UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA

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1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA MANUAL DE PRÁCTICAS BIOLOGÍA DEL DESARROLLO

2 MANUAL DE PRÁCTICAS DE: BIOLOGIA DEL DESARROLLO. COMPILADORES: Principal: M. en C. S.P. Abraham Aquino Carreño Colaboradores: P. de Biol. Citlalic Salinas Morales Revisado por: Dr. Raymundo Rivas Cáceres Ciudad Juárez, Chihuahua Universidad Autónoma de Ciudad Juárez 2009 p. 81 Complemento práctico del Curso Biología del Desarrollo del programa de Biología 2

3 M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biología D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biología Dr. Alejandro Martínez Martínez Jefe del Departamento de Ciencias Químico-Biológicas M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomédicas Comité editorial M. en C. S. P. Abraham Aquino Carreño M. en C. Ana Gatica Colima M. en C. Guillermo Bojórquez Rangel Dra. Helvia Rosa Pelayo Benavides 3

4 INDICE PRÁCTICA No. 1 EL CICLO CELULAR, MITOSIS Y MEIOSIS... 1 PRÁCTICA Nº 2 ESPERMATOGENESIS EN MAMIFEROS PRÁCTICA Nº 3 ESPERMATOGENESIS EN ORTOPTEROS PRÁCTICA Nº 4 OVOGÉNESIS EN ORTÓPTEROS PRÁCTICA Nº 5 OVOGÉNESIS EN ANFIBIOS PRÁCTICA Nº 6 FOLICULOGÉNESIS EN MAMÍFEROS PRACTICA Nº 7 FECUNDACIÓN EN EQUINODERMOS PRACTICA Nº 8 ANALISIS SEMINAL PRÁCTICA Nº 9 CITOLOGIA Y CICLO ESTRAL DE RATA PRÁCTICA Nº 10 DESARROLLO EMBRIONARIO DEL POLLO PRACTICA Nº 11 TINCIÓN DE ESQUELETO EMBRIÓN DE POLLO PRACTICA Nº 12 EXTRUCTURAS EXTRAEMBRIONARIAS Y PLACENTA i

5 PRÁCTICA No. 1 EL CICLO CELULAR, MITOSIS Y MEIOSIS Introducción Las células a lo largo de su vida pasan por varias fases que en conjunto constituyen el ciclo celular. El estado habitual de una célula es con su cromatina descondensada, con genes en actividad y con una actividad fisiológica más o menos intensa. Esta situación corresponde al periodo de interfase. En tejidos en crecimiento o en regeneración una célula se divide para formar dos células hijas genéticamente iguales, es decir con el mismo número de cromosomas e idéntica información genética. Este tipo de división se denomina mitosis. En los organismos que presentan reproducción sexual, las células que van a dar origen a los gametos, sufren un tipo de división reduccional. Se originan cuatro células en las que se ha reducido a la mitad el número de cromosomas y además en virtud del entrecruzamiento y la recombinación genética que se produce, las células formadas no son idénticas a la célula original. Este tipo de división es la meiosis. La meiosis es un proceso imprescindible para mantener constante el número de cromosomas característico de cada especie. Objetivos Identificar distintas fases de la mitosis y meiosis. Comprender los conceptos de diploidía y haploidía. Diferenciar entre ambos procesos. Materiales Computadora y distintas páginas web. Dirección de la página web: 1

6 Procedimiento Abre la siguiente página y estudia el capítulo relativo al ciclo celular. N/T406_MITOSIS/INDICE.htm 2. Ahora que ya conoces las fases del ciclo celular podrás resolver estos ejercicios: Esta figura representa el ciclo celular. Esta figura representa el ciclo celular. Nombra las etapas numeradas sabiendo que a es la citocinesis. Qué representa el color Verde? Y el amarillo? 2

7 3.- Abre la siguiente página y podrás estudiar la mitosis Cuantos cromosomas tiene la célula madre de esta animación?. Cuantas cromátidas tiene cada cromosoma? 5.- Cuantos cromosomas tienen las dos células hijas que se forman? Con cuantas cromátidas cada cromosoma? 6.- La célula madre es diploide o haploide? Y las células hijas? 7.- En qué momento del ciclo celular los cromosomas se duplican y cada uno de ellos da lugar a la cromátida hermana?. Como ocurre esto? 8. Abre la siguiente página y podrás estudiar la meiosis. Qué proceso ocurre durante la profase I de la meiosis que no ocurre en la mitosis?. En qué consiste? 3

8 9.- La célula madre es diploide o haploide? Y las células hijas que resultan al final? 10.- Cita qué procesos ocurren en la anafase I de la meiosis. 11. Conéctate a INTERNET: Selecciona: mitosis y meiosis En el menú que aparece en la pantalla, dentro de Identificación y descripción de los fenómenos más importantes de la mitosis, elige: Revisión Mitosis animal Deja que se cargue la imagen. 13. Señala con el cursor los nombres de las fases podrás ver fotografías y la descripción de los procesos. Escribe una característica típica de cada fase. Interfase: 4

9 Profase: Metafase: Anafase: Telofase: 14. Cuando termines haz clic en siguiente, en la parte inferior aparece Revisión Mitosis vegetal. Escribe qué ocurre tras la telofase de la mitosis animal y vegetal. 5

10 15. Selecciona Siguiente para volver al menú principal. Sitúa el cursor sobre Pregunta 1. Escribe aquí las respuestas correctas: Fase: 16. Selecciona Pregunta 2. Escribe las respuestas: Fase: 17. Selecciona Pregunta 3. Anota las respuestas correctas: Fase: 18. Selecciona Identificación y descripción de los fenómenos más importantes de la meiosis, y dentro de ello pincha La Profase I compara la fotografía que se muestra a la izquierda con la descripción que se hace en la parte inferior de la imagen. 19. Selecciona Las otras fases de la meiosis y observa las fotos y explicaciones. 6

11 20. Dando a siguiente vuelves a llegar al menú principal. Sitúa el cursor sobre Pregunta 1 de meiosis. Escribe aquí la respuesta correcta: Fase: 21. Selecciona Pregunta 2. Escribe las respuestas: Fase: 22. Selecciona Pregunta 3. Escribe las respuestas: Fase: 23. Selecciona Pregunta 4. Escribe las respuestas: Fase: 7

12 24. Selecciona Pregunta 5. Escribe las respuestas: Fase: 25. Cierra la pregunta 5 y ves al apartado analogías y diferencias entre mitosis y meiosis. Selecciona Pregunta 1 y realiza la actividad. Se observan los cromosomas homólogos emparejados al inicio de la Profase de la mitosis? Y qué ocurre con ellos en la meiosis? 26. Selecciona Pregunta 2 y realiza la actividad. Cuántos cromátidas tienen los cromosomas al iniciarse la profase de la mitosis? Y al terminar todo el proceso de mitosis? 8

13 Conclusiones Bibliografía consultada 9

14 PRÁCTICA Nº 2 ESPERMATOGENESIS EN MAMIFEROS Introducción En casi todos los vertebrados el aparato reproductor está formado por las gónadas y por un grupo de conductos y glándulas que en conjunto constituyen el tracto reproductor masculino. Los órganos sexuales internos están compuestos por los testículos y sus sistemas de conductos y glándulas accesorias. La gónada genera los gametos que son transportados a lo largo del tracto reproductor. En el momento de la eyaculación las glándulas anexas vierten los productos de su secreción, los cuales, junto con los espermatozoides, constituyen el semen. La mayor parte de los componentes de estas estructuras se originan a partir del mesodermo intermedio. Los testículos de mamíferos son estructuras pares y ovaladas cuyas principales funciones son dos: producción de espermatozoides y síntesis de hormonas masculinas, los andrógenos. Los testículos se encuentran rodeados por una gruesa capa de tejido conjuntivo: la túnica albugínea. De ella salen numerosos septos que se extienden radialmente y que dividen al testículo en los lobulillos. Cada lobulillo está constituido por túbulos seminíferos que delimitan tres compartimentos: el tubular, ocupado esencialmente por el epitelio seminífero, el peritubular, ocupado por las células mioepiteliales, y el intersticial, donde se situarían los vasos sanguíneos, linfáticos, células del conjuntivo y de Leydig. Los túbulos descansan en la parte apical del testículo, la red testicular, la cual a su vez converge en el epidídimo, que se continúa con el conducto deferente, conducto eyaculador y uretra, y es en ellos donde ocurre la espermatogénesis. El epitelio del túbulo es estratificado, formado por células de Sertoli, espermatogonias, espermatocitos en diferentes etapas del proceso meiótico, espermátidas y espermatozoides. Por lo general, a lo largo del túbulo varían los estadíos de meiosis y espermiogénesis. Además, en rata, ratón y hámster un corte del túbulo sólo presenta un 10

15 estadio espermatogénico mientras que en humano pueden presentarse varios estadios. El papel del epidídimo es importante en la fisiología del macho, ya que en él los espermatozoides son concentrados y, a medida que son transportados en su interior, van experimentando la maduración espermática. Cuando los espermatozoides alcanzan la región distal del epidídimo, son almacenados por un tiempo variable hasta el momento de ser eyaculados. El epitelio que recubre el epidídimo es pseudo estratificado. El sistema de conductos se continúa con el conducto deferente, el cual comunica la región distal del epidídimo con la primera región de la uretra. Objetivos Que el alumno conozca y se familiarice con las estructuras que participan en el proceso de espermatogénesis. Diferenciar las estructuras y tipos tisulares en testículo. Materiales Cortes histológicos de testículo humano, rata, ratón y hamster Procedimiento La práctica consiste en la observación de secciones histológicas de testículo humano, de ratón, rata y hámster, diferenciando las características morfológicas de las células de Sertoli y de las espermatogonias y espermatocitos en las diferentes etapas de maduración en los mamíferos estudiados, así como las etapas del proceso de espermatogénesis presentes en las secciones histológicas. 11

16 Resultados Dibuja e identifica las estructuras que componen el órgano reproductor masculino y realiza una comparación entre los cortes de ratón, rata, hámster y humano. 12

17 Cuestionario 1.- Explicar la citología de las células de Sertoli, poniendo especial atención a los núcleos de las especies de mamíferos estudiadas en prácticas. Son todos iguales? Qué les caracteriza y que les diferencia? 2.- Qué diferencias hay entre las espermátidas en distintos estados de maduración que se ven en los cortes de testículo? Y entre las distintas especies estudiadas en prácticas? 3.- Dibuja algunas espermátidas en diferentes etapas de maduración en las que se vea el cuerpo cromatoide. Cual es su posible función? 13

18 4.- Qué características presenta el intersticio del testículo en las especies de mamíferos que se han estudiado? Qué diferencias se observan entre dichas especies? 5.- Realizar un dibujo esquemático de un corte transversal de túbulo seminífero de rata. Indicar el estadio del ciclo definido por la asociación celular presente en el corte dibujado. 14

19 Conclusiones Bibliografía consultada 15

20 PRÁCTICA Nº 3 ESPERMATOGENESIS EN ORTOPTEROS Introducción La espermatogénesis es el conjunto de cambios que ocurren en la espermatogonia, y que tienen como final la formación del espermatozoide. Se conoce como espermiogénesis a toda la serie de cambios tanto citoplásmicos como nucleares que sufren las espermátidas hasta convertirse en espermatozoides. Estos cambios morfo funcionales son muy variables y dependen de la especie estudiada. No obstante, y como rasgos generales, podemos decir que se centran en la compactación de la cromatina en el núcleo, la pérdida de casi la totalidad del citoplasma, la génesis de una vesícula acrosómica y la adquisición de un aparato locomotor por parte de la célula. Objetivos El alumno analizara las diferentes fases de la espermatogénesis así como su organización así como la del túbulo seminífero. Materiales Ortopteros Estuche de disección Porta objetos y cubre objetos Procedimiento En preparaciones obtenidas mediante la técnica de aplastado a partir de testículos de ortópteros fijados en etanol y ácido acético en proporción 3:1. Se estudiara la organización de las células que cursan la espermatogénesis y el túbulo 16

21 seminífero en cortes de testículo de saltamontes fijado con Bouin e incluido en parafina. Aplastados de testículo de ortóptero teñidos con Feulgen. Seleccionamos testículos de ortópteros fijados en etanol y ácido acético 3:1 al menos con una semana de antelación y los colocamos en agua destilada para su hidratación durante 10 minutos. A partir de este momento conviene realizar todo el proceso en el mismo recipiente, preferiblemente plástico y no vidrio. No utilizar ningún elemento metálico. Hidrolizar los testículos en HCl 5N durante 30 min. Transcurrido este tiempo se lavan abundantemente en agua destilada. Posteriormente se introducen en reactivo de Schiff durante 30 minutos a temperatura ambiente. Este proceso es preferible realizarlo en oscuridad. Se lavan los testículos en agua sulfurosa y posteriormente en agua del grifo. Separamos un par de túbulos seminíferos del testículo y los colocamos sobre un portaobjetos. Sobre ellos se coloca inmediatamente una gota de ácido acético al 50% en agua destilada y se deja un par de minutos. Con un trozo de papel elimina el exceso por los laterales y, con cuidado de no moverlo, se realiza el aplastado presionando fuertemente con el dedo pulgar sobre una superficie plana. Observar los aplastados en el microscopio tratando de determinar las diferentes etapas del proceso meiótico, así como las espermátidas en los diferentes estadíos de la espermiogénesis. Secciones de testículo de ortóptero teñido con tricrómico de Masson. El análisis de cortes de parafina supone la realización de tres procesos: la inclusión del material en un medio sólido, el corte y desparafinado del mismo y la tinción de los cortes. 17

22 Las secciones de testículo se observarán en el microscopio determinando la disposición de los túbulos seminíferos en el conjunto, así como las zonas apicales y basales de los túbulos. Resultados Dibuja lo que observaste. Y descríbelo. 18

23 Cuestionario 1- Qué es una espermatogonia? Dónde se localiza y qué dotación genética presenta? Qué carga de ADN tiene? 2.- Realiza el dibujo de una espermatogonia de saltamontes e indica cuál es la característica morfológica que la diferencia del resto de células en un aplastado de testículo de ortóptero. Cuál es su posición en el túbulo? 19

24 3.- Dibuja los núcleos de espermátidas de saltamontes en distintas etapas de maduración, observadas en la práctica. 4.- Explica los cambios morfológicos que observas experimentan y cómo eres capaz de determinar cuál es más madura y cuál menos. 20

25 5.- Dibujar y rotular un túbulo seminífero completo de saltamontes indicando las diferencias entre los extremos proximal y distal. 6.- Qué es un cisto? Dibujar uno y determinar en qué etapa se encuentran los espermatocitos que lo integran. Cómo has llegado a esa conclusión? 21

26 7.- A partir de un corte de testículo de saltamontes, dibujar un cisto en el que estén presentes espermátidas tanto normales como aberrantes. Por qué eres capaz de determinar que no son normales? 8.- Qué es un espermatóforo? Dibuja uno de saltamontes. 22

27 Conclusiones Bibliografía consultada 23

28 PRÁCTICA Nº 4 OVOGÉNESIS EN ORTÓPTEROS Introducción El aparato genital femenino de ortóptero está diseñado para recibir y almacenar gametos masculinos y producir huevos, además de para asegurar el encuentro de los dos tipos de células reproductivas recuperando en una célula el número cromosómico de la especie y posteriormente en el exterior de la hembra generar un individuo. La estructura del aparato reproductor femenino de insectos es variable, ya que éste es uno de los más ampliamente diversificados. Los más típicos son los descritos a continuación. Los ovarios son dos y simétricos respecto de un eje longitudinal. Cada uno de ellos está formado por estructuras tubulares denominadas ovariolas, cuyo número es especie-específico. Éstas se arraciman confluyendo todas en un cáliz propio de cada ovario y éste en un oviducto lateral que converge con el del otro ovario y éste a su vez en uno común. Los oocitos en meiosis discurren por las ovariolas hasta el oviducto común, que desemboca en la bursa copulatrix, donde son puestos en contacto con el esperma, almacenado y alimentado de cada cópula que haya realizado la hembra. Así, los huevos de una misma puesta probablemente son fecundados por distintos machos. La ovariola es la unidad funcional del ovario y consiste, en su estructura típica, en el filamento terminal, germario, vitelario y pedicelo. Todo el ovario esta inmerso en un tejido conjuntivo muy laxo. En el germario, por mitosis, se originan los oocitos primarios, que entran en el vitelario con sus células foliculares asociadas. El oocito dede almacenar nutriente para el desarrollo, lo que implica que la velocidad de crecimiento sea elevada aunque esté determinada en última instancia por el tipo de ovariola. 24

29 Objetivos Que el alumno conozca y se familiarice con la ovogénesis y reconosca las etapas de formación de la misma así como las estructuras que participan en el proceso. Materiales Ejemplares de Ortopteros Estuche de disección Porta objetos y cubre objetos Procedimiento En la práctica se observan secciones histológicas de ovarios de hembras de saltamontes (ejemplares joven y adulto) teñido con tricromico de Masson y con hematoxilina-eosina. En dichas secciones se observara la disposición de las ovariolas en el ovario, así como la estructura y disposición de las células foliculares y del ovocito en las diferentes etapas de maduración. Resultados Dibuja y describe lo que observaste en las laminillas de hembra joven y hembra madura, menciona las diferencias que notaste. 25

30 Cuestionario 1. Cuántos tipos de ovariolas existen cuales son las diferencias que hay entre ellas? 2.- Dibuja los distintos tipos de ovariolas y sus principales estructuras. 26

31 Conclusiones Bibliografía consultada 27

32 PRÁCTICA Nº 5 OVOGÉNESIS EN ANFIBIOS Introducción Al igual que en invertebrados, el ovario de anfibios está diseñado para producir los gametos femeninos que se caracterizarán esencialmente por la acumulación de vitelo, fundamental para las primeras etapas del desarrollo. Los ovarios de anfibios son, estructuras pares de forma lobulada, en cuyo interior se localizan los folículos en distintos grados de maduración. Los folículos más tempranos se sitúan en la periferia del ovario, siendo de menor tamaño y con una cantidad pequeña de vitelo acumulado. Estos folículos también se encuentran rodeados por células foliculares, con origen en el estroma, y que tendrán un papel menos importante en la producción de vitelo al interior del oocito. A medida que los folículos maduran, se localizan más internamente en el ovario, acumulan mayor cantidad de vitelo y aumentan de tamaño. Las células foliculares que los rodean forman 2 ó 3 capas, si bien su morfología no experimenta cambio alguno. Al mismo tiempo, el citoplasma del oocito se diferencia en tres regiones en función de la acumulación de orgánulos. Así, es posible observar una región cortical más externa, una región medular inmediatamente por debajo y una última región, más cercana al núcleo, que recibe el nombre de citoplasma activo. Otra característica típica de los folículos de anfibios es que, a medida que el oocito madura, en su núcleo se produce un fenómeno denominado amplificación génica, en el cual se transcriben masivamente los cistrones ribosomales, por lo que se pueden observar gran cantidad de nucleolos extracromosómicos dispersos por el núcleo. Alcanzado cierto grado de maduración, el vitelo se compacta adoptando estructura paracristalina en forma de plaquetas vitelinas, si bien éstas presentan una morfología más regular y diferente a la observada en ortópteros, además de un tamaño menor. 28

33 El proceso de ovogénesis en anfibios dura aproximadamente unos tres años, siendo el último periodo en el que se produce el aumento más significativo de tamaño de los huevos, los cuales llegan a tener hasta unos 2-3 mm de diámetro en el momento de la puesta. Estos huevos son de tipo heterolecito y presentan una pigmentación diferencial característica que define los polos. Además de los folículos, en su estructura histológica el ovario presenta un fino epitelio que lo recubre, además de numerosos vasos sanguíneos de distinto tamaño en su estroma. Objetivos Que el alumno se familiarice con las estructuras que forman parte y participan en el proceso de ovogénesis. Materiales Cortes histológicos de ovario de rana. Procedimiento Se estudiarán secciones histológicas de ovario de rana teñidas con tricrómico de Masson. En estas preparaciones se analizará la disposición de los folículos dentro del ovario y el proceso de maduración de éstos, así como el consiguiente aumento de tamaño debido a la progresiva acumulación de vitelo que dará lugar finalmente a su compactación en forma de plaquetas vitelinas. Éstas se observarán con detalle con el fin de establecer diferencias con respecto a las encontradas en oocitos maduros de saltamontes. Igualmente se analizarán las diferencias morfológicas visibles en el citoplasma de los oocitos maduros de rana. 29

34 Resultados Dibuja e identifica lo que observaste en los cortes, describe tu esquema. 30

35 Cuestionario 1.- Realizar un dibujo de un ovario de rana y señalar en él todos los elementos morfológicos. 31

36 2.- Como diferencias a simple vista la ampolla del istmo en el oviducto? 3.- Cuanto folículos hemorrágicos has observado en los ovarios de las preparaciones? Cuántos cuerpos lúteos? Cuántos cuerpos albicans? Conclusiones 32

37 Bibliografía consultada 33

38 PRÁCTICA Nº 6 FOLICULOGÉNESIS EN MAMÍFEROS Introducción En mamíferos, los órganos sexuales femeninos internos están compuestos por los ovarios, las trompas uterinas, el útero y la vagina. La mayor parte de los componentes de estas estructuras se originan a partir del mesodermo intermedio y del mesodermo lateral. Los ovarios son estructuras pares y ovaladas. Consta de la corteza, que rodea a la médula, el límite entre estas estructuras no está definido. En la corteza se localizan los folículos de diferentes tamaños en función de la fase de desarrollo. La médula está formada básicamente por tejido conjuntivo laxo y por una masa de vasos sanguíneos. Los folículos están incluidos en el estroma de la corteza. Durante cada ciclo menstrual son varios los folículos que comienzan a madurar, pero lo normal es que sólo uno acabe el proceso, mientras que el resto degenera, fenómeno llamado atresia folicular. La inmensa mayoría son folículos primordiales formados por un ovocito grande rodeado de una capa de células foliculares planas. Éstos se encuentran principalmente en la periferia de la corteza ovárica A medida que en los folículos madura pasa de ser plana a cúbica, por proliferación mitótica éstos adquieren nuevas capas de células foliculares: folículos primarios. La capa folicular externa descansa sobre la membrana basal y a ella se adhieren células del conjuntivo que forman las tecas foliculares. La zona pelúcida, se sitúa entre el ovocito y la capa de células foliculares. El tamaño del ovocito aumenta de tamaño, los folículos aumentan mucho más y comienzan a aparecer cavidades entre las células foliculares que se llenan de líquido folicular. Las cavidades tienden a fusionarse formando el antro folicular. Estos folículos son llamados folículos secundarios o antrales. 34

39 Objetivos Que el alumno se familiarice e identifique las estructuras que conforman el órgano reproductor femenino en mamíferos Reconocer el proceso de desarrollo y maduración del ovocito en ovario de mamífero. Materiales Muestras de cortes histológicos de tejido ovárico de humano y ratón. Procedimiento Consiste en la observación de secciones histológicas de tejido ovárico humano y de roedor distinguiendo los folículos ováricos en las diferentes etapas de maduración. Además se estudiará la estructura histológica de secciones transversales de útero de rata y hámster determinando las características del endometrio (epitelio, glándulas y tejido conectivo), del miometrio (disposición de las capas musculares y del perimetrio. Resultados Dibuja lo que se observo y identifica las estructuras que componen el útero. Compara los úteros de rata y hámster, menciona las diferencias entre ellos. 35

40 Cuestionario 1.- Realizar un dibujo de todas y cada una de las etapas de la foliculogénesis señalando las estructuras más características. 36

41 2.- Realizar un esquema de un útero de rata, indicando claramente las diferentes capas que presenta. 37

42 Conclusiones Bibliografía consultada 38

43 PRACTICA Nº 7 FECUNDACIÓN EN EQUINODERMOS Introducción En los organismos con reproducción sexual el óvulo es fecundado por el espermatozoide formándose el cigoto, a partir del cual se originará el nuevo individuo. La contribución de los gametos masculino y femenino al cigoto es muy diferente; el óvulo aporta tanto su conjunto haploide de cromosomas como un rico citoplasma que posee los requerimientos necesarios para que, al menos, se inicie el desarrollo. El espermatozoide, sin embargo, principalmente aporta su núcleo y escasos componentes citoplasmáticos. El proceso de fecundación comprende una serie de sucesos que en la mayor parte de los organismos puede resumirse en: Activación del espermatozoide (capacitación), que ocurre en respuesta a las secreciones del oviducto o al contacto con el medio acuoso. Reacción acrosómica que permite que el espermatozoide se abra paso a través de las distintas cubiertas que posee el óvulo hasta la membrana plasmática. Fusión de las membranas plasmáticas del espermatozoide y del óvulo. Bloqueo de la polispermia para evitar que un mismo óvulo sea fecundado por más de un espermatozoide. Continuación de la meiosis en caso de que el óvulo expulsado del ovario se encuentre detenido en alguna de las fases del proceso meiótico (en humanos se encuentra en metafase II, mientras que en equinodermos ya ha finalizado la meiosis). Fusión de los pronúcleos, formándose un núcleo diploide de fecundación, o bien los cromosomas maternos y paternos se ordenan directamente sobre la placa ecuatorial en la primera división de segmentación. Activación metabólica del huevo y comienzo del desarrollo. 39

44 Objetivos El estudiante realizara la fecundación del ovocito de un erizo de mar para observar el proceso de segmentación y desarrollo embrionario. Materiales Erizo KCL Agua de mar Recipiente de vidrio. Vidrios de reloj Procedimiento Obtención de gametos Inyectar a través de la membrana oral (peristoma, zona oral) 1 ml de 0,5 M de KCl en agua de mar. Colocar el espécimen sobre un recipiente de vidrio que contiene unos ml de agua salina sobre la cara aboral, lado puesto a la zona oral. Pocos minutos después aparece un líquido espeso en la cara aboral, los gonoporos. Si el líquido es blanquecino se trata de esperma, mientras que si es rojizo corresponde a óvulos. Observar al microscopio en vidrios de reloj el aspecto y movimiento de óvulos y espermatozoides recién eyaculados y después de diluir con agua (1:10). Los espermatozoides sólo adquieren movilidad después de contactar con el agua salina. Los óvulos se conservan en el frigorífico por espacio de unas pocas horas. Los espermatozoides se pueden mantener hasta 24 h en seco y sin diluir en agua. 40

45 Fecundación Colocar sobre un porta excavado una gota de agua con ovocitos (1 gota de suspensión + 5 ml de agua). Enfocar en el microscopio con cuidado de que el objetivo no entre en contacto con el agua salina. Añadir una gota de esperma (1 gota de semen "seco" + 10 ml de agua). óvulos. Remover y observar la progresión de los espermatozoides en dirección a los Observar la membrana de fecundación que se forma en menos de 5 min. Desarrollo Observar en el microscopio los principales cambios morfológicos que suceden después de la fecundación y que llevan a la formación de la larva Pluteus. 5 min. Membrana de fecundación 1 h. 1ª. División de segmentación 2 h 30 min. Embrión de 16 células 6-12 h. Blástula 24 h. Gástrula 48 h. Larva Pluteus. 41

46 Resultados Dibuja y describe ampliamente lo observado. 42

47 Cuestionario 1.- Dibujar todas las fases del desarrollo embrionario del erizo de mar vistas en prácticas, desde el óvulo sin fecundar hasta el estadio de larva Pluteus. 43

48 Conclusiones Bibliografía consultada 44

49 PRACTICA Nº 8 ANALISIS SEMINAL Introducción En los últimos años se han logrado avances notables en el conocimiento de los mecanismos de la reproducción humana, así como en los métodos de investigación y diagnóstico de los trastornos de la fertilidad. A pesar de esto, el análisis del semen sigue siendo un examen imprescindible en el estudio del hombre que acude a consulta por infertilidad; luego se realizan otros exámenes según los resultados del mismo. Un análisis seminal completo nos informa sobre las propiedades del semen en su conjunto, tanto de la producción de espermatozoides como de la función de las glándulas sexuales accesorias. Es el estudio más importante para evaluar la fertilidad masculina. Consiste en una evaluación macroscópica y microscópica del semen. El análisis macroscópico incluye entre otros, la evaluación del volumen de semen, el aspecto, la viscosidad y el ph. El análisis microscópico está enfocado a las características de los espermatozoides. Se estudian la concentración, la movilidad y la morfología de los mismos. La concentración de espermatozoides es uno de los parámetros más importantes en la evaluación de la fertilidad masculina. Tradicionalmente, el recuento de espermatozoides se realiza utilizando la cámara de Neubauer que se ha convertido en el patrón de oro y el método recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Sin embargo se han diseñado otras cámaras como la de Makler para determinar la concentración de espermatozoides. La ventaja de las nuevas cámaras sobre la cámara de Neubauer es que estas utilizan las muestras sin diluir, aumentando la precisión del procedimiento y la reproducibilidad de los resultados. 45

50 Objetivo Que el alumno conozca la utilidad de la técnica de espermatobioscopía y se relaciones con ella haciendo estudios macroscópicos y microscópicos de la misma. Materiales Muestra de semen. Pipeta. Guantes. Lentes de seguridad. Microscopio. Portaobjetos y cubreobjetos. Tinción: azul de metileno. Procedimiento Obtener una muestra de semen preferentemente con máximo 5 días de abstinencia y mínimo 3 días. El material que utilice debe ser preferentemente estéril y solo puede ser utilizado una vez y desechado como material peligroso. No olvides utilizar gantes de protección. Para el conteo espermático utilizar cama de Mackler. No olviden desactivar el esperma con alcohol una vez terminada la práctica. A través de observaciones y manipulación de la muestra, determinar: Aspecto. Color del semen. Volumen de la muestra. Licuefacción. Tiempo que tarda en volverse homogénea la muestra. Viscosidad. ph. 46

51 47

52 Resultados Anota los valores obtenidos. Cuestionario. 1. La muestra que examinaste cumplía con los niveles estándar normales? A que atribuyes tus resultados, justifica 48

53 2. Qué factores pueden influir para que la muestra no esté con condicione óptimas? 3. Investiga que son los siguientes términos: Normazoospermia. Hipospermia. Hiperspermia. Aspermia. Azoospermia. Piospermia. 49

54 Criptozoospermia. Hematozoospermia. Polizoospermia. Oligozoospermia. Astenozoospermia. Teratozoospermia. 50

55 Conclusiones Bibliografía consultada 51

56 PRÁCTICA Nº 9 CITOLOGIA Y CICLO ESTRAL DE RATA Introducción La pared vaginal sufre cambios cíclicos que corresponden con los cambios del ciclo del endometrio. Estos cambios se hallan bajo la influencia de las hormonas ováricas. Las fases del ciclo estral pueden identificarse a través de las células descamadas obtenidas de la vagina. El ciclo hormonal (hipofisiario y ovárico) está estrechamente relacionado con los cambios en el epitelio del tracto reproductivo de los mamíferos. Los cambios en las distintas fases indican que el efecto de los estrógenos sobre la mucosa vaginal es mucho más pronunciado que el de la progesterona. Los estrógenos son responsables de los procesos de: Proliferación Diferenciación (incremento en el tamaño y cambio de forma de la célula, presencia de precursores de queratina y degeneración del núcleo picnosis-) Exfoliación de las células El grado de cambios en el epitelio vaginal y en el frotis refleja la cantidad de estrógenos circulante (mayor concentración de estrógenos en proestro y estro). Se han creado varios índices para describir las células que se observan en frotis vaginales: Índice eosinofílico (EI) Índice de células superficiales (SCI) Índice cariopicnótico (KPI) * En qué consiste cada índice? Aunque los cambios inducidos en las células vaginales son continuos, las células en un frotis pueden ser clasificadas en cinco tipos principales: 52

57 Células basales Células parabasales Células intermedias pequeñas Células intermedias grandes Células superficiales Objetivos 1. Identificar las características citológicas del epitelio vaginal en cada etapa del ciclo estral. 2. Identificar las aplicaciones de la técnica de tinción de Papanicolaou y su importancia en el diagnóstico de salud de los seres humanos. Materiales Laminillas histológicas de cristal esmeriladas Citoespray Cubreobjetos Resina sintética para montar Microscopio óptico Ejemplares (ratas hembras) del bioterio Procedimiento En una rata, realizar un frotis vaginal diario durante 5 días, de la manera siguiente: Introducir en la vagina de la rata un hisopo para raspar el epitelio y de esta manera tomar la muestra. Tratando de frotar el hisopo en toda la laminilla para procurar dejar lo más posible de la muestra Fijar con citospray. Llevar las laminillas al laboratorio donde se colocarán en la canastilla histológica. Para eliminar el citospray, las laminillas introducir varias veces en alcohol al 70 % Realizar la tinción del Papanicolaou. Después utilizando unas pinzas para sostener la laminilla, introducir cada una de las laminillas en alcohol al 10%. 53

58 Dejar las laminillas por 5 minutos en hematoxilina, dar otros dos baños de alcohol al 80 %. Introducir por 10 minutos en OC6, después dos baños en alcohol al 80% Dejar las laminillas 10 minutos en EA50, después en alcohol al 80%, 96%, y dos baños mas de alcohol absoluto. Por último meter las laminillas en Xilol dos veces. Esperar a que sequen las laminillas, para luego montar en resina sintética Colocar el cubreobjetos esperando que al colocarlo quede totalmente cubierta. Por último colocar en la plancha para esperar a que seque para después ya poder observar la muestra en el microscopio. Tinción de Papanicolaou Teñir las preparaciones siguiendo el procedimiento siguiente. En donde las células acidofilas se colorean de un tono naranja rojizo, por otro lado las basofilas y los núcleos de un tono morado o guinda. 54

59 Bibliografía Hernández Pichardo, E., Fernández Reyes, F. y Cortés Suárez S. Fundamentos teórico prácticos de la citología exfoliativa en medicina veterinaria. CBS,Manual 5. UAM Unidad Xochimilco. Resultados Dibuja y describe tus observaciones. Fases ciclo Estro del Frotis vaginal Descripción Histología Comportamiento Duración Metaestro Diestro Proestro 55

60 Cuestionario 1. En qué etapa del periodo estral se tiene una mayor concentración de estrógenos? 2.- Por qué las hembras de estas especies se ciclan al mismo tiempo cuando comparten el mismo espacio físico? En qué otras especies ocurre este fenómeno? 3.- Cuál es el objetivo del examen de Papanicolaou y con qué frecuencia debe realizarse? Explica en qué consiste esta prueba en las mujeres. Cuál es la prueba equivalente en los hombres y cada cuándo debe realizarse? 56

61 Conclusiones Bibliografía consultada 57

62 PRÁCTICA Nº 10 DESARROLLO EMBRIONARIO DEL POLLO Introducción Del ovario izquierdo se desprenden las yemas. Estas durante su paso a lo largo del oviducto adquieren la clara o albúmina y por último la cáscara, el huevo se forma a lo largo del oviducto. La fecundación se produce en la parte superior del oviducto, se necesita la participación del gallo entre 36 y 24 horas antes de poner el huevo. El huevo está protegido por la cáscara muy delgada, pero dura; que permite la respiración a través de los poros superficiales. Además de esta cáscara porosa, el huevo contiene dos membranas que están alineadas muy juntas dentro de la cáscara pero conservan una separación con la cáscara y entre ellas. La membrana más cercana a la cáscara se la "membrana exterior de la cáscara" y la que está en contacto con la albúmina se la "membrana interior de la cáscara". Durante la incubación la cámara de aire situada en el extremo más ancho del huevo se forma como resultado de la separación de las dos membranas. Al comenzar la incubación, se empiezan a desarrollar tres membranas: el amnios, el corion y el alantoides. Este sistema de membranas tiene vasos sanguíneos que permiten al embrión obtener oxígeno. En su interior se encuentra la clara y la yema. El saco vitelino es la membrana que contiene el vitelo. Está conectada al cordón umbilical y contiene vasos sanguíneos. La utilización de la yema es gradual al inicio de la incubación, y es muy acelerada en los últimos 5 días. Esto es transferido al cuerpo del polluelo, a través del ombligo, justo antes del nacimiento, es absorbido durante la primera semana de vida fuera de la cáscara. El amnios una membrana cerrada en forma de saco que contienen el líquido amniótico. Esta se desarrolla más rápido que el alantoides; el embrión está sumergido en él. Sirve para amortiguar al embrión contra los golpes mecánicos, y lo protege contra la deshidratación o los contactos con la cáscara. Parte de este fluido es absorbido por el embrión en los últimos estadios de su desarrollo. 58

63 El alantoides es una membrana en forma de saco que está conectada con el tubo digestivo; cumple dos funciones: como órgano respiratorio, llevándole oxígeno al embrión y expulsando el dióxido de carbono, y como órgano excretor: el riñón excreta sus productos dentro del alantoides. La posición del embrión se define ya desde las 36 a 48 horas de incubación. En este momento el embrión descansa en la yema, de manera transversal, a lo largo del eje menor del huevo. Hacia el 5 día de incubación, el embrión se halla cerca de la cámara de aire. A partir del 11 día, cuando el cuerpo del embrión pesa más que su cabeza, el mismo efectúa un giro a la izquierda, lo que provoca que el cuerpo descienda en dirección al polo fino del huevo. A los 14 días, el cuerpo del embrión está situado a lo largo del eje mayor del huevo, con la cabeza dirigida hacia el polo grueso. Esta es la posición correcta y necesaria que debe adoptar el pollito para el nacimiento. El embrión está orientado normalmente con su cabeza hacia la punta ancha de la cáscara. En el día 19, el embrión introducirá su pico entre las membranas separadas y usará la cámara de aire para respirar por primera vez. Objetivos 1. Distinguir las estructuras que dan origen a los órganos y sistemas en un embrión 2. Comparar el desarrollo embriológico del ser humano con otras especies. 3. Correlacionar las características morfológicas del embrión con las etapas del desarrollo embrionario por semana. 4. Trabajar limpia y ordenadamente en el laboratorio, tratando de mantener una actitud científica investigativa. 5. Realizar dibujos apropiados que describan las etapas de desarrollo embrionario según lo observado. 59

64 Materiales Incubadoras. Huevos fértiles incubados entre 2 y 5 días. Lupas. Recipientes apropiados para la práctica. Pinzas. Embriones conservados. Microscopios. Papel mayordomo. Bolsas para deshechos. Equipo para limpieza de los materiales utilizados. Procedimiento 1. Identificar la porción del huevo donde se encuentra la cámara de aire. Corresponde al extremo romo del huevo. 2. Eliminar la porción de cáscara que recubre la cámara de aire. 3. Retirar con mucho cuidado la membrana interior. 4. Vaciar el contenido en el recipiente e identificar donde se encuentra el embrión, el amnios, la yema y las chalazas. Si está suficientemente desarrollado se observará el corazón funcionando. 5. Extraer el embrión y colocarlo sobre un portaobjetos y observarlo por medio de la lupa. 6. Con su otra mano y con un par de tijeras afiladas, corte las membranas extraembrionarias alrededor del embrión. No suelte nunca al embrión porque puede hundirse en la yema. 7. Levantar el embrión cuidadosamente de la yema y observar si se han cortado por completo las membranas. 60

65 8. Si su embrión es demasiado joven para tener un cuello identificable, la mejor manera de quitarlo está en usar una corona circular de papel de filtro. Corte un disco de papel, dentro del disco corte un agujero, un poco más grande que el embrión. 9. Colocar esta corona circular de papel encima del embrión para que el mismo sobresalga por el orificio y el papel de filtro se adhiere a la región extraembrionaria. 10. Mediante unas tijeras realizar una pequeña incisión en el borde del papel de filtro. Agarrar bien papel y membranas con las pinzas y con las tijeras terminar de cortar las membranas extraembrionarias alrededor del filtro. 11. Observe dibuje e identifique las estructuras principales. 61

66 Resultados Realiza un dibujo de las estructuras que lograste identificar. 62

67 63

68 Cuestionario 1. Cuánto tiempo de desarrollo aproximadamente tiene el embrión? 2.- Describe y menciona cuanto tiempo dura la formación del huevo en la gallina? 3.- Realiza un dibujo de las estructuras que forman el huevo. 64

69 Conclusiones Bibliografía consultada 65

70 PRACTICA Nº 11 TINCIÓN DE ESQUELETO EMBRIÓN DE POLLO Introducción Esta técnica consiste en la coloración del tejido óseo del embrión de pollo. Para poder visualizar este tejido, una vez teñido, sin la necesidad de aparatos especiales, se lleva a cabo la transparentación de los tejidos blandos. Este tipo de técnicas se utilizan de manera rutinaria en los laboratorios farmacéuticos, para estudiar el efecto de los nuevos fármacos sobre el desarrollo embrionario. Nosotros utilizaremos embriones de pollo de días de incubación (estadio Hamburger Hamilton). Los embriones se mantendrán durante todo el proceso en un recipiente de plástico de 250 ml. Objetivo Que el alumno conozca y desarrolle la técnica de tinción de tejido óseo embrionario Materiales Incubadoras. Huevos fértiles incubados entre 2 y 5 días. Lupas. Recipientes apropiados para la práctica. Pinzas. Embriones conservados. Microscopios. 66

71 Procedimiento 1. Extraeremos el embrión abriendo el huevo y depositando todo el contenido sobre una placa de petri. Retiramos las membranas que lo envuelven y lo lavamos en una solución de PBS (Solución buffer de fosfatos). Composición del PBS: Na2HPO4 2H2O g NaH2PO4 H2O ,1 g NaCl ,5 g H2O destilada Trabajando siempre bajo la lupa binocular, retiramos la piel del embrión, procurando no dañar las estructuras. Una vez terminado lo lavaremos en PBS. 3. Abrimos el abdomen introduciendo las tijeras por el cordón umbilical en dirección craneal. Llegando hasta la entrada del tórax, vigilando no cortar las costillas ni el esternón. En dirección caudal abriremos hasta la cloaca. Se extraen todas las vísceras del embrión, vaciando las dos cavidades por completo (tórax y abdomen). Lo volvemos a lavar en PBS y lo introducimos en una solución de alcohol etílico al 70%, aquí estará un mínimo de 10 días (solución fijadora). 4. A los 10 días se lavan los embriones en agua corriente a poca presión y se pasan a una solución de hidróxido potásico al 1% durante 1 día (solución permeabilizadora). Composición para 100 ml de solución de KOH 1 %: H2O destilada ml KOH g. 5. Al día siguiente se lavan los embriones en agua corriente a poca presión y se ponen en una solución de rojo de alizarina. Aquí deberán permanecer 2 días (solución colorante). 67

72 Composición para 1000 ml de solución: Rojo de alizarina ,006 g KOH 1 % ml 6. Se extraen los embriones de la solución de rojo de alizarina, se lavan con agua corriente y se introducen en una solución de glicerol / alcohol etílico al 70 % / alcohol bencílico, en una proporción de 2:2:1, hasta que se transparenten (solución transparentadora). Composición para 100 ml de solución: Glicerol ml Alcohol etílico 70 % ml Alcohol bencílico ml 7. Los embriones se almacenan en una solución de glicerol / alcohol etílico al 70%, en una proporción 1:1 (solución conservadora). Composición para 100 ml de solución: Glicerol ml Alcohol etílico 70 %

73 Resultados Realiza un dibujo de las estructuras que lograste identificar. 69

74 Cuestionario 1.- Cuál es la función de Hidróxido de Potasio en el tejido óseo del embrión, explica el proceso en el tejido? 2. Cuáles son los componentes celulares en la formación del hueso en el embrión de pollo, y de que capa embrionaria proceden? 70

75 Conclusiones Bibliografía consultada 71

76 PRACTICA Nº 12 EXTRUCTURAS EXTRAEMBRIONARIAS Y PLACENTA Introducción Las membranas fetales y la placenta separan al embrión de la madre pero permiten el intercambio de sustancias entre los torrentes sanguíneos de ambos. En mamíferos, las membranas fetales son el amnios, el saco vitelino, el alantoides y el corion o placenta. Cuando el cigoto alcanza el útero (aproximadamente 5 días después de la fecundación), ya se ha formado la blástula o blastocisto, compuesto por una capa de células (trofoblasto) que rodean a una cavidad (blastocele) en la que en un extremo (polo embrionario) se sitúa un conglomerado de células (masa celular interna). Las células del trofoblasto están implicadas en la fijación e implantación del embrión y en la posterior formación del corion y de la placenta. La masa celular interna será la encargada de formar al individuo y además participará en la formación de ciertas estructuras extraembrionarias (amnios, saco vitelino y alantoides). La implantación ocurre hacia el sexto día después de la fecundación. En el proceso, el trofoblasto invade el estroma endometrial. El trofoblasto pronto origina dos capas celulares, una externa: el sincitiotrofoblasto, encargada de erosionar el endometrio, y otra interna: el citotrofoblasto, con capacidad de división. En la invasión el sincitiotrofoblasto se llenan de sangre materna, fundamental para la alimentación del embrión en los primeros días de la gestación. El tejido uterino materno implicado en el proceso de implantación recibe el nombre de decidua. Entre los días 13 y 21 se organizan las vellosidades coriales. El citotrofoblasto forma las vellosidades coriales hacia los tejidos maternos originando una envoltura continua, la coraza citotrofoblástica. Entre los días 21 y 40 es posible distinguir en el corion una región lisa y otra frondosa, que constituye el componente fetal de la placenta. 72

77 Desde finales del 4º mes al término de la gestación la placenta conserva su estructura general. La placenta, por lo tanto, es un órgano maternofetal que presenta dos componentes: a) Una porción fetal que se desarrolla a partir del saco coriónico; b) Una porción materna que deriva del endometrio. Placenta y estructuras extraembrionarias de rata La formación y estructura de la placenta no es la misma en todos los mamíferos. Los roedores son multíparos, ocurriendo la implantación en un útero bicorne. Cada embrión tiene su conjunto de estructuras extraembrionarias. Poco después de la implantación, las células de la masa celular interna (ICM) proliferan rápidamente y se introducen en el saco vitelino, de manera que la mayor parte del espacio ocupado por el saco vitelino en otros mamíferos aquí es eliminado. A partir de la ICM se formarán dos capas: 1.- El ectodermo, semejante al epiblasto de aves y 2.- El endodermo, semejante al hipoblasto de aves. Posteriormente, y tras la evolución de ambas capas, se formarán una serie de membranas y cavidades extraembrionarias que rodearán al embrión: 1.- Cavidad amniótica 2.- Membrana amniótica (con componente ectodérmico y mesodérmico), 3.- Cavidad exocelómica, 4.- Saco vitelino (con componente mesodérmico del saco vitelino y endodérmico visceral), 5.- Cavidad del saco vitelino, 6.- Endodermo extraembrionario parietal, 7.- Membrana de Reichert, 8.- Cono ectoplacentario y derivados del trofoectodermo. 73

78 Objetivos a) Estudiar las estructuras extraembrionarias de mamíferos, en particular la placenta de humano y de rata. b) Observar secciones histológicas de cordón umbilical de humano y de rata y de placenta humana a término. c) Estudiar la estructura de la placenta de rata, comparándola con la humana. Procedimiento Análisis de secciones histológicas. El material a observar ha sido incluido en parafina y las secciones de unas 5-6 µm de espesor se han teñido con hematoxilina/eosina y corresponden a: a) Placenta humana a término. b) Cordón umbilical de rata a término. c) Placenta y estructuras extraembrionarias de rata de 15 días de gestación. d) En la placenta humana determinar los componentes de la barrera placentaria. e) En la placenta de rata estudiar las diferentes capas que rodean al embrión en la zona opuesta al cono placentario (amnios, saco vitelino con todos sus componentes, cavidad uterina y decidua parietal). f) En el cono placentario, determinar el trofoblasto gigante y la sangre fetal y materna. g) Observación de vellosidades corionicas en placenta de rata teñidas con tricrómico de Masson. h) Observar corte histológico de cordón umbilical de rata teñido con hematoxilina-eosina. 74

79 Resultados Realiza un dibujo de las estructuras que lograste identificar. 75

80 76

81 77

82 Cuestionario 1.- Qué membranas embrionarias nutren y cuales protegen al feto de mamíferos? 2.- A qué órganos darán origen las capas embrionarias? 3.- Describe cuales son y en qué consisten los componentes fetales y maternos de la placenta. 78

83 4.- Como se forma el trofoblasto y como participa en la formación de la placenta? 5.- En qué consisten, como se forman y para qué sirven los cotiledones placentarios 79