inducidas (Fig. 1, C). Repicando los plantines a un me- 314 CONCI, Vilma C.; CAFRUNE, Eva E.; LUNELLO, Pablo; NOME, Sergio; PEROTTO, Cecilia

336 Termoterapia Líneas selectas Cultivo de meristema (medio de iniciación) Plantas in vitro Multiplicación in vitro (en medio de multiplicación) Bulbificación in vitro (medio de bulbificación) Planta in vitro 1º generación en suelo (bajo jaula) 2º ó mas generaciones en suelo (bajo jaula) Multiplicación en áreas aisladas (productores, semilleros) Transferencia a productores (producción comercial) ANALISIS por ISEM-D (OYDV, LYSV, GCLV, SLV, GarV A, y otros - Allexivirus ANALISIS por DAS-ELISA (Potyvirus, Carlavirus y Allexivirus) ANALISIS por DAS-ELISA (Potyvirus, Carlavirus y Allexivirus) ANALISIS por DAS-ELISA (Potyvirus, Carlavirus y Allexivirus) zando las plantas, una por una, mediante pruebas de DAS- ELISA (Fig. 1, F y G). Los bulbos producidos son entregados a semilleros que realizan la multiplicación en áreas aisladas de otros cultivos de Alliaceae, hasta obtener el número de bulbo-semilla suficiente como para iniciar una producción comercial. Cuando se comparan los bulbos producidos por las plantas libres de virus con respecto a los producidos por plantas infectadas las diferencias en peso y tamaño son notables Fig.1, M. Esquema de producción Fig.2. 3 Certificación Figura 2: Esquema de producción de plantas de ajo libres de virus, IFFIVE-INTA, Argentina. dio sin hormonas, con alto contenido de sacarosa y luz continua se consigue mejorar el porcentaje de bulbificación en algunos clones, o bien, se obtienen plantas más robustas que soportan mejor el transplante a suelo. Los minibulbillos obtenidos in vitro son cosechados y sembrados en suelo estéril compuesto por una mezcla de tierra/mantillo/ arena (1/1/1). Las plantas que no forman bulbos son transferidas a suelo y mantenidas en cámara húmeda por un tiempo variable entre 15 y 20 días luego son paulatinamente adaptadas a las condiciones naturales de humedad y temperatura (Fig. 1, D y E). Las plantas ex vitro son probadas mediante DAS-ELISA para constatar su estado sanitario y mantenidas bajo jaulas antivectores. Los bulbos cosechados son conservados en lugar fresco y seco hasta la época de siembra. Las sucesivas multiplicaciones se realizan en jaulas donde se continúa anali- La implementación de programas tendientes a la producción de plantas de ajo libre de virus y el control de la enfermedad adquiere fundamental importancia ya que han comenzado a regir en Argentina normativas para la fiscalización de semilla de ajo. Estas normas establecen las categorías de Básica (subcategoría Preinicial, Inicial y Fundación) Registrada (subcategoría A y B) y Certificada. Cada una de estas categorías contempla diferentes porcentajes de OYDV. Por ahora sólo se controla este virus; sin embargo, con el avance de los conocimientos respecto del daño que producen el resto de los integrantes del complejo, seguramente algunos otros serán considerados en el futuro. 4 Lecturas recomendadas CANAVELLI, A; NOME, S. F. y CONCI, V. C Incidencia de las virosis en ajo Rosado Paraguayo. Fitopatología Brasilera 23 (3): Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 315

337 CONCI, V. C.; CANAVELLI, A.; LUNELLO, P.; DI RIENZO, J.; NOME, S. F.; ZUMELZU, G. and ITALIA, R Yield Loss of Virus-Free Garlic in the Field During Successive Crop Cycles. Plant Disease 87 (12): CONCI, V.C Virus y Fitoplasmas de ajo. In Burba, J. L. 50 temas sobre producción de ajo. Vol. 3: EEA-INTA La Consulta, Mendoza, Argentina. CONCI, V.C. y NOME, S.F Virus free garlic (Allium sativum L) plants obtained by thermotherapy and meristem tip culture. J. Phytopathology 132: RAVNIKAR, M.; PLAPER, I.; UCMAN, R. and ZEL, J Establishment of an efficient method for virus elimimation in meristem cultures and regeneration of high quality plants. Proc. of IPBA, Rogla. December, 5-7: SENULA, A; KELLER, E. R. J. and LESEMANN, D. E Elimination of viruses through meristem culture and thermotherapy for the establishment of an in vitro collection of garlic (Allium sativum). Acta Hoticulturae 530: TSUNEYOSHI, T. and SUMI, S Differentation Among Garlic Viruses in Mixed Infections Based on RT-PCR Procedures and Direct Tissue Blotting Immunoassays. The American Phytopathological Society. Vol 86, N 3: VAN DIJK, P Carlavirus isolates from cultivated Allium species represent three viruses. Neth. J. Pl. Path. 99: VAN DIJK, P Survey and characterization of potyviruses and their strains of Allium species. Neth. J. Pl. Path. 99. Supplement 2:1-48. WALKEY, D.G.A.; WEBB, M. J. W.; BOLLAND, C.J. and MILLER, A Production of virus-free garlic (Allium sativum L.) and shallot (A. ascalonicum L.) by meristemtip culture. Journal of Horticultural Science, 62 (2): CONCI, Vilma C.; CAFRUNE, Eva E.; LUNELLO, Pablo; NOME, Sergio; PEROTTO, Cecilia

338 VIII.-Capítulo 7 Plantas cítricas libres de enfermedades Costa, Norma; Plata, María Inés; Anderson, Catalina 1 Introducción Para competir en un mercado citrícola globalizado se necesita de la máxima eficiencia en todas las fases de la producción. Para lograrlo es primordial partir con material de excelencia desde el vivero. La planta es el primer escalón para iniciar una citricultura exitosa. Las exigencias de calidad en los cítricos producidos en los viveros comerciales de todo el país aumentan día a día. El material de multiplicación para la producción de plantas de vivero debe provenir de un origen cierto y certificado. El citricultor espera que la planta que pondrá en sus explotaciones tenga un porte adecuado, un sistema radicular desarrollado y la garantía sanitaria y varietal correspondiente para obtener una producción rentable y duradera. Las enfermedades producidas por virus, viroides y otros organismos similares producen importantes pérdidas económicas en los cítricos de todo el mundo. Algunas enfermedades provocan la muerte de las plantas y otras disminuyen la producción y la calidad de la fruta, causando pérdida de vigor y de longevidad de la planta. Algunas de las principales enfermedades causadas por este tipo de microorganismos son la psorosis, tristeza, exocortis y cachexia. Estas enfermedades se han extendido debido a la propagación vegetativa de material infectado. Es normal encontrar varias virosis en una misma planta y en muchos países como la Argentina casi la totalidad de las plantas adultas están afectadas por alguna virosis. La psorosis y otras enfermedades se transmiten mediante el injerto de yemas. Una vez hecho el injerto, la planta puede permanecer con la enfermedad latente durante muchos años. Las yemas que se extraigan de una planta con enfermedad latente originarán plantas enfermas. Los países con citricultura de avanzada han basado su éxito en el empleo de Programas de Certificación utilizando plantas libres de enfermedades, especialmente las causadas por virus u organismos similares. Estas plantas libres de virus se obtienen a partir de plantas de variedades cítricas agronómicamente ideales pero afectadas por una o más enfermedades causadas por virus u organismos similares. Para esto se recurre a técnicas que permitan la obtención de plantas libres de virus a partir de individuos enfermos. La termoterapia y la obtención de plantas nucleares han sido técnicas usadas para conseguir aquel objetivo. Otra técnica que cumple este objetivo es la técnica de microinjerto de ápices caulinares in vitro. Dicha técnica es la que actualmente se utiliza en gran parte de los países citrícolas que tienen programas de eliminación de virus y viroides. Con la combinación de las técnicas de termoterapia y de microinjerto de ápices caulinares in vitro es posible obtener un elevado porcentaje de plantas cítricas libres de virus, cosa que una técnica sola no permite lograr. La técnica de microinjerto se basa en la hipótesis de que los virus vegetales no llegan a infectar el meristema. Una vez obtenida la planta por esta técnica debe ser sometida a las pruebas de comprobación sanitaria (pruebas biológicas, químicas, inmunoquímicas, serológicas, moleculares, etc.) que determinen con certeza que esa planta esta «libre» de lo que se está analizando. El PROCITRUS es un proyecto que el INTA desarrolló para la obtención, producción, mantenimiento y distribución de material de portainjertos y cultivares de especies cítricas con identidad varietal y estado sanitario controlados y en su esquema básico (Tabla 1) emplea estas técnicas para cumplir dichos objetivos. 2 Técnica de microinjerto de ápices caulinares in vitro La planta a microinjertar es seleccionada de las introducciones de variedades cítricas de copa y portainjerto que se realizan a los Bancos de Germoplasma, de selecciones locales y de variedades obtenidas en los Pro- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 317

339 Tabla 1: Esquema operativo del proyecto PROCITRUS: para la obtención de una planta libre de enfermedades - Introducciones. - Selecciones locales. - Programas de Mejoramiento. Planta candidata Termoterapia 32 C Cultivo de Tejidos Diagnóstico Sanitario Planta Madre Original Protegida gramas de Mejoramiento. Una vez obtenida esta «planta candidata a planta madre», es sometida a termoterapia y cultivo de tejidos empleando la técnica de «microinjerto de ápices caulinares in vitro». Esta técnica comprende las siguientes etapas: preparación del portainjerto, preparación del ápice, injerto, cultivo de plantas injertadas e injerto sobre un plantín vigoroso. Las plantas obtenidas por microinjerto no presentan caracteres juveniles y en las mismas no se han observado anormalidades con respecto a la planta madre. El éxito de la técnica depende del tamaño del tejido extraído ( mm) y del patógeno que se quiera eliminar. En el caso de exocortis, tristeza y cachexia, el porcentaje de plantas libres es superior al 90%. El más Tabla 2: Pruebas de Diagnóstico para Plantas Madres difícil de eliminar es el virus de la psorosis de los cítricos (CPsV). Una vez obtenida la planta de microinjerto y cuando tiene tamaño suficiente, se realizan las pruebas de diagnóstico para comprobar que estén libres de patógenos (Tabla 2). Las técnicas de diagnóstico para cada enfermedad pueden ser varias pero deben emplearse aquellas reconocidas internacionalmente por organismos de referencia. Para el PROCITRUS y para el Programa Nacional de Certificación de Cítricos las técnicas empleadas son las recomendadas por las «Normas para la Producción, Comercialización e Introducción de Plantas Cítricas de Vivero (RES N 149/98)» y las «Normas de Funcionamiento de Laboratorios de Diagnóstico para Enfermedades de Plantas Cítricas de Vivero y sus partes, aprobadas por el INASE y el SENASA dependientes de la SAGPyA (Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentación). 3 Lecturas recomendadas: 1- Enfermedades de los Cítricos Monografía de la SEF (Sociedad Española de Fitopatología). Editores Científicos: Núria Duran-Vila y Pedro Moreno 165 pp 2-Proceedings of the IOCV (International Organization of Citrus Virologists): (15 Conferencias) 3-Improvements in serodiagnosis of Citrus Psorosis Virus (CPsV) Aliotto, D.,M. Gangemi,P. Sposato, S. Deaglio, E. Luisoni and R.G. Milne.14th Proceedings of the IOCV pp 4- Indexing of Citrus viroids by imprint hybridisation Palacio-Bielsa, A.,X. Foissac and N. Duran-Vila. European Journal of Plant Pathology 105: Tristeza Psorosis Exocortis Enfermedad Metodología Duración Repetición Cachexia-xiloporosis Inmunoimpresión ELISA Plantas indicadoras ELISA DAS Plantas indicadoras ELISA TAS Plantas indicadoras Hibridación Molecular Electroforesis Plantas indicadoras Hibridación Molecular Electroforesis 4h 12 meses 48 h 12 meses 48 h meses 3 meses 3 meses 12 meses 3 meses 3 meses 1 año 3 años 6 años 6 años CVC ELISA DAS 48 hs 6 años Cancrosis Infiltración de tejido susceptible Medio Selectivo Inmunofluorescencia indirecta ELISA DAS 10 días 7 días 7 días 48 hs 1 año 5- Cancrosis de los Citrus en el Litoral Argentino Canteros, Blanca I. IDIA XXI Año I- Nro pp 6- Citrus Canker in Argentina- Control, Eradication, and Current Managment International Citrus Canker Research Workshop. Ft. Pierce, Florida USA pp 7- Manual para Productores de Naranja y Mandarina de la Region del Río Uruguay INTA Manual Serie «A» Nro. 2 - Diversificación Productiva. Eds. A. Fabiani, R. Mika, L. Larocca y C. Anderson. 238 pp 8- Graft-Transmissible Diseases of Citrus. Handbook for detection and diagnosis Roistacher, C.N. FAO and IOCV 286 pp. 318 COSTA, Norma; PLATA, María Inés; ANDERSON, Catalina

340 VIII.-Capítulo 8 Certificación sanitaria de especies frutales de Prunus Docampo, Delia M. 1 Introducción Monitoreos realizados en especies frutales del género Prunus (durazneros, ciruelos, cerezos, guindos) del área frutícola templada (provincias de Mendoza, Córdoba y Buenos Aires) evidenciaron el deterioro de la condición sanitaria de las plantaciones en producción y de propagación. Los análisis pusieron de manifiesto que una de cada cuatro plantas analizadas se encontraba infectada por uno o más virus. Varios factores han sido decisivos para la distribución de estos patógenos. La carencia de controles sanitarios, la ineficacia de los métodos usados en los análisis, su dispersión por vectores y la diseminación de materiales infectados a larga distancia, por el hombre a través de la comercialización. Un Sistema de Certificación Sanitaria de Plantas Perennes se fundamenta en producir el número de plantas requeridas por el mercado a partir de una Planta Inicial. El Sistema contempla cuatro etapas básicas: 1) Elección de la Planta Inicial (selecta de variedades y de portainjertos) seleccionada sobre la base de sus caracteres agronómicos deseables, por su pureza varietal (deben coincidir con los Descriptores del Registro Nacional de Cultivares) y su estado sanitario, (analizado por las técnicas más rigurosas establecidas en el Sistema de Certificación). Constituye el material fundacional de un Sistema de Certificación del cual derivará todo el material certificado; 2) Establecimiento de un Monte Fundación. Constituido generalmente por tres plantas de cada cultivar (de variedad y de cada portainjerto) obtenidas por propagación agámica de la Planta Inicial. Constituye un monte de reserva y es donante de materiales de propagación; 3) Organización de un monte de Plantas de Base que deberá mantener al menos diez plantas por cultivar y/o portainjerto como «plantas madres» de la propagación, sometidas a rigurosos controles sanitarios y varietales anuales; 4) Producción de Plantas Certificadas. Está destinada a producir las plantas que demanda el mercado (viveros expendedores). Cada etapa puede tener subetapas. Todas están reglamentadas y sometidas a estrictos controles sanitarios y varietales. El Material Certificado producido por los Sistemas de Certificación referidos al saneamiento de virus puede considerar dos calificaciones según su programación: «Material Libre de Virus» (virus free - VF) cuando los materiales están exentos de todos los virus conocidos en esa especie y «Material Testado» (virus test - VT) cuando los materiales se encuentran exentos de los principales virus. Por lo común ninguna planta seleccionada como candidata a Planta Inicial resulta libre de patógenos sistémicos. El cultivo in vitro de meristemas precedido por la aplicación de termoterapia ofrece la posibilidad de recuperar materiales contaminados para obtener una Planta Inicial. El cultivo in vitro es, además, una práctica de rutina para la rápida multiplicación de portainjertos en los cuales injertar yemas para propagar cultivares. Una planta de un cultivar (variedad) puede donar numerosas yemas que requieren igual número de portainjertos (Fig. 1). Esta clonación permite obviar el empleo de carozos como generadores de portainjertos y de esta manera uniformar su respuesta a estrés biótico o abiótico. 2 Micropropagación de portainjertos para Prunus de Sanidad Certificada, mediante cultivo in vitro Los Sistemas de Propagación de Portainjertos Certificados establecen procedimientos para su micropropagación mediante el cultivo in vitro que en general contemplan el siguiente desarrollo: 1.- Tomar explantos de Plantas Iniciales o de Plantas de Propagación (Monte Fundación, Plantas de Base) que hayan superado todos los controles sanitarios y de pureza varietal anuales. 2.- El número de multiplicaciones in vitro no deberá superar los diez ciclos una vez superada la fase de adaptación. 3.- Iniciar la micropropagación empleando meristemas de 0,3-0,5 mm (meristema con uno o dos primordios foliares), e identificar el material Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 319

341 CONTROL SANITARIO Estaca de planta seleccionada enraizada MICROPROPAGACIÓN a a1a2a3a4a5a6 Seccionado de yemas Yemario generado por ápice caulinar a a: explanto inicial a1, a2,... a6: clon Termoterapia abcdefghij Iniciación del cultivo in vitro. Cada ápice caulinar originará un clon CONTROL SANITARIO Clones libres MICROPROPAGACIÓN Toma de muestras Seccionado de brotes Yema tratada Cultivo de ápices caulinares RIZOGÉNESIS Micropropación (hasta 10 ciclos) Desinfección superficial Ápice caulinar Remoción de hojas TRANSPLANTE A SUELO BAJO CONDICIONES CONTROLADAS EN INVERNADERO Figura 1: Esquema de micropropagación de Prunus sembrado. 4.- Los meristemas generarán yemas (un yemario), en general, entre las 6 y 12 semanas de implantado. 5.- Repicar las yemas del yemario. La propagación de cada meristema se deberá identificar con una sigla, de manera que cada ápice caulinar dé origen a un clon (una línea de descendencia). 6.- Control sanitario. Antes de la tercera multiplicación deberán tomarse al menos 3 plantas de cada clon para realizar el análisis de los patógenos que se estableció eliminar. Las plántulas seleccionadas deberán permanecer destapadas por al menos una semana, fuera de la cámara de cultivo, bajo luz, temperatura y humedad relativa controladas a fin de dar oportunidad a el o los patógenos, si los hubiera, de incrementar su población lo cual facilitará su detección. El control sanitario deberá realizarse en plantas leñosas y herbáceas por indexación, testado mediante técnicas inmunoenzimáticas (DAS-ELISA o sus variantes), microscopía electrónica (dips, secciones ultrafinas, ISEM + D) y técnicas moleculares (dsrna viral, PCR, PCR anidado). La línea de descendencia que no supere este control será eliminada. 7.- Los medios de cultivo no deben contener sustancias nocivas ni antibióticos que puedan enmascarar la presencia de microorganismos. 8.- Es motivo de rechazo el material cultivado en medios contaminados. 9.- Consignar en un Libro de Registro las acciones realizadas durante la micropropagación (ciclos de micropropagación, medios de cultivo, número de individuos logrados, toma de muestras para análisis, tipo de análisis, resultados, depuraciones, etc.) por cada línea de descendencia Trasplantar a suelo (mezcla de turba, 320 DOCAMPO, Delia M.

342 perlita, mantillo 1:1:1:) estéril las plantas regeneradas in vitro. 2.1 Aclimatación 1.- Descalzar del medio las plantas regeneradas lavando cuidadosamente sus raíces bajo chorro de agua hasta retirar la totalidad del agar. 2.- Plantar en terrinas plásticas desinfectadas con NaOCl al 15% (Cl activo 80 g/dm 3 ), en una mezcla de turba, mantillo y perlita 1:1:1 esterilizada en autoclave durante 1 h sin presión. 3.- Colocar las terrinas en cámaras con HR del %, con luz continua de 4000 luxes provista por tubos fluorescentes de luz blanca fría, temperatura mínima 15 ºC, máxima 35 ºC. 4.- A los 30 días transplantar a cestillos plásticos (6 cm de diámetro) y mantenerlos bajo túneles de polietileno en invernadero con HR 70-90% y 16 h de luz. 5.- Levantar el plástico por los costados lentamente cada 2-3 días hasta su retiro definitivo. 6.- Control varietal: tomar al menos tres plantas por línea de descendencia clonal para el control varietal. Dentro de un Sistema de Certificación, el productor cultivará las plantas en sus instalaciones de aclimatación e informará al organismo oficial responsable para que efectúe las correspondientes inspecciones. Toda planta fuera de tipo y las afectadas por plagas serán eliminadas. Esta depuración debe ser anotada en el Libro de Registro. 7.- Control sanitario: realizar un segundo control sanitario (indexing y testado serológico, microscopia electrónica, técnicas moleculares) al año de desarrolladas las plantas en todos los clones. 8.- Identificar con una clave, que debe figurar en el Libro de Registro, cada línea de descendencia. En los recipientes de multiplicación figurará la clave y el número de multiplicación que corresponda. 9.- En la etiqueta debe figurar «Producido in vitro». 3 Obtención de una Planta Inicial (cultivar y/o portainjerto) libre de patógenos mediante cultivo in vitro asociado con termoterapia 1.- Seleccionar plantas (cultivares y/o protainjertos) por su pureza varietal y condiciones agronómicas deseables (candidata a Planta Inicial). 2.- Investigar su condición sanitaria por indexación en plantas leñosas y herbáceas, testeado mediante técnicas inmunoenzimáticas (DAS-ELISA y/o sus variantes), microscopia electrónica (dips, secciones ultrafinas, ISEM-D) y técnicas moleculares (dsrna viral, PCR, PCR anidado). 3.- Si ninguna de las plantas resultase libre de patógenos sistémicos, aplicar termoterapia seguida de cultivo de meristemas de las yemas tratadas. Los controles sanitarios de las plantas regeneradas permitirán seleccionar las plantas libres de patógenos. 3.1 Termoterapia Se aplica sobre materiales activos (barbados con brotes, plantas jóvenes). 1.- Enraizar individualmente en suelo estéril estacas de la planta seleccionada para el tratamiento o estacas de portainjertos de Sanidad Certificadas para injertar yemas de las variedades seleccionadas. 2.- Colocar las plantas enraizadas y con brotes (en actividad) en cámaras donde reciban una corriente de aire caliente. 3.- Temperatura: varía con la relación cultivar-patógeno. Algunos patógenos son eliminados con facilidad por el calor mientras otros disminuyen su concentración pero permanecen en los tejidos. Los Prunus tienen intolerancia a los tratamientos prolongados con calor, pero pueden soportarlos si se utiliza calor moderado (34-38 ºC). 4.- Fotoperíodo: 16 h de luz suministrada por tubos fluorescentes de luz blanca. Intensidad lumínica: µM S-1m-2 (3,5 4,0 klux). Riego: diario. Humedad relativa: entre 60 y 80%. 5.- Tiempo: varía con la relación planta patógeno. Oscila entre 3 y 7 semanas, aunque, por lo común, varía entre 3-4 semanas. 6.- Retirar las plantas de la termoterapia y a continuación aislar y cultivar los meristemas de las yemas desarrolladas durante el tratamiento. Evitar la recontaminación de los meristemas prolongando el tiempo entre la finalización de la termoterapia y el cultivo de los materiales. 7.- Continuar la micropropagación como se desarrolla desde el ítem 2 en Micropropagación de portainjertos para Prunus de Sanidad Certificada, mediante cultivo in vitro. 4 Obtención de variedades (cultivares) libres de patógenos mediante el microinjerto de ápices caulinares in vitro Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 321

343 La técnica es adecuada para injertar meristemas de frutales de carozo infectados sometidos a termoterapia. 1.- Cultivar in vitro explantos de un portainjerto libres de infección. 2.- Colectar brotes de la variedad sometida a termoterapia y desinfectarlos. 3.- Extraer bajo lupa el meristema (0,2-0,4 mm). 4.- Decapitar los portainjertos cultivados in vitro. 5.- Colocar el meristema de la variedad sobre el extremo decapitado de la plántula portainjerto cuidando que las zonas vasculares entren en contacto. 6.- Colocar los microinjertos en ambiente controlado (16 h de luz aportada por tubos fluorescentes de luz blanca. Intensidad lumínica: 3,5 4,0 klux, HR: 60 y 80%). 7.- Dejar desarrollar la planta injertada en un medio adecuado durante 5 a 15 semanas bajo luz. 8.- Transplantar a suelo estéril. Se inicia su aclimatación en invernadero bajo condiciones de luz, temperatura y humedad controlada por varias semanas. 9.- Continuar con la aclimatación de las plantas generadas como se señalara previamente. 5 Lecturas recomendadas CHANG, T.T The case for large collections. En: The use of plantgenetic resources (A.H.D. Brown, O.H. Frankel, D.R. Marshall y J.T. Williams, eds.). Cambridge University Press, Reino Unido. p DOCAMPO D. M., HAELTERMAN, R. M., GUERRA, G. D Distribución del PNRSV, PDV y PLV en Prunoideas de Areas Frutícolas de la República Argentina. RIA 22 (1): GELLA FAÑANAS, R Obtención de planta certificada. Servicio de Investigación Agraria. Diputación General de Aragón. España. pp. 33 GEORGE, J., DAVIDSON, T Pollen transmission of necrotic ring spot and sour cherry yellows virus from tree to tree. Canadian Journal of Plant Science 43: GILMER, R. M., BRASE, K. D Nonuniform distribution of Prune dwarf virus on sweet and sour cherry. Phytopathology 53: HAELTERMAN, R. M., DOCAMPO D. M Presencia del virus de las manchas foliares cloróticas del manzano (apple chlorotic leaf spot virus) en tres áreas de Argentina. XXI Congreso Argentino de Horticultura. San Pedro. Buenos Aires. Argentina. pp 70. JARAMILLO, S. y M. BAENA Material de apoyo a la capacitación en conservación ex situ de recursos fitogenéticos. Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos, Cali, Colombia. NEMETH, M In: Virus, mycoplasma and rickesttia diseases of fruit trees. Martinus Nijhoff and Dr. W. Junk publishers. Academiai Kiado, Budapest, Hungary. Pp NOME, S.F. Aspectos técnicos de la producción de materiales de sanidad controlada en Pagliano, Daniel coord. Calidad genética y sanitaria: un instrumento para la competitividad de la cadena agroindustrial / Coord. Daniel Pagliano. Montevideo : IICA-PROCISUR, p. ISBN OGAWA, J. M., ZEHR, E. I., BIRD, G. W., RITCHIE, D. F., URIU, K., UYEMOTO, J. K Compendium of stone fruit diseases. APS press. The American Phytopathological Society. Pp. 95. PAGLIANO, DANIEL coord. Calidad genética y sanitaria: un instrumento para la competitividad de la cadena agroindustrial / Coord. Daniel Pagliano. Montevideo : IICA-PROCISUR, p. ISBN GEORGE, J., DAVIDSON, T A technique for detecting virus infected Montmorency cherry seeds. Canadian Journal of Plant Science 42: DOCAMPO, Delia M.

344 VIII.-Capítulo 9 Biotecnología aplicada al control de enfermedades fúngicas y bacterianas Zappacosta, Diego 1 Introducción Desde la domesticación de las plantas por el hombre las enfermedades han causado enormes pérdidas en la producción. El uso intensivo de monocultivos con baja diversidad genética en la agricultura moderna ha redundado en una elevada susceptibilidad a algunas enfermedades y en un incremento de la agresividad de algunos patógenos. Con excepción de las enfermedades epidémicas, que llegan a destruir cultivos completos, se estima que las pérdidas ocasionadas por patógenos en el plano mundial representan un 12% del potencial de producción, teniendo mayor incidencia en hortalizas, frutales y arroz. Además de causar pérdidas en la producción, algunos patógenos también reducen la calidad de los alimentos, como es el caso de algunas especies de Fusarium y Aspergillus, que dejan en los tejidos infectados toxinas que afectan la salud humana y animal. Existen varias formas de controlar las enfermedades, entre los que podemos mencionar: a) las prácticas culturales, como la rotación, la sanidad del material inicial, el control de restos vegetales, etc., b) la aplicación de agroquímicos y c) la resistencia genética. Aunque las tres alternativas son utilizadas, la última, por su mejor implementación y menor impacto ambiental, es una de las mejores opciones. Es frecuente, sin embargo, encontrar inconvenientes para su aplicación, tales como la falta de genes de resistencia, la rápida evolución de nuevas razas virulentas del patógeno, etcétera. La incorporación de genes de resistencia es uno de los mayores desafíos para los mejoradores durante el desarrollo de nuevos cultivares. Tradicionalmente se ha llevado a cabo a través de métodos convencionales de mejoramiento, que involucran selección y evaluación de grandes poblaciones derivadas de cruzamientos entre materiales susceptibles y resistentes y la posterior selección bajo condiciones propicias para la enfermedad. Si bien estos métodos convencionales han resultado exitosos en muchos casos, son lentos y laboriosos, ya que involucran cruzas, retrocruzas y selección, siendo además difícil seguir la evolución de nuevas razas virulentas de los patógenos. Esto ha llevado a un uso masivo de agroquímicos a pesar de su alto costo y su alto impacto ambiental. La biotecnología y la biología molecular ofrecen nuevas herramientas a los mejoradores, aumentando las posibilidades y la eficiencia en la obtención de variabilidad genética y en la selección de caracteres deseables, brindando además alternativas viables para identificar, seleccionar y transferir genes de resistencia. El cultivo in vitro fue una de las primeras herramientas de la biotecnología utilizadas en la búsqueda de resistencia a enfermedades. Desde sus distintas alternativas brinda soluciones para sortear barreras en los cruzamientos, colaborando además en la selección de genotipos resistentes. En lo que respecta a la ingeniería genética, la resistencia a enfermedades fúngicas y bacterianas no ha alcanzado el mismo nivel de desarrollo que la resistencia a insectos o virus. Sin embargo existen numerosos proyectos de investigación en curso y se prevé un gran desarrollo comercial en los próximos años. En este capítulo se intentará ofrecer un panorama actualizado de las herramientas que la biotecnología vegetal brinda al mejorador para el estudio y control de las enfermedades fúngicas y bacterianas. 2 Cultivo in vitro Es posible encontrar genes de resistencia en muchas de las especies cultivadas o en especies muy cercanas filogenéticamente y transferirlos por cruzamientos convencionales a especies susceptibles. Sin embargo, a veces, es necesario recurrir a especies no tan cercanas filogenéticamente, pudiendo existir barreras de incompatibilidad. En estos casos es posible obtener híbridos viables con la utilización de técnicas tales como el rescate de embriones, la hibridización somática, la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 323

345 fusión de protoplastos, la polinización in vitro, etc. Estas técnicas ya fueron descriptas en capítulos precedentes y son utilizadas para la incorporación de diversas características entre las que encontramos la resistencia a enfermedades. Una técnica promisoria es la selección in vitro de materiales resistentes utilizando al patógeno vivo o algún metabolito purificado o no del mismo u otras sustancias químicas como agente de selección. Esta técnica será tratada con más detalle a continuación. 2.1 Selección in vitro de genotipos resistentes Los ensayos para la selección de resistencia a patógenos («screening») y el estudio de la interacción hospedador-patógeno bajo condiciones de campo se encuentran sujetos a una gran variación entre experimentos. Esto se debe principalmente a la distribución no uniforme de los patógenos y a la falta de control sobre las variables ambientales. Por ejemplo, en el caso de enfermedades del suelo, los períodos relativamente largos de crecimiento favorecen el desarrollo de otras enfermedades que pueden interferir y afectar la validez de los resultados. Por esta razón, queda claro que los ensayos de selección por resistencia a enfermedades deben realizarse, en lo posible, bajo condiciones controladas. Estas condiciones raramente pueden encontrarse a campo. Se han planteado alternativas utilizando invernáculos o ambientes controlados, lo cual soluciona algunos de los problemas mencionados anteriormente. En estas situaciones, la selección de genotipos resistentes se basa en la observación de la respuesta de genotipos individuales en la población de plantas ante la presencia del patógeno. Otras metodologías plantean el uso de metabolitos producidos por el patógeno, que en algunos casos han demostrado tener el mismo efecto que el microorganismo mismo. Esto último se observa principalmente cuando las toxinas producidas por el hongo son factores de virulencia importantes. La selección in vitro se basa en exponer plantas, órganos, tejidos o células vegetales a patógenos o sus metabolitos simulando la interacción hospedador-patógeno que tiene lugar en la naturaleza. Esta técnica permite estandarizar la evaluación, haciéndola repetible y confiable, con la ventaja adicional de que en un espacio reducido y en un corto período se puede chequear la resistencia o tolerancia de gran cantidad de individuos. Esto brinda además la posibilidad de poder ensayar callos y plántulas, sin necesidad de trabajar con plantas adultas. Presenta, sin embargo, algunos inconvenientes, tales como la falta de correlación in vitro-in vivo y la posible aparición de modificaciones genéticas no deseables originadas por el pasaje por cultivo in vitro. No obstante, en algunos casos, la respuesta obtenida in vitro ha demostrado tener una estrecha correlación con la resistencia-tolerancia obtenida in vivo (Yoder, 1980). Diferentes técnicas in vitro pueden ser explotadas para seleccionar o inducir variantes con mayor resistencia a enfermedades o para establecer modelos de estudio de interacciones planta-patógeno. Sin embargo, la elección de la estrategia experimental depende del sistema hospedador-patógeno considerado. Las principales variables a tener en cuenta son (Daub, 1986): La naturaleza y complejidad de las técnicas de cultivo in vitro requeridas (cultivo de embriones, regeneración de plantas desde suspensiones celulares, callos, etc.). El nivel en que se realiza la selección o «screening» (in vitro o en plantas regeneradas luego de realizar manipulaciones in vitro) Los agentes utilizados para la selección de resistencia (el patógeno mismo, filtrados, toxinas específicas o toxinas de otro patógeno muy relacionado, agentes químicos, etc.). El origen de la nueva resistencia buscada (recuperación de variación existente, cambios espontáneos, mutagénesis, etc.). Muchos microorganismos patógenos de plantas producen fitotoxinas, que son metabolitos tóxicos, no enzimáticos, que, no obstante hallarse a bajas concentraciones, dañan a las plantas (Tabla 1). Una toxina específica es un metabolito producido por el patógeno que posee la misma especificidad por el material vegetal que el patógeno mis- 324 ZAPPACOSTA, Diego

346 Tabla 1: Principales toxinas de microorganismos patógenos de plantas mo. En cambio, las toxinas no específicas son metabolitos producidos por el patógeno que pueden tener alguna relevancia en el desarrollo de la enfermedad, pero no son responsables de todos los daños causados por el mismo. Sin embargo, en algunas interacciones compatibles estas toxinas no específicas pueden ser necesarias para una infección exitosa y en otros casos son sólo determinantes secundarios de la enfermedad. El mecanismo responsable de su toxicidad varía con el patosistema y, en muchos de ellos, el(los) rol(es) de las toxinas en la patogenicidad no está(n) claramente establecido(s), especialmente en los casos de toxinas no específicas, como por ejemplo el ácido fusárico. En general se considera que actúan como factores de virulencia, debilitando al hospedador o inhibiendo o retardando las respuestas de defensa (Johal, 1995). Buscando resistencia a toxinas se puede hallar resistencia a patógenos, ya que la toxina puede tener un rol decisivo en la patogénesis (McCormick y col., 1998). En algunas especies de plantas se ha tenido éxito en la selección de materiales resistentes a patógenos utilizando toxinas específicas como presión de selección in vitro. Entre las interacciones más estudiadas podemos mencionar el caso de avena- Cochliobolus victoriae, caña de azúcar- Drechslera sacchari y plátano- Mycosphaerella fijiensis. También se pueden usar toxinas no específicas para la selección de materiales resistentes. Muchos patógenos producen estos metabolitos tóxicos y la resistencia a alguno de ellos puede mejorar la resistencia a la enfermedad en forma cuali y cuantitativa. Ejemplos de selección usando toxinas no específicas se encuentran en las interacciones: arroz-c. miyabeanus, tomate- Fusarium oxysporum, apio-septoria apiicola, café-colletotrichum kahawae, espárrago-f. oxysporum, Arabidopsis- F. moniliforme, cebolla-phoma terrestris, entre otras. Una de las principales limitaciones de este sistema de selección es precisamente el desconocimiento del tipo de toxina(s) o la importancia de ellas en muchas enfermedades. También es de destacar que en algunas interacciones donde se conocen toxinas específicas, las mismas no son activas en todos los tejidos y células. Descifrar el fundamento bioquímico de la resistencia a una toxina facilitaría el proceso de selección. Aunque los comentarios anteriores se aplican fundamentalmente a patógenos fúngicos, las bacterias también producen fitotoxinas. En general, estas toxinas son no específicas y causan síntomas en muchas plantas que no son hospedadores del patógeno que las produce. Aunque las fitotoxinas bacterianas son generalmente no requeridas para la patogénesis, ellas típicamente funcionan como factores de agresividad y su producción resulta en un incremento de la severidad de la enfermedad (Bender, 1998). Otra alternativa para la selección de materiales resistentes es usar como presión de selección enzimas pectolíticas, cuando éstas cumplen un rol importante en la patogénesis, como es el caso de los patógenos que producen la maceración de los tejidos que atacan. Un ejemplo de ello lo constituye la interacción entre Rhizoctonia fragariae y Botrytis cinerea con la frutilla, donde se logró seleccionar plantas con mayor resistencia a los patógenos mencionados utilizando Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 325

347 enzimas pectolíticas purificadas a partir de cultivos líquidos de los mismos. La falta de toxinas relevantes en la patogénesis de muchas enfermedades y/o activas a nivel celular, ha llevado a establecer y estudiar sistemas in vitro con el patógeno mismo. Uno de los mayores problemas en estos sistemas es controlar el crecimiento excesivo del patógeno, sea bacteria u hongo, sobre el material vegetal y sobre el medio de cultivo y la dificultad para interpretar los resultados. Otro inconveniente es la correlación entre las interacciones hospedadorpatógeno in vitro e in vivo (la resistencia in vitro puede no ser expresada in vivo o la situación recíproca). Un prerrequisito para una eficiente selección in vitro utilizando al patógeno es que el sistema in vitro sea consistente con los eventos que suceden a nivel de planta (hay que tener en cuenta cuáles son los tejidos susceptibles, el estado fisiológico de la planta, etc.). En el caso de hongos biótrofos obligados y en muchos necrótrofos las técnicas de cocultivo han resultado ser una solución para cultivarlos en condiciones controladas. El cultivo dual de hongos necrótrofos y tejidos vegetales puede resultar óptimo para estudios básicos y aplicados, constituyendo un sistema simplificado en el cual factores nutricionales y ambientales pueden ser cuidadosamente controlados. Se ha establecido exitosamente este sistema de cultivo para las interacciones alfalfa- Phytophthora megasperma, tabaco-p. parasitica var. nicotianae, tabaco-peronospora tabacina, caña de azúcar- Sclerospora sacchari, abeto-ceratocystis polonica y Lamium purpureum- Coniothyrium palmarum, entre otras (Miller, 1985). 3 Obtención de resistencia utilizando herramientas de ingeniería genética Una de las alternativas biotecnológicas más promisorias para obtener resistencia a enfermedades es la incorporación de genes de resistencia mediante tecnología génica. Estas técnicas han sido descriptas previamente (ver III.-3), por lo que en esta sección sólo se tratarán las situaciones específicas de resistencia a bacterias y hongos patógenos. Como resultado de los estudios tendientes a la identificación, clonación y caracterización de genes involucrados en la resistencia a enfermedades han sido identificados muchos mecanismos que las plantas utilizan para responder a la infección de patógenos, Figura 1: Principales mecanismos de defensa que presentan las plantas frente al ataque de microorganismos (modificado de Kombrink y Somssich, 1995). 326 ZAPPACOSTA, Diego

348 lográndose avances en el conocimiento de los genes que participan en estas respuestas (Fig. 1). La identificación de estos genes permitió la evaluación de su rol específico y su forma de activación mediante el empleo de plantas transgénicas. Numerosos trabajos detallan los distintos mecanismos de defensa que las plantas poseen para contrarrestar 3.1 Resistencia a hongos fitopatógenos La selección de genes de resistencia para ser introducidos en plantas por tecnología génica se basa, en parte, en la evaluación de la toxicidad de productos génicos sobre el crecimiento y desarrollo de los patógenos in vitro y del rol del gen en las respuestas de resistencia. Muchos productos génicos pertenecen al grupo de las proteínas relacionadas a la patogénesis (van Loon, 1999), mientras que otras pertenecen a las vías biosintéticas de las fitoalexinas (compuestos antimicrobianos de bajo peso molecular producto del metabolismo secundario) o fortalecen las defensas estructurales (por ejemplo fortificación de la pared celular). Algunas respuestas normales de resistencia son relativamente lentas, detectándose, en algunos casos la expresión 48 hs luego de la infección (Fig. 2). En el caso de plantas transgénicas la idea sería lograr expresión temprana o sobreexpresión del producto, generalmente a través de promotores constitutivos. Otros genes interesantes son aquellos que participan en las vías de inducción de los mecanismos naturales de resistencia. Recientemente, la clonación de numerosos genes R (de resistencia) ha precipitado el interés en el uso de estos genes para obtener resistencias de amplio espectro. Las principales estrategias de control de enfermedades fúngicas mediante el uso de plantas transgénicas pueden ser agrupadas en cinco categorías (Punja, 2001): Figura 2: Tiempo relativo de inducción de las principales defensas contra patógenos fúngicos (modificado de Kombrink y Somssich, 1995). el ataque de microorganismos y son recomendados como una lectura accesoria al material que sigue a continuación (Kombrink y Somssich, 1995; Durand-Tardif y Pelletier, 2003). Expresión de productos génicos que son directamente tóxicos para los patógenos o que reducen su crecimiento. Incluyen proteínas relacionadas a la patogénesis (proteínas PR), como enzimas hidrolíticas (quitinasas, 1,3-β-glucanasas), proteínas antifúngicas (osmotinas y taumatinas), péptidos antimicrobianos (tioninas, defensinas, lectinas), proteínas de transferencia de lípidos (LPT), proteínas inactivadoras de riboso-mas 28S rrna fúngicos (RIP) y fitoalexinas. Expresión de productos génicos que destruyen o neutralizan componentes de ataque del patógeno. Por ejemplo: inhibidores de poligalacturonasas (enzimas que degradan algunos componentes de la pared celular vegetal), ácido oxálico o lipasas. Expresión de productos génicos que mejoran las defensas estructurales de la planta. Consiste en la elevación de los niveles de ligninas y peroxidasas asociadas a la pared celular. Expresión de productos génicos que participan en las vías de señales que regulan las defensas. Incluyen la producción de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 327

349 elicitores específicos, peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ), ácido salicílico o etileno. Expresión de productos de genes de resistencia (genes R). Participan en la reacción de hipersensibilidad y en la interacción con factores de avirulencia. 3.2 Enzimas hidrolíticas La estrategia más ampliamente utilizada es la sobreexpresión de enzimas hidrolíticas tales como 1,3-β-glucanasas o quitinasas, que degradan la pared celular de hongos y han demostrado tener actividad antifúngica in vitro. Con la expresión de diferentes tipos de quitinasas en varias especies vegetales se ha logrado reducir el tamaño, el número y el desarrollo de lesiones causadas por varios hongos patógenos, algunos de amplio rango de hospedadores, como por ejemplo Botrytis cinerea y Rhizoctonia solani. La expresión de quitinasas ha sido inefectiva, sin embargo, para el control de Cercospora nicotianae, Colletotrichum lagenarium y Pythium spp., indicando que en los hongos existen diferencias en la sensibilidad a este tipo de enzimas. Las diferentes quitinasas presentan variación en características tales como especificidad de sustrato, ph óptimo y localización celular, lo cual trae aparejadas diferencias en su actividad antifúngica. Aunque los resultados de estos estudios no han sido espectaculares en términos de niveles de control de la enfermedad, la tasa de progresión y la severidad de la misma pudieron ser significativamente reducidas, como se ha demostrado en cultivos transgénicos evaluados a campo (Melchers y Stuiver, 2000). Los resultados obtenidos utilizando 1,3- b-glucanasas son similares a los de quitinasas. La expresión combinada de ambas enzimas en varias especies ha revelado un comportamiento mucho más efectivo en la prevención del desarrollo de varias enfermedades que la expresión de una sola de ellas, corroborando los resultados obtenidos en los ensayos in vitro. Lo mismo sucede con otras proteínas PR con actividad antifúngica in vitro, tales como osmotina y taumatina (TLP), que en plantas transgénicas muestran una disminución de los daños causados por enfermedad, pero los resultados más alentadores aparecen cuando se expresan en combinación con quitinasas y 1,3-bglucanasas. Como regla general, el uso de estrategias de ingeniería genética que involucren la expresión de dos o más productos de genes antifúngicos en un determinado cultivo debería proveer un control de la enfermedad más efectivo y de más amplio espectro que el uso de estrategias con un solo gen (Shah, 1997). 3.3 Péptidos antimicrobianos Las defensinas y tioninas son péptidos de bajo peso molecular, ricos en cisteína, que poseen actividad antimicrobiana. La sobreexpresión de estas proteínas en plantas transgénicas reduce el desarrollo de varios patógenos como Fusarium y Alternaria y confiere resistencia a Verticillium en papa en condiciones a campo. También se han desarrollado plantas transgénicas que expresan pequeños péptidos antimicrobianos sintéticos (10-20 aminoácidos) que pueden afectar a las hifas, a la pared celular o aumentar la permeabilidad de las membranas celulares fúngicas. La habilidad para crear recombinantes sintéticos o variantes combinadas de péptidos ofrece nuevas oportunidades para lograr resistencia a un amplio rango de patógenos de manera simultánea, siendo alternativas promisorias para mejorar la eficacia de las plantas transgénicas en el futuro (Lassner y Bedbrook, 2001). 3.4 Fitoalexinas Son otro grupo de compuestos antimicrobianos, productos del metabolismo secundario, presentes en un amplio rango de especies vegetales cuya expresión es inducida por la infección de patógenos y elicitores. Son sintetizados a través de complejas vías bioquímicas, como la del shikimato. La manipulación genética para suprimir o mejorar la producción de fitoalexinas no es sencilla, ya que se hallan involucradas varias enzimas. Como en el caso de las enzimas hidrolíticas, no se ha demostrado concluyentemente su rol en mejorar la resistencia a enfermedades en muchas interacciones 328 ZAPPACOSTA, Diego

350 hospedador-patógeno. En plantas transgénicas se ha demostrado que la sobreexpresión de genes que participan en la síntesis de ciertas fitoalexinas como el resveratrol y la medicarpina resulta en una demora en el desarrollo de la enfermedad y en la aparición de los síntomas producidos por varios patógenos en distintas especies vegetales. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las fitoalexinas son potencialmente tóxicas para los animales y tienden a no ser específicas en su acción, por lo tanto es necesario realizar más evaluaciones de los riesgos potenciales de su utilización, además de las relacionadas con sus características de conferir resistencia a enfermedades (Essenberg, 2001). 3.5 Compuestos que mejoran las defensas estructurales de la planta La pared celular vegetal es una barrera que los patógenos tienen que superar en su ataque y lo logran a través de enzimas que la degradan (como las poligalacturonasas) o mediante la acción de toxinas. Se han diseñado plantas transgénicas que expresan inhibidores de poligalacturonasas, pero los resultados por el momento no son concluyentes. Otra estrategia considerada ha sido la sobreexpresión de peroxidasas, enzimas que participan en la lignificación de la pared celular. La lignificación alrededor de los sitios de infección es un mecanismo natural que presentan las plantas para restringir el ataque de patógenos. Mediante esta estrategia se logró un aumento en los niveles de lignina de la planta, que no brindó, sin embargo, una mejora en la resistencia a enfermedades en varios sistemas hospedadorpatógeno estudiados. Una opción más reciente es la expresión de enzimas que degradan toxinas fúngicas, como la expresión en tabaco de una enzima degradadora de tricotecenos de Fusarium sporotrichloide, que reduce el daño a los tejidos y mejora la emergencia de plántulas en presencia de la toxina. La inactivación de factores de virulencia específicos por productos génicos expresados en plantas transgénicas es una estrategia promisoria para reducir el desarrollo de patógenos específicos. 3.6 Elicitores Las vías de señales que coordinan las respuestas de defensa en las plantas, que incluyen la reacción de hipersensibilidad (RH), la producción de proteínas PR y de fitoalexinas, pueden ser activadas por moléculas llamadas elicitores. La inducción de RH y necrosis, que resulta en la activación de respuestas de defensa, podría resultar en una inducción de resistencia a un amplio espectro de enfermedades. El uso de estas estrategias requeriría, sin embargo, de la cuidadosa manipulación de vías metabólicas complejas, cuya alteración podría tener efectos secundarios no deseables sobre otros caracteres del cultivo, ya que intervienen en varios procesos vegetales. Mediante el uso de plantas transgénicas se han disectado genéticamente muchas de estas vías, identificándose muchos de los compuestos intervinientes en las respuestas de defensa a patógenos. El peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) inhibe el crecimiento de patógenos y activa ciertas vías de trasmisión de señales que inducen respuestas de defensa. La expresión de niveles elevados de H 2 O 2 en plantas transgénicas a través de la expresión de la glucosa oxidasa reduce los efectos causados por patógenos como Rhizoctonia, Verticillium, Phytophthora y Alternaria en varias especies cultivadas. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que niveles elevados de H 2 O 2 son fitotóxicos. Otros activadores de defensas son el ácido salicílico, el etileno y el ácido jasmónico. La manipulación de los niveles de ácido salicílico en plantas transgénicas tiene un gran potencial para mejorar la resistencia a enfermedades, ya que no sólo inducen la expresión de proteínas PR, sino también la de otros productos de defensa, los cuales, en conjunto, han demostrado tener una interacción sinérgica y conferir elevados niveles de resistencia (Lawton, 1997). 3.7 Genes R Estos genes son los más utilizados en mejoramiento convencional ya que son determinantes simples de una resistencia efectiva y específica. En su mayoría, los productos de estos genes actúan reconociendo in- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 329

351 Figura 3: Modelos de interacción entre productos de avirulencia del patógeno (Avr), sitio target de este producto en la célula vegetal (T) y productos de genes de resistencia R (R1 y R2). (modificado de Hammond-Kosack y Parker, 2003). directamente factores de avirulencia de patógenos a través de correceptores, pero también hay casos de interacción directa (Fig. 3). Existen varios ejemplos de plantas transgénicas que expresan genes R; sin embargo, debido a la complejidad de las vías de señales involucradas en las respuestas de defensa, es improbable que la expresión de un solo gen mejore la tolerancia a enfermedades. Se dispone de una gran cantidad de genes R clonados cuyo análisis permitirá la obtención de genes R sintéticos con dominios funcionales adecuados que confieran resistencias de amplio espectro (Rommens y Kishore, 2000). 4 Perspectivas El desarrollo de plantas transgénicas con resistencia a enfermedades fúngicas no ha alcanzado el éxito logrado en el desarrollo de otras resistencias, como por ejemplo a herbicidas, insectos o virus. La mayoría de los estudios se han realizado sobre sistemas modelo como tabaco, habiendo pocos estudios a campo, estimándose la aparición en el mercado de materiales transgénicos con resistencia a hongos en los próximos años. En la mayoría de los casos mencionados anteriormente, la expresión de los transgenes ha sido constitutiva, lo cual es positivo para el control de patógenos que afectan al mismo tiempo varios tipos de órganos como hojas, tallos y frutos. Sin embargo, cuando la acción de los patógenos es específica de órganos o tejidos es recomendable el uso de promotores específicos. En ciertos casos la actividad antifúngica de determinados compuestos mejora cuando actúan en el espacio apoplástico o son volcados en la vacuola. En este aspecto es necesario orientar los esfuerzos hacia la búsqueda de promotores específicos inducibles por patógenos y a la evaluación de los sitios más adecuados de expresión de los transgenes a fin de desarrollar plantas transgénicas con elevados niveles de resistencia a un amplio espectro de enfermedades. Las expectativas puestas en el desarrollo de plantas transgénicas son grandes, ya que podrían brindar soluciones para el control de distintas enfermedades, como las provocadas por patógenos de amplio rango de hospedadotes, entre los que se encuentran Rhizoctonia solani y Botrytis cinerea, para los cuales existen muy pocas fuentes convencionales de resistencia. Las plantas transgénicas expresando resistencia a enfermedades podrían ser cuestionadas porque: Los productos génicos antimicrobianos podrían tener efectos adversos sobre la microflora no patogénica que habita sobre o en las inmediaciones de las plantas. Los productos antifúngicos expresados podrían tener efectos indeseables en la salud de los organismos que consumen dichas plantas, en particular el hombre. Una fuerte presión sobre los patógenos podría llevar a la aparición de nuevas cepas resistentes y la ruptura de genes de resistencia nuevos o existentes. Algunos productos de genes de resistencia, como las proteínas PR, los compuestos antifúngicos y los inhibidores de poligalacturonasas (PGIP), reducen el desarrollo de la enfermedad, pero no la previenen totalmente. La inducción de muerte celular y de RH pueden ser peligrosas, ya que si no son co- 330 ZAPPACOSTA, Diego

352 rrectamente controladas pueden provocar importantes alteraciones metabólicas. La existencia de un escudo general de resistencia, que es lo que se busca con niveles elevados de resistencia de amplio espectro, puede llevar a la pérdida de genes menores de resistencia en el cultivo y, si un patógeno logra eludir esta barrera, no existirían otras para detener su avance. 5 Resistencia a bacterias Sólo una pequeña proporción de las bacterias son fitopatogénicas y han desarrollado mecanismos para invadir y colonizar plantas hospedadoras y causar enfermedades. Por ello los esfuerzos invertidos en lograr resistencia a bacterias por tecnología génica han sido escasos. La mayoría de los mismos se han centrado en una bacteriosis importante en el ámbito mundial para la cual no se han hallado genes de resistencia potencialmente transferibles por cruzamientos convencionales, como es el caso de la podredumbre blanda y pie negro de la papa, causados por Erwinia carotovora (During, 1996). Las principales estrategias para lograr resistencia a bacterias fitopatógenas son las siguientes: Expresión de péptidos bactericidas (cecropinas) provenientes de insectos y ranas, que actúan a nivel de la membrana bacteriana. Expresión de tioninas, que son polipéptidos ricos en cisteína presentes en endosperma y hojas de los cereales, cuya acción, no específica, se basa en la permeabilización de las membranas celulares. Expresión de la lisozima del bacteriófago T4 y de huevo de gallina. Cambio de la enzima blanco de toxinas bacterianas o expresión de enzimas detoxificantes provenientes del mismo patógeno u otro organismo. Síntesis de fitoalexinas, que generalmente involucra la modificación de vías biosintéticas complejas, las cuales no siempre son accesibles a la ingeniería genética. Los resultados, en algunos casos, han sido promisorios, aunque la estrategia más intensamente investigada, la expresión de cecropinas, no ha producido resultados concluyentes, especialmente en los ensayos a campo. Este péptido es degradado por enzimas vegetales, por lo cual sería necesario el desarrollo de análogos resistentes a proteasas. La expresión de tioninas de cereales en tabaco mejora la resistencia a Pseudomonas syringae. Estas proteínas poseen actividad antimicrobiana in vitro y su expresión constitutiva trae aparejada una disminución significativa del crecimiento de la bacteria y una reducción en el porcentaje de lesiones necróticas. Las lisozimas son enzimas que catalizan la hidrólisis de la mureína, constituyente de la pared celular bacteriana. Se localizan en las vacuolas de varias especies vegetales y comúnmente poseen fuerte actividad quitinasa. Antes del inicio de una enfermedad las bacterias patógenas se acumulan en grandes cantidades en los espacios intercelulares de la planta. Las lisozimas sólo entran en contacto con las mismas luego de la ruptura de la célula, cuando las bacterias son demasiado numerosas como para ser efectivamente controladas. Por ello, las estrategias se han centrado en dirigir las lisozimas hacia el espacio intercelular. Pocas lisozimas vegetales han sido caracterizadas y clonadas, por lo que se han buscado lisozimas de otros orígenes para ser expresadas en plantas transgénicas, como la del bacteriófago T4 y la de huevo de gallina. Esta estrategia ha dado buenos resultados en varios casos y es una de las más prometedoras. Algunas bacterias producen toxinas que son clave en el desarrollo de la enfermedad, como por ejemplo la tabtoxina de Pseudomonas syringae pv. tabaci, que actúa sobre la síntesis de glutamina, provocando clorosis. La expresión del gen trr que codifica para una enzima bacteriana que protege de la acción de la tabtoxina ha logrado disminuir los síntomas de la enfermedad, mejorando la resistencia. Otra ejemplo es la expresión en plantas de tabaco de ornitil transcarbamilasas insensibles a la toxina de P. syringae pv. phaseolicola, que inhibe la actividad de la misma en poroto. Los hospedadores resistentes y algunos no hospedadores son capaces de reconocer Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 331

353 y combatir las bacterias fitopatógenas. Estas plantas resistentes reaccionan con una muerte celular localizada en el sitio de infección (RH), que es inducida por compuestos bacterianos llamados elicitores, tales como proteínas de avirulencia (proteínas Avr), que son reconocidos por proteínas receptoras del hospedador (Fig. 1). La dilucidación de los mecanismos de resistencia en hospedadores resistentes posibilita la obtención de plantas transgénicas que expresen diferentes receptores que reconozcan una variada gama de elicitores bacterianos (harpinas, proteínas Avr, etc.) y que activen las respuestas de defensa. Varias de las estrategias mencionadas previamente son potencialmente aplicables en el control de bacterias fitopatógenas. Las que implican la expresión de proteínas antibacterianas, tales como cecropinas y lisozimas, tienen la ventaja de implicar a un solo gen y conferir resistencia amplia. La inactivación de toxinas bacterianas o la modificación del sitio blanco de dichas toxinas puede brindar una estrategia mucho más específica y eficiente. 6 Genómica y enfermedades causadas por bacterias En este área también está incursionando la genómica. Xylella fastidiosa es una bacteria que vive en el xilema de las plantas, causando enfermedades que producen grandes pérdidas económicas, incluyendo clorosis variegada en cítricos. Un grupo de biotecnólogos brasileños seleccionó este patógeno para secuen-ciación genómica debido a la gran importancia de los cítricos para la economía de Brasil. Los frutos de las plantas afectadas son más pequeños y no tienen valor comercial. Utilizando programas de predicción de secuencias se han encontrado en el genoma de esta bacteria, que consta de más de 2.5 millones de pares de bases, unos genes. A la mitad de los mismos se les ha asignado funciones sobre la base de comparaciones realizadas con otros genomas. Entre estos genes se encuentran algunos que están involucrados en la patogenicidad, generando compuestos que actúan en diferentes procesos, como: - Proteínas involucradas en la síntesis y secreción de toxinas. - Enzimas involucradas en la ruptura de las paredes celulares. - Enzimas para detoxificar de compuestos de defensa de la planta. - Transportadores eficientes de azúcares, que permiten la existencia en el xilema, pobre en nutrientes. - Proteínas regulatorias, que ayudan a regular la expresión génica para mantener el crecimiento en distintos ambientes. - Síntesis y excreción de polisacáridos extracelulares. - Genes involucrados en la eliminación de antibióticos, que podrían se producidos por la planta para matar a la bacteria. - Captación y secuestro de hierro y otros metales. 7 Situación en la Argentina La Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA) ha venido autorizando la realización de pruebas de laboratorio-invernáculo o a campo de plantas transgénicas que expresan resistencia a enfermedades. Del total de autorizaciones realizadas en el periodo , 39 (aproximadamente el 10%) corresponden a solicitudes presentadas por distintas empresas o instituciones para la evaluación de distintos materiales con resistencia a enfermedades. En la tabla 2 se presenta una lista de algunas de las liberaciones autorizadas. 8 Resumen Los hongos y bacterias fitopatógenos son responsables de gran parte de las pérdidas que se producen sobre los cultivos. Una de las formas de control más eficiente es a través de la resistencia genética. Sin embargo, no siempre es posible incorporar genes de resistencia en plantas de cultivo por mejoramiento convencional. La biotecnología brinda al mejorador nuevas herramientas para la búsqueda e incorporación de resistencias a través del cultivo in vitro y la ingeniería genética. Mediante el cultivo in vitro es posible sortear barreras a la hibridización y seleccionar rápida y eficientemente materiales resistentes a enfermedades. La selección in vitro se basa en exponer plantas, órganos, tejidos o células vegetales a patógenos o sus metabolitos simulando la interacción 332 ZAPPACOSTA, Diego

354 Tabla 2: Lista de algunas de las liberaciones de plantas transgénicas con resistencia a enfermedades autorizadas por la CONABIA (recopilación de la página web de la CONABIA, hospedador-patógeno que tiene lugar en la naturaleza. Mediante tecnología génica es posible transferir genes que confieren resistencia a enfermedades. Las estrategias más utilizadas son la expresión de compuestos antimicrobianos (enzimas hidrolíticas, proteínas antimicrobianas), la expresión de enzimas o compuestos que neutralizan componentes de ataque del patógeno (inhibidores de poligalacturonasas, inactivadores de toxinas), fortalecimiento de las defensas estructurales (aumento en los niveles de ligninas o peroxidasas) o la modificación de las vías de señales que regulan las defensas por la producción de elicitores específicos (peróxido de hidrógeno, ácido salicílico o etileno). La genómica brinda nuevas herramientas para la detección de genes involucrados en la patogénesis y, aunque actualmente no existen en el mercado plantas transgénicas que expresen resistencia a enfermedades fúngicas o bacterianas, el nivel de desarrollo alcanzado indica que en un futuro muy próximo aparecerán plantas resistentes a enfermedades logradas por ingeniería genética. 9 Lecturas Recomendadas BENDER C Bacterial phytotoxins. Method. Microbiol., 27: DAUB M Tissue culture and the selection of resistance to pathogens. Annu. Rev. Phytopathol., 24: DURAND-TARDIF M. y G. PELLETIER Contribution of molecular and cellular biology and genetics to plant protection. C. R. Biologies, 326: DURING K Genetic engineering for resistan-ce to bacteria in transgenic plants by introduction of foreign genes. Mol. Breed., 2: ESSENBERG M Prospects for streng-thening plant defenses through phytoalexin engineering. Physiol. Mol. Plant Pathol., 59: JOHAL, G.; J. GRAY; D. GRUIS y S. BRIGGS Convergent insights into mechanisms determining disease and resistance response in plant-fungal interactions. Can. J. Bot., 73 (Suppl. 1):S468-S474. KOMBRINK E. y I. SOMSSICH Defense responses of plants to pathogens. Adv. Bot. Res., 21:1-34. HAMMOND-KOSACK K. y J. PARKER Deciphering plant-pathogen communication: fresh perspectives for molecular resistance breeding. Curr. Opin. Biotechnol., 14: LASSNER M. y J. BEDBROOK Directed molecular evolution in plant improvement. Curr. Opin. Plant Biol., 4: LAWTON M Recognition and signaling in plantpathogen interactions: implications for genetic engineering. En: Genetic Engineering, vol. 19, Ed. J. Setlew, Plenum Press, USA, pp Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 333

355 McCORMICK S., T. HOHN, A. DESJARDINS, R. PROCTOR, N. ALEXANDER Role of toxins in plant microbial interactions. En: Phytochemical Signals and Plant-Microbe Interactions, Cap. 2, pp MELCHERS L. y M. STUIVER Novel genes for diseaseresistance breeding. Curr. Opin. Plant Biol., 3: MILLER S Tissue culture methods in phytopathology. II - Fungi. En: Plant Cell Culture - A Practical Approach, Cap. 10, pp PUNJA Z Genetic engineering of plants to enhance resistance to fungal pathogens - a review of progress and future prospects. Can. J. Plant Pathol., 23: ROMMENS C. y G. KISHORE Exploiting the full potential of disease-resistance genes for agricultural use. Curr. Opin. Biotechnol., 11: SHAH D Genetic engineering for fungal and bacterial diseases. Curr. Opin. Biotechnol., 8: VAN LOON L Occurrence and properties of plant pathogenesis-related proteins. En: Pathogenesis-Related Proteins in Plants, Eds. S. K. Datta y S. Muthukrishnan, CRC Press, Boca Raton, USA, Cap. 1, pp YODER, O Toxins in pathogenesis. Annu. Rev. Plant Pathol., 18: ZAPPACOSTA, Diego

356 PARTE IX Bioseguridad y regulación de organismos vegetales genéticamente modificados (OVGM) Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 373

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358 IX.-Capítulo I Criterios científicos para la evaluación de la bioseguridad de organismos genéticamente modificados. Rubinstein, Clara Si bien las tecnologías de mejoramiento de variedades tradicionalmente utilizadas introducen modificaciones genéticas y producen efectos no intencionales, las tecnologías de ADN recombinante presentan características propias que se han considerado lo suficientemente novedosas a nivel de las organizaciones internacionales que han recomendado su regulación. Las características de un organismo vegetal genéticamente modificado (OVGM) son estudiadas y evaluadas desde las etapas más tempranas de su desarrollo desde el punto de vista de su bioseguridad. Para ello, se utiliza un enfoque comparativo que ha sido desarrollado con anterioridad a la aparición de cultivos transgénicos o sus derivados alimentarios en el mercado. Fue descripto por primera vez en este contexto, en un documento de la OECD (Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico) de 1993, que fue el resultado de dos años de discusiones que reunieron a más de 60 expertos de 19 países. Este enfoque, así como los criterios científicos utilizados para su implementación, son presentados en este capítulo, con énfasis en la inocuidad para el consumo. A lo largo de la historia, los mejoradores han apelado a todo tipo de tecnologías para generar diversidad genética, de la cual poder seleccionar aquellas características deseadas. En los capítulos y secciones anteriores se han descripto las más recientes, que se suman a otras, utilizadas durante siglos con el mismo fin. La aplicación de las técnicas de ADN recombinante al mejoramiento vegetal en la década de 1980, sin embargo, marcan un punto de inflexión, dada las preocupaciones que han generado en diferentes ámbitos y posteriormente, también debido a su impacto en la percepción pública, en especial en la Unión Europea. El National Research Council de los EE.UU., publicó en 1989 un informe en el cual analiza las diferencias entre el mejoramiento tradicional y las nuevas biotecnologías para la modificación genética de plantas y microorganismos. En este informe, se incluye a las tecnologías de ADN recombinante como parte integrante de la secuencia de los avances del conocimiento y de la tecnología científica, a lo largo de años de desarrollo humano (NRC, 1989, ver Fig 1). También concluyen en que «las mismas leyes físicas y biológicas gobiernan la respuesta de los organismos modificados por los modernos métodos moleculares y celulares y aquéllos producidos por métodos clásicos». Figura 1: Aumento en la capacidad de modificación genética a través del tiempo Fuente: Informe de Expertos del IFT (2000), adaptado de NRC, 1989 Al mismo tiempo, organismos internacionales como FAO y OMS (la Organización para la Alimentación y la Agricultura y la Organización Mundial de la Salud, respectivamente) se han ocupado de la bioseguridad de las nuevas tecnologías aplicadas a la producción de alimentos. Un informe conjunto de 1991 afirma que «la biotecnología tiene una larga historia de uso en producción y procesamiento de alimentos. Representa un continuo abrazo entre las técnicas de reproducción tradicionales y las últimas técnicas basadas en la biología molecular.» «El uso de estas técnicas no resulta en alimentos Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 375

359 inherentementes menos seguros que los producidos por técnicas convencionales». Se desprende de esto, así como de lo expuesto en capítulos anteriores, que todas las especies mejoradas por el hombre son, de un modo u otro, «genéticamente modificadas». A pesar de esto, la aplicación de las técnicas de ingeniería genética a la producción de alimentos ha sido considerada lo suficientemente nueva y diferente, como para justificar el control de su desarrollo e implementación. Esto tiene sus antecedentes en las primeras etapas del desarrollo de la ingeniería genética, en los años 70. En 1974 y 1975, los Institutos Nacionales de Salud de los EE.UU. (NIH) convocan a las Conferencias de Asilomar (California), éste fue el primer paso para la creación de políticas para el control de la seguridad de organismos recombinantes. Desde allí, y en todo el mundo, han evolucionado estas políticas y las regulaciones que controlan el desarrollo de nuevos organismos y sus productos mediante técnicas de ADN recombinante. Estas regulaciones se basan en criterios científicos y también empíricos, en particular, en lo que hace a la seguridad de los alimentos. En efecto, muchos de nuestros conocimientos sobre la inocuidad de lo que comemos, proviene de cientos o miles de años de experiencia, ensayos y errores. Aunque los alimentos tradicionalmente disponibles en las diferentes culturas se aceptan como seguros, se sabe que algunos pueden ser tóxicos, según la parte de la planta que se consuma por ejemplo el tallo se puede consumir, pero no así las hojas o las raíces o el estadío de su desarrollo. También hay alimentos de origen vegetal que deben ser cocinados para ser seguros (por ej. porotos), así como sabemos que hay grupos de alimentos que pueden provocar alergias en individuos sensibles (maní, leche, nueces, huevo, soja). En 1986 la OECD (Organización para el Desarrollo y la Cooperación Económica) convoca a reuniones de expertos que reúnen sus recomendaciones en el llamado «Blue Book». Más adelante, en 1993, OECD resumió estos conceptos: «La seguridad de los alimentos para consumo humano se basa en que debe existir una certeza razonable de que no resultará daño alguno del uso debido bajo las condiciones de consumo anticipadas. Históricamente, los alimentos preparados y utilizados bajo las condiciones tradicionales han sido considerados seguros, por su historia de uso y experiencia, aun cuando pudieran contener tóxicos naturales o antinutrientes. En principio, los alimentos se han considerado seguros, a menos que un peligro significativo se haya podido identificar». En este capítulo se intentará dar un panorama de los criterios científicos que se utilizan internacionalmente para evaluar la seguridad de los cultivos transgénicos, también llamados genéricamente OGM (Organismos Genéticamente Modificados). 1. El análisis de riesgos y la identificación del peligro Se ha establecido que el análisis de riesgos consta de tres etapas fundamentales: La identificación del peligro: es la identificación y cuantificación de un efecto adverso, en general, a partir de ensayos experimentales; por ejemplo, de tipo toxicológico en modelos animales. Valoración de la exposición: estima y si es posible cuantifica la frecuencia y el tiempo de exposición a dicho peligro. Caracterización del riesgo: es la estimación que surge de evaluar el peligro en función de la exposición y evaluar diferentes escenarios de exposición máxima, para establecer qué grado de exposición es aceptable en cuanto a la seguridad. Este proceso se aplica a casos muy diferentes, y existe amplia experiencia en su aplicación a la evaluación de riesgos para aditivos alimentarios, agroquímicos y compuestos específicos en general. En esos casos, es relativamente simple someter cantidades exactas y conocidas de un compuesto a ensayos toxicológicos clásicos en modelos animales, o evaluaciones de residuos en alimentos, aguas, suelos, etc. De esta forma, se establecen parámetros como el NOAEL (por No Adverse Effect Level), que es el nivel de exposición en el que no se observan efectos adversos. Este da una medida de la peligrosidad del compuesto: cuanto mayor el 376 RUBINSTEIN, Clara

360 NOAEL, menor el potencial tóxico del compuesto. Basándose en el NOAEL, es posible estimar un nivel de exposición seguro, que define el ADI (dosis diaria aceptable, expresada por kg de peso corporal) y que dependiendo del tipo de sustancia y otras variables, suele estar unas 100 veces por encima del NOAEL. Este factor de multiplicación se conoce como margen de seguridad para la exposición. Sin embargo, estos principios no son tan directamente aplicables al análisis de riesgos para OVGM o sus derivados de uso alimentario, ya que constituyen mezclas complejas, que contienen miles de compuestos, macro y micro nutrientes, tóxicos naturales (compuestos tóxicos que están naturalmente presentes en la especie), antinutrientes (compuestos que inhiben la absorción o biodisponibilidad de algunos nutrientes), metabolitos secundarios, etcétera. Por lo tanto, la evaluación de estos cultivos es más una evaluación de seguridad o inocuidad más que un análisis de riesgos «clásico», ya que hasta ahora no se han determinado peligros cuantificables en los OGM estudiados. De hecho, en la práctica, en caso de identificarse efectos adversos, estos cultivos no se autorizarían para su salida al mercado. Por todo lo anterior, se ha desarrollado para los OGM un enfoque que ha sido utilizado para otros casos de alimentos y que se basa en la comparación del nuevo alimento o cultivo con el tradicionalmente utilizado y considerado seguro. Este enfoque se ha desarrollado consensuadamente con la colaboración de diferentes organismos internacionales (OECD, FAO,OMS, International Life Sciences Institute o ILSI) que periódicamente convocan a paneles de expertos que revisan y actualizan las recomendaciones de acuerdo con los avances tecnológicos y el estado del conocimiento. Es en este contexto dinámico y cambiante, que se ha desarrollado el sistema de evaluación de la seguridad alimentaria de OGM, como resume el documento de OECD, 1993: «Nuestra comprensión de la naturaleza y composición de los alimentos aumenta cada día y estamos investigando y conociendo más acerca de la importante relación entre dieta y efectos sobre la salud. En el futuro, seguramente descubriremos nueva información importante acerca de beneficios especiales y riesgos ocultos en los alimentos que comemos, que nos podrán ayudar a conducirnos hacia dietas más saludables.» 2. El enfoque comparativo y la equivalencia sustancial En 1993 la OECD formuló el concepto de Equivalencia Sustancial. Este concepto no constituye en sí la evaluación de inocuidad sino que es un marco de referencia que orienta la evaluación, que sí se basa en un Enfoque Comparativo. Este enfoque no hace otra cosa que tomar como referencia los cultivos o alimentos conocidos y aceptados como seguros y compararlos con sus versiones mejoradas mediante ingeniería genética. Es oportuno aclarar que estas técnicas no en todos los casos van a tener como resultado la introducción de un transgén, sino que hay otras estrategias experimentales - antisentido, silenciamiento por regulación epigenética o anulación de la actividad de un gen por «knock out», que si bien involucran manipulación in vitro y transformación, no resultan en la adición de un gen y/o una proteína nuevos. El Enfoque Comparativo fue evolucionando desde las primeras propuestas de recomendaciones que formularon OECD; FAO/ OMS e ILSI desde La base de esta estrategia para establecer inocuidad de nuevos alimentos, es la historia de uso seguro del cultivo parental (es decir aquel que es la base de la modificación). - Qué se compara y por qué Es claro que toda modificación tiene un objetivo, sea obtener una mejora de tipo agronómica (a esta categoría pertenecen los OVGM conocidos como de «primera generación») como resistencia a plagas o enfermedades, una mejora nutricional o de calidad («segunda generación») o bien la síntesis de un producto en particular («tercera generación») desde un fármaco, hasta biocombustibles, pasando por vacunas comestibles. Es decir que la modificación tiene efectos intencionales medibles, que se traducen en una característica fenotípica dada. Por otro lado, es posible que se produzcan efectos no intencionales de la modifica- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 377

361 ción, que pueden o no tener un impacto negativo en la seguridad de la planta modificada, pero que es pertinente estimar. Y es aquí donde la comparación tiene un papel relevante. Los impactos no deseados de la introducción de un gen o secuencia en el genoma de una planta, comprenden diferentes aspectos que son examinados durante el proceso de evaluación: Toxicidad o alergenicidad de la(s) proteínas expresadas Influencia de los productos de expresión sobre el metabolismo de la planta, que lleve a cambios en el valor nutricional o la concentración de tóxicos o alérgenos naturales. Inserción no intencional en otros genes («knock out» no intencional) que sean esenciales o activación de otros, que no se expresen normalmente. Efectos pleiotrópicos de los genes insertados (efectos sobre la actividad de otros genes o vías metabólicas, que se manifiesten a diferentes niveles en el fenotipo de la planta). Es importante tener en cuenta que estos efectos también pueden producirse durante el mejoramiento convencional (definido como el que no utiliza ingeniería genética), si bien los cultivos mejorados mediante tecnologías no recombinantes no se someten por el momento, a este tipo de evaluación, con la excepción de Canadá, que sí regula algunos casos especiales. La normativa canadiense, evalúa aquellas variedades con rasgos suficientemente novedosos, independientemente del proceso utilizado para su obtención, si bien menciona particularmente ciertas metodologías de mejoramiento, como la mutagénesis acelerada (inducida por agentes químicos o irradiación) o la fusión celular. Como veremos en detalle a continuación, el proceso evaluativo recorre una serie de pasos que se basan en evidencia experimental, y que van llevando a conclusiones que permiten tomar decisiones respecto de la inocuidad del OGM en cuestión (ver Figura 3). Las evaluaciones de seguridad, entonces, se concentran: a) en la característica introducida: para ello, se caracteriza completamente el gen insertado en el cultivo GM y se evalúa la seguridad de la/s proteína/s resultantes. Si bien esta evaluación la deben realizar los obtentores previamente a la transformación, ya que no será aprobado un cultivo que pueda presentar algún problema toxicológico o de alergenicidad, las agencias regulatorias encargadas del control de estos productos efectúan un exhaustivo análisis de seguridad de los genes insertados y sus productos de expresión. b) en el cultivo o alimento como un todo: sobre el cultivo GM, se analizan los rasgos fenotípicos / agronómicos y la composición y se los compara con los de sus contrapartes no-gm o convencionales. Las diferencias encontradas, sean intencionales o no, se convierten en el centro de ulteriores evaluaciones de seguridad. El objetivo de estas evaluaciones es demostrar que el cultivo o alimento GM es tan seguro como el alimento tradicional conocido, independientemente de su grado de equivalencia (Figura 2). a. El rasgo introducido: Para caracterizar el gen introducido se requiere conocer la secuencia completa del inserto o insertos, el número de copias y su estabilidad a lo largo de varias generaciones. La seguridad (o inocuidad) de la/s proteína/s producidas por el inserto se evalúa basándose en información relativa a su fuente de origen (el organismo donante, historial de uso seguro, etc.), su estructura (secuencia de aminoácidos, cambios postraduccionales, incluso su estructura tridimensional), su función / especificidad / modo de acción, su expresión en diferentes tejidos de la planta, su toxicidad aguda, su potencial de alergenicidad, su digestibilidad in vitro y su estabilidad al procesamiento, que son indicadores de esta potencialidad. Se utiliza la toxicidad aguda determinada en ensayos estándares en ratones por vía oral, ya que la gran mayoría de las proteínas ejercen sus efectos tóxicos por esta vía, fundamentalmente debido a su naturaleza (que hace que se degraden rápidamente en el tracto intestinal). Para detectar otros efectos que podrían dejar fuera a algunos casos especiales, se realizan estudios de alimentación en animales y toxicológicos subcrónicos (en general, estudios de 90 días en rata, cuando se considera justificado por 378 RUBINSTEIN, Clara

362 comparar los patrones de proteínas del suero de pacientes sensibles, que se unen a inmuglobulinae (la responsable de las reacciones alérgicas severas) en análisis de Western sobre geles bidimensionales, para determinar si hay nuevas proteínas o si el patrón endógeno se ha visto alterado por la modificación. Como ya se dijo, aún no se cuenta con modelos animales que se encuentren lo suficientemente desarrollados para ser validados a nivel internacional en cuanto a su capacidad predictiva de alergenicidad, pero numerosos organismos e instituciones internacionales se encuentran trabajando en ello. Figura 2. Enfoque comparativo las demás evidencias experimentales). En cuanto a la estimación del potencial alergénico, la aproximación que se utiliza, es la del «peso de la evidencia». Este concepto se basa en el hecho de que no existe un solo parámetro que defina a un alérgeno, y que no es posible hoy contar con modelos que predigan adecuadamente la alergenicidad en humanos. Dado que existe una serie de parámetros fisicoquímicos que son compartidos por los alérgenos proteicos conocidos (que son un grupo reducido de proteínas de origen animal y vegetal), éstos pueden ser utilizados para estimar la posible alergenicidad de la proteína introducida. Por ejemplo, la resistencia a la digestión, la prevalencia en el alimento (normalmente, los alérgenos proteicos son mayoritarios en la composición final) y la similitud con otras proteínas alergénicas, son algunos de estos parámetros. En efecto, se realizan análisis bioinformáticos que comparan la secuencia de los productos de expresión presentes en los OGM, contra bases de datos de todos los alérgenos conocidos. En el caso de cultivos con actividad alergénica conocida, como la soja, es posible b) El cultivo o alimento GM: Sobre la base de los 50 años de experiencia ganada en mejoramiento tradicional (breeding), y evaluación de seguridad de otros productos como medicamentos, alimentos, y químicos, las agencias internacionales recomiendan comparar los siguientes parámetros de los OGM respecto de contrapartes convencionales, para poder contar con suficiente información que permita arribar a una certeza razonable de inocuidad: - Parámetros fenotípicos: La caracterización fenotípica/agronómica del cultivo GM se hace tempranamente durante el proceso de selección. Los puntos evaluados ( por ej. morfología, rendimiento) son muy sensibles a los cambios genéticos y a las perturbaciones desfavorables en el metabolismo, por lo tanto son buenos indicadores de equivalencias entre el cultivo modificado y su contraparte tradicional. Se observan y miden cuidadosamente las características morfológicas, fisiológicas, y reproductivas, la resistencia o susceptibilidad a plagas y enfermedades, e incluso características como perfume o sabor de los frutos. Este proceso, que dirige la selección de aque- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 379

363 llas plantas transformadas (o «eventos») que tengan las características deseadas, es crítico para eliminar efectos no intencionales. -Composición química: ésta es la evaluación en la que se fundamenta gran parte del análisis comparativo. Se realiza la determinación analítica de la composición en diferentes tejidos de la planta, sobre muestras de ensayos a campo controlados, realizados en ambientes representativos de aquellos donde ese cultivo va a ser sembrado, a lo largo de varias campañas de producción (años). Se determina la composición de macro y micronutrientes (proteínas, grasas, hidratos de carbono, aminoácidos y ácidos grasos, vitaminas, etc.), minerales, tóxicos naturales y compuestos bioactivos y/o metabolitos secundarios, dependiendo del cultivo. Por ejemplo, se miden niveles de fitoestrógenos y antinutrientes (inhibidores de tripsina, lectinas) en soja, glucosinolatos en colza, cumarinas en apio y solaninas en papa. También se pueden medir alérgenos en soja (glicinina), beta carotenos en zapallo, y gosipol en algodón. La OECD ha publicado recientemente recomendaciones que especifican qué componentes son más apropiados analizar para cada cultivo en particular. A parte de la comparación en componentes específicos, se realizan, generalmente, ensayos de aptitud nutricional en modelos animales. Estos apuntan a detectar cualquier efecto no intencional de la modificación que pudiera haber afectado el valor nutricional del alimento o su inocuidad. Es común que se utilicen ensayos de alimentación de duración variable (entre 42 y 120 días) dependiendo del modelo elegido. Uno de los más utilizados y sensibles es el de pollos parrilleros, ya que pasan de pesar 35 gramos a más de 2 kg en 42 días. Este crecimiento rápido hace que se puedan detectar pequeñas deficiencias nutricionales del alimento. Tabla 1: Ensayos de alimentación con OGM en modelos animales (adaptado de Kuiper y col., 2001, Faust and Glenn, 2002) Mientras que la evaluación de seguridad de las proteínas introducidas se lleva a cabo con la proteína (s) purificadas y generalmente sintetizadas en modelos bacterianos (por la cantidad que se necesita para los ensayos toxicológicos), los estudios de alimentación se realizan con el alimento completo, por ejemplo, grano o forraje en el caso de maíz, harinas de soja tostadas, o semilla de algodón como suplementación de la dieta. (Ver Tabla 1). Según los resultados de todos los puntos analizados, es posible clasificar al cultivo o alimento GM en una de estas tres categorías posibles (FAO/OMS/OECD): * El producto GM es sustancialmente equivalente a la contraparte tradicional, no existiendo diferencias significativas. Esta situación se da principalmente en productos altamente refinados. El aceite o la fructosa derivados de maíz GM, son totalmente equivalentes a los derivados de maíz convencional. * El cultivo o alimento GM es sustancialmente equivalente a su contraparte tradicional con la excepción de diferencias claramente definidas (presencia de la/s proteínas introducidas y/o diferencias bien caracterizadas en otros elementos individuales). Dentro de esta categoría caen la mayoría 380 RUBINSTEIN, Clara

364 de los cultivos de primera generación, que expresan un rasgo único, tal como la resistencia a herbicidas o la protección contra insectos, y algunos de segunda generación, con mejoras nutricionales o de calidad. Para demostrar que los cultivos o alimentos GM son «tan seguros como» su contraparte tradicional, se debe mostrar que cada diferencia encontrada no tiene consecuencias toxicológicas ni nutricionales. Esta evaluación se lleva a cabo caso por caso, y según se considere necesario, pueden conducirse ensayos de toxicidad o estudios de alimentación en animales grandes con el cultivo entero. * El cultivo o alimento GM no es sustancialmente equivalente a su contraparte tradicional o no existe un cultivo equivalente con el cual compararlo. Ejemplo de esto serían cultivos con ciertos rasgos combinados o cultivos con valor nutritivo aumentado que contienen nuevas vías metabólicas o modifican las endógenas. La evaluación de seguridad se va a enfocar en las características de los nuevos productos expresados. En cada caso en particular se Tabla 2: componentes analizados en semillas enteras de soja y en varias fracciones de soja procesada (Tomado del Cuadernillo Técnico No1, Seguridad de la Soja RR tolerante a Glifosato (Monsanto Agricultura España, 2001) determinará el programa de estudios que corresponda. Actualmente, todos los cultivos modificados y sus productos alimentarios derivados presentes en el mercado han sido analizados en profundidad para evaluar su seguridad, demostrándose que son sustancialmente equivalentes, con la excepción de la/s proteínas introducidas y son tan seguros como su contraparte tradicional. En un futuro se introducirá una segunda generación de cultivos con rasgos de calidad y valor nutritivo mejorado. Por definición, es menos probable que sean sustancialmente equivalentes a las variedades tradicionales. La evaluación de la seguridad en estos casos requerirá enfocarse en los cambios composicionales intencionales que se hayan introducido en cada caso, y en la evaluación de los efectos no intencionales (esperados o no) que pudieran haberse producido por modificación de las vías metabólicas involucradas. Como ejemplo de este tipo de casos, se puede mencionar el arroz conocido como «arroz dorado», debido a la modificación introducida para expresar altas concentraciones de betacaroteno, precursor de vitamina A (que le da esta coloración particular). Como efecto no esperado de esta modificación, se encontró que también se expresaban mayores niveles de xantofilos, un cambio que fue detectado aplicando técnicas de croma-tografía de alta presión (HPLC) para carotenoides, y que no hubiera sido aparente en un análisis general de composición. Este tipo de análisis, por lo tanto, puede ser apropiado en casos de modificaciones nutricionales (de «segunda generación») dirigidas a cambiar algún paso en vías metabólicas específicas, pero que pueden tener efectos en el ámbito de otros componentes. Es en estos casos, en los que las nuevas tecnologías analíticas que se están desarrollando pueden aportar soluciones al análisis de riesgo (ver próxima sección). Asimismo, este tipo de modifica- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 381

365 ciones puede implicar un cambio significativo en la ingesta de ciertos nutrientes (por ejemplo, vitamina A), y requerir un seguimiento luego de su comercialización para verificar el posible impacto nutricional (positivo o negativo) que esto pueda tener en una determinada población. En la Tabla 2 se resume como ejemplo el tipo de componentes analizados en diferentes fracciones, para la evaluación de seguridad alimentaria para el evento de soja GM , tolerante a glifosato (ver Parte VIII, capítulo 6). En la Tabla 1 se listan los diferentes modelos animales utilizados para la evaluación de aptitud nutricional de OGM y los parámetros que se analizan en cada caso. 3. Evaluación de impacto ambiental Toda tecnología tiene un cierto riesgo que debe ser evaluado 1) en función del beneficio o beneficios que aporta y 2) en el contexto de las tecnologías que se utilizan con el mismo fin y de tecnologías alternativas, en caso de existir. La evaluación del impacto ambiental de nuevos cultivos GM es una parte fundamental de su proceso de aprobación y control y debe enfocarse dentro de los parámetros enunciados. En los capítulos 2 y 3 se desarrolla este aspecto en mayor detalle, por lo que en este punto se enunciarán los posibles impactos sobre el ambiente, que son evaluados antes de la introducción de un OGM en los agroecosistemas, y que se resumen en los siguientes puntos: Capacidad de convertirse en maleza: en caso de que la planta GM tuviera características que la hicieran más resistente a las condiciones ambientales, o tuviera mayor poder reproductivo que su contraparte convencional. Posible impacto en especies benéficas o sobre la flora o fauna circundante: es evaluado el impacto que el cultivo podría tener en especies propias del agroecosistema. Por ejemplo, efectos sobre especies que no son el blanco de su actividad en el caso de cultivos GM protegidos de insectos. Mayor capacidad de cruzarse con plantas de su entorno que la contraparte convencional. Incluso en caso de ser idéntica, se evalúa cuáles serían las consecuencias de dichos cruzamientos (debido al llamado flujo génico mediado por polen). El flujo genético entre poblaciones es un fenómeno natural, responsable de una gran diversidad genética. Para estimar qué peso puede tener un rasgo nuevo introducido por ingeniería genética en el flujo génico general, es importante tener en cuenta qué efecto en particular producirá ese gen si se establece en otra población. Todo esto se examina en función de la existencia de parientes silvestres de ese cultivo en la zona donde se lo quiere introducir. Por ejemplo, en el caso de la soja o el maíz, no existen parientes silvestres en la Argentina, pero sí en México (en el caso de maíz) y en China (en el caso de la soja). En el caso de cultivos resistentes a insectos, la aparición de insectos resistentes. Es conocida la plasticidad genética de los insectos para desarrollar estrategias adaptativas que les permiten sobrevivir a insecticidas químicos. De igual modo, es posible pensar que lo mismo ocurrirá con las proteínas de control biológico utilizadas en los cultivos transgénicos tolerantes a plagas. Por este motivo, se han desarrollado procedimientos y estrategias para minimizar o prevenir el desarrollo de estas resistencias en las plagas blanco. Si bien no se han reportado casos de aparición de insectos resistentes por el uso de la tecnología de protección de insectos en plantas desde 1996, es importante desarrollar estrategias que apunten a conservar el recurso biológico. Estos programas se conocen como de Manejo de Resistencia de Insectos o MRI (IRM en inglés: Insect Resistance Management) y se diseñan a medida de cada cultivo y plaga que se va a controlar, basandóse en el conocimiento del modo de acción de esta proteínas y la dinámica de las poblaciones de los insectos plaga. Es requisito presentar un plan de MRI, para que las agencias regulatorias evalúen el impacto ambiental antes de la introducción comercial de un cultivo GM protegido de insectos. Todos estos puntos son analizados, del mismo modo que la inocuidad alimentaria, caso por caso. También se estima el cambio que podría provocar en el manejo agronómico, la introducción de un dado cultivo GM. 382 RUBINSTEIN, Clara

366 El objetivo de las evaluaciones de riesgo ambiental, es identificar impactos en el ambiente, cuantificarlos y proporcionar elementos para aquellos que deben manejar y minimizar estos riesgos, siempre en el contexto del balance riesgo-beneficio y de las tecnologías alternativas disponibles (por ejemplo, cultivos Bt evaluados en relación con las aplicaciones tradicionales de insecticidas químicos, y en el contexto del Manejo Integrado de Plagas, como una herramienta más de control biológico). 4. Nuevas tecnologías potencialmente aplicables a la evaluación de la bioseguridad Figura 3: Diagrama para la estimación de seguridad de OGM. Adaptado de Cockburn, 2002 Los avances en la tecnología científica de los últimos años han transformado profundamente la forma en la que se hace ciencia y se obtiene información de los sistemas biológicos. La enorme capacidad de secuenciación en combinación con la bioinformática han potenciado la identificación y caracterización de genes (genómica) y el estudio de su función (genómica funcional). Otras tecnologías derivadas de las primeras y en constante evolución, se ocupan del estudio del transcriptoma, el proteoma, el metaboloma, que abarcan todos los transcriptos, proteinas o metabolitos de una especie, respectivamente. Hoy se habla de las tecnologías «ómicas» en referencia global a este tipo de aproximación. Paralelamente, estas tecnologías permiten el desarrollo de nuevos campos de la ciencia, como la farmacogenómica, la toxicogenómica y la nutrigenómica, que son versiones «ómicas» de las especialidades tradicionales que abordan el mismo problema. Estas tecnologías hoy se encuentran en una etapa inicial de generación de enormes cantidades de datos; sin embargo, el potencial que presentan a corto y mediano plazo para el descubrimiento y la comprensión de procesos biológicos, no tiene precedentes. En el campo del análisis de riesgos, especialmente en los aspectos toxicológico y nutricional, será valioso contar con tecnologías que permitan determinar los perfiles bioquímicos de OGM y sus contrapartes convencionales (profiling), ya que será posible de «un vistazo», detectar cambios en los patrones de expresión genética y en los proteicos o metabólicos por efecto de la modificación. El problema es que seguramente, al penetrar en niveles de resolución tan altos, se encontrarán una serie de cambios que incluso son evidentes entre individuos del mismo grupo (por ejemplo, individuos de la misma variedad no Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 383

367 GM), debido a la variabilidad natural. Esta variabilidad, hace muy difícil en estos momentos poder interpretar de manera clara muchos de los resultados que se obtienen, y su significación biológica real, para poder sacar conclusiones en cuanto a su relevancia en la bioseguridad. Sin embargo, en un futuro cercano, y a medida que se avanza en el conocimiento de los sistemas biológicos, será posible aplicar nuevas tecnologías a la evaluación de la seguridad alimentaria, no sólo de OGMs sino de cualquier alimento. Conclusión El objetivo del análisis de riesgos para organismos y/o alimentos derivados del uso de la ingeniería genética (GM) es estimar el impacto que los efectos intencionales y los no intencionales de la modificación, pudieran tener sobre la inocuidad del alimento o del organismo GM, o sobre su impacto ambiental. El enfoque utilizado para aplicar este proceso (el enfoque comparativo) ha sido consensuado a partir de consultas y discusiones en el plano internacional, y se basa en la comparación de parámetros como composición, tóxicos naturales o aptitud nutricional, con la contraparte convencional que tiene historia de uso seguro y es aceptado como alimento inocuo (OECD, 2000). Lecturas sugeridas : Agbios.com: Agricultural Biotechnology: Informing the Dialogue. College of Agriculture and Life Sciences, Cornell University, ANZFA (2000) GM Foods and the Consumer. Australia New Zealand Food Authority s Safety Assessment Process For Genetically Modified Foods. ASTWOOD JD, LEACH JN, FUCHS RL (1996) Stability of food allergens to digestion in vitro. Nature Biotechnol 14: BENEFITS ASSESSMENT, Revised BT Crops Assessment. EPA. bt_reassess/6-benefits.pdf BENEFITS AND CONCERNS ASSOCIATED WITH RECOMBINANT DNA BIOTECHNOLOGY-DERIVED FOODS. (2000). Food Technology 54 (10): (published by the Institute of Food Technologists- IFT). BURKS AW, FUCHS RL (1995) Assessment of the endogenous allergens in glyphosate tolerant and commercial soybean varieties. J Allergy Clin Immunol 96: BUSH RR, HIGHLY SL (1996) Food allergens. Crit Rev Food Sci Nut 36(S):S CARPENTER J (2001) Case Studies in Benefits and Risks of Agricultural Biotechnology: Roundup Ready Soybeans and Bt Field Corn. National Center for Food and Agricultural Policy. benefitsandrisks.pdf CARPENTER, J.; FELSOT, A.; GOODE, T.; HAMMIG, M.; ONSTAD, D.; SANKULA, S. (2002). Comparative Environmental Impacts of Biotechnology-derived and Traditional Soybean, Corn, and Cotton Crops. Council for Agricultural Science and Technology CAST: I-189. COCKBURN, ANDREW (2002). Assuring the safety of Genetically Modified Foods: the importance of an holistic, integrative approach. Journal of Biotechnology, 98, ANTHONY, J.; GLARE, TRAVIS R.; NAP, JAN-PETER The release of genetically modified crops into the environment. Part II. Overview of ecological risk assessment. The Plant Journal 33: Council for Agricultural Science and Technology. Applications of Biotechnology to Crops: benefits and Risks. Documento explicativo de la Universidad de California en San Diego: «Foods from Genetically Modified Crops» DONKIN SS, VELEZ JC, STANISIEWSKI EP et al. (2000) Effect of feeding Roundup Ready corn silage and grain on feed intake, milk production and milk composition in lactating dairy cattle. J. Dairy Sci. 83 (Suppl 1):273 FAO/WHO (2000) Safety aspects of genetically modified foods of plant origin. Report of a Joint FAO/WHO Consultation. World Health Organization, Geneva WHO/ SDE/PHE/FOS/00.6 FAUST, M y GLENN, B. (2002) Animal feeds from Crops Derived through Biotechnology: Farm Animal Performance and Safety. En: Biotechnology and Safety Assessment, 3ra edicion, John Thomas y Roy Fuchs, Elesevier.Capitulo 6. FOLMER, J.D.; GRANT, R.J.; MILTON, C.T. et al. (2000) Effect of Bt corn silage on short-term lactational performance and ruminal fermentation in dairy cows. J. Dairy Sci. 83 (5):1182 HAMMOND, B.G.; VICINI, J.L.; HARTNELL, G.F. et al. (1996) The feeding value of soybeans fed to rats, poultry, catfish and dairy cattle is not altered by incorporation of glyphosate tolerance. J Nutr 126: ILSI ALLERGY AND IMMUNOLOGY INSTITUTE AND INTERNATIONAL FOOD BIOTECHNOLOGY COUNCIL 384 RUBINSTEIN, Clara

368 (1996) Allergenicity of food produced by genetic modification. Crit Rev Food Sci Nutr, vol 36 suppl, CRC Press, Boca Raton. ILSI EUROPE (1995) The safety assessment of novel foods. Guidelines prepared by the ILSI Novel Food Task Force. ILSI Europe Report Series ILSI EUROPE (1999) Safety assessment of viable genetically modified micro-organisms used in food. Consensus Guidelines reached at a workshop held in April ILSI Europe Report Series ILSI : INTERNATIONAL FOOD BIOTECHNOLOGY COMMITTEE (IFBIC), 2003 : base de datos composicional de cultivos agroalimentarios : ILSI HEALTH AND ENVIRONMENTAL SCIENCES INSTITUTE (1999) An evaluation of insect resistance management in Bt field corn: a science-based framework for risk assessment and risk management. Report of an Expert Panel KIMBER, I.; KERKVLICT, N.I.; TAYLOR, S.L. et al. (1999) Toxicology of Protein Allergenicity: Prediction and Characterization. Toxicological Sciences 48: KUIPER, H.; KLETER, G.; NOTEBORN, H. and KOK, E.(2001) Assessment of the Food Safety Issues Related to Genetically Modified Foods. The Plant Journal, 27 (6), M. J. CRAWLEY et al., 2000, Transgenic Crops in Natural Habitats (Nature, Vol. 409: ). Un estudio de largo plazo (diez años). Cuatro cultivos transgénicos fueron probados en 12 habitats diferentes y seguidos durante 10 años. Disponible en : MARTENS, M.A.(2002) Philosophy of hazard Assessment of GM foods BCPC Symposium Proc. No75, Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca (ir a CONABIA) TAYLOR, N.B.; FUCHS, R.L.; MACDONALD, J. et al. (1999) Compositional analysis of glyphosate-tolerant soybeans treated with glyphosate. J Agric Food Chem 47: TESHIMA, R.; AKIYAMA, H.; OKUNUKI, H. et al (2000) Effect of GM and non-gm soybeans on the immune system of BN rats and B10A mice. J Food Hygienic Society of Japan 41: THE INSTITUTE OF FOOD TECHNOLOGISTS (2000) IFT Expert Report on Biotechnology and Foods: Human Food Safety Evaluation of rdna Biotechnology-Derived Foods. Food Technology 54 (9): WHO (1995) Application of the principles of substantial equivalence to the safety evaluation of foods or food components from plants derived by modern biotechnology. Report of a WHO workshop. World Health Organization, Geneva. WHO/FNU/FOS/95 PARIZA, M. y JONSON, E. (2001) Evaluating the safety of microbial enzyme preparations used in food processing: update for a new century». Regulatory Toxicology and Pharmacology, 33, (on line en NAP, JAN-PETER; METZ, PETER L.; ESCALER, MARGA; CONNER, ANTHONY J The release of genetically modified crops into the environment. Part 1. Overview of the current status and regulations. The Plant Journal 33: CONNER, ANTHONY J.; GLARE, TRAVIS R.; NAP, JAN-PETER The release of genetically modified crops into the environment. Part II. Overview of ecological risk assessment. The Plant Journal 33: NRC(1989) Field testing Genetically Modified Organisms: Framework for Decisions. Nat.Res.Council, Natl Acad Press, Washington. OECD (2000) Report of the OECD Task Force for the Safety of Novel Foods and Feeds. OECD, Okinawa, Japan. / PHIPPS, R.;PARK, J Environmental Benefits of Genetically Modified Crops - Global and European Perspectives on Their Ability to Reduce Pesticide Use. Journal of Animal and Food Sciences. 11: pdf PIMENTEL, D.S.; RAVEN, P.H. (2000) Bt Corn Pollen impacts on nontarget Lepidoptera: Assessment of Effects in Nature. Proceedings of The National Academy of Sciences 97: pdf POTRYKUS, I.; LUCCA, P.; YE, X.; AL BABILI, S.; HURRELL, R.F. and BEYER, P. (1999) Contributions to Food Security by Genetic Engineering with Rice. New York: Rockefeller Foundation. t_news/t_072699_rice.html. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 385

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370 IX.- Capitulo 2 Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados - Marcos Regulatorios Dr Burachik, Moisés 1. Panorama Internacional Desde 1986, algunos países como Japón, por ejemplo, se han ocupado de elaborar y desarrollar regulaciones para controlar la entrada en el mercado de productos derivados del uso de técnicas de ADN recombinante. En ese momento el foco estaba puesto en los ingredientes o aditivos alimentarios producidos por microorganismos recombinantes, pero a medida que la tecnología avanzaba y se aplicaba a otros organismos, estas reglamentaciones se vieron extendidas a plantas y animales modificados. Numerosos países en los cinco continentes, tienen en este momento un marco regulatorio disponible para la evaluación y aprobación de OGMs antes de su entrada en el mercado. Entre los primeros países que han desarrollado estos procesos, se encuentran los países europeos, siendo la Comisión Europea, el órgano de evaluación y control de la Unión Europea. En los Estados Unidos, diferentes agencias están involucradas en estas evaluaciones: la Agencia de Alimentos y Drogas (FDA), la Agencia para la Protección del Medio Ambiente (EPA) y el Departamento de Agricultura (USDA). Canadá y Australia-Nueva Zelanda, han establecido sus sistemas regulatorios más recientemente (a partir de 1993). En cuanto a América Latina, Argentina fue el país pionero en esta materia, con la creación de CONABIA en 1991, en el ámbito de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentación (ver más adelante). Es importante notar que después de los EEUU, Argentina es el país con mayor grado de adopción de cultivos agrobiotecnológicos, seguido por Canadá. Otros países de la región han comenzado desde entonces a establecer sistemas para la evaluación de la bioseguridad de OGMs. Colombia, Chile, Brasil, Uruguay, Paraguay, Bolivia, poseen comisiones técnicas evaluadoras, y en algunos de estos países ya se han aprobado la comercialización y el cultivo de variedades GM. Estos sistemas están siendo establecidos en muchos otros países, especialmente apuntando a la implementación del Protocolo de Bioseguridad, también conocido como Protocolo de Cartagena, vigente desde Septiembre de Este protocolo, firmado en el año 2000 por más de 130 estados, regulará los movimientos transfronterizos de OGMs vivos o OVGMs, con el objeto de asegurar un nivel adecuado de bioseguridad en el comercio internacional y la conservación de la biodiversidad. Para una actualización sobre marcos regulatorios en America Latina, ver el listado de sitios recomendados. 2. Cuáles son los riesgos? Uno de los problemas inherentes a la concepción de un marco regulatorio para los ensayos de campo de plantas GM es el de la identificación de los riesgos que deben considerarse. Esta identificación depende de las opciones que se acepten de un conjunto de posibilidades y de los valores de los que optan, sean ellos científicos, funcionarios, políticos, empresarios o público en general. Esto es, deben compatibilizarse criterios sobre lo que se consideran riesgos aceptables, en un marco de intereses muy variados. Por otra parte, si bien la identificación de los riesgos se basará en conocimiento científico disponible ahora, existirá siempre un componente de extrapolación (si bien plausible) cuando se estimen efectos adversos «potenciales», que es la materia misma y el objetivo del análisis de riesgos. No obstante estas limitaciones, «la evaluación de efectos potenciales de una entidad y sus implicaciones, para verificar y estimar la posiblidad de ocurrencia de un efecto adverso y caracterizar la naturaleza de tal efecto es (definible como) una actividad científica» (Natl. Acad. Sci., 1983). Con estas limitaciones en mente, lo que sigue es una lista acotada de características Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 387

371 comúnmente asociadas con los riesgos de los ensayos de campo de plantas GM, que son los que se han tenido en cuenta al fundamentar los requerimientos necesarios para evaluar su impacto en cada caso. I Pérdida de Diversidad Biológica: Aquí nos referimos a la pérdida debida a la presión del mercado y de los costos sobre los productores, induciendo cambios en las prácticas agronómicas (menor uso de herbicidas e insecticidas) por la utilización (ventajosa) de OGMs, en desmedro de razas locales adaptadas (landraces) empleadas en la actualidad. También podría producirse si se cultivan OGMs en la vecindad de centros de origen o de diversidad de sus parientes silvestres o de especies sexualmente compatibles, por fenómenos de introgresión génica (este riesgo es relativamente más importante en el hemisferio Sur). II Transferencia genética a especies silvestres o malezas sexualmente compatibles, con el resultado de la formación de híbridos viables con fenotipos no deseados (p.ej., tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos u otras plagas). (Ver Capítulo 3, de esta parte). III Incremento de la presión de selección, tal que favorezca un aumento de la tolerancia de plagas a insumos defensivos actualmente empleados. En el caso de insumos que por razones ambientales, económicas o de manejo agrícola, son apreciados por el productor y/o por la sociedad (p.ej., herbicidas postemergentes, productos biodegradables, insecticidas biológicos, productos de menor costo, o sin restricciones relacionadas con la propiedad intelectual, etc.), el aumento de la tolerancia de la plaga al producto es un efecto desfavorable, ya que puede convertir a dicho insumo en inútil en el futuro. IV Modificación de las relaciones predador-plaga entre insectos, en detrimento de los insectos benéficos. Aquí se incluyen los efectos sobre organismos no-blanco (caso de cultivos con incorporación de genes de resistencia a insectos). El conocimiento insuficiente sobre especies amenazadas de extinción (p.ej., insectos benéficos, sus plantas-refugios, etc.), también es un factor a tener en cuenta. V Persistencia en estado funcional (transferible, integrable y expresable) del DNA residual en suelos u otros hábitats (p.ej., el intestino de mamíferos), y de los posibles mecanismos de su eventual transferencia (p.ej. genes de resistencia a antibióticos hacia microorganismos patógenos humanos). Este riesgo se incluye en esta lista limitada, pero su ocurrencia se considera en general muy poco probable. VI Modificaciones en la relaciones ecológicas con otros organismos en el largo plazo. VII Fenómenos no esperados de recombinación (relacionados con promotores, enhancers, cápsides virales, etc) que cambien características epidemiológicas, ecológicas o rango de huésped de patógenos. Este es también un fenómeno de ocurrencia muy poco probable. La existencia de una zona potencialmente recombinogénica en el promotor 35S del virus del mosaico del coliflor, ampliamente utilizada en las construcciones insertadas en OGMs, no parece tener consecuencias biológicas significativas. En cuanto a la resistencia a virus por sobre-expresión de la cápside viral (un mecanismo que más probablemente se trate de silenciamiento génico que de reencapsidación del ácido nucleico viral. Ver VIII- 4) es también muy poco probable que genere fenómenos de trans-capsidación con cambios hipotéticos en el rango de huésped (cápside A tomada por un virus B, de modo que el rango de huésped de B pasa a ser el de A). VIII Efectos del ingreso de proteínas de inactivación de antibióticos en la cadena alimentaria. Posible necesidad de cambiar los marcadores de selección utilizados en la obtención de las plantas transgénicas. Este riesgo no ha sido probado, y por el contrario existen muchas pruebas (y barreras biológicas) de que tiene una muy baja probabilidad de ocurrencia. Sin embargo se inclu- 388 BURACHIK, Moisés

372 ye en esta lista por el impacto que tiene en la legislación europea en este sentido. IX Posibles cambios en los flujos comerciales. En el área del manejo de riesgos, es importante el manejo de las modificaciones esperables en la resistencia de las plagas, por parte de los productores, mediante un control post-liberación. Este no es un riesgo, sino una condición necesaria para el mantenimiento de la utilidad del OGM con determinadas características. Por ejemplo, la liberación de plantas conteniendo genes de resistencia a insectos (genes Bt), debe estar acompañada con programas de manejo (establecimiento de refugios, control de plantas y cultivos vecinos) para prevenir que la presión selectiva del evento seleccione poblaciones de insectos resistentes que harán inefectiva la protección inicialmente lograda con la modificación genética. En realidad este fenómeno sólo se puede retrasar, ya que toda presión de selección generará individuos tolerantes, en tiempos más o menos cortos. 3. Fundamentos de las normativas - Definiciones La elaboración y evolución de un marco regulatorio para la bioseguridad de una tecnología novedosa como la biotecnología aplicada al mejoramiento vegetal, no está exenta de dificultades. Por una parte está la responsabilidad de asegurar la aplicación sustentable de la nueva tecnología, y de preservar al hombre, la flora, la fauna y el ambiente de los potenciales efectos perjudiciales de las innovaciones, tanto en el presente como en el futuro. Por otra parte, hay razones para no obstaculizar el desarrollo de las innovaciones biotecnológicas, que ya han demostrado poseer un gran potencial para brindar beneficios a la sociedad. Toda actividad humana (especialmente la innovación tecnológica) implica peligros (riesgos) y por lo tanto requiere la atención (gestión) de su seguridad. La seguridad se obtiene definiendo, evaluando y gestionando los riesgos asociados con la innovación. Aplicando estos conceptos a la biotecnología, que implica el uso de organismos vivos, podemos enfocar el análisis de los riesgos de los ensayos hacia los siguientes aspectos generales: Identificación de los todos organismos involucrados (donantes, receptores, etc), Características de los organismos involucrados en la obtención del OGM (familiaridad, patogenicidad, etc), Manera en que serán utilizados los OGMs (escala, contención) Características de las zonas y de los otros organismos (lugares, medio receptor potencial, incluyendo seres humanos) La normativa argentina ha tomado en consideración estos aspectos, entre otros, para elaborar un marco regulatorio detallado para los Ensayos a Campo de Plantas Transgénicas, que se describe a continuación en sus rasgos principales. Consideramos una definición aceptable de bioseguridad, como la protección de la salud humana y del ambiente con respecto a los riesgos conocidos y/o percibidos de la técnica o proyecto en cuestión, de acuerdo al estado actual de nuestros conocimientos. Está implícita en esta definición que una regulación para la bioseguridad, que significa una regulación de los riesgos aceptables para la sociedad, conlleva una condición de flexibilidad y de adaptación permanentes. Para la normativa argentina, un OGM es: un organismo (vegetal, animal, microorganismo o virus) en el cual se ha introducido información genética precisa y definida en forma deliberada y dirigida a obtener un determinado fenotipo siendo aquella introducción realizada de tal manera que dicha información genética no podría haber sido adquirida por ese organismo por la vía de mutaciones, recombinaciones u otras formas de transferencia genética reconocidas como mecanismos que operan en la Naturaleza sin intervención humana. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 389

373 Esta definición hace referencia al método de obtención del OGM, con el propósito de establecer el campo de aplicación de la norma, excluyendo, por ejemplo, los cruzamientos tradicionales. Sin embargo, en el análisis del riesgo de la liberación de un OGM, la característica dominante, esto es, aquella que constituye el foco del análisis de la Comisión, es el inserto, esto es, la porción de DNA efectivamente presente en el genoma transformado, cuya naturaleza y consecuencias (geno- y fenotípicas) caracterizan al OGM como tal. Al OGM o conjunto de OGMs con un dado inserto se los denomina colectivamente evento. Varios OGMs pueden contener el mismo evento, y por lo tanto sus análisis de riesgo serán equivalentes. Ocasionalmente, en etapas tempranas del desarrollo de un OGM, se admite que el evento puede no estar inequívocamente caracterizado, en el sentido de que no se ha definido el inserto con la debida precisión (por ejemplo, el inserto puede estar en diferentes posiciones en el genoma del vegetal). En estos casos, el análisis se enfoca en la construcción genética utilizada en la transformación. Definimos como transformación, el método utilizado para introducir la nueva información genética, vehiculizada por el vector. Si bien la normativa argentina atiende aspectos del proceso de obtención de un OGM en el análisis de riesgo, esa atención sólo se enfoca en aquellas características que interesan en la evaluación del producto (y no del proceso de su obtención), en el sentido de que esas características se encontrarán finalmente en el OGM obtenido. Otra característica del marco regulatorio administrado por la CONABIA es que considera cada producto o liberación caso por caso. Si bien los antecedentes (si los hubiera) se tienen en cuenta, y los casos similares son identificados y considerados como objetos de información válida para la evaluación, los datos no son transferibles, y cada caso y/o solicitante deben ser coherentes y autosuficientes en cuanto a la información que provee a la Comisión. La definición de caso es entonces relevante. Un caso está definido por: La empresa o ente solicitante. El evento de transformación (es decir: un inserto definido introducido en el genoma de la planta, admitiéndose un conjunto de eventos con un único vector en las etapas muy preliminares del desarrollo del OGM). La escala de la liberación. Cualquiera de estas condiciones que no se conserve (p.ej., el mismo evento presentado por dos empresas o entes diferentes) representará un caso diferente. La normativa puesta en práctica es proactiva, en el sentido de que requiere un análisis previo de todas las previsibles consecuencias de una liberación antes de que tal liberación sea autorizada. 4. Marco Regulatorio en Argentina Argentina dispone desde 1991 de un marco regulatorio para el Análisis y la Gestión de los Riesgos asociados con los Ensayos a Campo de Organismos Genéticamente Modificados (OGMs). Esta normativa es administrada por la Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA), que opera en el ámbito de la Secretaría de Estado de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos (SAGPyA). Esta Comisión es multisectorial (la forman representantes de los sectores público y privado), multidisciplinaria, y es la encargada de emitir las recomendaciones con respecto a la autorización para los ensayos solicitados (experimentación y/o liberaciones a campo). Estas recomendaciones son remitidas a la autoridad decisoria, que es el Secretario de la SAGPyA. En el presente trabajo se analiza esta normativa y se exponen algunas consideraciones sobre los factores que deben ser atendidos. La consideración básica que guía el funcionamiento y los dictámenes de la CONABIA es la Bioseguridad, y su característica esencial es que funda sus procedimientos operativos en consideraciones exclusivamente técnicas, fundadas en los conocimientos científicos disponibles. Los principales criterios aplicados en la normativa argentina para decidir si una libe- 390 BURACHIK, Moisés

374 ración puede autorizarse, pueden resumirse así: a) el criterio de bioseguridad: la definición, evaluación y gestión de los riesgos, es la consideración primaria y su aplicación es proactiva, esto es, debe realizarse antes de autorizarse la liberación; los ensayos son evaluados caso por caso; el foco del interés está en el producto, pero aquellas características del procedimiento de su obtención que terminan afectando o manifestándose en el producto final, son también analizadas b)el enfoque precautorio: el marco regulatorio acompaña el desarrollo del producto, y no se requiere la fundamentación científica completa para detener dicho desarrollo; basta que se presente alguna de las siguientes situaciones: i) no existe suficiente información sobre el sistema, ii) los riesgos no son aceptables en base a presunciones razonables, iii) la evaluación no sea concluyente, o iv) el sistema es demasiado complejo La CONABIA no interviene en las etapas ulteriores (aprobación alimentaria, dictamen sobre el impacto en las exportaciones y registro, para la comercialización) del camino de una planta GM hacia el mercado (Ver Figura 1). Sin embargo, emite un dictamen particular fundado sobre la bioseguridad de la producción masiva a escala comercial del cultivo en cuestión. De este modo, la Solicitantes Aprobación o Rechazo Secretario de Agricultura Información requerida Fase I liberación experimental Fase II liberación extensiva /comercial Dictámenes fundamentados CONABIA dictamina sobre la historia de bioseguridad de la planta transgénica, para información de las agencias específicas del Estado encargadas de aquellos pasos. Si bien el marco regulatorio inicial ha experimentado algunas modificaciones a lo largo de los años (como respuesta a las necesidades de su adaptación en un campo tecnológico de rápido crecimiento), sus principios básicos se han mantenido y han demostrado su eficacia, desde varios puntos de vista que se describen más abajo. La versión que se presenta aquí resume las principales características de la normativa vigente en la actualidad. 5. El Ente Regulatorio Argentino: CONABIA La CONABIA es una Comisión multisectorial, formada por miembros de los sectores público y privado. Su Coordinación Técnica está a cargo de tres profesionales que pertenecen al sector público (véase la Tabla). Dada las características de esta composición, la operatoria de la Comisión hace especial énfasis en mantener una elevada ética de transparencia, evitando rigurosamente la posible interferencia de conflictos de intereses. Para ello, los miembros deben declarar la existencia y naturaleza de sus intereses, sean ellos comerciales o científicos, y excluirse totalmente de la discusión de solicitudes de liberación de OGMs que provengan de las empresas o institutos a los que están vinculados. La Comisión es profesionalmente multidisciplinaria, CONABIA SENASA (seguridad alimentaria) Dirección de Mercados Internacionales Evaluación del OGM a tres niveles FIGURA 1: el sistema de regulación y aprobación de OGMs en Argentina los criterios para la toma de decisiones son exclusivamente técnicos y el principio básico que rige esas decisiones, que se toman por consenso, es la bioseguridad. En los documentos que presentan a la CONABIA, los solicitantes de autorizaciones de ensayos tienen la opción de hacer reserva de información que consideren confidencial. La información así considerada, será examinada por solamente uno de los miem- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 391

375 bros de la Comisión, quien deberá emitir un juicio fundado sobre la bioseguridad de la propuesta y exponer esta opinión (aunque no la información reservada) ante la Comisión. A continuación se resumen los más importates logros luego de once años de trabajo de CONABIA : El análisis de riesgo y autorización de unas 550 liberaciones de OGMs. El número de presentaciones muestra un pronunciado crecimiento hasta 1999, en que la gestión a cargo de la Secretaría de Agricultura Ganadería Pesca y Alimentos desde esa fecha, y hasta 2001, demoró la aprobación de muchos ensayos. Procedimientos operativos ágiles, que mantienen la alta calidad de los análisis de riesgos sin obstruir ni producir demoras innecesarias en el normal desarrollo y aplicación de la tecnología. Juicios positivos manifestados sobre su actuación por varias autoridades representativas de los entes regulatorios de países como el Reino Unido de Gran Bretaña, Estados Unidos de Norteamérica y Canadá, entre otros. Organización y Co-organización de Reuniones Internacionales sobre Bioseguridad y Manejo de Riesgo, con la participación de representantes de países con amplia experiencia regulatoria. Misiones de asesoramiento institucional a países limítrofes en la elaboración de sus marcos regulatorios. Desarrollo de varias iniciativas de armonización regulatoria regional. Asesoramiento a los negociadores de la Cancillería y participación institucional en las discusiones sobre la política nacional con relación a la implementación de la Convención de Diversidad Biológica sobre Bioseguridad para la Biotecnología. Esta operatoria de CONABIA permite asegurar, tanto para la sociedad como para los sectores empresariales, un balance correcto entre la protección de la salud, la preservación de la calidad ambiental y la sustentabilidad de los proyectos aprobados, con la implementación regulada, en tiempo y forma, de las innovaciones tecnológicas propuestas por los solicitantes. La CONABIA realiza las evaluaciones de todas las Solicitudes de liberaciones de OVGM al ambiente, y recomienda al Secretario de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos sobre la conveniencia o no de autorizar dichas liberaciones. Estas evaluaciones comprenden dos fases: 1)las evaluaciones de las liberaciones experimentales cuyo propósito es determinar que la probabilidad de efectos sobre el ambiente es no significativa primera fase de evaluación-, y 2)las evaluaciones de las liberaciones extensivas cuyo propósito es determinar que dichas liberaciones del OVGM no generarán un impacto sobre el ambiente que difiera significativamente del que produciría el organismo homólogo no GM segunda fase de evaluación-. (Ver Figura 1) 6. Primera Fase de Evaluación: Ensayos experimentales Los solicitantes deben presentar un legajo de información específica, que consta de una Información General sobre la liberación y sobre el OGM en cuestión y de un apartado sobre las Condiciones de Bioseguridad que se pondrán en práctica. El campo del análisis de los riesgos abarcado por estas informaciones, que debe proveer el solicitante, es amplio, e incluye tanto las características de la liberación como las del OGM. Con respecto a las características de la liberación, la Información General sometida al análisis incluirá: Si el material es importado: status regulatorio en el país de origen. Propósito de la liberación (objetivo, cronograma, protocolos, antecedentes). Si es a escala de invernadero o a campo Operaciones de transporte de OGM (ingreso al país, transportes internos). Cantidad y tipo de material a liberar, antecedentes en otros países. Lugar de la liberación. Detalles operativos para auditar la liberación (fechas, instituciones, personas). Con respecto a las características del OVGM, se analizará el genotipo del evento 392 BURACHIK, Moisés

376 (es decir, las nuevas características genéticas introducidas), para lo cual el solicitante debe proveer información con respecto a: Descripción de la biología molecular del sistema donante-vector-receptor Método de transformación utilizado Genes principales (y sus organismos donantes). Genes auxiliares (marcadores de selección). Secuencias regulatorias (promotores, terminadores, enhancers, etc.). Otros elementos genéticos introducidos. Productos de expresión, tejidos de la planta en los que se expresan, niveles de expresión. Homologías de secuencia con proteínas tóxicas o alergénicas. Descripción fenotípica del organismo receptor, centros de origen o diversidad genética. Estabilidad fenotípica y número de generaciones en los que se verificó. En cuanto a la sección sobre las Condiciones de Bioseguridad, la información solicitada depende de la escala de la liberación: desde laboratorio/invernadero hasta pruebas a campo. En el caso de eventos que aún no han obtenido la autorización de comercialización en el país, es decir, eventos regulados, que se siembran a gran escala para producciones de semilla en contraestación para el hemisferio Norte, o con otros fines, existe un protocolo específico que es necesario presentar para obtener la autorización. En todos los casos el solicitante debe proveer información relativa a varios aspectos básicos de los Procedimientos de Bioseguridad, a saber: a) Durante la liberación: Descripción y ubicación del lugar o instalación donde se realizará la liberación. Localización precisa (mapas detallados): distancia a caminos, lugares transitados, límites del predio bajo control del solicitante. Características constructivas de bioseguridad (laboratorio o invernadero) y normas de acceso. Tamaño y número de parcelas, su diseño, plano de siembra y superficie a sembrar. Medidas de aislamiento En ensayos a campo: distancias, tiempos de floración, jaulas, cobertura para evitar la diseminación del polen, por viento o insectos, control de vectores potenciales de polen u otro material con capacidad de propagación, etc. En ensayos en laboratorio o invernadero: métodos o estructuras de contención contra el ingreso de vectores potenciales de material genético. b) En los movimientos de materiales: semillas, material vegetal acompañante, así como los lugares, normas e identificación del material que sea almacenado. c) En lo relacionado con el destino del material cosechado: el solicitante deberá informar sobre su utilización, aclarando si será local o si será exportado o destruído, e identificando los lugares de su almacenaje final o transitorio. d) En lo relacionado con la disposición final (OGM y materiales remanentes): se requiere información sobre el tratamiento del suelo post-cosecha, el uso futuro del terreno, los controles posteriores (detección de plantas voluntarias) y su duración. e) En el caso de un eventual escape del OGM y/o de cualquier material asociado: El solicitante debe exponer con claridad los procedimientos que seguirá en el caso de un eventual escape del OGM y/o de cualquier material asociado. Normalmente, esto incluye métodos de identificación del OGM, procedimientos para limitar y controlar el escape, así como la obligación de notificar perentoriamente a la autoridad regulatoria. f) Técnicas que se usarán para detectar la transferencia de genes desde el OGM al ambiente biótico. g) Usos previstos del terreno con posterioridad a la liberación solicitada. Control posterior de la parcela, duración de los controles post-cosecha. Una vez completados los ensayos, es requisito indispensable para poder acceder a nuevas autorizaciones, la entrega de un Informe de Cierre de la Liberación, que incluye observaciones relativas al comportamiento agronómico del OVGM en cuanto a germinación, crecimiento vegetativo, floración, susceptibilidad a enfermedades y plagas, así como efectos sobre organismos no Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 393

377 blanco y características de la cosecha, los tratamientos realizados y la disposición final. Es importante notar que estas liberaciones son periódicamente inspeccionadas por agentes habilitados por la SAGPyA. La normativa completa, así como los requerimientos de información detallados en los formularios que deben completarse para obtener una autorización de liberación, se encuentran a disposición para la consulta a través del sitio de CONABIA (ver en la lista de lecturas y sitios recomendados). 7. Segunda Fase de Evaluación : el camino hacia el mercado Tabla I: COMPOSICION DE LA CONABIA Representantes del Sector Público Coordinación Técnica de la Comisión: Dirección de Agricultura (Secretaría de Estado de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos) INASE: Instituto Nacional de Semillas SENASA: Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Secretaría de Recursos Naturales y Desarrollo Sustentable Institutos Nacionales de Investigación: De Investigaciones Agropecuarias De investigaciones Científicas y Técnicas Universidad de Buenos Aires Sociedad Argentina de Ecología REPRESENTANTES DEL SECTOR PRIVADO Asociación de Semilleros de Argentina Foro Argentino de Biotecnología Cámara de Productos de Sanidad Agropecuaria y Fertilizantes Cámara Argentina de Productos Veterinarios Como ya se ha enfatizado antes, la incumbencia básica de la CONABIA está limitada a la gestión de los riesgos y la bioseguridad de los ensayos a campo de plantas GM a diferentes escalas. Los pasos siguientes hacia el mercado, es decir la aprobación de su uso como materia prima alimentaria, la verificación de que su liberación comercial no afectará negativamente nuestro comercio internacional, el registro de la nueva variedad, y la autorización para la producción comercial, son resorte de otras agencias del Estado (Ver Figura 1). Esas dependencias basan su decisión en dos clases de información: La información requerida a los solicitantes que es específica a sus necesidades (la aptitud alimentaria, la estructura de nuestro mercado de exportación). La información suministrada por la CONABIA sobre el comportamiento del OGM en cuestión a lo largo de los ensayos autorizados que se han realizado. Esta última información constituye una parte crucial del camino de la planta GM hacia el mercado, y es solicitada y analizada por la CONABIA. En la normativa argentina actual se la denomina Segunda Fase de Evaluación. La condición necesaria para dar una respuesta positiva a estas solicitudes en la práctica, es que la CONABIA considere que: No existen riesgos para la salud humana, para el agroeco-sistema, y para la flora y la fauna asociados, derivados del cultivo no confinado del OGM en consideración. Esta categorización requiere del solicitante la presentación de un breve Resumen (características del OGM; el evento, breve descripción molecular del inserto; usos del OGM, destacando los que difieran del organismo no transformado; condiciones especiales, si las hubiera, para el cultivo extendido en gran escala) y de una Solicitud que se compone de: A) Información General, que se refiere a la información anterior, pero de manera más detallada. Deberá incluir, entro otras informaciones, Caracterización del OVGM, incluyendo proteínas y/o RNAs que expresa el OGM originados en el inserto y el fenotipo que resulta de esa expresión; las ventajas aportadas por la modificación genética; resultados de los ensayos de campo realizados, en el país y en el extranjero, en lo que respecta a la bioseguridad. Una declaración de equivalencia, diferencia o no equivalencia del OVGM. El solicitante declarará aquí si el OVGM es equivalente al organismo no GM de la misma especie, excepto por el fenotipo aportado por la modificación genética introducida. La declaración se referirá a todas aquellas características del OVGM que no fue intención modificar en el evento. Se deben citar los trabajos que sostienen esta declaración. La equi- 394 BURACHIK, Moisés

378 valencia se referirá al menos a: a) composición centesimal, procesamiento, productos y subproductos y b) características y prácticas agronómicas, áreas geográficas, tipos de ambientes, precauciones específicas para el cultivo extensivo, si las hubiera, con relación a efectos ambientales. Asimismo, se declararán aquí las observaciones sobre cualquier diferencia no intencional o no esperada, observada en cualquier aspecto de la expresión fenotípica del OVGM en comparación con el organismo no GM de la misma especie. Se deberá incluir toda observación que haya surgido en el monitoreo post- comercialización de este evento (si éste ha sido liberado comercialmente en otros países), como así también las que resultaran de investigaciones realizadas con posterioridad a dichas liberaciones comerciales. En caso que corresponda, el solicitante declarará aquí si el tipo de modificación genética tiene el propósito de introducir diferencias que determinan que el OVGM no pueda considerarse sustancialmente equivalente al no OVGM, explicando sucintamente aquellas diferencias. (Ver también Capítulo1). Una historia de experimentaciones y ensayos previos, instrucciones sobre manejo (agronómico y del producto) y almacenaje (producto, subproductos y remanentes) si difieren del organismo no transgénico. Propuestas para el envasado, rotulado y procesamiento, si difieren del organismo no transgénico y medidas que deben tomarse en caso de liberación accidental o mal empleo. B. Caracterización general del OVGM : esta información se concentra en la metodología y la construcción utilizada en la obtención del OGM y en la caracterización exhaustiva del mismo a nivel molecular y fenotípico. Se debe proporcionar información sobre: La especie receptora (características fenotípicas, centros de origen y diversidad, distribución geográfica en Argentina, estabilidad genética, potencial de transferencia y/ o intercambio de genes con otros organismos, reproducción, supervivencia, diseminación, interacciones con otros organismos, características patogénicas, tóxicas, antinutricionales, alergénicas u otras, e historia de modificaciones genéticas previas). La modificación genética : método de transformación empleado, descripción detallada del vector (cada elemento genético componente, su origen, tamaño y función; mapa del vector; secuencias nucleotídicas o regiones de la construcción cuyos productos o funciones no sean conocidas; capacidad para transferir genes, o para ser movilizados por conjugación, recombinación o integración; regiones del vector que se incorporan al OGM, es decir que constituyen el inserto). Caracterización del inserto: análisis molecular de la inserción en el genoma del OVGM (número de sitios de integración, número de copias de cada gen, incorporación de porciones de genes), origen y función de cada elemento insertado en el OVGM, información sobre si el inserto (esto es, alguno de sus elementos) confiere alguna función no requerida para la expresión del fenotipo esperado en el OVGM, transposiciones y/o rearreglos dentro del inserto presente en la planta (con respecto a las posiciones que los elementos genéticos tenían en el vector) y/ o de/con porciones del genoma de la planta dentro del inserto y en sus regiones flanqueantes; información detallada de las secuencias del genoma vegetal que flanquean del inserto y sobre la presencia/ausencia de fragmentos del inserto en regiones del genoma vegetal fuera del inserto funcional. Los organismos donantes: características patogénicas (con relación a las resultantes de la expresión de los elementos presentes en la construcción utilizada en la transformación). Características perjudiciales para la salud humana o animal (con la observación del punto anterior), potencial y/o antecedentes de transferencia natural (esto es, en hábitats y condiciones naturales) de los elementos que constituyen la construcción, desde los organismos donantes a otros organismos, su probabilidad o frecuencia, y fenotipos posibles u observados de los organismos receptores. Caracterización del OVGM propiamente dicho: características fenotípicas incorporadas, si alguna característica fenotípica del organismo receptor no GM no se expresa en el OVGM. Estabilidad genética, segregación y transferencia a la progenie. Análisis molecular (Southern blot, PCR). Características de la expresión del nuevo material Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 395

379 genético. Productos expresados (debe incluir todos los elementos genéticos que se incorporan al OVGM, total o parcialmente), características de la expresión (p.ej., constitutiva, tejido-específica), tejidos del OVGM en que se expresan los genes introducidos y niveles de expresión y su evolución temporal, en relación con el ciclo de la planta. Actividad biológica de las secuencias expresadas, ARNs transcriptos no traducidos, sus niveles, función y caracterización. Análisis detallado de las posibilidades de transcripción, por ejemplo, que comience dentro del inserto y se extienda hacia el genoma de la planta ignorando señales de terminación, así como de transcripción y traducción de proteínas de fusión o de marcos de lectura nuevos, generados como consecuencia de la inserción. También, se deben detallar las técnicas de detección del OVGM en el ambiente: Métodos moleculares y Métodos biológicos: Efectos sobre la salud humana: posibles efectos tóxicos o alergénicos del OVGM, sus materiales derivados, sus productos metabólicos, los productos resultantes del procesamiento industrial habitual (incluyendo pero no limitado a alimentos), o los resultantes de interacciones de estos productos con otros componentes normales de la dieta humana. Efecto de la modificación genética sobre aquellas características del organismo no GM que constituyan un peligro o riesgo para la salud (incluyendo, pero no limitados a, los niveles de antinutrientes). Interacciones del OVGM con el ambiente: supervivencia en el ambiente, tasa de germinación y dormición, vigor vegetativo (calidad agronómica, susceptibilidad a patógenos, a insectos, a factores de estrés ambiental), ventajas adaptativas presentes o potenciales del OVGM frente al organismo no GM, en hábitats y condiciones naturales, y en condiciones de agroecosistemas para la misma especie y para otros cultivos geográficamente compatibles. Los modos y tasas de multiplicación y las formas naturales de propagación. Información cuantitativa sobre interacciones: susceptibilidad a patógenos, plagas e insectos y rendimiento. Impacto ambiental del OVGM en el agroecosistema: efectos del OVGM sobre la flora, fauna y población microbiana, con énfasis en las especies benéficas. Efectos derivados de cambios en las prácticas agronómicas (si los hubiera). Conceptos para el manejo de los efectos mencionados en los puntos anteriores y condiciones específicas para el manejo de efectos ambientales debidos al OVGM. Estudios realizados sobre el escape de genes vía polen. C. Comportamiento esperado en la producción del OVGM a escala comercial: esta información se refiere específicamente al impacto ambiental, a información general sobre la inocuidad del OVGM o sus derivados alimentarios y a su perfil composicional. Impacto Ambiental: efectos sobre la flora y fauna, manejo de efectos no deseados potenciales (p.ej., desarrollo de resistencia a Bt en insectos previamente sensibles), programa de investigaciones de seguimiento propuesto, para monitorear posibles efectos sobre el ambiente en el largo plazo. Efectos sobre la salud humana: conceptos y programa de investigaciones que se realizaron para la evaluación de la inocuidad de las nuevas proteínas expresadas en el OVGM; evaluación de la toxicidad, digestión en jugo gástrico simulado, a diferentes ph: velocidad, caracterización de los fragmentos originados y su actividad biológica. Toxicidad aguda de las nuevas proteínas en animales de laboratorio; determinación del nivel de efecto adverso no observable (sigla del inglés NOAEL), si es posible. Cálculo de la ingesta diaria aceptable (IDA), y su comparación con la ingesta habitual para humanos en dietas normales. Evaluación del potencial alergénico, homologías de las secuencias de aminoácidos de las nuevas proteínas con otras proteínas relevantes (toxinas, alérgenos, etc.). Composición centesimal del OVGM, y comparación con el correspondiente organismo no GM, en todos los tejidos de la planta; proteínas y composición en aminoácidos, lípidos y composición de ácidos grasos, carbohidratos y otros componentes (cenizas, fibra, materia seca, vitaminas, etc.). Como se presenta en el esquema correspondiente, la evaluación completa y detallada de la inocuidad y aptitud alimentaria de los OVGMs es llevada a cabo por otra Comisión Evaluadora, que funciona en la órbita del SENASA (Servicio Nacional de Calidad y 396 BURACHIK, Moisés

380 Sanidad Agroalimentaria). Las características de esta etapa de evaluación son similares a las que lleva adelante CONABIA, y basa sus conclusiones en toda la información presentada a CONABIA, más otra serie de datos, evidencias experimentales y estudios que deben ser presentados específicamente en relación con los aspectos nutricionales y/o toxicológicos del OVGM en cuestión, de acuerdo a los requisitos de la resolución oficial. En ambas instancias de evaluación de bioseguridad se aplica el enfoque comparativo desarrollado en el Capítulo 1 y la conclusión a la que como mínimo, debe arribarse para poder recomendar la autorización comercial, es: El OGM es tan seguro como su contraparte no modificada, para el medio ambiente y la salud humana o animal. 8. Eventos con aprobación para su producción o consumo en países Latinoamericanos De acuerdo con el ultimo informe de ISAAA (International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications, 2003), hay seis países en la región que han aprobado cultivos transgénicos para su pro- Tabla 2. Países de América Latina que han aprobado cultivos GM País Maíz Soja Algodón Otros Argentina -Maíz resistente a lepidópteros (evento Bt 176) -Maíz tolerante al herbicida glufosinato de amonio -Maíz resistente a lepidópteros (evento MON 810) -Maíz resistente a lepidópteros (evento Bt 11) -Maíz tolerante a glifosato (evento Nk603) -Soja tolerante al herbicida glifosato -Algodón resistente a lepidópteros -Algodón tolerante al herbicida glifosato Brasil* -Soja tolerante al herbicida glifosato Colombia -Algodón resistente a lepidópteros -Algodón tolerante al herbicida glifosato Clavel azul Honduras -Maíz resistente a lepidópteros México** -Maíz resistente a lepidópteros -Maíz resistente a coleóptero -Maíz tolerante a herbicidas -Soja tolerante al herbicida glifosato -Algodón resistente a lepidópteros (RL) -Algodón tolerante al herbicida glifosato (TH) -Algodón RLxTH (evento combinado) Papa resistente a escarabajo de la papa y virus Y (New leaf Y) Tomate de maduración retrasada. Canola tolerante a herbicidas Uruguay -Maíz resistente a lepidópteros (MON 810) -Soja tolerante al herbicida glifosato *Siembra permitida durante la campaña ** maíces aprobados para importación en alimentos. Soja y algodón, siembras pre-comerciales. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 397

381 ducción o para su importación como alimentos. Lecturas /sitios recomendados BURACHIK, M. y TRAYNOR, P Análisis of a Nacional Biosafety System: Regulatory Policies and Procedures in Argentina. ISNAR Country report McLEAN, M.A.; MACKENZIE, D.J. and COLE, BA, Policy Choices in the Development of National Frameworks for Biosafety Regulation. Report for the International Service for National Agricultural Research (ISNAR), The Hague. (ir a Biotecnología, Conabia y SENASA): resolución 39/ : resolución 412/ sitio canadiense con información detallada sobre cultivos GM y seguridad sitio de la Comisión de Bioseguridad de Brasil Organización para el Desarrollo y la Cooperación Económica Agencia de Drogas y Alimentos de los EEUU Agencia para la Agricultura y la Alimentación de la Naciones Unidas ir a Marco Regulatorio, para información sobre bioseguridad en America Latina y el Caribe Programa ambiental de las Naciones Unidas. Información sobre el Protocolo de Bioseguridad y marcos regulatorios internacionales sitio de la Comisión evaluadora de bioseguridad de OGMs del gobierno de México. sitio del Instituto Colombiano Agropecuario Asociación Brasilera de Bioseguridad sitio con información regultoria unificada de los EEUU 398 BURACHIK, Moisés

382 IX.-Capítulo 3 Flujo génico mediado por polen y su posible impacto ambiental Poverene, Mónica; Ureta, Soledad El flujo de genes es un proceso biológico natural. Puede ocurrir flujo mediado por polen entre plantas de la misma especie o de especies relacionadas y depende del modo de polinización y la compatibilidad genética entre la planta receptora y la dadora de polen. También puede ocurrir flujo génico por movimiento de semillas o de otras partes vegetales hacia poblaciones sexualmente compatibles. Los agricultores pueden adoptar prácticas de manejo para minimizar y controlar este flujo. 1. Flujo génico y riesgo de escape de transgenes al ambiente El flujo génico es el proceso de incorporación de genes de una población dentro de otra. En plantas, donde el concepto de especie es frecuentemente puesto a prueba, el intercambio de material genético ocurre entre individuos formalmente considerados una especie o entre especies relacionadas. El flujo génico tiene lugar a través de la migración de polen o semillas, dispersados por viento, agua o la acción de animales y el hombre. En el contexto de la agricultura, el intercambio de genes entre plantas y poblaciones es un proceso bien conocido en todos los cultivos mejorados por técnicas tradicionales o mediante ADN recombinante y en las plantas silvestres relacionadas con ellos. El flujo génico es un poderoso mecanismo para prevenir la diversificación de las poblaciones, pero también para permitir la difusión de mutaciones favorables (Rieseberg y Burke, 2001). La utilización de cultivos transgénicos plantea la posibilidad de que el flujo de transgenes hacia otras poblaciones («escape al ambiente») represente un riesgo para los ecosistemas, dependiendo de las características que aporten y sus efectos sobre la población receptora. Se denomina escape a la diseminación no intencional de la construcción genética de un OGM (plantas, microorganismos o animales) hacia otras poblaciones, mediante mecanismos biológicos naturales como la reproducción sexual o la transferencia horizontal. La reproducción sexual implica la unión de gametos femeninos y masculinos, uno de los cuales debería ser portador del transgen. La transferencia génica horizontal o lateral consiste en el intercambio de material genético entre especies no relacionadas e involucra fenómenos diferentes. Estos procesos son bien conocidos en microorganismos, mediados por diferentes sistemas moleculares de inserción (Kurland y col., 2003). En el caso de las plantas, el escape génico a través del polen es el mecanismo más probable y de allí que la atención se enfocará sobre este aspecto. El flujo de genes desde cultivos GM hacia cultivos no transgénicos, la aparición de nuevas malezas difíciles de erradicar y la reducción de la biodiversidad son las inquietudes más frecuentemente invocadas del escape de transgenes. Excepto el primero, no se han informado casos concretos donde las otras dos situaciones se hayan observado. La literatura sobre los riesgos del escape es especulativa y los estudios científicamente documentados hasta el momento confirman la imposibilidad de extraer conclusiones generales y la necesidad de efectuar pruebas para cada caso particular (Carpenter y col., 2002; Conner y col, 2003), tal como lo recomiendan las principales agencias regulatorias del mundo. Estas exigen ensayos experimentales con todos los eventos en desarrollo y generalmente, la información obtenida a partir de los mismos así como las conclusiones de los comités evaluadores se pueden consultar en Internet (ver lista de sitios recomendados). Las construcciones genéticas en las variedades GM son caracterizadas a nivel molecular y en cuanto a sus efectos fenotípicos antes de su liberación (ver capítulos 1 y 2 de esta Sección). El número de insertos y de copias es conocido y la transmisión de los caracteres introducidos se estudia para evaluar su comportamiento y estabilidad. En algunos casos de transgénesis la transmisión puede ser variable. El cultivar de zapallo Freedom II posee tres insertos Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 399

383 de un transgen que confiere resistencia a virus y su descendencia puede heredar una, dos o las tres copias del gen (Spencer y Snow, 2001). Normalmente, el carácter conferido se expresa como dominante y aun cuando no se conozca exactamente el número de copias de un transgen en un genoma, la probabilidad de transmisión a través del polen mediante el proceso normal de meiosis, es de al menos 50%. En especies alógamas o parcialmente alógamas, la difusión del transgen hacia variedades no transgénicas de la misma especie dependerá exclusivamente de los mecanismos de polinización, generalmente por el viento (anemófila) o los insectos (entomófila). En la mayor parte de los cultivos se conocen las distancias mínimas de aislamiento necesarias para prevenir la polinización cruzada entre variedades. Estas constituyen la base para determinar las medidas de bioseguridad que se exigirán en cada caso durante la fase de liberación experimental. Una vez aprobado el cultivo para su siembra a escala comercial, esas distancias no son necesariamente aplicadas en la práctica agronómica. La cuestión queda en manos de los agricultores y depende de los intereses económicos que para ellos represente la comercialización de un cultivo transgénico, tradicional u orgánico. Un ejemplo de conflicto se dio en 1998 en Canadá, donde se registraron denuncias de contaminación de lotes de colza tradicional con polen de colza GM, posiblemente provenientes de lotes cercanos o de plantas subespontáneas, escapadas de los cultivos ( go/pr/fr/-/2/hi/science/nature/ stm). En lugares donde se ha autorizado la siembra de cultivos transgénicos, éstos pueden coexistir con cultivos tradicionales u orgánicos, lo que requiere medidas adecuadas durante el cultivo, cosecha, transporte y almacenamiento, a fin de evitar la mezcla accidental de materiales GM y no GM, que puede tener consecuencias económicas para productores que comercialicen productos no transgénicos. Las recomendaciones tendientes a evitarla consisten en: 1. Medidas a tomar dentro del establecimiento, como respetar las distancias de aislamiento, colocar barreras a la dispersión del polen, o intercalar lotes con cultivo de una especie distinta. 2. Cooperación entre establecimientos vecinos sobre planes de siembra, o uso de variedades con tiempo de floración diferente. 3. Utilizar los servicios de extensión para informar a los productores, monitoreo, intercambio de información técnica y servicios de alarma. La modificación genética en plantas ha sido exitosa en más de 20 familias botánicas diferentes, comprendiendo cereales, oleaginosas, forrajeras, especies hortícolas, frutales, forestales y ornamentales ( La mayor parte de las especies domesticadas como cultivos posee parientes silvestres, los que frecuentemente se utilizan como donantes de caracteres útiles para el mejoramiento genético, tales como resistencia a estreses bióticos y abióticos. Esto implica que entre la especie domesticada y la silvestre existe suficiente relación genética como para transferir esos caracteres mediante cruzamientos y selección. Los cruzamientos ocurren naturalmente en regiones donde las especies conviven y muchas malezas han evolucionado a través de la adquisición de genes de los cultivos (Keeler, 1989; Ellstrand y col., 1999). Es posible que un transgen sea transferido de un cultivo GM hacia poblaciones silvestres o malezas relacionadas. Los transgenes que confieren tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos o a patógenos podrían conferir las mismas características a plantas silvestres relacionadas en la vecindad, determinando una mayor supervivencia bajo la presión de selección natural (insectos herbívoros o patógenos) o de prácticas agronómicas usuales para el control de malezas, plagas o enfermedades (uso de pesticidas, agentes de control biológico). En consecuencia, aumentaría el número o tamaño de las poblaciones silvestres. El concepto de «supermaleza» ha surgido como consecuencia de reconocer la dificultad que implicaría el control de esas poblaciones. El potencial impacto ambiental depende tanto de la probabilidad de transferencia del transgen a la población silvestre como de la consecuencia de esa transferencia (Ahl Goy y Duesing, 1996). Según la probabilidad de transferencia, los cultivos pueden clasificarse en tres grupos: I. Mínima probabilidad de transferencia a especies silvestres, sea porque éstas no exis- 400 POVERENE, Mónica; URETA, Soledad

384 ten en el área o no hay compatibilidad sexual entre el cultivo y su pariente silvestre. II. Cultivos con baja probabilidad de transferencia, cuando la compatibilidad sexual es limitada. III. Cultivos con alta probabilidad de transferencia, cuando especies silvestres sexualmente compatibles crecen en la vecindad del área sembrada. Las consecuencias de la transferencia dependen de la capacidad potencial del transgen para aumentar la aptitud biológica y conferir ventajas selectivas a la especie silvestre receptora. De acuerdo con este criterio, también se pueden agrupar los genes en diferentes clases. En la clase I se sitúan los transgenes que confieren pequeña o ninguna ventaja adaptativa, como los marcadores de selección, genes de androesterilidad o de madurez retrasada. La clase II, de escasa ventaja adaptativa, comprende genes que pueden conferir alguna ventaja bajo la adecuada presión de selección, como los de tolerancia a herbicidas o de resistencia a insectos y enfermedades. En la clase III se sitúan genes para mejorar el crecimiento y la supervivencia, que conferirían ventajas adaptativas en cualquier ambiente. La Tabla I presenta una clasificación de los cultivos GM autorizados o bajo ensayo en la Argentina, según esos criterios. La reducción de la biodiversidad por causa del uso de cultivos GM es probablemente la consecuencia más difícil de visualizar. La erosión o pérdida de variabilidad genética atribuida al monocultivo o al uso de unas pocas variedades que dominen el mercado de semillas, no es privativa de los cultivos GM y puede prevenirse mediante una adecuada planificación de la agricultura regional. Por otra parte, algunas especies crecen en ambientes especializados o geográficamente limitados como raras especies silvestres o razas locales domesticadas (landraces) constituyendo reservorios de diversidad genética de potencial uso en el mejoramiento genético. Cuando crecen en la vecindad de cultivos a gran escala, existe la posibilidad de cruzamientos naturales y flujo génico a través del polen del cultivo hacia la especie local. Esto puede resultar en una pérdida de vigor y fertilidad en los descendientes depresión por alogamia o de identidad genética por sucesivos ciclos de cruzamiento con el cultivo, de manera que paulatinamente la especie local se va perdiendo hasta la completa extinción. El proceso es dependiente de la frecuencia de cruzamiento, la cual a su vez depende de la cantidad relativa de individuos de cada especie. Nuevamente, el proceso puede evitarse mediante adecuadas medidas de conservación y manejo del cultivo. Se puede concluir que la posibilidad de escape de transgenes es de orden diferente según la población recipiente. Una variedad no GM de la misma especie ciertamente adquirirá el transgen si es expuesta al flujo de polen del cultivo GM. Una rara variedad local domesticada perderá asimismo identidad por contacto genético con el cultivo. En México se ha informado la detección de razas nativas de maíz portadoras de transgenes provenientes de variedades GM, cuyo cultivo está vedado (Quist y Chapela, 2001), lo que ha generado controversias y estudios científicos adicionales. Algunos autores hacen notar que las prácticas de cultivo de los pequeños productores de maíces criollos en México también contribuyen al flujo génico entre híbridos, variedades mejoradas, GM y los maíces criollos, como parte de sus hábitos de selección y ensayo (Christou, 2002; Martínez Soriano y col., 2002; CIMMYT 2003). Cuando no existen barreras biológicas al flujo génico, el escape depende exclusivamente de factores antrópicos y puede ser prevenido mediante un manejo cuidadoso. La situación no es tan simple si se trata de una población silvestre emparentada, ya que dependerá de las relaciones genéticas con el cultivo, que determinan la probabilidad de hibridación. Se requerirá de una evaluación de la probabilidad de escape y del impacto que el transgen podría ocasionar en la población silvestre. 2. Factores que determinan el escape de transgenes y su impacto ambiental La mayor parte de los cultivos actuales está emparentada con una o más especies silvestres o malezas, con las que puede hibridar y producir descendientes total o parcialmente fértiles. Trigo, arroz, avena, sorgo, cebada, maíz, soja, girasol, colza, maní, po- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 401

385 roto, caña de azúcar, remolacha azucarera, algodón, papa, zapallo, frutilla, rábano, zanahoria, vid, tréboles y otras especies cultivadas son objeto de experimentación biotecnológica. El flujo génico a través del polen permite la transmisión de caracteres heredables a parientes silvestres. Si esos caracteres son beneficiosos para la supervivencia o la fertilidad, aumentarán la aptitud biológica de las poblaciones recipientes. El intercambio genético de los cultivos con sus parientes silvestres es uno de los mecanismos de origen de las malezas (Keeler, 1989; Ellstrand y col., 1999). Aproximadamente la mitad de los caracteres que determinan invasividad están controlados por genes únicos, de modo que existe la posibilidad de que transgenes relacionados con la aptitud biológica persistan y modifiquen poblaciones silvestres. Podría resultar que éstas se vuelvan más abundantes en su hábitat o invadan nuevos hábitat. También podrían tener efectos adicionales sobre poblaciones de insectos o patógenos. La evaluación del riesgo de escape de transgenes comprende tres etapas: 1. Investigación de barreras genéticas o geográficas para el escape del transgen desde el cultivo hacia las poblaciones silvestres. 2. Investigación del efecto del transgen sobre la aptitud biológica de las plantas silvestres. 3. Investigación de las consecuencias ecológicas de la difusión del transgen en la población silvestre. Hasta el momento existe escasa información sobre situaciones reales y no sería posible generalizar las conclusiones, ya que éstas dependen del evento de transformación, la población recipiente y las condiciones ambientales donde tiene lugar el escape. A continuación se expondrán algunos factores a tener en cuenta en ese esquema. 3. Barreras geográficas y genéticas entre el cultivo y especies silvestres Las especies silvestres suelen difundirse desde su centro natural de origen, pero no siempre están presentes en la misma área geográfica del cultivo. Por ejemplo, la soja (Glycine max) y su pariente silvestre G. soja conviven naturalmente en China y Corea, donde producen un híbrido interfértil, G. gracile, pero no en el resto del mundo. El maíz (Zea mays) hibrida con el teosinte (Z. m. ssp. mexicana, Z. diploperennis, Z. luxurians) presente en México, aunque existe evidencia que muestra que el flujo génico entre híbridos de maíz y teosinte va en la dirección teosinte-híbrido y no en la dirección opuesta (Evans y Kermicle, 2001). En la Argentina, estas especies no conviven con parientes silvestres, mientras que colza, arroz y girasol sí lo hacen y pueden cruzarse con ellos. El primer paso consiste en el estudio sistemático de la flora local. Aún cuando se encontraran especies silvestres emparentadas, la hibridación con la especie cultivada dependerá de la afinidad genética que tengan entre ellas, la cual determina desde completa fertilidad de los híbridos hasta grados variables de esterilidad y aún la imposibilidad de cruzamiento. Para que la cruza tenga lugar, ambos taxa deben florecer al mismo tiempo y el polen debe ser capaz de germinar y efectuar la fecundación. La descendencia suele tener una fertilidad menor que las especies parentales, pero raramente es por completo estéril. La fertilidad parcial de los híbridos permite la introgresión, la incorporación estable de genes de una especie en otra mediante sucesivas retrocruzas de sus descendientes con una o ambas especies parentales. Caracteres morfológicos y fenológicos intermedios entre la especie cultivada y la silvestre constituyen un buen diagnóstico de hibridación e introgresión, pero el estudio de marcadores moleculares resulta invalorable. Este ha demostrado que la mayor parte de los cultivos hibrida con sus parientes silvestres y que los alelos de las especies domesticadas persisten durante generaciones en las poblaciones silvestres, aún cuando no se adviertan cambios morfológicos. Este es el caso del girasol con sus parientes silvestres Helianthus annuus ssp. annuus y H. petiolaris en Norteamérica (Whitton y col., 1997, Riesberg y col., 1999, Snow y col., 2000). En la Argentina, donde ambas especies silvestres se han naturalizado, hemos encontrado numerosas evidencias de hibridación e introgresión con el cultivo en la región central del país, tanto por caracteres morfológicos y fenológicos como por mar- 402 POVERENE, Mónica; URETA, Soledad

386 cadores moleculares, constatando además la fertilidad parcial de los híbridos mediante estudios del polen y de la producción de semillas (datos propios no publicados). En girasol se ha estudiado la transmisión a plantas silvestres de un transgen Bt (ver Parte VIII) para resistencia a lepidópteros (Show y col., 2003) y uno de oxalato oxidasa, OxOx que confiere resistencia al hongo Sclerotinia (Burke y Rieseberg, 2003). En zapallo GM (Cucurbita pepo) se estudió la transferencia de la resistencia a dos virus, ZYMV y WMV2 (Spencer y Snow, 2001). El flujo génico a través del polen es una poderosa fuerza evolutiva y el impacto sobre las poblaciones silvestres depende de su magnitud, así como del efecto de los alelos transmitidos sobre la población recipiente. La magnitud del flujo mediado por polen puede medirse a través de la frecuencia de marcadores moleculares característicos del cultivo presentes en una población silvestre o sus descendientes. Estos han demostrado que la ubicación de un gen en el genoma tiene una importancia crucial para su difusión mediante hibridación. En colza, un aloploide (AACC), la introgresión de tolerancia a herbicidas y androesterilidad hacia la especie diploide Brassica rapa (AA) sería menos probable si los transgenes que codifican esos rasgos estuvieran en el genoma C, porque implicaría una recombinación intergenómica. (Jorgensen et al. 1996). En girasol (Helianthus annuus) donde ha ocurrido una extensa remodelación cromosómica mediante inversiones y translocaciones, la transferencia de un transgen hacia la especie silvestre H. petiolaris es improbable si este no está situado en las porciones colineares entre ambos genomas (Rieseberg y col., 1999). La cuantificación de la tasa de hibridación e introgresión entre el cultivo y la especie silvestre mediante experimentos adecuados es previa a la investigación de las consecuencias génicas y ecológicas del escape del transgen, ya que si la tasa de hibridación fuera despreciable, no cabría preocuparse por las consecuencias. 4. Efecto del transgen sobre la aptitud biológica de las plantas silvestres Una vez comprobada la posibilidad de hibridación y la presencia de un transgen en plantas silvestres, surge la pregunta: se espera que el transgen incremente su frecuencia en las poblaciones silvestres? El destino de un alelo en una población dependerá de su efecto sobre la aptitud biológica de los individuos que lo adquieren. Si no tiene efecto alguno en ese ambiente ecológico, se trata de un alelo neutro y su destino dependerá del azar, o sea que su frecuencia en la población estará sujeta a la deriva génica y persistirá o eventualmente se perderá. Si su efecto es deletéreo conducirá a una depresión alogámica, con disminución de la viabilidad y fertilidad de los híbridos. El efecto nuevamente dependerá de la magnitud del flujo génico y cuanto mayor sea, mayor será el riesgo de extinción de la población silvestre. Si el alelo es beneficioso, el flujo génico acelerará su diseminación en la población silvestre y la frecuencia alélica aumentará rápidamente, en forma proporcional al movimiento de polen desde el cultivo a la población silvestre (Ellstrand y col., 1999). La diseminación de un transgen en la población silvestre requiere que los híbridos cultivo/silvestre se reproduzcan en condiciones naturales. Estudios previos de hibridación entre cultivos no transgénicos de colza, sorgo, girasol, rábano, poroto y trigo y sus parientes silvestres han demostrado que no sólo lo hacen sino que su aptitud biológica puede ser incluso mayor que la de sus progenitores silvestres. En uno de los primeros estudios de transmisión de un transgen a poblaciones silvestres, Scott y Wilkinson (1998) encontraron una baja frecuencia de plantas híbridas de Brassica rapa portadoras de un transgen de colza, considerado neutral y concluyeron que el riesgo de transmisión era bajo. En tanto, Spencer y Snow (2001) demostraron que los híbridos entre calabaza GM y zapallo silvestre eran suficientemente vigorosos como para permitir la rápida introgresión de transgenes neutrales y beneficiosos en las poblaciones silvestres. En girasol, un transgen beneficioso que confiere resistencia a lepidópteros mediante la producción de la proteína Bt Cry1Ac, aumentó considerablemente la fecundidad de las plantas silvestres recipientes, aunque este efecto varió entre localidades y años (Show y col., 2003). De acuerdo con estas observaciones, podría esperarse que el gen Bt aumente la aptitud biológica de girasoles silvestres Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 403

387 e incremente rápidamente su frecuencia en las poblaciones naturales, debido a que reduce el daño producido por varias especies de insectos herbívoros. Sin embargo, el transgen OxOx, que confiere resistencia al hongo Sclerotinia, no aumentó significativamente la fecundidad de plantas de girasol silvestre, sugiriendo que su diseminación sería prácticamente neutral luego de un escape hacia poblaciones naturales (Burke y Rieseberg, 2003). En Brassica rapa un transgen Bt adquirido por cruzamiento con colza transgénica disminuyó su agresividad como maleza en un 20% comparado con B.rapa no GM (Adam, 2003). Estos son ejemplos contrastantes de los efectos de transgenes sobre la aptitud y comportamiento ecológico de poblaciones silvestres. Cómo estimar los costos y beneficios de un transgen para la aptitud biológica de una especie silvestre? La aptitud o valor adaptativo es una medida relativa de la eficacia reproductiva de un genotipo, cuando se lo compara con otro genotipo. En este caso, los genotipos a comparar son el que ha adquirido el transgen por hibridación con el cultivo y el que no lo ha adquirido, o sea el genotipo silvestre de la población en ausencia de flujo génico del cultivo. Los componentes de la aptitud son la supervivencia y la fecundidad, que pueden resultar afectadas en distintos momentos del ciclo vital. La medición de la aptitud puede hacerse a través del porcentaje de germinación, supervivencia de plántula, número de flores, producción de semilla, peso de la semilla, etc. y en cada caso de estudio será necesario determinar cuáles parámetros reflejan mejor la supervivencia y la fertilidad de los individuos. Los resultados obtenidos deberían indicar la velocidad de diseminación del transgen y la probabilidad de que las poblaciones que lo incorporen, adquieran ventajas adaptativas. En general, las poblaciones silvestres son menos susceptibles a patógenos y plagas que sus parientes cultivados. Mayor diversidad genotípica, menor densidad de plantas y ausencia de laboreo son algunas de las causas de esa diferencia. Por ello, un transgen que confiera resistencia a una plaga o patógeno puede no representar para la especie silvestre una ventaja tan grande como para el cultivo. Por el contrario, puede representar un costo para la planta que lo adquiera debido a efectos pleiotrópicos sobre otros caracteres fenotípicos que a su vez afecten la aptitud. El beneficio de un transgen asociado a la resistencia a determinada plaga debe ser evaluado comparando la aptitud biológica de plantas con el transgen y sin él que hayan sido expuestas a esa plaga. Por el contrario, el costo de adquirir el transgen debe ser medido comparando la aptitud biológica de plantas que lo llevan o no, en ausencia de la plaga. Además, los caracteres que determinan supervivencia y fecundidad pueden ser afectados por las condiciones ambientales, por lo que es necesario estimarlos en distintos ambientes y a lo largo de varias estaciones de crecimiento. Las diferencias significativas entre plantas silvestres GM y no GM en cada sitio, entre sitios y entre años pueden ser probadas para cada carácter relacionado con la aptitud mediante un análisis de la varianza. 5. Consecuencias ecológicas de la difusión del transgen en la población silvestre La teoría de la selección natural predice que un fenotipo cuya aptitud biológica sea superior a la de otros fenotipos de la población, dejará mayor cantidad de descendientes y que si estos a su vez heredan el genotipo favorecido, su frecuencia aumentará en detrimento de los demás genotipos. Sin embargo, el impacto ambiental dependerá no sólo de la frecuencia sino del cambio en las interacciones bióticas y abióticas de ese genotipo silvestre en su ambiente. La predicción de las consecuencias de un escape de transgenes requiere del estudio de la alteración de las interacciones ecológicas existentes entre las especies. Un gen de resistencia a insectos o a enfermedades modificará la herbivoría o la relación huésped-patógeno entre la especie silvestre y otras especies de su hábitat, así como un transgen que favorezca el crecimiento modificará las relaciones de competencia intra e interespecíficas. Cuanto más se conozca acerca de la dinámica poblacional de una especie, más fácilmente se podrá evaluar el impacto ambiental. En Cucurbita pepo, híbridos entre 404 POVERENE, Mónica; URETA, Soledad

388 un cultivar GM y plantas silvestres mostraron amplias variaciones en fecundidad entre años y localidades, que fueron atribuidas a condiciones de suelo y clima, densidad de herbívoros, competencia con malezas, enfermedades y otros factores ambientales (Spencer y Snow, 2001). El crecimiento poblacional a través de la producción de semilla es uno de los parámetros más informativos y es más probable que sea limitante para especies anuales; por ello, caracteres que aumenten la producción o germinación de semilla tienen un gran efecto ecológico. Asimismo, está relacionado con la dispersión, la dinámica del banco de semillas y la longevidad de las poblaciones. Resultados preliminares en poblaciones experimentales de girasol silvestre sometidas a flujo génico de un cultivo GM (Bt) indicaron que el aumento de la producción de semilla determinó mayor número de plántulas, mayor supervivencia hasta la edad reproductiva, mayor número de inflorescencias con semilla y mayor área total de capítulo al año siguiente (Pilson y col., 2002). El incremento en tamaño y número de las poblaciones silvestres de una especie afectará a otras especies vegetales del hábitat, cuya frecuencia relativa podría disminuir. El escape de un transgen Bt de resistencia a insectos a una población silvestre podría tener un impacto negativo en varias especies de herbívoros, algunas de las cuales pueden ser especialistas, alimentándose con exclusividad de la especie silvestre receptora. Como parte de los estudios necesarios para la evaluación del impacto ambiental de eventos Bt, se incluyen estudios del impacto de estos genes sobre especies no blanco (aquellas que no son las controladas específicamente por esos genes) (Wolt y col., 2003). Las toxinas Bt son altamente específicas para determinados tipos de herbívoros (lepidópteros, coleópteros, dípteros) y la disminución de uno de ellos puede alterar las relaciones de competencia con los demás. Las relaciones ecológicas entre herbívoros suelen implicar un delicado equilibrio demográfico cuyo colapso podría contribuir a mayores niveles de infestación y daño (Groot y Dicke, 2002). El uso comercial de cultivos Bt ejerce una presión selectiva que podría favorecer la selección de insectos resistentes a las toxinas, que llevan una mutación recesiva de resistencia en condición homocigota. La descendencia podría heredar los genes de resistencia y en unos pocos años, la biotecnología desarrollada para el control de insectos se volvería inefectiva. Para evitar esta situación se ha ideado la estrategia del cultivo refugio, que consiste en sembrar una franja de variedad no transgénica junto a la variedad Bt. Los insectos se reproducen libremente en esa franja, de modo que los raros portadores de resistencia se mantendrán en una frecuencia relativamente baja en la población total de insectos. La pérdida de la eficacia Bt es actualmente una de las mayores preocupaciones ambientales en relación con el uso de biotecnología agrícola aplicada al control de insectos. Hasta el momento no se han detectado insectos resistentes en condiciones de producción a campo de cultivos Bt (Shelton y col., 2002; Tabashnik y col., 2003). Conclusiones El estudio del impacto ambiental precede la liberación de cualquier nuevo evento de transformación en plantas para tener resultados confiables en el ambiente de la liberación. La mayor parte de los efectos no deseados del escape de un transgen pueden evitarse mediante acciones adecuadas que pueden planificarse anticipadamente (manejo del cultivo, bancos de germoplasma, cultivos refugio, etc.). Sin embargo, la difusión de un transgen hacia poblaciones silvestres emparentadas es difícil de evitar debido a que el polen de los cultivos puede alcanzar grandes distancias. En las próximas décadas, los cultivos GM se utilizarán en gran escala, por lo que será necesario evaluar cuidadosamente el riesgo de escape de transgenes para cada uno de ellos. Esa evaluación, realizada por equipos multidisciplinarios, debe considerar los siguientes aspectos: a) Presencia de especies silvestres sexualmente compatibles con el cultivo y la probabilidad de que el transgen difunda en ellas. b) Cambios en las características de poblaciones de patógenos, insectos y malezas relacionadas con el cultivo GM y medidas para evitar o retardar la aparición de biotipos resistentes. c) Cambios Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 405

389 Tabla I. Clasificación de las especies GM en Argentina según la probabilidad de transferencia del transgen (Grupo 1,2,3) y las consecuencias biológicas de la modificación genética( Clase 1,2,3). 406 POVERENE, Mónica; URETA, Soledad

390 en la dinámica de poblaciones de otras especies vegetales y animales que comparten el hábitat (polinizadores, parásitos y predadores, microflora y fauna del suelo). Esos estudios también tienen en cuenta el fondo genético y las condiciones ambientales para cada caso en particular (Burachik y Traynor 2002, Ver Capítulos 1 y 2 de esta sección). Referencias y sitios sugeridos ADAM, D Transgenic crop trial s gene flow turns weeds into wimps. Nature 421:462 AHL GOY P. Y DUESING J.H Assessing the environmental impact of gene transfer to wild relatives. Biotechnology 14: BURACHIK M. Y TRAYNOR P Analysis of a National Biosafety System: Regulatory Policies and Procedures in Argentina. ISNAR Country Report 63, 69 p. ISSN ISBN ( BURKE J.M. Y L.H. RIESEBERG 2003 Fitness effects of transgenic disease resistance in sunflowers. Science 300: CARPENTER, J., A. FELSOT, T. GOODE, M. HAMMIG, D. ONSTAD, Y S. SANKULA Comparative Environmental Impacts of Biotechnology-derived and Traditional Soybean, Corn, and Cotton. Council for Agricultural Science and Technology, Ames, Iowa. CHRISTOU, P No credible scientific evidence is presented to support claims that transgenic DNA was introgressed into traditional maize landraces in Oaxaca, Mexico. Transgenic Research 11: iii-v. ( agbioworld.org/biotech_info/articles/ transresearch.html) CIMMYT 2003 Mexican Maize Documents from the International Maize and Wheat Improvement Center Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 407

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392 IX-Capítulo 4 Detección de OGM en la cadena alimentaria Tozzini, Alejandro C. Una gran cantidad de plantas genéticamente modificadas (GM) han sido aprobadas para su cultivo en el ámbito mundial luego de haber pasado por rigurosos controles de seguridad alimentaria y ambiental. Sin embargo, algunos mercados, en particular la Unión Europea, tienen estrictos requerimientos para su etiquetado. En este caso, la normativa de etiquetado que rige a partir de abril de 2004, establece el etiquetado obligatorio de los alimentos y piensos derivados de un OGM, independientemente de la detectabilidad de ADN o proteínas, y sólo admite la presencia adventicia (accidental) de hasta un 0.9% de OGM aprobados o de 0,5% en el caso de eventos, aún no aprobados pero con un dictamen de bioseguridad favorable. La Argentina es uno de los países con mayor adopción de OGM, segundo después de los EE.UU. y antes que Canadá. El aprovechamiento a campo de los beneficios de la biotecnología vegetal implicó inmediatamente la necesidad de implementar procedimientos de campo y laboratorio para poder discriminar mercaderías conteniendo un nivel de OGM superior a un determinado umbral, de aquellas que estaban por debajo. A partir del año 1997 los exportadores comienzan a demandar el análisis de partidas de granos destinados a la Comunidad Europea. En ese momento el contenido aceptable era inferior al 1%, los protocolos de detección requerían de la germinación de los granos (para extraer ADN de las hojas) y en algunos casos hasta el uso de sondas radioactivas. Desde entonces, se ha avanzado sensiblemente en una serie de aspectos que han hecho evolucionar el panorama, tanto en el país como en el mundo: - Se han desarrollado protocolos de purificación de ADN y de PCR para aplicar a gran escala. - Los métodos de PCR han evolucionado hacia técnicas cuantitativas (PCR en Tiempo Real) - Se han desarrollado técnicas inmunológicas y «kits» específicos de fácil aplicación. - Hay más información molecular sobre los eventos y los primers específicos correspondientes. - Los operadores de mercado se han familiarizado con el concepto de OGM. - Se han desarrollado y aplicado programas de Trazabilidad e Identidad Preservada para la característica «genéticamente modificado». - Se discuten protocolos y materiales de referencia a nivel de normas de CODEX Alimentarius, ISO (International Standards Organization) e ISTA (International Seed Testing Asociation) entre otras. - En el país se ha desarrollado una logística de segregación de granos y semillas capaz de abastecer con distintos productos, los requerimientos específicos de mercados de exportación, o del nacional, en aquellos casos en los que la demanda esté dispuesta a cubrir los costos derivados de la segregación. A grandes rasgos, una planta genéticamente modificada es aquella a cuyo genoma se han incorporado uno o más transgenes mediante alguna de las técnicas de ingeniería genética. Estos transgenes poseen una secuencia nucleotídica específica y algunos de ellos se expresan generando una proteína nueva en el organismo, lo cual le va a conferir un nuevo fenotipo a la planta. En cualquiera de estos tres niveles, ADN, proteínas o fenotípico, es posible hacer un análisis para determinar cualitativa o cuantitativamente la presencia de una modificación genética. La detección a nivel de ADN se realiza mediante amplificación por PCR, a nivel de proteínas por técnicas inmunológicas (tiras reactivas o ELISA), mientras que la fenotípica implica la evaluación de la nueva característica producida por el transgen. Desde el punto de vista de los requerimientos técnicos, el análisis fenotípico puede ser el más sencillo, mientras que el análisis por PCR es en general, el más complejo. Los protocolos analíticos son muy sensi- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 409

393 bles ya que detectan un gen en decenas de miles de genes del genoma, o una nueva proteína entre varios miles de proteínas. A esto hay que sumarle la «dilución» no OGM / OGM, que en muchos casos requiere detectar y cuantificar un grano GM entre varios miles. Actualmente, los protocolos pueden detectar un evento o grupo de eventos en un cultivo en particular pero ninguno puede hoy detectar en un único ensayo todos los eventos, por eso no se puede asegurar que una muestra está «libre de OGM»; sólo se puede asegurar que está libre de los eventos para los cuales se hayan realizado los análisis pertinentes. Detección fenotípica Figura 1: mezcla de semillas de maíz no GM y GM (evento GA 21, Monsanto) puestas a germinar con agua (superior) y con solución de glifosato (inferior). (gentileza de Ing. Agr. Silvia Passalacqua y Mónica Abal. Lab. del SENASA) En referencia a los métodos de detección fenotípica, nos concentraremos en el fenotipo como resultado de algún proceso metabólico de la planta (y no restringirnos a una definición de fenotipo que implique la medición de alguna proteína). Las plantas genéticamente modificadas (PGM) que se encuentran actualmente a campo presentan la característica de resistencia a herbicida y/o a insectos. La evaluación de la resistencia a insectos de una planta se realiza mediante ensayos biológicos complejos y de larga duración, por eso ésta no es una alternativa práctica parael análisis de granos. Sin embargo, la resistencia a herbicidas sí puede ser evaluada mediante ensayos sencillos en laboratorio y a campo. Las semillas o granos pueden ser puestos a germinar en presencia del herbicida (para soja, 0.5 ml glifosato 48% en 1 litro de agua; Monsanto America Latina. 2001), y sólo germinarán aquellos individuos portadores del gen de resistencia (Fig. 1). La cantidad de semillas GM puede ser estimada en la muestra mediante un cálculo sencillo: semillas RR = semillas germinadas con glifosato/semillas germinadas con agua. Una vez que un lote ha sido sembrado y mientras el cultivo se encuentre en una etapa en la que es susceptible al herbicida, se pueden hacer aplicaciones de herbicida en pequeñas parcelas representativas (Fig. 2) para luego hacer el recuento de plantas sobrevivientes sobre total de plantas tratadas. Si los individuos GM y no GM tienen el mismo rendimiento entonces, los granos que se cosechen en ese lote tendrán una proporción de GM/ no GM igual al porcentaje de plantas sobrevivientes. Estas alternativas de evaluación son usadas en soja por los propios productores que abastecen a parte de la industria nacional productora de jugos y alimentos a base de soja. La industria, por su parte, controla esta materia prima mediante el uso de tests inmunológicos a la entrada de la planta procesadora. Generalmente de un conjunto de lotes así controlados se toma una muestra que se envía a un laboratorio para realizar un análisis por PCR para así tener un límite de detección menor y una cuantificación del contenido de GM, lo que además les permite obtener un certificado de una tercera parte (laboratorio independiente) para el control de procesos de producción. Detección inmunológica o por PCR? La elección del método de detección depende de varios factores, uno de ellos es el producto que se va a analizar: la matriz (granos, harina, galletita, sopa, etc). En el caso de grano y los primeros productos de molienda de éstos, tanto la proteína como el ADN conservan sus propiedades físicoquímicas intactas, por lo tanto ambos métodos pueden aplicarse. Sin embargo, a medida que la materia prima es elaborada ha- 410 TOZZINI, Alejandro C.

394 Procedimientos inmunológicos Básicamente dos son los formatos que toman los ensayos inmunológicos para la detección de OGM: las tiras reactivas (o strips de flujo lateral) o ELISA (ensayo de inmunodetección ligado a enzimas). Flujo lateral o lateral flow Figura 2: representación esquemática de la aplicación de herbicida en parcelas representativas en un lote de soja para determinar y cuantificar la presencia de individuos GM con resistencia al herbicida. cia alimentos terminados, los distintos tratamientos a que son sometidos los componentes, hacen que se vayan degradando el ADN y las proteínas. Especialmente estas últimas pierden su estructura disminuyendo rápidamente sus propiedades inmunológicas, por lo tanto no es apropiado aplicar métodos inmunológicos a alimentos con alto grado de procesamiento. El ADN, por su parte, se corta en fragmentos pequeños, hasta que la mayoría tiene un largo menor al segmento a amplificar y por lo tanto ya no resulta amplificable. A esto hay que sumarle las modificaciones químicas de las bases del ADN que hacen que pierdan su capacidad de servir como templado en el proceso de copia in vitro que ocurre durante la PCR (Fig. 3), por eso en determinadas ocasiones la presencia de OGM en las materias primas usadas deja de ser detectable en el producto final. Algo similar ocurre con aquellas materias primas usadas como sustrato de procesos fermentativos, como la fabricación de cerveza, al final del cual la mayoría de las moléculas han sido digeridas y resintetizadas. Junto con esto cabe acotar que los costos de extracción/purificación del ADN son mayores a partir de matrices elaboradas y/o complejas. Otro de los factores que atenta contra las posibilidades de detección es el grado de purificación del producto: en productos como los aceites, la lecitina o la glucosa no queda una cantidad suficiente de ADN como para ser purificado y amplificado. Figura 3: Representación esquemática de la degradación de las propiedades fisico-químicas de las proteínas y del DNA con el grado de procesamiento de la materia prima hasta el alimento terminado. De alli la elección de la técnica adeacuada para detectar OGMs según la matriz a analizar. En este formato se reúnen todos los reactivos en un soporte sólido y mediante el flujo por capilaridad de la muestra en solución se logra determinar la presencia o ausencia de una determinada proteína (análisis cualitativo). Este formato ha sido exitosamente aplicado para la detección de un sinnúmero de moléculas de importancia en el diagnóstico veterinario y humano, como es el caso de los tests rápidos de embarazo. Para el ensayo debe molerse una cantidad determinada de granos y una alícuota de esta harina mezclarse con un buffer (provisto con el kit) o agua, para generar una solución que incluya la proteína de interés. La tira posee en la parte inferior un fieltro que sirve para absorber la solución con las proteínas y filtrar las partículas que se hallan en suspensión (Fig. 4). Al mismo tiempo, en el otro extremo se encuentra un material absorbente que recibe el flujo que asciende por capilaridad. El líquido en su ascenso, pasa primero por una zona en donde se halla un anticuerpo monoclonal (Atb) contra la proteína a detectar, conjugado con una molécula coloreada (con oro o látex). Si la proteína está presente en la muestra, en esta zona se producirá el reconocimiento Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 411

395 por el Atb y ambos seguirán migrando juntos. La segunda zona es la de «pegado» o línea de resultado. En ésta se halla inmovilizado un segundo anticuerpo monoclonal contra la proteína en cuestión, de forma que cuando ésta llega a esa zona, queda retenida y concentrada en una línea delgada, y al traer consigo al conjugado coloreado, la región comienza a ser visible. Finalmente, hay una tercera zona llamada de control, en la cual un segundo anticuerpo contra el anticuerpo conjugado está inmovilizado y retiene al conjugado que no haya quedado retenido en la línea de resultado, generando también una línea visible en esa zona. Esto indica que se produjo el flujo ascendente de líquido y que el anticuerpo conjugado se halla en buenas condiciones. La aparición de esta línea avala los resultados negativos, al indicar que la falta de color en la linea de resultado no se debe a una falla del kit. Cuando el resultado es positivo (visualización de color en la zona de resultado) no es necesario que aparezca la banda de control. En la práctica, la banda de control presenta menor intensidad en las muestras positivas que en las negativas debido a que el conjugado que llega a esta zona es sólo aquel que no se adhirió a la proteína y no quedó retenido en la línea de resultado (ver foto en Fig. 4). En casos excepcionales todo el conjugado queda retenido en la línea de resultado quedando sin color la banda de control. Para realizar el ensayo a partir de granos es necesario moler los mismos y resuspender en un buffer una muestra representativa de la harina obtenida. En esta suspensión se introduce la parte inferior de la tira y se espera de 10 a 20 minutos el desarrollo de color. El resultado es cualitativo (positivo o negativo) y la sensibilidad (o límite de detección) oscila entre el 0.5 y 2% para los eventos Bt11 y Mon810 en maíz (eventos protegidos de insectos con el gen cry1ab de B.thuringiensis) y de % para soja RR (evento GTS , tolerante a glifosato, con el gen para la enzima CP4EPSPS). Como se mencionó, el ensayo es cualitativo, pero a partir de los resultados se pueden hacer cálculos estadísticos para determinar la probabilidad de que la muestra tenga un contenido de granos GM inferior a un determinado valor para un dado nivel de confianza. Para esto, es imprescindible conocer la sensibilidad del strip expresada en granos GM/ granos no GM, y trabajar con submuestras que no excedan este número para evitar resultados falsos negativos. Por ejemplo, la sensibilidad de detección de la proteína CP4 EPSPS es de 1 grano GM en 1000 no GM, por lo tanto el número máximo de granos a incluir en cada submuestra es de Entonces, para una submuestra de granos de resultado negativo y aceptando un nivel de confianza de 95% (i.e. la probabilidad de resultado negativo del análisis es de 5%), la frecuencia de no GM (probabilidad de no GM) será la raíz unmilésima de 0.05; esto es y por lo tanto el contenido máximo de GM esperado es de (0.3%). Si de la misma muestra se analizan dos submuestras de granos y ambas resultan negativas, el cálculo ahora involucra la raíz dosmilésima de 0.05, lo que determina un contenido máximo de GM de (0.15%). Realizando el análisis de submuestras, la sensibilidad de análisis de una muestra se puede mejorar combinando estadísticamente los resultados de cada una de ellas. Los manuales de los distintos kits incluyen tablas de cálculo que están basadas en estos conceptos. En general, los strips reactivos tienen una versión optimizada para la detección a partir de tejido vegetal para poder realizar el análisis en los períodos en que el cultivo aún no presenta granos. La mayor ventaja de realizar el análisis en granos es la facilidad para muestrear cientos de individuos y combinarlos en una misma muestra; esto es mucho más difícil de lograr a partir de la recolección de hoja. Por otro lado, algunos eventos (ej, maiz Bt 176, de Syngenta) tienen niveles de expresión de las proteínas transgénicas altos en hojas y prácticamente nulos en granos, por lo tanto en estos casos resulta ventajoso el análsis de hojas y desaconsejado el de granos. Como se observa en la Figura 5 los eventos Bt11 y MON810 pueden ser detectados hasta en una concentración de 0.5%, mientras que el evento 176 no se detecta, aún en una concentración de 10%. Resultados similares se obtienen con los strips provistos por Envirologix o por Strategic Diagnostic Inc (A. Tozzini, datos no publicados). Otros datos de perfomance de 412 TOZZINI, Alejandro C.

396 Figura 4: Esquema de las partes de un strip reactivo (ver texto) y foto de dos strips para la detección de la proteína CP4 EPSPS (resistencia a glifosato) mostrando un resultado negativo (izq.) y otro positivo (der). (Gentileza de Mónica Porcio, Agricheck Argentina, representante de Strategic Diagnostic Inc. ) Figura 16: Lectura de un microchip luego de la hibridación con DNA marcado. Suponiendo que se tratara de un micro-array para identificar GMO, los puntos fluorescentes representarían secuencias pertenecientes a GM presentes en la muestra. En primer plano se muestra una ampliación de uno de los 16 campos que conforman el micro-array. reactivos inmunológicos en formato de strips o de ELISA para distintos eventos y proveedores puede verse en Obviamente la gran ventaja de esta metodología de análisis radica en su simplicidad y rapidez, por eso se la utiliza «a campo» como control inicial en la conformación de conjuntos que luego serán analizados por algún método cuantitativo, o como primer control a la entrada de un proceso o industria. ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay) Figura 5: Ensayo de límite de detección de granos de maíz Bt utilizando el Quickstick TM de Envirologix ( Los porcentajes expresan granos de un evento/granos no GM. Entre paréntesis figura el tiempo en minutos transcurridos desde el inicio del ensayo y en el cual se iniciaron las lecturas de los resultados. No hubo cambios en una lectura posterior a los 20 min. (A. Tozzini, Instituto de Biotecnología INTA) En este caso, el análisis inmunológico se resuelve sobre el soporte sólido de placas de poliestireno en el formato de 96 pocillos o de tiras de 8 o 12 pocillos. Estos pocillos están recubiertos con el anticuerpo de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 413

397 Primers (en exceso) DNA genómico Separada de las hebras (95ºC) y pegado de los primers (60ºC) Primers complementarios a la secuencia genómica Extensión de los primers (72ºC) por la Taq polimerasa Nuevas cadenas de DNA sintetizada a partir de los primers y sobre las hebras genómicas Separado de las hebras, pegado de los primers y extensión Nuevas cadenas de DNA sintetizada sobre DNA sintético (tamaño del fragmento a detectar) Separado de las hebras, pegado de los primers y extensión DNA doble cadena del tamaño esperado (amplicón) copias de amplicón Duplicación de la cantidad de amplicón por cada ciclo de amplificación CICLO 1 CICLO 2 CICLO 3 CICLO 30 Figura 6: Esquema del proceso de PCR (Polimerase Chain Reaction). Amplificación de un fragmento específico de DNA mediante un proceso de síntesis in vitro. captura, en los cuales se agrega la solución con la muestra (preparación similar a la anterior). Si la proteína en cuestión (antígeno) está presente, ésta queda capturada en el pocillo por los anticuerpos. Finalizado el período de incubación con la muestra ésta se vuelca del pocillo y se realizan lavados con buffer para retirar las moléculas que no hayan sido capturadas. Luego se coloca un segundo anticuerpo que se unirá a la proteína capturada por el anticuerpo anterior, y que está conjugado con una enzima que transformará el cromógeno (ver más adelante). Finalizada la incubación con el conjugado, se lava con buffer para retirar todo el conjugado libre (no unido al antígeno). El último reactivo que se agrega es una solución conteniendo un cromógeno, una sustancia incolora que es modificada por la enzima del conjugado en un compuesto coloreado y que revela, por lo tanto, la presencia del antígeno en la muestra. La intensidad de color generada en un pocillo determinado en un tiempo dado es medible en un espectrofotómetro Figura 14: Desarrollo de la amplificación en una PCR en Tiempo Real para distintas muestras (incluyendo la curva de calibración, el control sin DNA (línea horizontal marrón) y el control negativo (inicia fase exponencial en ciclo TOZZINI, Alejandro C.

398 para placa de ELISA y es proporcional a la cantidad de antígeno inicial. Por lo tanto, esta lectura puede transformarse (con una curva de calibración apropiada) en una estimación cuantitativa del contenido del OGM en la muestra. La sensibilidad de estos análisis se encuentra entre el 0.3 y 1%, y requiere de un laboratorio de complejidad baja a media y personal calificado. El resultado se obtiene en 3 a 4 horas (sin contar la molienda de la muestra). Como en el caso de las tiras, también son varias las empresas que ofrecen anticuerpos y placas para realizar este tipo de ensayo (ver / Este ensayo es adecuado para asistir un proceso de segregación de granos, para aquellos eventos que tengan una buena expresión de la proteína transgénica en granos y en casos que se necesite hacer un análisis cuantitativo sencillo. Para un determinado tipo de proteína, por ejemplo la de Bacillus thuringiensis Bt Cry1A, la secuencia de aminoácidos codificada es la misma (o muy similar) en las distintas construcciones utilizadas para generar los distintos eventos de transformación, aún cuando sus secuencias nucleotídicas sean muy distintas. Por eso, el mismo anticuerpo puede ser usado para detectar distintas construcciones presentes en los distintos eventos (los maíces tolerantes a lepidópteros MON 810, Bt11 y Bt176, tienen Bt Cry1A). En algunos casos no es posible generar un anticuerpo para detectar la proteína introducida debido a que es muy similar a proteínas propias de la planta original y por lo tanto no es posible generar un anticuerpo que detecte a la proteína introducida sin detectar también la ya presente en la planta (reacción cruzada). Este es el caso de la proteína que determina la resistencia a glifosato introducida en el evento GA21, en el cual la proteína modificada (mepsps, la enzima tolerante al herbicida) presenta sólo dos aminoácidos de diferencia en 450, con respecto a la EPSPS nativa de maíz, la cual es sensible al glifosato. Detección del ADN Existen varias técnicas para determinar la presencia de una determinada secuencia de ADN; sin embargo, los servicios de detección de secuencias transgénicas utilizan casi exclusivamente PCR. El transgen es uno más entre las decenas de miles de genes originales de la planta. Además, en la práctica, se requiere de la capacidad de poder detectar un grano GM entre o granos no GM, y la PCR ha demostrado tener la sensibilidad suficiente como para cumplir este cometido. Sin embargo, la mayor dificultad de un análisis dirigido a detectar niveles mínimos de OGM no radica en las técnicas analíticas sino en la posibilidad de hacer un muestreo representativo en la práctica, acorde a los niveles a detectar. Las muestras de granos (de al menos granos para detecciones de 0.1%) deben ser molidas y reducidas en su granulometría para tomar una muestra de harina menor a un miligramo y de allí, purificar su ADN. La reacción en cadena de la polimerasa es una síntesis in vitro de ADN, mediada por una ADN polimerasa ADN-dependiente a partir de un cebador o primer (segmento de ADN simple cadena de 18 a 25 nucleotidos). Un par de primers son utilizados para determinar la especificidad y el tamaño del fragmento a amplificar. Una ADN polimerasa termo-rresistente proveniente de Termophilus aquaticus, Taq polimerasa, es la enzima encargada de la replicación del ADN bajo un programa de ciclos repetidos que alterna normalmente tres temperaturas: una temperatura de desnaturalización (94-95 ºC) en la cual el ADN doble cadena se abre en hebras simples, le sigue una etapa de hibridación de los primers (de 45 a 68 ºC) en la cual éstos se unen por complementariedad de bases con el ADN simple cadena y sirven de punto de inicio de la síntesis de ADN por la Taq polimerasa. Finalmente la temperatura se eleva a 72 ºC, en la fase de elongación, ya que ésta es la temperatura óptima de fun- Figura 7: Ubicación de distintos pares de primers con respecto a la construcción y al sitio de inserción en el genoma de la especie. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 415

399 cionamiento de la enzima y de esta forma se acelera la reacción. Así termina un ciclo de copia y se inicia el siguiente elevando nuevamente la temperatura hasta ºC (Fig. 6, ver pág.6). Estos ciclos tienen una duración de 2 a 4 minutos y se repite de 35 a 50 veces multiplicando una copia del fragmento inicial en más de millones de copias al final del proceso. El producto de la amplificación se resuelve por electroforesis en gel de agarosa y se visualiza con un colorante fluorescente (bromuro de etidio) bajo radiación UV. Este aparece como una banda de un tamaño predeterminado de pares de bases, correspondiente al fragmento amplificado. La técnica de PCR es muy sensible, y por lo tanto, niveles ínfimos de contaminación con ADN en una muestra pueden generar un resultado positivo falso. La amplificación repetida del mismo fragmento de ADN (amplicón) va generando cientos de miles de millones de copias dentro del mismo laboratorio y estas copias pueden contaminar las nuevas muestras y los reactivos si no se tienen cuidados especiales. En primer lugar se Bt Figura 8: Representación esquemática de las partes componentes de las construcciones de los eventos aprobados en la Argentina en soja y maíz (no están los dos eventos en algodón). P35S: promotor 35S, T35S: terminador 35S, Tnos: terminador de la nopalin sintetasa, Pmaíz: promotor no especificado de un gen de maíz, Cry 1Ab: proteína Bt que confiere resistencia insectos, CP4 EPSPS: proteína que confiere resistencia al herbicida glifosato, PAT: fosfinotricin acetil transferasa, determina resistencia a glifosinato. Tabla 1: Número de copias por genoma de distintas secuencias regulatorias en diferentes eventos (P35S = promotor 35S CaMV. Tnos = terminador de la nopalin sintetasa. T35S = terminador del 35S de CaMV) Evento P 35S Tnos T35S GA GTS MON NK T TC Bt MON T MON DBt418 5 CBH requiere de un laboratorio especialmente diseñado con cuartos separados para las distintas tareas del análisis y con un flujo unidireccional de la muestra desde las áreas «limpias» hasta la última zona «sucia». En el primer cuarto se muele la muestra, en el segundo se purifica el ADN y se prepara la reacción de PCR y en el último se produce la amplificación y se resuelve por electroforesis. En este último cuarto se abre el tubo de reacción y es donde se «liberan» los amplicones. Es conveniente que el primer y último cuarto tengan presión negativa, mientras que en el de purificación la presión debe ser positiva. Cada cuarto debe ser limpiado regularmente con hipoclorito de sodio, tener un sistema de luz UV para la destrucción del ADN y tener sus propios equipos e instrumentos. Sólo personal capacitado puede ingresar en los laboratorios para minimizar el transporte de amplicones de un cuarto a otro. El reactivo clave en una reacción de PCR son los primers que determinarán el fragmento a amplificar. Para esto, se requiere conocer la secuencia de nucleótidos de un segmento de la construcción usada para generar el evento, para así poder diseñarlos. Esta información no siempre está disponible, pero una vez que se la conoce, la síntesis de primers es mucho más barata y sencilla que la producción de anticuerpos para reactivos inmunológicos. Según sea la secuencia so- 416 TOZZINI, Alejandro C.

400 Figura 9. Evolución de la acumulación de DNA en una reacción de PCR positiva. La fase exponencial de crecimiento está marcada entre barras. Figura 10: Evolución de la acumulación de DNA en función de los ciclos para distintas reacciones de PCR correspondiente a diferentes concentraciones iniciales del fragmento de DNA a amplificar. La línea umbral corresponde a un determinada cantidad de DNA, que es superado por las distintas reacciones en diferentes ciclos. bre la cual se ubiquen los primers, los mismos tendrán propiedades de detección distintas. Los primers generales o «universales» están diseñados sobre secuencias presentes en la mayoría de las construcciones vegetales (promotores, terminadores, genes marcadores, etc.), por lo tanto, permiten detectar varios eventos (Fig. 7). Los primers específicos permiten detectar uno o pocos eventos. Si estos están ubicados sobre la secuencia codificante pueden detectar un mismo tipo de construcción, por ejemplo, los eventos Bt11 y MON810. Normalmente, con una construcción se obtienen muchos eventos en una misma especie, pero sólo uno alcanza la fase comercial; sin embargo, a veces una misma construcción se usa para transformar varias especies y por ello, una misma construcción se repite en el mercado en varios cultivos. En estos casos, los primers que amplifican esta construcción detectan varios eventos. Por ejemplo, con los mismos primers se puede amplificar el evento GTS de soja y el NK603 en maíz (así como también los mismos reactivos inmunológicos). Los primers evento-específicos están diseñados sobre el inserto y sobre la región genómica adyacente al sitio de integración; por eso, permiten detectar un solo evento (de todos los que hayan sido obtenidos con una determinada construcción). Todos los eventos aprobados en la Argentina hasta la fecha (ver: Biotecnología CONABIA en tienen en su estructura por lo menos una copia de la secuencia del promotor 35S, sea para dirigir la transcripción del gen principal o del gen marcador (Fig. 8 y Tabla 1); por eso, una reacción de PCR con primers ubicados sobre el p35s permite detectar la presencia de cualquiera de estos eventos. Existen dos tipos de PCR desde un punto de vista técnico: la primera versión de PCR, ahora denominada de Punto Final (End Point PCR), debido a que el resultado de la amplificación se obtiene al finalizar la reacción (electroforesis en gel), y la otra versión, más reciente, la PCR en Tiempo Real (Real Time PCR), ya que el resultado de la amplificación se lee ciclo a ciclo (sistema de tubo cerrado). Desde el punto de vista del objetivo de la reacción, un ensayo puede hacerse a los fines de detectar la presencia de OGM o de un evento en particular (análisis cualitativo) o para cuantificar su presencia (análisis cuantitativo). La cinética de acumulación del producto de PCR se puede describir en tres etapas, la primera de lenta acumulación del producto, una segunda en la cual en virtud de la cantidad de copias acumuladas, el crecimiento del producto es exponencial y la tercera en la cual el sistema se satura y alcanza un «plateau». (Fig. 9). Los momentos (ciclos del proceso) en los cuales se alcanzan las distintas etapas dependen del número inicial de copias del segmento de ADN a amplificar en la muestra; una muestra con mayor número de copias iniciales alcanzará la fase exponencial antes que una con menor número. Otra característica del sistema es que la fase estacionaria o de plateau, determina que las cantidades de producto totales acumuladas en las distintas muestras tiendan a igualarse aunque hayan iniciado con un número distinto de copias. (Fig. 10). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 417

401 El resultado de una PCR en Punto Final (PCR PF) se obtiene una vez que se han cumplido todos los ciclos de amplificación programados y el producto se resuelve por electroforesis en un gel de agarosa. El bromuro de etidio agregado al gel o después de haberlo corrido se intercala en el ADN y permite visualizar los productos de amplificación cuando se lo irradia con iluminación UV. De esta manera se puede determinar la presencia del producto esperado (amplificación cado entre el 0.01 y 0.05% de genomas GM. Esto equivale a detectar de 5 a 25 copias de transgen por reacción según el tamaño del genoma de la especie y de la cantidad de ADN usado en cada reacción. Programando un alto número de ciclos (45 a 50 ciclos) se permite que aún las muestras con un bajo Figura 11: Resultado semicuantitativo por PCR de Punto Final. Scanning de una foto de trabajo, los trazos verticales a mano alzada separan las distintas calles del gel. Las primeras 6 calles corresponden a la Curva de Calibración con los siguientes puntos, 0.05%, 0.1%, 0.25%. 0.5%. 1% y 5% (genomas GM/genomas totales). Le siguen dos calles correspondientes al control negativo (maíz no GM, molido en la misma tanda que las muestras siguientes). Los pares de calles de 1 a 7 corresponden a 7 muestras con dos repeticiones cada una (dos extracción de DNA y una PCR de cada extracción), muestras 1, 2 y 3, GM no detectado con LOD 0.05%; muestras 6 y 7 GM detectado, con contenido estimado inferior al 0.1%; muestras 4 y 5 debe repetirse la PCR y/o extracción hasta igualar los resultados entre las repeticiones (generalmente esto ocurre con muestras con bajo contenido de GMO por un tema de muestreo de la harina y del DNA). específica), identificado por su peso molecular (en pares de bases), relativo a un marcador de peso conocido. También se puede observar la presencia de productos inespecíficos si los hubiera. Análisis cualitativo por PCR PF La PCR en Punto Final es adecuada para análisis cualitativos, es decir, donde el resultado se medirá como amplificación positiva (OGM detectado) o como negativa, (OGM no detectado), considerando la sensibilidad lograda, límite de detección o LOD. Optimizando todos los parámetros de la reacción: ADN de muy buena calidad, primers bien diseñados, reactivos de máxima calidad y con un programa y un equipo adecuados, se puede lograr un límite de detección ubi- Figura 12: PCR competitiva. Co-amplificación de las diluciones crecientes del estandar y decrecientes del DNA de la muestra. En el punto de equivalencia se igualan las masas de los productos de amplificación número de copias iniciales alcancen la fase exponencial y acumulen una masa visible de producto, a costa de saturar las muestras con contenidos mayores. En estos ensayos, además de los controles negativos compuestos por una muestra con ADN de material no GM y el control sin ADN (sólo agua), se debe incluir como controles positivos al menos dos puntos de concentración conocida de GM. Una de éstas debe tener un contenido de GM igual al límite de detección deseado de forma tal de verificar que el LOD se ha alcanzado y otro superior como segundo control en caso de que la eficiencia del proceso no haya sido óptima. Estos valores podrían ser 0.05% (LOD) y 0.20%. Es muy conveniente que estos controles positivos se inicien en el proceso de análisis a partir del momento de la purificación del ADN. De esta manera, se está controlando en ellos la calidad del ADN obtenido, además de la eficiencia del proceso de PCR. El análisis cualitativo es también denominado screening test, ya que permite hacer un primer análisis a un determinado número de muestras y luego derivar a PCR cuantitativa aquellas que resultaron positivas. Análisis semicuantitativo por PCR PF En un análisis en PF puede obtenerse una estimación del contenido de OGM en un rango dinámico acotado. Un resultado po- 418 TOZZINI, Alejandro C.

402 Figura 13: Esquema de la estructura optica del ABI prism 7700 (PE Biosystem). Este sencillo esquema muestra como a partir de uan fuente de luz (laser en este caso) se direcciona la luz hasta cada muestra y la emisión de retorno es dirigido hacia una cámara. Un detalle de equipos como este es que la tapa caliente que apoya sobre las muestras debe ser transparente. Fuente PE Biosystems sitivo se expresa como detección de OGM y un contenido estimado por una curva de calibración con valores próximos al LOD del ensayo. Para esto hay que estandarizar muy bien las condiciones intralaboratorio, especialmente cantidad y calidad de ADN y cantidad de ciclos de amplificación (teniendo en cuenta que alcanzado el plateau de la reacción, la cantidad de ADN acumulado tiende a igualarse entre muestras con distintas concentraciones de OGM). El resultado positivo se expresa como: OGM detectado con un LOD de ensayo X; la cantidad de producto generado se ubica entre las señales producidas por los estándares A y B (controles positivos). Por ej.: amplificación de promotor 35S positiva con un LOD = 0.05%; la cantidad de producto amplificado se ubica entre los generados por los estándares de 0.1 y 0.5%. Cuando este ensayo se realiza con una curva de calibración puede verse, por ejemplo, una señal débil en los estándares de 0.05 y 0.1%, una señal media en 0.25 y 0.5% y fuerte en 1 y 5% (Fig. 11). Análisis cuantitativos por PCR PF, PCR competitiva Una de las estrategias desarrolladas para cuantificar por PCR de Punto Final fue la PCR competitiva (Hardegger y col., 1999) y está basada en la co-amplificación (en la misma reacción y a partir del mismo par de primers) de un estándar interno de concentración conocida. Cuando la señal de amplificación generada a partir de la muestra y a partir del estándar interno son iguales, se asume que ambos procesos partieron de igual número de copias iniciales del ADN blanco. El estándar interno se construye clonando en un plásmido el fragmento a amplificar y produciéndole una inserción o deleción de manera tal que cuando se resuelvan en un gel los productos de amplificación a partir de la muestra y del estándar, se distingan por sus pesos moleculares. Para lograr una reacción donde se igualen los productos de amplificación (muestra: control interno) se arma una serie de diluciones crecientes del estándar y se combina con una serie de diluciones decreciente de la muestra (Fig. 12.). Esta estrategia, además de laboriosa (para obtener una reacción donde se igualen los productos de amplificación), requiere del desarrollo del control interno, pero se puede realizar en un laboratorio de PCR tradicional. PCR en Tiempo Real (Real Time PCR) En un sistema de PCR en Tiempo Real, el proceso de amplificación se va siguiendo ciclo a ciclo, observando el incremento de la masa de ADN presente en cada reacción. Esto se logra gracias a un termociclador que tiene adosado un sistema óptico que emite un haz de luz sobre cada muestra y registra la emisión de fluorescencia a partir de las misma y de uno o más reactivos fluorescentes agregados a la reacción y que emiten luz de manera proporcional a la cantidad de ADN presente (Fig. 13). La ventaja de este sistema es que permite detectar en qué momento cada reacción alcanza su fase exponencial de amplificación (Fig. 14, ver pág.6), y ésta correlaciona con la cantidad de copias del ADN blanco que había inicialmente en la muestra. Para poder cuantificar se necesita incluir en el experimento una curva de calibración con la cual comparar las muestras incógnitas. A partir de esta curva, se determinará en qué ciclo alcanza la fase exponencial cada concentración de OGM. Una muestra con un 10% de OGM alcanzará la fase exponencial antes que una muestra con un 1%; y ésta antes que una con 0.1%. La cuantificación del contenido de OGM se obtiene comparativamen- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 419